Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc (LA tiến si)

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẶNG THỊ MAI LAN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ
ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN Listeria,
Salmonella spp., Staphylococcus aureus Ô NHIỄM TRONG
THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y

Thái Nguyên, năm 2017


BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẶNG THỊ MAI LAN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ
ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN Listeria,
Salmonella spp., Staphylococcus aureus Ô NHIỄM TRONG
THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC

Chuyên ngành: Ký sinh trùng & VSV học thú y
Mã số:
62.64.01.04

LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Xuân Bình

2. PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh

Thái Nguyên, năm 2017


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện
với sự giúp đỡ của:
- Ths. Phạm Thị Phương Lan cùng các anh, chị, em Bộ môn Công nghệ vi
sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên.
- Ths. Nguyễn Thị Hoài Thu cùng toàn thể các anh, chị, em phòng Công nghệ
sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công
nghệ sinh học.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ
rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày tháng
Tác giả

Đặng Thị Mai Lan

năm 2017


ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi xin
được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS. Đặng Xuân Bình và
PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt nhiều kinh
nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Tôi xin được chân thành cảm ơn tới Ths. Phạm Thị Phương Lan cùng các anh,
chị, em Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên
đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới Ths. Nguyễn Thị Hoài Thu cùng toàn
thể các anh, chị, em phòng Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học cũng đã tận tình giúp đỡ và
tạo điều kiện để cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án.
Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban
Chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y, các thầy cô, các anh chị em đồng nghiệp khoa
Chăn nuôi thú y, Lãnh đạo Chi cục Thú y, Trạm thú y các tỉnh Thái Nguyên, Bắc
Giang, Hà Tây - Hà Nội, Vĩnh Phúc đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành
luận án.
Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người bạn,
người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ đã luôn kịp thời động viên và tạo mọi
điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận án. Xin cảm ơn người chồng thân yêu
đã luôn giúp đỡ, chia sẻ với tôi trong suốt những năm tháng qua.
Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này.

Thái Nguyên, ngày tháng

năm 2017

Đặng Thị Mai Lan

iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ii
MỤC LỤC.....................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................xiii
APS:.............................................................................................................................xiii
AOAC:.........................................................................................................................xiii
bp: xiii
base pair (cặp base).....................................................................................................xiii
C. perfringens:.............................................................................................................xiii
Clostridium perfringens..............................................................................................xiii
DBB:............................................................................................................................xiii
Denaturing Binding Buffer.........................................................................................xiii
DEB:............................................................................................................................xiii
Denaturing Elution Buffer..........................................................................................xiii
ADN:...........................................................................................................................xiii
Acid deoxyribonucleic ...............................................................................................xiii
dNTPs:.........................................................................................................................xiii
deoxynucleotide triphosphate.....................................................................................xiii
E. coli:.........................................................................................................................xiii
Escherichia coli...........................................................................................................xiii
EDTA:.........................................................................................................................xiii
Ethylene Diamine Tetraacetace Acid.........................................................................xiii
Epp:..............................................................................................................................xiii
Eppendorf....................................................................................................................xiii
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside......................................................................xiii

LB: xiii
Luria and Bertani.........................................................................................................xiii
Histocompatibility complex class II...........................................................................xiii

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.............................................xiii
Methicillin‐ sensitive Staphylococcus aureus............................................................xiii
Ngân hàng gen ............................................................................................................xiii
Ngộ độc thực phẩm.....................................................................................................xiii


iv

PCR:............................................................................................................................xiii
Polymerase Chain Reaction........................................................................................xiii
PBS:.............................................................................................................................xiii
Phosphate buffer saline...............................................................................................xiii
S. aureus:.....................................................................................................................xiii
Staphylococcal chromosomal cassette........................................................................xiii
SDS:.............................................................................................................................xiii
Sodium dodecyl sulfate...............................................................................................xiii
se: xiii
Staphylococcal enterotoxin.........................................................................................xiii
sea: xiii
Staphylococcal enterotoxin A.....................................................................................xiii
seb: xiii
Staphylococcal enterotoxin B.....................................................................................xiii
sec: xiii
Staphylococcal enterotoxin C.....................................................................................xiii
sed: xiii
Staphylococcal enterotoxin D.....................................................................................xiii

see: xiii
Staphylococcal enterotoxin E.....................................................................................xiii
ses: xiii
Staphylococcal enterotoxin S......................................................................................xiii
set: xiv
Staphylococcal enterotoxin T......................................................................................xiv
Staphylococcal enterotoxin B 534..............................................................................xiv
SMX/TMD:.................................................................................................................xiv
Sulfamethoxazole – Trimethoprim.............................................................................xiv
RNA:............................................................................................................................xiv
Ribonucleic Acid.........................................................................................................xiv
Pulsed-field gel electrophoresis..................................................................................xiv
Peptidoglycan..............................................................................................................xiv
TEMED:......................................................................................................................xiv
Toll-like receptor.........................................................................................................xiv
TSST: ..........................................................................................................................xiv


v

v/p: xiv
Vòng/phút....................................................................................................................xiv
VKHK:.........................................................................................................................xiv
Vi khuẩn hiếu khí........................................................................................................xiv
UBND:.........................................................................................................................xiv
Ủy ban nhân dân..........................................................................................................xiv
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU...............................................................................xv
DANH MỤC CÁC HÌNH..........................................................................................xxii
MỞ ĐẦU........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học...........................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn...........................................................................................................2

4. Điểm mới của đề tài...................................................................................................3
Chương 1........................................................................................................................4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................................4
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và
Staphylococcus aureus thế giới và Việt Nam.........................................................4
1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S.
aureus trên thế giới......................................................................................................4
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S.
aureus tại Việt Nam....................................................................................................6

1.2. Ngộ độc thực phẩm do nhiễm Listeria, Salmonella spp., S. aureus và nguyên
nhân gây nhiễm khuẩn vào thịt lợn.......................................................................10
1.2.1. Khái niệm ngộ độc và phân loại tình trạng ngộ độc.................................................10
1.2.2. Ngộ độc thực phẩm do Listeria, Salmonella spp. và Stapylococccus aureus...........10

1.2.2.1. Ngộ độc thực phẩm do Listeria ..................................................10
1.2.2.2. Ngộ độc thực phẩm do Salmonella spp.......................................11
1.2.2.3. Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus..........................11
1.2.3. Nguyên nhân gây nhiễm khuẩn vào thịt...................................................................12

1.2.3.1. Nguyên nhân từ cơ thể động vật................................................12
1.2.3.2. Nguyên nhân từ nguồn nước sản xuất........................................13
1.2.3.3. Nguyên nhân từ không khí .........................................................13
1.2.3.4. Nguyên nhân từ dụng cụ, trang thiết bị không đảm bảo vệ sinh
......................................................................................................................13

vi

1.2.3.5. Nguyên nhân từ người trực tiếp giết mổ....................................14
1.2.3.6. Nguyên nhân do vận chuyển........................................................14
1.2.3.7. Nguyên nhân do thời gian và nơi bày bán..................................15
1.3. Đặc điểm sinh vật, hóa học của một số vi khuẩn gây ô nhiễm trên thịt lợn........15
1.3.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus..............................15

1.3.1.1. Phân loại vi khuẩn Listeria ..........................................................16
1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn Salmonella spp...............................................16
1.3.1.3. Phân loại vi khuẩn Staphylococcus aureus..................................17
1.3.2. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Listeria ...................................................20

1.3.2.1. Đặc điểm hình thái......................................................................20
1.3.2.2. Đặc tính nuôi cấy.........................................................................20
1.3.2.3. Đặc tính sinh hóa..........................................................................21
1.3.2.4. Sức đề kháng.................................................................................21
1.3.2.5. Khả năng kháng kháng sinh.........................................................22
1.3.2.6. Đặc tính gây bệnh........................................................................22
1.3.3. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella spp........................................23

1.3.3.1. Đặc điểm hình thái......................................................................23
1.3.3.2. Đặc tính nuôi cấy.........................................................................23
1.3.3.3. Đặc tính sinh hóa..........................................................................24
1.3.3.4. Sức đề kháng.................................................................................26
1.3.3.5. Khả năng kháng kháng sinh.........................................................26
1.3.3.6. Đặc tính gây bệnh........................................................................27
1.3.4. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Staphylococcus aureus............................28

1.3.4.1. Đặc điểm hình thái......................................................................28
1.3.4.2. Đặc tính nuôi cấy.........................................................................28
1.3.4.3. Đặc tính sinh hóa..........................................................................29
(Reginald W. B. và Gayle A. L., 2001 [124])............................................30
1.3.4.4. Khả năng đề kháng......................................................................30
1.3.4.5. Khả năng kháng kháng sinh.........................................................31
1.3.4.6. Đặc tính gây bệnh........................................................................32
1.4. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus.............32
1.4.1. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria .................................................................32

1.4.1.1. Cấu tạo kháng nguyên..................................................................32
1.4.1.2. Độc tố - yếu tố độc lực của vi khuẩn .......................................33
1.4.2. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella spp.....................................................33

1.4.2.1. Cấu tạo kháng nguyên..................................................................33
1.4.2.2. Độc tố - yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella spp..............36
1.4.2.3. Plasmid - yếu tố di truyền khả năng sản sinh độc tố ..............38
1.4.3. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. aureus...............................................................39

1.4.3.1. Cấu trúc kháng nguyên.................................................................39
1.4.3.2. Độc tố của S. aureus ....................................................................39


vii

1.5. Gene sản sinh độc tố của vi khuẩn Salmonella spp. và Staphylococcus aureus..44
1.5.1. Gene sản sinh độc tố đường ruột của Salmonella spp..............................................44
1.5.2. Gene sản sinh độc tố đường ruột của Staphylococcus aureus..................................45

1.6. Biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm........................................................49
1.6.1. Giải pháp trước mắt..................................................................................................49

1.6.1.1. Giải pháp trong chăn nuôi (theo VietGap)...................................49
1.6.1.2. Các giải pháp kỹ thuật..................................................................50
* Tăng cường trang thiết bị chẩn đoán nhanh....................................................................51

1.6.1.3. Các giải pháp quản lý...................................................................51
1.6.1.4. Các giải pháp xã hội.....................................................................51
1.6.2. Giải pháp lâu dài.......................................................................................................52

Chương 2......................................................................................................................53
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......53
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.........................................................................53
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................................53
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu.................................................................................................53

- Địa điểm phân tích mẫu: ...........................................................................................53
+ Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên.........................53
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2015.................................................53

2.2. Vật liệu nghiên cứu ..............................................................................................53
2.2.1. Động vật thí nghiệm.................................................................................................53
2.2.2. Các loại môi trường, hóa chất và thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu........53

- Máy móc, dụng cụ: thuộc phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự
sống - Đại học Thái Nguyên. Ngoài ra, các hóa chất và thiết bị dùng cho sinh
học phân tử của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học.......................................54
2.3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................55

2.3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh học của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và
S. aureus trên thịt lợn tươi bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc...........55
- Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung
tâm của một số tỉnh phía Bắc....................................................................................55
- Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã phân lập được......................55
- Xác định tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn đã phân lập được đối với một số loại
kháng sinh ................................................................................................................55


viii

2.3.3. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S.
aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.....................................................55
2.3.4. Xác định gene sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. và S.
aureus phân lập được................................................................................................55

2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................56
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu...............................................................................................56
2.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus
nhiễm trên thịt lợn ....................................................................................................56
2.4.3. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn..........................................59
2.4.4. Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Listeria, Salmonella spp. và S. aureus
đã phân lập được.......................................................................................................59
2.4.5. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và
S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm ........................................................62
2.4.6. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn
Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được...............................................63
2.4.7. Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được..........64
2.4.8. Phương pháp xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn
Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” ................65

2.4.9. Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp.
và S. aureus bằng phương pháp PCR........................................................................66

2.4.9.1. Phương pháp tách ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố
đường ruột..................................................................................................66
2.4.9.2. Phương pháp PCR để nhân gene đích........................................67
2.4.9.3. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose...............................68
2.4.10. Phương pháp đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quả bằng
phần mềm chuyên dụng đối với vi khuẩn S. aureus.................................................69
2.4.11. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch gene seb 534 của vi khuẩn S. aureus............69

2.4.11.1. Phân lập gene wtSEB...................................................................69
2.4.11.2. Thiết kế vector biểu hiện...........................................................70
2.4.11.3. Biểu hiện gene wtSEB.................................................................70
Chủng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường Luria Broth (LB) lỏng có
bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/l (LBA) ở nhiệt độ 37oC, lắc 200
vòng/phút qua đêm. Chuyển 2 % dịch tế bào nuôi cấy qua đêm sang
môi trường LBA, tiếp tục nuôi lắc điều kiện 37oC, 200 vòng/phút đến
khi mật độ tế bào (OD600) đạt khoảng 0,5 đến 0,8. Bổ sung chất cảm
ứng IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1 mM và tiếp tục nuôi lắc 200
vòng/phút ở 28oC để cảm ứng tế bào tổng hợp protein ngoại lai. Sau 5


ix

giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào vi khuẩn được thu lại bằng cách ly tâm
tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. .........................................70
Cặn tế bào được hòa lại trong đệm TE (Tris - HCl 10 mM; EDTA 1
mM) pH8 sao cho OD600nm = 10. Protein tổng số của chủng tái tổ hợp
được kiểm tra trên gel điện di biến tính SDS - PAGE 12,5 %. Sau đó,

chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình
biểu hiện protein tái tổ hợp wtSEB như: nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ
chất cảm ứng, thời gian cảm ứng để tìm ra các điều kiện tối ưu nhất
cho việc sinh tổng hợp protein ngoại lai wtSEB.......................................70
2.4.11.4. Tinh sạch protein wtSEB tái tổ hợp............................................70
2.5. Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................................71
Chương 3......................................................................................................................72
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...........................................................72
3.1. Tình hình tiêu thụ và tỷ lệ nhiễm khuẩn trên thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc.....72
3.1.1. Khảo sát tình hình giết mổ lợn trên địa bàn một số tỉnh phía Bắc...........................72
3.1.2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thịt lợn
bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc....73

Kết quả bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy: .......................................................................74
Tính chung cho thấy: các mẫu thịt lợn được bày bán có tỷ lệ nhiễm Listeria chiếm
13,13 % (tỷ lệ dao động từ 8,57 - 17,98 %). Salmonella spp. chiếm 11,45 % (tỷ
lệ dao động từ 11,43 - 12,36 %) và S. aureus chiếm 76,82 % (tỷ lệ dao động từ
72,37 - 83,15 %). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê Minh Sơn (2003)
[42]........................................................................................................................75
3.2. Tỷ lệ nhiễm Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung
tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây, Vĩnh Phúc................................75
3.2.1. Kết quả tỷ lệ nhiễm Listeria nhiễm trên thịt lợn.......................................................75
3.2.2. Kết quả tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. nhiễm trên thịt lợn.........................................76
3.2.3. Kết quả tỷ lệ nhiễm S. aureus nhiễm trên thịt lợn....................................................77

3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus nhiễm
trên thịt lợn bán tại các chợ ..................................................................................78
3.3.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes nhiễm trên thịt lợn ..........................78
3.3.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. nhiễm trên thịt lợn ..............................79
3.3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus trên thịt lợn ...................................................80

3.4. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus nhiễm
trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu sau bán hàng................................................83


x

3.4.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy
mẫu ...........................................................................................................................83
3.4.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu.....85
3.4.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu.....87

3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus
trên thịt lợn theo mùa ...........................................................................................89
3.5.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes trên thịt lợn theo mùa.........89
3.5.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trên thịt lợn theo mùa .................................93
3.5.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn S. aureus trên thịt lợn theo mùa .......................96

3.6. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes,
Salmonella spp. và S. aureus phân lập được .......................................................99
3.6.1. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes
phân lập được............................................................................................................99
3.6.2. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân
lập được...................................................................................................................100
3.6.3. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập
được........................................................................................................................101

3.7. Thử độc lực của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp. và S.
aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm......................................................102
3.7.1. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được trên

chuột thí nghiệm.....................................................................................................102
3.7.2. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được trên
chuột thí nghiệm.....................................................................................................103
3.7.3. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được trên chuột thí
nghiệm.....................................................................................................................105

3.8. Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của các chủng L.
monocytogenes, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được...........................106
3.8.1. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng L. monocytogenes
phân lập được..........................................................................................................106
3.8.2. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Salmonella spp. phân
lập được ..................................................................................................................107
3.8.3. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng S. aureus phân lập được ...............109

3.9. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella
spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.............................110


xi

3.9.1. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp.
bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”..............................................................110
3.9.2. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn S. aureus bằng
“Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.......................................................................111

3.10. Kết quả xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân lập được bằng
phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính theo sơ đồ của Kauffmann White...................................................................................................................113
3.11. Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của chủng Salmonella
spp. và S. aureus phân lập được..........................................................................114
3.11.1. Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp........114

* Kết quả tách chiết ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố đường ruột .....................114
* Kết quả nhân đoạn gene độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella spp......................115
3.11.2. Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin nhóm B của vi khuẩn S. aureus ...116
* Kết quả tách ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố đường ruột ..............................116
Giếng số 2: ADN mang gene mã hóa của chủng S23......................................................117
Giếng số 3: ADN mang gene mã hóa của chủng S24......................................................117
* Kết quả nhân gene seb từ các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được.......................117
* Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR...................................................................................119
* Phân lập gene wtSEB vào vector đọc trình tự và vector biểu hiện................................120
* Kết quả xác định trình tự gene seb trong vector pJET1.2.............................................121
* Thiết kế vector biểu hiện ..............................................................................................123
* Khảo sát các điều kiện biểu hiện protein wtSEB...........................................................124
* Tinh sạch protein wtSEB tái tổ hợp...............................................................................127

Sản phẩm protein wtSEB này đã được kiểm chứng tính độc ở chuột thí nghiệm (kết
quả không công bố). Kết quả này, lần nữa khẳng định tính độc có mặt ở một số
chủng S. aureus đã phân lập được từ một số mẫu thịt lợn nghiên cứu..............128
3.12. Đề xuất một số biện pháp phòng ngừa.............................................................128
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................130
1. Kết luận...................................................................................................................130
- Đã thiết kế và biểu hiện thành công protein wtSEB tái tổ hợp trong tế bào E. coli
BL21 (DE3). Hàm lượng protein tái tổ hợp được tạo ra là cao nhất khi chủng
được nuôi cảm ứng ở 37oC với nồng độ IPTG là 0,5 mM; sau 5 giờ cảm ứng.
Protein tái tổ hợp wtSEB được tinh sạch thành công bằng sắc ký cột ái lực Ni -


xii

NTA với lượng 10 mg/100 ml môi trường nuôi cấy. Đã tinh sạch thành công
protein tái tổ hợp seb 534 ở dạng tự nhiên. .......................................................131

2. Kiến nghị................................................................................................................131
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.................132
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................133
I. Tài liệu tiếng Việt...................................................................................................133
II. Tài liệu Tiếng Anh.................................................................................................139
III. Tài liệu Internet....................................................................................................148
PHỤ LỤC...................................................................................................................149


xiii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS:

Ammoniumpersulfate

AOAC:

Association of Official Agricultural Chemists

bp:

base pair (cặp base)

C. perfringens:

Clostridium perfringens

DBB:

Denaturing Binding Buffer

DEB:

Denaturing Elution Buffer

ADN:

Acid deoxyribonucleic

dNTPs:

deoxynucleotide triphosphate

E. coli:

Escherichia coli

EDTA:

Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

Epp:

Eppendorf

IPTG:

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB:

Luria and Bertani

MHC II:

Histocompatibility complex class II

MRSA:

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

MSSA:

Methicillin‐ sensitive Staphylococcus aureus

NCBI:

Ngân hàng gen

NĐTP:

Ngộ độc thực phẩm

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PBS:

Phosphate buffer saline

S. aureus:

Staphylococcus aureus

SCC:

Staphylococcal chromosomal cassette

SDS:

Sodium dodecyl sulfate

se:

Staphylococcal enterotoxin

sea:

Staphylococcal enterotoxin A

seb:

Staphylococcal enterotoxin B

sec:

Staphylococcal enterotoxin C

sed:

Staphylococcal enterotoxin D

see:

Staphylococcal enterotoxin E

ses:

Staphylococcal enterotoxin S


xiv

set:

Staphylococcal enterotoxin T

seb 534

Staphylococcal enterotoxin B 534

SMX/TMD:

Sulfamethoxazole – Trimethoprim

RNA:

Ribonucleic Acid

PFGE:

Pulsed-field gel electrophoresis

PGN:

Peptidoglycan

TEMED:

N, N, N’, N’- tetramethylethylenediamine

TRL:

Toll-like receptor

TSST:

Toxic shock syndrome toxin

v/p:

Vòng/phút

VKHK:

Vi khuẩn hiếu khí

UBND:

Ủy ban nhân dân


xv

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ii
MỤC LỤC.....................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................xiii
APS:.............................................................................................................................xiii
AOAC:.........................................................................................................................xiii
bp: xiii
base pair (cặp base).....................................................................................................xiii
C. perfringens:.............................................................................................................xiii
Clostridium perfringens..............................................................................................xiii
DBB:............................................................................................................................xiii
Denaturing Binding Buffer.........................................................................................xiii
DEB:............................................................................................................................xiii
Denaturing Elution Buffer..........................................................................................xiii
ADN:...........................................................................................................................xiii
Acid deoxyribonucleic ...............................................................................................xiii
dNTPs:.........................................................................................................................xiii
deoxynucleotide triphosphate.....................................................................................xiii
E. coli:.........................................................................................................................xiii
Escherichia coli...........................................................................................................xiii
EDTA:.........................................................................................................................xiii
Ethylene Diamine Tetraacetace Acid.........................................................................xiii
Epp:..............................................................................................................................xiii
Eppendorf....................................................................................................................xiii

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside......................................................................xiii
LB: xiii
Luria and Bertani.........................................................................................................xiii
Histocompatibility complex class II...........................................................................xiii
Methicillin‐ sensitive Staphylococcus aureus............................................................xiii
Ngân hàng gen ............................................................................................................xiii
Ngộ độc thực phẩm.....................................................................................................xiii
PCR:............................................................................................................................xiii
Polymerase Chain Reaction........................................................................................xiii


xvi

PBS:.............................................................................................................................xiii
Phosphate buffer saline...............................................................................................xiii
S. aureus:.....................................................................................................................xiii
Staphylococcal chromosomal cassette........................................................................xiii
SDS:.............................................................................................................................xiii
Sodium dodecyl sulfate...............................................................................................xiii
se: xiii
Staphylococcal enterotoxin.........................................................................................xiii
sea: xiii
Staphylococcal enterotoxin A.....................................................................................xiii
seb: xiii
Staphylococcal enterotoxin B.....................................................................................xiii
sec: xiii
Staphylococcal enterotoxin C.....................................................................................xiii
sed: xiii
Staphylococcal enterotoxin D.....................................................................................xiii
see: xiii

Staphylococcal enterotoxin E.....................................................................................xiii
ses: xiii
Staphylococcal enterotoxin S......................................................................................xiii
set: xiv
Staphylococcal enterotoxin T......................................................................................xiv
Staphylococcal enterotoxin B 534..............................................................................xiv
SMX/TMD:.................................................................................................................xiv
Sulfamethoxazole – Trimethoprim.............................................................................xiv
RNA:............................................................................................................................xiv
Ribonucleic Acid.........................................................................................................xiv
Pulsed-field gel electrophoresis..................................................................................xiv
Peptidoglycan..............................................................................................................xiv
TEMED:......................................................................................................................xiv
Toll-like receptor.........................................................................................................xiv
TSST: ..........................................................................................................................xiv
v/p: xiv
Vòng/phút....................................................................................................................xiv


xvii

VKHK:.........................................................................................................................xiv
Vi khuẩn hiếu khí........................................................................................................xiv
UBND:.........................................................................................................................xiv
Ủy ban nhân dân..........................................................................................................xiv
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU...............................................................................xv
DANH MỤC CÁC HÌNH..........................................................................................xxii
MỞ ĐẦU........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................................2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học...........................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn...........................................................................................................2

4. Điểm mới của đề tài...................................................................................................3
Chương 1........................................................................................................................4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................................4
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và
Staphylococcus aureus thế giới và Việt Nam.........................................................4
1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S.
aureus trên thế giới......................................................................................................4
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S.
aureus tại Việt Nam....................................................................................................6

1.2. Ngộ độc thực phẩm do nhiễm Listeria, Salmonella spp., S. aureus và nguyên
nhân gây nhiễm khuẩn vào thịt lợn.......................................................................10
1.2.1. Khái niệm ngộ độc và phân loại tình trạng ngộ độc.................................................10
1.2.2. Ngộ độc thực phẩm do Listeria, Salmonella spp. và Stapylococccus aureus...........10
1.2.3. Nguyên nhân gây nhiễm khuẩn vào thịt...................................................................12

1.3. Đặc điểm sinh vật, hóa học của một số vi khuẩn gây ô nhiễm trên thịt lợn........15
1.3.1. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus..............................15
1.3.2. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Listeria ...................................................20
1.3.3. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella spp........................................23
1.3.4. Đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn Staphylococcus aureus............................28

1.4. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus.............32
1.4.1. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria .................................................................32
1.4.2. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella spp.....................................................33

xviii

1.4.3. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. aureus...............................................................39

1.5. Gene sản sinh độc tố của vi khuẩn Salmonella spp. và Staphylococcus aureus..44
1.5.1. Gene sản sinh độc tố đường ruột của Salmonella spp..............................................44
1.5.2. Gene sản sinh độc tố đường ruột của Staphylococcus aureus..................................45

1.6. Biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm........................................................49
1.6.1. Giải pháp trước mắt..................................................................................................49
* Tăng cường trang thiết bị chẩn đoán nhanh....................................................................51
1.6.2. Giải pháp lâu dài.......................................................................................................52

Chương 2......................................................................................................................53
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......53
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.........................................................................53
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................................53
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu.................................................................................................53

- Địa điểm phân tích mẫu: ...........................................................................................53
+ Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên.........................53
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2015.................................................53

2.2. Vật liệu nghiên cứu ..............................................................................................53
2.2.1. Động vật thí nghiệm.................................................................................................53
2.2.2. Các loại môi trường, hóa chất và thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu........53

- Máy móc, dụng cụ: thuộc phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự
sống - Đại học Thái Nguyên. Ngoài ra, các hóa chất và thiết bị dùng cho sinh

học phân tử của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học.......................................54
2.3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................55
2.3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh học của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và
S. aureus trên thịt lợn tươi bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc...........55
- Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung
tâm của một số tỉnh phía Bắc....................................................................................55
- Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã phân lập được......................55
- Xác định tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn đã phân lập được đối với một số loại
kháng sinh ................................................................................................................55
2.3.3. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S.
aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.....................................................55


xix

2.3.4. Xác định gene sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. và S.
aureus phân lập được................................................................................................55

2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................56
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu...............................................................................................56
2.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus
nhiễm trên thịt lợn ....................................................................................................56
2.4.3. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn..........................................59
2.4.4. Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Listeria, Salmonella spp. và S. aureus
đã phân lập được.......................................................................................................59
2.4.5. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và
S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm ........................................................62
2.4.6. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn
Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được...............................................63

2.4.7. Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được..........64
2.4.8. Phương pháp xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn
Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” ................65
2.4.9. Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp.
và S. aureus bằng phương pháp PCR........................................................................66
2.4.10. Phương pháp đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quả bằng
phần mềm chuyên dụng đối với vi khuẩn S. aureus.................................................69
2.4.11. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch gene seb 534 của vi khuẩn S. aureus............69

2.5. Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................................71
Chương 3......................................................................................................................72
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...........................................................72
3.1. Tình hình tiêu thụ và tỷ lệ nhiễm khuẩn trên thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc.....72
3.1.1. Khảo sát tình hình giết mổ lợn trên địa bàn một số tỉnh phía Bắc...........................72
3.1.2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thịt lợn
bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc....73

Kết quả bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy: .......................................................................74
Tính chung cho thấy: các mẫu thịt lợn được bày bán có tỷ lệ nhiễm Listeria chiếm
13,13 % (tỷ lệ dao động từ 8,57 - 17,98 %). Salmonella spp. chiếm 11,45 % (tỷ
lệ dao động từ 11,43 - 12,36 %) và S. aureus chiếm 76,82 % (tỷ lệ dao động từ
72,37 - 83,15 %). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê Minh Sơn (2003)
[42]........................................................................................................................75


xx

3.2. Tỷ lệ nhiễm Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung
tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây, Vĩnh Phúc................................75
3.2.1. Kết quả tỷ lệ nhiễm Listeria nhiễm trên thịt lợn.......................................................75

3.2.2. Kết quả tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. nhiễm trên thịt lợn.........................................76
3.2.3. Kết quả tỷ lệ nhiễm S. aureus nhiễm trên thịt lợn....................................................77

3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus nhiễm
trên thịt lợn bán tại các chợ ..................................................................................78
3.3.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes nhiễm trên thịt lợn ..........................78
3.3.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. nhiễm trên thịt lợn ..............................79
3.3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus trên thịt lợn ...................................................80

3.4. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus nhiễm
trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu sau bán hàng................................................83
3.4.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy
mẫu ...........................................................................................................................83
3.4.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu.....85
3.4.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu.....87

3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus
trên thịt lợn theo mùa ...........................................................................................89
3.5.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes trên thịt lợn theo mùa.........89
3.5.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trên thịt lợn theo mùa .................................93
3.5.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn S. aureus trên thịt lợn theo mùa .......................96

3.6. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes,
Salmonella spp. và S. aureus phân lập được .......................................................99
3.6.1. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes
phân lập được............................................................................................................99
3.6.2. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân
lập được...................................................................................................................100
3.6.3. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập
được........................................................................................................................101

3.7. Thử độc lực của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp. và S.
aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm......................................................102
3.7.1. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được trên
chuột thí nghiệm.....................................................................................................102


xxi

3.7.2. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được trên
chuột thí nghiệm.....................................................................................................103
3.7.3. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được trên chuột thí
nghiệm.....................................................................................................................105

3.8. Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của các chủng L.
monocytogenes, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được...........................106
3.8.1. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng L. monocytogenes
phân lập được..........................................................................................................106
3.8.2. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Salmonella spp. phân
lập được ..................................................................................................................107
3.8.3. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng S. aureus phân lập được ...............109

3.9. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella
spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.............................110
3.9.1. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp.
bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”..............................................................110
3.9.2. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn S. aureus bằng
“Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”.......................................................................111

3.10. Kết quả xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân lập được bằng

phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính theo sơ đồ của Kauffmann White...................................................................................................................113
3.11. Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của chủng Salmonella
spp. và S. aureus phân lập được..........................................................................114
3.11.1. Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp........114
* Kết quả tách chiết ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố đường ruột .....................114
* Kết quả nhân đoạn gene độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella spp......................115
3.11.2. Gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin nhóm B của vi khuẩn S. aureus ...116
* Kết quả tách ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố đường ruột ..............................116
Giếng số 2: ADN mang gene mã hóa của chủng S23......................................................117
Giếng số 3: ADN mang gene mã hóa của chủng S24......................................................117
* Kết quả nhân gene seb từ các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được.......................117
* Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR...................................................................................119
* Phân lập gene wtSEB vào vector đọc trình tự và vector biểu hiện................................120
* Kết quả xác định trình tự gene seb trong vector pJET1.2.............................................121
* Thiết kế vector biểu hiện ..............................................................................................123


xxii

* Khảo sát các điều kiện biểu hiện protein wtSEB...........................................................124
* Tinh sạch protein wtSEB tái tổ hợp...............................................................................127

Sản phẩm protein wtSEB này đã được kiểm chứng tính độc ở chuột thí nghiệm (kết
quả không công bố). Kết quả này, lần nữa khẳng định tính độc có mặt ở một số
chủng S. aureus đã phân lập được từ một số mẫu thịt lợn nghiên cứu..............128
3.12. Đề xuất một số biện pháp phòng ngừa.............................................................128
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................130
1. Kết luận...................................................................................................................130
- Đã thiết kế và biểu hiện thành công protein wtSEB tái tổ hợp trong tế bào E. coli
BL21 (DE3). Hàm lượng protein tái tổ hợp được tạo ra là cao nhất khi chủng

được nuôi cảm ứng ở 37oC với nồng độ IPTG là 0,5 mM; sau 5 giờ cảm ứng.
Protein tái tổ hợp wtSEB được tinh sạch thành công bằng sắc ký cột ái lực Ni NTA với lượng 10 mg/100 ml môi trường nuôi cấy. Đã tinh sạch thành công
protein tái tổ hợp seb 534 ở dạng tự nhiên. .......................................................131
2. Kiến nghị................................................................................................................131
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.................132
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................133
I. Tài liệu tiếng Việt...................................................................................................133
II. Tài liệu Tiếng Anh.................................................................................................139
III. Tài liệu Internet....................................................................................................148
PHỤ LỤC...................................................................................................................149

DANH MỤC CÁC HÌNH
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ii
MỤC LỤC.....................................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................xiii
APS:.............................................................................................................................xiii
AOAC:.........................................................................................................................xiii
bp: xiii


xxiii

base pair (cặp base).....................................................................................................xiii
C. perfringens:.............................................................................................................xiii
Clostridium perfringens..............................................................................................xiii
DBB:............................................................................................................................xiii
Denaturing Binding Buffer.........................................................................................xiii
DEB:............................................................................................................................xiii
Denaturing Elution Buffer..........................................................................................xiii
ADN:...........................................................................................................................xiii

Acid deoxyribonucleic ...............................................................................................xiii
dNTPs:.........................................................................................................................xiii
deoxynucleotide triphosphate.....................................................................................xiii
E. coli:.........................................................................................................................xiii
Escherichia coli...........................................................................................................xiii
EDTA:.........................................................................................................................xiii
Ethylene Diamine Tetraacetace Acid.........................................................................xiii
Epp:..............................................................................................................................xiii
Eppendorf....................................................................................................................xiii
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside......................................................................xiii
LB: xiii
Luria and Bertani.........................................................................................................xiii
Histocompatibility complex class II...........................................................................xiii
Methicillin‐ sensitive Staphylococcus aureus............................................................xiii
Ngân hàng gen ............................................................................................................xiii
Ngộ độc thực phẩm.....................................................................................................xiii
PCR:............................................................................................................................xiii
Polymerase Chain Reaction........................................................................................xiii
PBS:.............................................................................................................................xiii
Phosphate buffer saline...............................................................................................xiii
S. aureus:.....................................................................................................................xiii
Staphylococcal chromosomal cassette........................................................................xiii
SDS:.............................................................................................................................xiii
Sodium dodecyl sulfate...............................................................................................xiii
se: xiii
Staphylococcal enterotoxin.........................................................................................xiii