Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal-I bằng kỹ thuật knock-down với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (319.16 KB, 27 trang )
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
NGUYỄN THỊ CÚC
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I
BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA
TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
NGUYỄN THỊ CÚC
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I
BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA
TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. ĐỒ THỊ THẢO
HÀ NỘI – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, hướng
dẫn tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ chân thành của các đồng nghiệp.
Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới TS.
Đỗ Thị Thảo - Phó trưởng Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ
sinh học, đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng
như trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học của Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban giám hiệu
Trường Đại học Thái nguyên và Phòng Thử nghiệm sinh học đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm các anh, chị đồng nghiệp phòng Thử
nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ và
giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên
Nguyễn Thị Cúc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
PHẦN I. MỞ ĐẦU ...................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu nghiên cƣ́u của đề tài ........................................................... 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1. Ung thƣ .................................................................................................. 3
2.1.1. Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và ở Việt Nam....................... 3
2.1.2. Đặc tính và nguyên nhân của ung thư ............................................. 3
2.1.2.1. Các đặc tính của bệnh ung thư ........................................................ 3
2.1.2.2. Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn .................................................. 3
2.1.3. Phân loại ung thư .............................................................................. 4
2.1.4. Tác nhân gây bệnh ung thư............................................................... 4
2.1.4.1. Tác nhân hóa học ............................................................................. 4
2.1.4.2. Tác nhân sinh học ............................................................................ 5
2.1.5. Cơ chế di căn của tế bào ung thư ...................................................... 5
2.1.6. Dòng tế bào ung thư vú MCF7.......................................................... 6
2.2. Giới thiệu về RNAi ............................................................................... 6
2.2.1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào ............................................... 6
2.2.2. Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào ..................................... 7
2.2.2.1. Khái niệm ......................................................................................... 7
2.2.2.2. Vai trò của RNAi .............................................................................. 7
2.2.2.3. Thành phần RNAi ............................................................................. 7
2.2.3. Lịch sử nghiên cứu siRNA ................................................................ 7
2.2.4. Cơ chế của RNAi ................................................................................ 9
2.2.4.1. Cơ chế chống lại các virus và gene nhảy của RNAi ........................ 9
2.2.4.2. Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA ........................................................ 9
2.2.5. Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi....................................... 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.2.5.1. Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư .................................... 10
2.2.5.2. Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh ........................... 10
2.2.5.3. Ứng dụng RNAi trong việc trừ sâu bệnh ........................................ 11
2.2.5.4.Các ứng dụng khác của RNAi ......................................................... 11
2.2.6. Ý nghĩa của RNAi ............................................................................ 11
2.2.7. Khái niệm về knock-down gene ......................................................... 11
2.3. Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST) ......................... 12
2.3.1. Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư ..... 12
2.3.2. Khái niệm về Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I .......................... 16
2.3.3. Phân loại các Enzyme sialyltransferase .......................................... 17
2.3.4. Mô hình tác động của hệ Enzyme sialyltransferase ....................... 18
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc thuộc lĩnh vực đề tài . 19
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 20
3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ......................................... 20
3.1.1. Vật liệu ............................................................................................. 20
3.1.2. Hoá chất............................................................................................. 20
3.1.3. Thiết bị ............................................................................................... 21
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ................................................... 21
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................... 21
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro ............................................. 21
3.3.2. Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA nhờ
lipofectamin ................................................................................................ 22
3.3.3. Phân tích và so sánh hình thái tế bào sau khi bị knock-down ...... 23
3.3.4. Xác định khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển nhiễm ..... 23
3.3.5. Thu nhận RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen .......... 23
3.3.6. Kiểm tra hiệu quả knock-down gene bằng RT-PCR theo bộ kit của
Applied Biosystem ...................................................................................... 23
3.3.7. Thu nhận Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 ........................... 24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số .............. 25
3.3.9. Phương pháp điện di trên gel .......................................................... 25
3.3.10. Phƣơng pháp Western blot để xác định mức độ biểu hiện của
các protein .................................................................................................. 26
3.3.11. Phương pháp nhuộm gel bằng siver staining ............................... 26
3.3.12. Phương pháp in-gel digestion....................................................... 27
3.3.13. Phương pháp phân tích khối phổ .................................................. 28
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................ 29
4.1. Hình thái tế bào MCF7 sau khi knock-down gene ST3Gal-I bằng
siRNA.......................................................................................................... 29
4.2. Khả năng phát triển của tế bào MCF7 sau khi chuyển nhiễm
siRNA.......................................................................................................... 30
4.3. Hiệu quả knock-down gene ............................................................... 31
4.4. Biểu hiện của protein tổng số khi gene ST3Gal-I bị knock-down . 34
4.5. Biểu hiện của một số protein khi gene ST3Gal-I bị knock-down
..................................................................................................................... 35
4.6. Hàm lƣợng Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm
..................................................................................................................... 37
4.7. Nhuộm bạc .......................................................................................... 40
4.8. Phân tích khối phổ MALDI-TOF-MS.............................................. 41
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 46
1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 46
2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Giới thiệu một số dạng liên kết giữa phân tử amino acid với phân
tử đường trong tự nhiên............................................................................... 13
Bảng 4.1 .Giá trị OD trung bình ở bước sóng 570 nm................................ 29
Bảng 4.2. Hàm lượng RNA tổng số của các mẫu ....................................... 30
Bảng 4.3. Hiệu quả knock-down gene ST3Gal-I sau khi chuyển nhiễm
siRNA .......................................................................................................... 32
Bảng 4.4. Hàm lượng Glycoprotein thu được từ tế bào chuyển nhiễm
siRNA .......................................................................................................... 37
Bảng 4.5 Kết quả phân tích khối phổ protein ............................................ 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Vị trí của gene ST3Gal-I ............................................................. 16
Hình 2.2. Mô hình tác động của hệ enzyme ST trong đó có ST3Gal-I ...... 18
Hình 4.1. Hình ảnh tế bào MCF7 sau 3 ngày chuyển nhiễm ở độ phóng đại
20 X gồm: (A) tế bào đối chứng (không chuyển nhiễm siRNA); (B) tế bào
chuyển nhiễm siRNA .................................................................................. 28
Hình 4.2. Sự sống sót và phát triển của các tế bào MCF7 sau khi chuyển
nhiễm siRNA ............................................................................................... 30
Hình 4.3. Định lượng RNA tổng số của các mẫu thu được bằng hệ thống
NanoDrop của Thermo Scientific ............................................................... 31
Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn về tương quan nồng độ BSA và giá
trị OD thu được ........................................................................................... 33
Hình 4.5. Hình ảnh western-blot glycoprotein màng tổng số của mu đối
chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) ..................................... 35
Hình 4.6. Ảnh Western-blot các protein Actin, Akt, GSK, P42/44 và
PODCL của mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) . 37
Hình 4.7. Hình ảnh nhuộm bạc silver-staining các glycoprotein màng của
mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) ....................... 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Akt
Protein Kinase B
ANKRD46
ankyrin repeat domain 46
bp
Base pair
cDNA
Complementary Deoxyribonucleic acid
DNA
Deoxyribonucleic acid
DMEM
Môi trường nuôi cấy tế bào
dsRNA
RNA sợi đôi
EDTA
Ethylenediamintetraacetic acid
FBS
Phosphate bufer saline (huyết thanh phôi bò)
Gal Nac
N-acetylgalactosamin
Hela S3
Dòng tế bào ung thư vú
HT-29
Dòng tế bào ung thư ruột người
NFkB-p65
nuclear factor kappa from B cells
MCF7
Dòng tế bào ung thư vú
MDA-MB-231
Dòng tế bào ung thư vú
miR 21
microRNA 21
miRNA
Micro Ribonucleic acid
mRNA
RNA thông tin (Messenger Ribonucleic acid)
Neu5Ac
N-acetylneuraminic acid
PI3K
Rapid Immunofilter Paper Assay
RIPA
Phosphatidylinositol 3-kinases
rpm
Revolutions per minute
RISC
RNA – incluced silencing complex
RNA
Ribonucleic acid
RNAi
RNA can thiệp (Ribonucleic acid interference)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
RNAse III
Ribonuclease III
RT-PCR
phản ứng Real time Polymerase chain reaction
ser/ther
serine/threonine
siRNA
Small interference RNA/short interference RNA
ssRNA
Single strand RNA
ST3Gal-I
2,3 Sialyltransferase galatose
SW480
Dòng tế bào ung thư ruột kết người
TBUT
Tế bào ung thư
WHO
Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
data error !!! can't not
read....
