đương-quy-edit

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM

********

Công nghệ sinh học thực vật
Đề tài
KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY TẠO RỄ IN VITRO CỦA
CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN
(ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA)

Giáo viên hướng dẫn: TS Trịnh Ngọc Nam
Lớp: DHSH10

Thành phố Hồ Chí Minh, 14 tháng 3 năm 2017

Page 1


TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC-THỰC PHẨM
MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

DANH SÁCH NHÓM
Stt

Họ Và Tên

MSSV

1

Nguyễn Đỗ Uyên

14127641

2

Nguyễn Lê Anh Thương

14061111

3

Trần Thị Minh Trang

14013101

4

Nguyễn Thị Thu Thủy

14057121

Page 2


LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian học tập tại trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM, nhóm

em xin chân thành cảm ơn trường, khoa đã tận tình giảng dạy. Bài tiểu luận là cơ
sở để nhóm em vận dụng kiến thức đã học, từ đó rút ra những bài học kinh
nghiệm vô giá. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, một lần nữa nhóm em xin
chân thành cảm ơn thầy Trịnh Ngọc Nam đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn nhóm
em rất nhiều để nhóm em có thể hoàn thành bài tiểu luận.
Với trình độ, khả năng còn hạn chế và kinh nghiệm làm tiểu luận chưa
nhiều, chắc chắn nhóm sẽ có những thiếu sót nhất định trong bài tiểu luận.
Nhóm em kính mong nhận được sự chỉ bảo của thầy.
Cuối cũng nhóm em xin chúc thầy và gia đình có nhiều thành công và sức
khỏe trong cuộc sống.

Page 3


LỜI NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................

.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
.................................................................................................................
Page 4


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU
Cây Đương quy nhật bản (Angelica acutiloba (Sieb. & Zucc.) Kitagawa) là cây thuốc
quí, đầu vị và không thể thiếu trong y học cổ truyền đối với việc điều trị bệnh phụ nữ
và bồi bổ khí huyết, đồng thời còn là thuốc trị bệnh như thuốc chữa thiếu máu, đau
đầu, kháng viêm, tăng cường miễn dịch. Dược tính của cây Đương quy đến từ bộ
phận rễ nơi có chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp, bao gồm 47 hợp chất khác nhau,
trong đó ligustilide (22,8%) và butylidenephthalide (19,5%) là hai hợp chất chính.
Rễ cây Đương quy có chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp quan trọng giúp giảm đau,
điều hoà nội tiết, kháng viêm, tăng cường miễn dịch, bồi bổ khí huyết.
Nhu cầu sử dụng và chiết xuất các hợp chất thứ cấp từ các loại thảo dược (như Nhân
sâm, Đương quy) ngày càng tăng theo thời gian, nhưng để thu hoạch rễ cây Đương
quy cần phải mất từ 2 – 3 năm, nhân công lao động và chi phí chăm sóc trên đồng
ruộng cũng làm tăng giá thành sản phẩm lên rất cao (Fukuda và cs, 2009).

Cây Đương quy nhật bản đã được du nhập vào trồng ở Việt Nam với diện tích mở
rộng từ Tây Bắc đến khu vực sông Hồng gần Hà Nội . Cây ưa khí hậu ẩm mát, vì vậy
việc gieo hạt và sinh trưởng của cây cần trùng với thời gian có nhiệt độ thấp trong
năm. Thời gian gieo hạt ở Việt Nam tốt nhất là đầu tháng 10. Việc gieo hạt vào thời
điểm muộn hơn (tháng 11 đến tháng 2) sẽ dẫn đến tỷ lệ nẩy mầm giảm đáng kể do
nhiệt độ giảm mạnh ở thời điểm này. Ngoài ra, hạt Đương quy dễ mất khả năng nảy
mầm khiến việc sử dụng hạt để nhân giống gặp nhiều khó khăn. Nhu cầu rễ cây
Đương Quy rất lớn trên thế giới vì vậy cần tìm phương pháp nhân nhanh hữu hiệu
cây Đương quy mà vẫn đảm bảo sự đồng nhất về mặt di truyền.
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật từ khi ra đời đã đem đến khả năng làm
tăng hệ số nhân giống của thực vật chỉ trong một thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi
cấy các cơ quan hay mô, tế bào thực vật đã giúp các nhà nghiên cứu thu nhận được
các hợp chất thứ cấp có giá trị trong y dược với hiệu suất cao khi không thể sản xuất
Page 5


từ tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học. Với mục đích như vậy,
để tạo nguồn sản phẩm sạch, tinh khiết nhằm khai thác được công dụng chữa bệnh
và phục vụ cho việc bào chế dược phẩm từ cây Đương quy, giảm giá thành sản
phẩm. sau đây nhóm chúng em sẽ giúp thầy và các bạn hiểu rõ hơn về cách nuôi cấy
invitro cây Đương Quy qua bài báo cáo này.

NỘI DUNG
1. Tổng quát
1.1.
1.1.1.

Giới thiệu về cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa)
Phân loại

Theo Nguyễn Bá (2007), cây Đương quy Nhật Bản được phân loại như sau:
Giới : Plantae

(Thực vật)

Ngành : Magnoliophyta (Thực vật có hoa)
Lớp

: Magnoliopsida (Ngọc lan)

Bộ

: Apiales

(Hoa tán)

Họ

: Apiaceae

(Hoa tán)

Chi

: Angelica

(Bạch chỉ)

Tên khoa học: Angelica acutiloba
ên tiếng Việt

Kitaga

: Đương quy Nhật Bản, Đông Đương Quy

Tên gọi khác

: Yamato Touki (Nhật Bản); Ribendanggui (Trung Quốc)

Phân bố

: được tìm thấy ở các đảo Honshu và Shikoku (Nhật Bản)

Số lượng nhiễm sắc thể: 2n = 22
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) là loài thực vật sống lâu năm, thân
thảo lớn, cây cao 40 – 80 cm, có thân hình trụ, rãnh dọc màu tím, 5 – 7 ngấn, các
ngấn đều có thể mọc thành mầm cành con, hình thành cá thể nhiều cành nhánh.
Thân chia thành thân sinh dưỡng và thân hoa. Thân sinh dưỡng chỉ tồn tại ở thời kì
sinh trưởng sinh dưỡng. Thân rất ngắn, chưa có sự phân hoá của các ngấn thân
cũng chưa phân cọng rõ ràng. Lá mọc so le, xẻ lông chim 3 lần; cuống dài 10 – 30
cm, có bẹ ngắn, dạng máng ôm lấy thân; lá chét phân thùy hình mác dài 2 – 7 cm,
rộng 1 – 3 cm, phía dưới có cuống ngắn hoặc không cuống, các thùy lại phân nhỏ,
gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có răng to sắc, lá ở phía ngọn tiêu giảm. Rễ có mùi
Page 6


hương đặc biệt, rễ 3 năm tuổi được thu hoạch vào mùa thu và mùa đông và được
đem phơi hoặc sấy khô để bảo quản. Cây cho hoa và hoa nở 1 lần từ tháng 6 – 8
hàng năm, cụm hoa tán kép gồm 25 – 40 tán nhỏ dài ngắn không đều; tổng bao và

tiểu bao giống nhau, có lá bắc dạng sợi, hoa nhỏ màu trắng hay lục nhạt, 5 cánh
lõm ở đầu, 5 nhị, bầu hình chóp ngược, có gân lồi, cuống dài. Quả bế đôi hơi
dẹt, có cạnh và gân lồi, gân ở mép rộng dạng cánh, rìa màu tím nhạt (Đỗ Huy
Bích và cs, 2004).
1.1.3.

Đặc điểm phân bố, sinh thái

Chi Angelica phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu và New Zealand. Việt Nam
đã nhập giống cây Đương quy Trung Quốc Angelica sinensis (Oliv.) (Diels.) (1960),
Đương quy Triều Tiên Angelica uchyamana Yabe (1978) và gần đây là Đương quy
Nhật Bản Angelica acutiloba Kit. (1996). Giống cây Đương quy Trung Quốc hiện
không còn, hai giống còn lại vẫn đang được trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung
quanh Hà Nội (Đỗ Huy Bích và cs 2003). Cây Đương quy ưa khí hậu ẩm mát, đến
mùa đông toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi, phần củ dưới mặt đất chịu đựng được
băng tuyết và sẽ mọc lại vào mùa xuân năm sau. Cây Đương quy trồng ở Việt Nam
thường cũng phải lựa chọn thời vụ, sao cho mùa gieo hạt và sinh trưởng của cây
trùng với thời gian có nhiệt độ thấp trong năm (Phạm Văn Ý, 2000).
1.1.4.
1.1.4.1.

Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Thành phần tinh dầu

Ở rễ có ligustilide, n – butylphtalide, n – butylidenphtalide, cnidilide, p – cymen.
Trong lá cây Đương quy Nhật Bản trồng ở Thanh Trì (Hà Nội), tinh dầu có chứa
ligustilid, γ – terpinen, mycren, β – ocimen, limonen, caryophylen oxyde. Trong lá
cây Đương quy Nhật Bản trồng ở Thái Nguyên chứa tinh dầu với thành phần chính là
p. cymen, γ – terpinen (Fukuda và cs, 2009). Tinh dầu trong cây Đương quy Nhật
Bản có tác dụng ức chế sự co tử cung, làm giảm sự căng tử cung, từ đó hạn chế cơn

đau bụng do kinh nguyệt. Ligustilide ở rễ có tác dụng chống hen, chống co thắt khí
quản (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).
1.1.4.2.

Glucid

Chủ yếu là glucose, sucrose (40%) và có polysaccharide (khoảng 8%) có tác dụng
điều tiết hệ miễn dịch. Thành phần polysaccharide của cây Đương quy Nhật Bản có
độ an toàn cao, hầu như không độc, tăng cường khả năng miễn dịch của hạch,

Page 7


chống lại sự phát triển của tế bào ung thư, nâng cao số lượng tế bào lympho T
(Kumazawa và cs, 1982).

1.1.4.3.

Các loại acid hữu cơ

Các nghiên cứu cho thấy trong cây Đương quy Nhật Bản có chứa acid ferulic có hoạt
tính chống oxi hoá rất mạnh, có thể loại hết gốc tự do, điều tiết cơ chế sinh lý cơ thể
con người, hạn chế sự tạo dung môi của phần gốc tự do. Mặt khác, acid ferulic còn có
thể hạn chế kết tụ tiểu cầu máu, hạn chế acid amin gốc –OH, hạn chế nguy cơ tổn hại
gan đồng thời phòng tránh xơ cứng động mạch (Lê Kim Loan và cs,1998; Nguyễn Gia
Chấn và cs, 1998).
1.1.4.4.

Một số thành phần khác

Trong cây Đương quy Nhật Bản chứa hơn 23 nguyên tố vô cơ, trong đó có 16 loại
cần thiết cho cơ thể con người. Tuy nhiên, do vùng đất trồng khác nhau, hàm lượng
nguyên tố vô cơ cũng có sự khác nhau. Ngoài ra còn có coumarin như umbeliferon,
scopoletin, xanthotoxin, isopimpinelin, bergapten; 17 loại acid amin trong đó có 7
loại mà cơ thể con người không tự tổng hợp được; polyacetylen như falcarinol,
falcarindiol, falcarinolon và các hợp chất sterol (Nguyễn Gia Chấn và cs,1998).
1.1.5.
•
•

Tính vị và công dụng dược lý
Tính vị: vị ngọt, hơi đắng, hơi cay, mùi thơm, tính ấm.
Công dụng dược lý:

Cây Đương quy Nhật Bản cung cấp một vị thuốc dùng rất phổ biến trong y học
phương đông và là vị thuốc đầu vị trong thuốc chữa bệnh phụ nữ, bồi bổ cơ thể và trị
bệnh thiếu máu, suy tim, mệt mỏi, đau đầu, lưng, ngực và bụng. Ngoài ra, cây Đương
quy còn được dùng làm thuốc giảm đau, chống co giật, làm ra mồ hôi, kích thích ăn
ngon. Các hợp chất thứ cấp trong cây Đương quy Nhật Bản di thực trồng ở Việt
Nam có hoạt tính trên chức năng nội tiết sinh dục kiểu oestrogen và progesteron
yếu. Rễ và hạt gây tăng trương lực và biên độ co bóp tử cung. Rễ có tác dụng tăng
lực, tăng sức đề kháng với ammoni clorid, chống viêm cấp tính và mãn tính; có tác
Page 8


dụng gây trấn tĩnh, giảm đau đói, giải nhiệt, chống viêm, làm giảm khả năng đông
máu; điều kinh, nhuận tràng; và kích thích miễn dịch, gây hoạt hoá tế bào lymphô và
T, làm tăng sản sinh kháng thể. Cây Đương quy Nhật Bản và cây Nhân sâm, được
thử nghiệm dưới dạng cao chiết với nước nóng, thể hiện hoạt tính điều hoà miễn
dịch. Độc tính cấp tính của rễ và hạt Đương quy rất thấp và rễ có độc tính cấp tính

thấp hơn so với hạt. (Đỗ Huy Bích và cs, 2004).

2. Cách thực hiện
2.1.Vật liệu
2.1.1. Thu mẫu ban đầu
Nguồn mẫu ban đầu là cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa) nuôi
cấy in vitro được nhân giống từ hạt do Trung tâm Nghiên cứu Sức khỏe, Môi trường
và Đồng ruộng .
Ban đầu, nuôi cấy invitro hạt giống cây Đương Quy Nhật Bản cho đến khi hạt nảy
mầm. Sau khi hạt Đương quy Nhật Bản nẩy mầm trong ống nghiệm, cây con được
nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962)
vitamin Morel (Morel và Wetmore, 1951), bổ sung 30 g l-1 sucrose, CĐHSTTV là 2
mg l-1 BA và 0,2 mg l-1 IBA, 8 g/l agar. pH của môi trường trước khi khử trùng là
5,8. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 25 phút. Sau đó, chồi
được tách ra thành từng chồi đơn và nuôi cấy trong môi trường có thành phần khoáng
MS, vitamin Morel, bổ sung 30 g l-1sucrose, 8 mg l-1 agar (không có CĐHSTTV)
trong 4 tuần. Các chồi được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, ở nhiệt
độ 24 + 2 oC và cường độ ánh sang 50 µmol m-2 s-1.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Nơi tiến hành thí nghiệm: Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt
đới.
1.

Thiết bị

- Giàn nuôi cấy gắn bóng đèn (1,4 m x 0,6m)
- Bóng đèn huỳnh quang 1,2 m, công suất 40 w (công ty Điện Quang thành phố
Hồ Chí Minh).
- Nồi hấp Hirayama, model HV – 85 (Hirayama Manufacturing Co., Nhật Bản).
Page 9

- Tủ cấy vô trùng, model MV9/91 (ADS Laminaire Co., Pháp).
- Máy đo pH hiệu Orion (Orion Research, Inc., Mỹ).
- Cân phân tích, model TE1502S (d = 10 mg) và TE214S (d = 0,1 mg) (Công ty
Satorius, AG Göttingen, Đức).
- Tủ sấy Sanyo, model MOV – 212 (Sanyo Electric Co. Ltd., Nhật Bản).
- Kính hiển vi Nikkon Eclipe 80i (Nikkon Co., Nhật Bản).
2.

Dụng cụ

- Bình tam giác (V = 350 ml) và bình hình trụ (V = 375 ml) dùng trong cấy
chuyền tạo số lượng mẫu cấy ban đầu cho thí nghiệm.
- Bình thủy tinh (dạng chai nước biển) (V = 130 ml) dùng để nuôi cấy mẫu thí
nghiệm.
- Ống đong dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml (Isolab, Đức).
- Đèn cồn, bình cồn cắm kẹp cấy, dao cấy, khăn lau, bình tia.
2.1.3. Một số hóa chất dùng trong thí nghiệm
o
o
- Cồn 96 , 70 .
- Javel (Công ty Vân Phương, Thành phố Hồ Chí Minh)
- Thuốc nhuộm 2 màu đỏ carmin và xanh iod.
- Acid acetic, nước cất.
- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm NAA, IBA, Kinetin, TDZ, BA và
glucose (Công ty Duchefa Biochemie, Hà Lan).
- Sucrose (Công ty Cổ phần Đường Biên Hoà, Đồng Nai), .
2.1.4. Giá thể và môi trường nuôi cấy
- Giá thể: Agar (Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh).

- Môi trường nuôi cấy: khoáng MS (Murashige and Skoog, 1962), vitamin Morel
(Morel và Wetmore, 1951), khoáng và vitamin Gamborg B5 (Gamborg và cs,
1968) (Công ty Duchefa Biochemie, Hà Lan).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật
đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương
quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro
2.2.1.1. Thí nghiệm 1a: Mẫu cấy phiến lá
1.Vật liệu

Page 10


Mẫu cấy xuất phát từ chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS có bổ
sung 30 g l-1 sucrose. Mỗi mẫu là 1 phiến lá (lá thứ 2 hoặc thứ 3 tính từ chồi ngọn
xuống) được cắt thành 3 phần, rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương trên mỗi phần
(Hình 2.1). Mẫu cấy phiến lá có trọng lượng tươi trung bình là 124,75 +20 mg.

Hình 2.1. Chồi và mẫu cấy phiến lá ban đầu
2.Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm có 2 yếu tố:
-1
-Yếu tố A là auxin, có 8 mức độ: NAA 2, 4, 6 hoặc 8 mg l
-1
hoặc 8 mg l
-1
-Yếu tố B là cytokinin, có 2 mức độ: kinetin 0 hoặc 1 mg l

Page 11

hoặc IBA 2, 4, 6


Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm1a

Số thứ tự

Nghiệm

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

thức X
N8K0
N8K1
N6K0
N6K1

N4K0
N4K1
N2K0
N2K1
I8K0
I8K1
I6K0
I6K1
I4K0
I4K1
I2K0

16

I2K1

Auxin
NAA mg l-1
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
0
0

0
0
0
0

IBA mg l-1
0
0
0
0
0
0
0
0
8
8
6
6
4
4
2

Cytokinin
Kinetin mg l-1
0
1
0
1
0
1

0
1
0
1
0
1
0
1
0

2

1

x
Ghi chú: N hoặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện
-1
cho nồng độ (2,4, 6 hoặc 8 mg l ), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện
-1
cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l )

3.Điều kiện thí nghiệm
-Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l

-1

-1
sucrose,8 g l

o

agar. Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121 C, 1 atm trong
thời gian 20 phút.


-Bình nuôi cấy dạng nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường.
-Thí nghiệm có 16 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 bình, được lặp lại 3 lần, mỗi
bình chứa 1 mẫu cấy là 1 phiến lá. Tổng số mẫu cấy là 144 mẫu
o
-Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 C, độ ẩm 65 + 5 %.
-Thời gian thí nghiệm: 42 ngày.

Hình 2.2. Mẫu cấy phiến lá trong bình


4.Chỉ tiêu theo dõi
-Tỷ lệ mẫu chết (%)
-Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
-Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)
-Số rễ/mẫu
-Chiều dài rễ/mẫu (mm)
-Trọng lượng tươi mẫu (mg)
-Trọng lượng khô mẫu (mg)
2.2.1.2.Thí nghiệm 1b: Mẫu cấy cuống lá
1.Vật liệu
Mẫu cấy xuất phát từ chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS có bổ
sung sucrose 30 g l-1. Mỗi mẫu là 1 cuống lá (lá thứ 2 hoặc thứ 3 tính từ chồi ngọn
xuống) được cắt thành 3 phần, rạch tạo 6 vết thương trên mỗi phần (Hình2.3). Mẫu cấy
cuống lá có trọng lượng tươi trung bình là 41,63 + 10 mg.

Hình 2.3. Mẫu cấy cuống lá ban đầu

2.Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm có 2 yếu tố:
-1
-Yếu tố A: Có 8 mức độ auxin: NAA 2, 4, 6 hoặc 8 mg l hoặc IBA 2, 4, 6 hoặc
-1
8 mg l
-

-1
Yếu tố B: Có 2 mức độ cytokinin: kinetin 0 hoặc 1 mg l .

Bảng 2.2.
Số thứ tự

Bố trí thí nghiệm 1b

Nghiệm

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15

thức X
N8K0
N8K1
N6K0
N6K1
N4K0
N4K1
N2K0
N2K1
I8K0
I8K1
I6K0
I6K1
I4K0
I4K1
I2K0

16

I2K1

Auxin
NAA mg l-1
8

8
6
6
4
4
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0

IBA mg l-1
0
0
0
0
0
0
0
0
8
8
6
6
4

4
2

Cytokinin
Kinetin mg l-1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0

2

1

x
Ghi chú: N hoặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện
-1
cho nồng độ (2,4, 6 hoặc 8 mg l ), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện
-1

cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l ).

3.Điều kiện thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1 sucrose,
8 g l-1 agar. Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121 oC, 1 atm
trong thời gian 20 phút.
- Bình nuôi cấy dạng chai nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường.


-Thí nghiệm có 16 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 bình, được lặp lại 3 lần, mỗi
bình chứa 1 mẫu cấy là 1 cuống lá. Tổng số mẫu cấy là 144 mẫu.
-Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 oC, độ ẩm 65 + 5 %
-Thời gian thí nghiệm: 42 ngày.

Hình 2.4. Mẫu cấy cuống lá trong bình


4.Chỉ tiêu theo dõi
-Tỷ lệ mẫu chết (%)
-Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
-Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)
-Số rễ/mẫu
-Chiều dài rễ/mẫu (mm)
-Trọng lượng tươi mẫu (mg)
-Trọng lượng khô mẫu (mg)
2.2.2.

Thí nghiệm 2: Sự phát sinh rễ từ mẫu cấy phiến lá và cuống lá ở các vị

trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản in vitro dưới sự ảnh hưởng của

thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy
2.2.2.1.

Thí nghiệm 2a: Mẫu cấy phiến lá

1.Vật liệu
Mẫu cấy xuất phát từ chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS có bổ
-1
sung 30 g l sucrose. Mỗi mẫu là 1 phiến lá của lá thứ 2, thứ 3 hoặc thứ 4 tính từ chồi
ngọn xuống được cắt thành 3 phần, rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương trên mỗi phần
(Hình 2.1).
2.Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm kế thừa kết quả của thí nghiệm trước, môi trường thí nghiệm có bổ
-1
-1
-1
-1
sung 30 mg l sucrose, 8 mg l agar, 6 mg l NAA và 1 mg l
kinetin.
Thí nghiệm 2 yếu tố:
-Yếu tố A là thành phần môi trường, có 2 mức độ: khoáng MS và Vitamin Morel hoặc
khoáng B5 và vitamin B5.
-Yếu tố B là vị trí mẫu, có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4 tính từ chồi ngọn xuống


Số thứ tự Tên nghiệm
1
2
3
4

5
6

thứcX
M2
M3
M4
B2
B3
B4

Thành phần môi trường
Khoáng
Vitamin
MS
MS
MS
B5
B5
B5

Morel
Morel
Morel
B5
B5
B5

Vị trí lá
2

3
4
2
3
4

x
Ghi chú: M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS, vitamin Morel hoặc khoáng B5,
vitamin B5, các số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4.

3.Điều kiện thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1 sucrose,8
g l-1 agar. Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm
trong thời gian 20 phút.
-Bình nuôi cấy dạng chai nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường.
-Thí nghiệm có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 bình, được lặp lại 3 lần, mỗi
bình chứa 1 mẫu cấy là 1 phiến lá. Tổng số mẫu cấy là 90 mẫu.
-Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 oC, độ ẩm 65 + 5 %
-Thời gian thí nghiệm: 42 ngày
4.Chỉ tiêu theo dõi
-Tỷ lệ mẫu chết (%)
-Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
-Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)
-Số rễ/mẫu
-Chiều dài rễ/mẫu (mm)
-Trọng lượng tươi rễ/mẫu (mg)
-Trọng lượng khô rễ/mẫu (mg)
-Trọng lượng tươi mẫu (mg)
-Trọng lượng khô mẫu (mg)
-TLT rễ/TLT mẫu (%)

-TLK rễ/TLK mẫu (%)
- (%) chất

2.2.2.2. Thí nghiệm 2b: Mẫu cấy cuống lá


Mẫu cấy xuất phát từ chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS có bổ
sung 30 g l-1 sucrose. Mỗi mẫu là 1 cuống lá của lá thứ 2, thứ 3 hoặc thứ 4 tính từ
chồi ngọn xuống được cắt thành 3 phần, rạch 6 đường tạo thành 6 vết thương trên
mỗi phần (Hình 2.3).
1.Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm kế thừa kết quả của thí nghiệm trước, môi trường thí nghiệm có bổ sung
30 mg l-1 sucrose, 8 mg l-1 agar, 6 mg l-1 NAA và 1 mg l-1 kinetin.
=>Thí nghiệm 2 yếu tố:
-Yếu tố A là thành phần môi trường, có 2 mức độ: khoáng MS và Vitamin Morel
hoặc khoáng B5 và vitamin B5.
-Yếu tố B là vị trí mẫu, có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4 tính từ chồi ngọn xuống
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm 2b
Số thứ tự

Tên
nghiệm

Thành phần môi trường
Khoáng
Vitamin

Vị trí lá

thứcX

1
M2
MS
Morel
2
2
M3
MS
Morel
3
3
M4
MS
Morel
4
4
B2
B5
B5
2
5
B3
B5
B5
3
6
B4
B5
B5
4

Ghi chú: xM hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS, vitamin Morel hoặc khoáng
B5, vitamin B5, các số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4.

2.Điều kiện thí nghiệm
-Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1 sucrose,8
g l-1 agar. Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm
trong thời gian 20 phút. Bình nuôi cấy dạng chai nước biển (V = 130 ml) chứa 18
ml môi trường.
-Thí nghiệm có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 bình, được lặp lại 3 lần, mỗi
bình chứa 1 mẫu cấy là 1 cuống lá. Tổng số mẫu cấy là 90 mẫu.
-Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 oC, độ ẩm 65 + 5 %.
-Thời gian thí nghiệm: 42 ngày.
3.Chỉ tiêu theo dõi
-

Tỷ lệ mẫu chết (%)


-

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)

-

Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)

-

Số rễ/mẫu

-

Chiều dài rễ/mẫu (mm)

-

Trọng lượng tươi rễ/mẫu (mg)

-

Trọng lượng khô rễ/mẫu (mg)

-

Trọng lượng tươi mẫu (mg)

-

Trọng lượng khô mẫu (mg)

-

TLT rễ/TLT mẫu (%)

-

TLK rễ/TLK mẫu (%)

-

(%) chất khô rễ

2.3.

Phương pháp tính số liệu

2.3.1. Tỷ lệ mẫu chết (%)
Số mẫu chết được đếm trên mỗi nghiệm thức ở mỗi lần lặp lại vào ngày kết thúc thí
nghiệm và tính trung bình cho mỗi lần lặp lại theo công thức:
Tỷ lệ mẫu chết(%) = ∑ Số mẫu chết x100
Số mẫu cấy

(1)

2.3.2. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Số mẫu tạo mô sẹo được xác định dưới kính lúp và đếm trên mỗi nghiệm thức ở mỗi
lần lặp lại vào ngày kết thúc thí nghiệm và tính trung bình cho mỗi lần lặp lại theo công
thức:
∑ Số mẫu tạo mô sẹo
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) =

x100
Số mẫu cấy

(2


2.3.3. Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)
Số mẫu tạo rễ (rễ có độ dài tối thiểu > 3mm) được đếm trên mỗi nghiệm thức vào
ngày kết thúc thí nghiệm và được tính theo công thức:

Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = ∑ Số mẫu tạo rễ x100
Số mẫu cấy

(3)

2.3.4. Số rễ/mẫu
Số rễ (rễ dài từ 3 mm trở lên) đếm được trên từng nghiệm thức vào ngày kết thúc thí
nghiệm và được tính theo công thức:
Số rễ/mẫu = ∑ Số rễ trên từng chai

(4)

Số mẫu cấy

2.3.5. Chiều dài rễ/mẫu ( mm)
Rễ dài nhất (rễ dài từ 3 mm trở lên) được đo ở mỗi mẫu của nghiệm thức vào ngày kết
thúc thí nghiệm và tính theo công thức:
Chiều dài rễ/mẫu = ∑ Chiều dài rễ dài nhất
Số mẫu cấy

(5)

2.3.6. Trọng lượng tươi rễ/mẫu (mg)
Tất cả rễ (rễ dài từ 3 mm trở lên) trong từng bình được cắt ra khỏi mẫu vào ngày kết
thúc thí nghiệm và cân bằng cân phân tích TE214S và tính theo công thức:
(6)
TLT rễ = ∑ TLT rễ của mỗi nghiệm thức
Số rễ cây

2.3.7. Trọng lượng tươi mẫu (mg)

Mẫu trong từng chai được cân bằng cân phân tích TE214S vào ngày kết thúc thí
nghiệm và tính theo công thức:
∑ TLT mẫu của mỗi nghiệm thức
TLT mẫu =
Số mẫu cấy

(7)


2.3.8.

Trọng lượng khô rễ/mẫu (mg)

Rễ được sấy ở 80oC trong tủ sấy Sanyo 72 giờ, sau đó để ổn định trong bình thuỷ tinh
hút ẩm 2 giờ và đem cân trọng lượng khô bằng cân phân tích TE214S và tính theo
công thức:
TLK rễ = ∑ TLK rễ của mỗi nghiệm thức
Số mẫu cấy

(8)

2.3.9. Trọng lượng khô mẫu (mg)
Mẫu được sấy ở 80oC trong tủ sấy Sanyo 72 giờ, sau đó để ổn định trong bình thuỷ
tinh hút ẩm 2 giờ và đem cân trọng lượng khô. Mẫu trong từng chai được cân bằng
cân phân tích TE214S và được tính theo công thức:
TLK mẫu = ∑ TLK mẫu của mỗi nghiệm thức
Số mẫu cấy

(9)

2.3.10.Trọng lượng tươi rễ / trọng lượng tươi mẫu
Tỷ lệ giữa trọng lượng tươi rễ/mẫu (6) và trọng lượng tươi mẫu (7) được tính

theo

công thức:
TLT rễ/TLT mẫu (%) =(TLT rễ/TLT mẫu) .100 (10)
2.3.12. Phần trăm chất khô của rễ (%)
Phần trăm chất khô của rễ được tính bởi tỷ lệ giữa TLK rễ/mẫu (8) và TLT rễ/mẫu
(6) bằng công thức:
% chất khô rễ = TLK rễ x 100
(12)
TLT rễ
2.4. Phương pháp giải phẫu quan sát sự phát sinh hình thái
Mẫu thí nghiệm được cắt mỏng, sau đó ngâm Javel trong 1 giờ. Rửa sạch bằng nước
cất. Ngâm mẫu trong acid acetic 10% trong 30 phút. Rửa sạch bằng nước cất. Ngâm
thuốc nhuộm 2 màu đỏ carmin – xanh iod trong 3 phút. Rửa sạch bằng nước cất. Mẫu
đặt trong nước cất trên lame và quan sát dưới kính hiển vi.
2.5. Phương pháp thống kê
Số liệu của 3 lần lặp lại được xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC - Đại học
Michigan, Mỹ, phiên bản 2.1. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức được phân tích
bằng ANOVA, nếu có ý nghĩa sẽ được tiếp tục phân hạng bằng Duncan’s Multiple
Range Test (nếu số nghiệm thức trong thí nghiệm > 6) hoặc LSD-test (nếu số nghiệm
thức trong thí nghiệm < 5).


Biểu đồ được vẽ bằng Microsoft Excel 2007.
3.kết quả và giải thich
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật
đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương

quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro
3.1.1. Kết quả
3.1.1.1.

Thí nghiệm 1a: Mẫu cấy phiến lá

Auxin và kinetin đã ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành mô sẹo và phát sinh rễ bất định
ở mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản (Hình 3.1)

Hình 3.1. Sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy
Nhật Bản ở ngày thứ 42. (Thanh ngang: 1 mm)
Ghi chú: N hoặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện
cho nồng độ (2,4, 6 hoặc 8 mg l-1), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện
cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l-1).




Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu chết không khác biệt về mặt thống kê (Hình 3.2), tuy nhiên, mẫu có tỷ lệ chết
cao ở môi trường chỉ bổ sung NAA. Ở nghiệm thức N6K1 và N4K1 (6 hoặc 4 mg l-1
NAA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin) cho tỷ lệ mẫu chết thấp hơn các nghiệm thức có
NAA ở các nồng độ khác. Khi môi trường được bổ sung IBA, tỷ lệ mẫu nuôi cấy chết
thấp hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường có NAA (<30%). Ở các nghiệm thức
I8K1, I4K1 và I4K0 có tỷ lệ chết thấp nhưng không khác biệt về mặt thống kê so với
các nghiệm thức còn lại. Khi không sử dụng kinetin, tỷ lệ mẫu chết ở nghiệm thức
N2K0 có bổ sung 2 mg l-1 NAA lên đến hơn 70% (Hình 3.2).

Hình 3.2. Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên khả năng tạo mô sẹo ở mẫu cấy phiến lá của

cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42.
Ghi chú: N hoặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện
cho nồng độ (2, 4,6 hoặc 8 mg l-1), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện
cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l-1).


Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)

Tất cả các mẫu sống đều tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo giữa các nghiệm thức không
có sự khác biệt về thống kê (Hình 3.2). Mẫu cấy ở các nghiệm thức có bổ sung 4 hoặc 6
mg l-1 NAA khi kết hợp với 1 mg l-1 kinetin cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao hơn so với các
nghiệm thức có bổ sung NAA ở các nồng độ khác. Kết quả cho


thấy mẫu cấy trong môi trường có bổ sung kinetin cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao hơn các
nghiệm thức không có kinetin. Tuy nhiên, hai nghiệm thức I4K0 và I4K1 có tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo tương đồng (96,30%) dù trong môi trường có bổ sung kinetin hay không
(Hình 3.2)
Theo quan sát, ngày đầu tiên các mẫu cấy xuất hiện rễ ở đa số các nghiệm thức có NAA
là ngày thứ 21 của thí nghiệm. Các nghiệm thức có bổ sung IBA và kinetin xuất hiện rễ
chậm hơn (ngày thứ 35).


Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)

Tỷ lệ mẫu tạo rễ có sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng
3.1). Khi môi trường có bổ sung NAA từ 2 – 6 mg l-1 và kinetin hiện diện với nồng độ
1 mg l-1 đã làm gia tăng tỷ lệ mẫu tạo rễ. Nghiệm thức có tỷ lệ mẫu tạo rễ cao nhất
(70,37%) là nghiệm thức N6K1 (6 mg l-1 NAA và 1 mg l-1 kinetin). Nghiệm thức có
nồng độ 4 mg l-1 NAA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin cho tỷ lệ tạo rễ cũng tốt hơn các

nghiệm thức còn lại (51,85%). Hai nghiệm thức N4K0 và N2K0 có tỷ lệ mẫu tạo rễ
tương đồng nhau và thấp nhất so với các nghiệm thức khác (Bảng 3.1). Khi so sánh với
các nghiệm thức có bổ sung NAA, các nghiệm thức có bổ sung IBA có tỷ lệ mẫu tạo
mô sẹo cao hơn (Hình 3.2) nhưng lại có tỷ lệ mẫu tạo rễ thấp hơn (Bảng 3.1). Khi môi
trường có bổ sung IBA từ 4 – 8 mg l-1 với sự hiện diện của 1 mg l-1 kinetin đã không
ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ rõ rệt như trường hợp bổ sung NAA, ngoại trừ ở nồng
độ 2 mg l-1 IBA (Bảng 3.1). Khi quan sát mô sẹo ở các nghiệm thức có IBA, mô sẹo
thường có màu vàng nâu, đặc và chắc.