Luận văn nghiên cứu khả năng sử dụng vi sinh vật để ức chế quá trình Quorum Sensing của các vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT
ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA
CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN
ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

Nguyễn Thị Kim Thu

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT
ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CỦA
CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN
ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN
Chuyên ngành : Vi sinh vâṭ hoc̣
Mã số

: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình hoc̣ tâp̣ và thưc hiêṇ đề tài , em đã nhâṇ đươc sự giúp đỡ
vàủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thểvàcánhân.
Đầu tiên, em xin bay tỏ lòng biết ơn chân thanh và sâu sắc nhất đến người
thầy hướng dẫn khoa hoc̣ : TS. Phạm Thế Hải , người thầy tâm huyết , đã tâṇ tình
hướng dẫn , chỉbảo vàgiúp đỡem trong quátrình thực hiện đềtài và

hoànthành

luâṇvăn này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ , tạo điều kiện của cô Đỗ Minh
Phƣơng cùng các anh chị, các bạn thuộc phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học
trong suốt quátrình hoàn thành luận văn.
Em xin gửi lời cam ơn tới quý thầy cô taị Khoa Sinh hoc̣ , đăc̣ biêṭ là cac thầy
cô ở Bô ̣ môn Vi sinh vâṭ hoc̣ , trường Đaị hoc̣ Khoa hoc̣ Tự nhiên đã nhiêṭ tinh giảng dạy
và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích , phương pháp luâṇ và nghiên cứu
khoa hoc̣ , làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em .
Cuối cùng, xin bày tỏlòng biết ơn chân thành vàsâu sắc nhất đến gia đình

,

người thân , bạn bè đã luôn động viên , giúp đỡ , tạo điều kiện và danh nhưng tinh

cảm thân thương - đó là nguồn đông lưc maṇ h mẽ nhất để tôi có thể hoàn thành bản luâṇvăn này.
HàNội, ngày tháng năm 2015
HỌC VIÊN

Nguyễn Thị Kim Thu


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU........................................................................................................ 5
1.1.Tổng quan vi khuẩn Vibrio ............................................................................3
1.1.1. Đặc điểm chung của chi Vibrio ....................................................................3
1.1.2. Môi trường nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio..............................................3 1.1.3.
Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio................................................................4 1.1.4. Một số
Vibrio gây bệnh trên người và động vật thuỷ sản ............................4 1.1.5. Phân loại Vibrio
bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá ..............6 1.2. Hiện tƣợng cảm ứng mật độ
(Quorum sensing) .........................................8 1.2.1. Lịch sử phát hiện quá trình quorum
sensing.................................................8 1.2.2. Khái niệm quorum
sensing ...........................................................................8 1.2.3. Cơ chế phân tử của quá
trình QS ở một số vi khuẩn Vibrio.........................8
1.2.4. Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi
khuẩn Vibrio..............................................................................................................11
1.3. Các phƣơng pháp ức chế quá trình QS đƣợc sử dụng hiện nay .............12
1.3.1. Sử dụng chất đối kháng quorum sensing ....................................................12 1.3.2.
Bất hoạt phân tử tín hiệu dựa vào enzym ...................................................13
1.4. Nghiên cứu về vi khuẩn ức chế quorum sensing và đối kháng với một số vi

khuẩn Vibrio ............................................................................................................14
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................... 16 2.1.
Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 16 2.2. Vật liệu
nghiên cứu ................................................................................ 16
2.2.1. Nguồn và chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu ..............................16
2.2.2. Hóa chất và thiết bị .....................................................................................17 2.2.3.
Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu: ...................................18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 20


2.3.1. Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang
sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi ......................20
2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức chế sự
phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng ...........................22
2.3.3. Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, phân loại của các chủng vi khuẩn có hoạt tính
ức chế phát sáng sinh học (liên quan đến QS) của Vibrio harveyi ............23
2.3.4. Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn .......................................................26
2.3.5. Chỉ tiêu theo dõi chung...............................................................................29
2.3.6. Phương pháp tính toán thống kê xử lý số liệu ............................................29
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 30
3.1. Xác định mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và cƣờng độ phát quang đo
đƣợc của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểm............................................. 30 3.2.
Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát
quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio

harveyi ......................................................................................................... 31
3.2.1. Phân lập các vi sinh vật ở các vùng ao nuôi tôm, rừng ngập mặn, đất, bùn của tỉnh
Nam Định và Ninh Bình..............................................................................31
3.2.2 Xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở Vibrio
harveyi của các vi sinh vật phân lập ..............................................................32

3.3. Kết quả phân tích định lƣợng khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến
quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập đƣợc........................ 36 3.4.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện môi trƣờng tới khả năng ức chế sự
phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng ................... 38
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ..............................................................................38
3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH môi trường nuôi cấy ................................................39
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) trong môi trường nuôi cấy .............40
3.5. Xác định đặc điểm hình thái và một số đặc điểm phân loại học khác của
các vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát quang sinh học liên quan đến quorum
sensing ở Vibrio harveyi ..........................................................................................41


3.5.1. Quan sát hình dạng tế bào của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự
phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi ......................42
3.5.2. Hình thái khuẩn lạc của hai chủng vi khuẩn tuyển chọn được ...................42 3.5.3.
Khả năng lên men yếm khí của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự
phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi ......................43
3.5.4. Khả năng di động của các chủng vi khuẩn triển vọng................................44 3.5.5.
Kết quả phân tích các đặc điểm sinh hoá của XTS1. .................................45
3.6. Phân tích trình tự gen 16S rRNA của chủng XTS1 ................................. 48
3.6.1. Khuếch đại gen 16S rRNA .........................................................................48
3.6.2. Kết quả xác định loài vi khuẩn XTS1 ức chế sự phát sáng sinh học liên
quan đến quorum sensing ở Vibrio harvei bằng kỹ thuật sinh học phân tử..............49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 53 PHỤ
LỤC ................................................................................................................ 58


DANH MUC CÁC CHƢ̃VIẾT TẮT
Viết tắt

Cụ m t ừ
AHL

Chất N-Acyl homoserine lactone

Cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

ĐC

Đối chứng

DN

Dịch nuôi

Epps

Eppendorf

HCD

Mật độ tế bào cao (High cell density) Mật

LCD

độ tế bào thấp (Low cell density)

LB

Môi trường Luria-Bertani

MQSR

Master quorum sensing regulator

MR

Methyl red

NCBI

Cơ sở dữ liệu về công nghệ sinh học

OD

Optical density (mật độ quang)

ONPG

O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp

QS

Quorum sensing

Rpm

revolutions per minute (số vòng trên phút)

sp.

Một loài bất kỳ

spp.

Nhiều loài bất kỳ

sRNA

Small RNA Vi

VSV

sinh vật
V.

VK

har

RNA

veyi
V.
parahaemolyt
icus
V
P


V
V
V
V
R


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trường .............. 4
Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB 0.5% NaCl nuôi cấy các VSV phân lập.. 19 Bảng 2.2.
Thành phần môi trường TCBS để chọn lọc vi khuẩn Vibrio............... 19 Bảng 3.1. Số chủng
VSV phân lập được từ 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình....... 31
Bảng 3.2. Kết quả phân lập được một số chủng vi khuẩn nghi ngờ có hoạt
tính ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi........................................... 32
Bảng 3.3 . Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng ức chế sự phát quang sinh
học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1.............................................. 38
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng ức chế phát quang sinh
học liên quan đến QS ở Vibrio harveyi của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 .... 39
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) đến khả năng ức chế của 2 chủng
XTS1 và CP1 tới sự phát quang sinh học(QS) của Vibrio harveyi...................... 41

Bảng 3.6. Khả năng lên men yếm khí của một số chủng vi khuẩn có triển
vọng ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi.............................................. 43
Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm MR phân loại vi khuẩn dựa vào khả năng lên men
đường glucose tạo sản phẩm acid bền.................................................................. 45
Bảng 3.8. Kết quả thử nghiệm VP chủng vi khuẩn XTS1 ................................... 46 Bảng
3.9. Kết quả thử nghiệm ONPG chủng vi khuẩn XTS1 ............................. 47
Bảng 3.10. Kết quả xác định loài vi khuẩn ức chế sự phát sáng liên quan
đến QS ở Vibrio harveyi bằng kỹ thuật sinh học phân tử ................................... 49


DANH MUC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ phân loại các loài Vibrio bằng các phản ứng sinh hoá .....................7 Hình 1.2.
Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri .................................................9 Hình 1.3.
Quorum sensing ở vi khuẩn Vibrio harveyi .............................................10 Hình 1.4. Hai
enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL .................... 13
Hình 3.1. Đồ thị mô tả sự tương quan giữa giá trị OD600nm và lượng phát
quang của Vibrio harveyi tại các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h................................ 30
Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi
của các chủng XTS1, CP1, CP10.............................................................................. 33 Hình
3.3. Đồ thị sinh trưởng của các chủng VSV...................................................... 34
Hình 3.4. Kết quả khảo sát tính đối kháng giữa các chủng Vibrio harveyi và 3
chủng VSV phân lập được bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ........................ 35
Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự ức chế sinh trưởng giữa các chủng XTS1 và
CP1 với V.harveyi bằng phương pháp đục lỗ thạch.................................................. 36
Hình 3.6. Đồ thị biểu thị cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở các giếng
thí nghiệm................................................................................................................. .37 Hình
3.7. Hiệu quả ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của hai chủng vi khuẩn XTS1 và
CP1..................................................................................................37 Hình 3.8. Hình dạng tế
bào XTS1 quan sát dưới vật kính 100x ................................42 Hình 3.9. Quan sát hình dạng tế bào

CP1 dưới vật kính 100x................................. 42 Hình 3.10. Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi
khuẩn XTS1 trên môi trường LB 3% NaCl và
TCBS...........................................................................................................43 Hình 3.11. Khả
năng lên men yếm khí của 2 chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát quang sinh học liên
quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi...................44 Hình 3.12. Khả năng di động
của XTS1 và CP1 ......................................................45 Hình 3.13. Kết quả thử nghiệm
MR..........................................................................46 Hình 3.14. Thử nghiệm VP của chủng
vi khuẩn XTS1 ............................................47 Hình 3.15. Kết quả thử nghiệm ONPG của
chủng vi khuẩn XTS1 .........................48 Hình 3.16. Kết quả quả PCR khuếch đại đoạn 16S
rADN của XTS1 ......................49 Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của XTS1 trên
GenBank................50


MỞ ĐẦU
Ngành thuỷ sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của
đất nước ta. Quy mô của ngành thuỷ sản ngày càng mở rộng và vai trò của ngành cũng tăng lên
không ngừng trong nền kinh tế quốc dân. Động vật thuỷ sản là một trong những nguồn
cung cấp lương thực, thực phẩm và các sản phẩm tiêu dùng
phong phú cho con người. Trong đó, bao gồm các loại tôm, cua, cá,…
Tuy nhiên, mỗi năm ngành thuỷ sản nước ta lại bị thiệt hại nặng nề vì dịch bệnh,
chủ yếu trên tôm nước lợ, cá nước ngọt, cá biển, nhuyễn thể… Các yếu tố ngoại cảnh tác động
lên động vật thuỷ sản bao gồm môi trường sống và tác nhân gây bệnh. Trong đó, dịch bệnh trên
động vật thuỷ sản gây thiệt hại lớn chủ yếu là do các tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm,
tác nhân gây bệnh kí sinh…). Một trong những vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản điển
hình đó là các vi khuẩn thuộc chi Vibrio [2 ; 22]. Thiệt hại do bệnh thủy sản, đặc biệt là tôm
lên đến 60000 ha (năm 2014) ảnh hưởng rất lớn đến người nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế.
Các vi khuẩn Vibrio sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, một
số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển. Đối với cá, Vibrio spp. chủ yếu gây bệnh
nhiễm trùng máu, đối với tôm Vibrio spp. gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin.
Những vi khuẩn này thường là tác nhân gây bệnh cơ hội, khi động vật thuỷ sản chịu sự bất lợi

từ yếu tố môi trường hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Động vật thuỷ
sản yếu không có sức đềkháng, các loài vi khuẩn Vibrio cơ hội gây bệnh nặng làm động vật này chết rải rác
tới hàng loạt [2].
Nhiều giải pháp để phòng, trừ bệnh do nhóm vi khuẩn này gây ra trên động vật thuỷ
sản như sử dụng kháng sinh, chế phẩm sinh học. Tuy nhiên, hiệu quả của các biện pháp này còn
thấp. Hơn nữa, do sử dụng nhiều kháng sinh màcác vi khuẩn Vibrio đa phần đều kháng kháng sinh gây
ảnh hưởng đến môi trường và càng làm giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh. Trong những năm
gần đây, các nghiên cứu tập trung vào việc làm rối loạn hệ thống "quorum sensing" - một dạng "giao
tiếp của vi khuẩn". Quorum sensing (QS) là cơ chế thông tin liên lạc giữa các tế bào và đáp
1


ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng, dò tìm các phân tử tín hiệu.
Vai trò của quorum sensing là điều khiển một số quá trình ở vi khuẩn gây bệnh như: sự phát
sáng, sự tiếp hợp, sự hình thành biofilm, swarming… [1; 9]. Việc ngăn chặn hệ thống giao tiếp
QS của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Vibrio nói riêng là hướng đi mới nhằm ngăn ngừa khả
năng gây bệnh của chúng mà không cần đặt chúng dưới áp lực chọn lọc (chẳng hạn như dùng
kháng sinh hoặc chất hoá học để tiêu diệt chúng).
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu khả năng sử
dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio gây
bệnh trên động vật thuỷ sản".

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan vi khuẩn Vibrio
1.1.1. Đặc điểm chung của chi Vibrio
Vibrio có vị trí phân loại như sau:

Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Chi Vibrio là một nhóm vi khuẩn đa dạng bao gồm ít nhất 74 loài riêng biệt. Vibrio
thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn
cong, kích thước từ 0,3-0,5 x 1,4-2,6µm di động nhờ tiên mao, không hình thành bào tử.
Đa số các Vibrio đều là các vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện. Hầu hết chúng đều phát triển trong môi
trường nước biển (Na+ cần cho sự phát triển của chúng, là nhu cầu tuyệt đối) và không phát triển
trên môi trường không có muối. Đa số các loài Vibrio sống hoại sinh, một số gây bệnh cho người và
động vật; ví dụ như Vibrio cholerae gây bệnh tả trên người, Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng
trên tôm, Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan trên cá. Đặc trưng của các loài
Vibrio là khả năng sống trong điều kiện pH cao (8,5 - 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trường
axít. Một số loài có thể phát triển rất nhanh (tăng gấp đôi trong 10 phút) [6; 7; 8; 40].

1.1.2. Môi trƣờng nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio
Môi trường chọn lọc để phân lập các loài vi khuẩn Vibrio là môi trường
thạch TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar). TCBS có tính chọn lọc cao, đáp ứng
nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Vibrio. Tuy nhiên, môi trường TCBS chỉ có thể giúp
phân loại vi khuẩn Vibrio thành hai nhóm: có sử dụng và không sử dụng đường sucrose.
Các vi khuẩn có khả năng lên men sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu vàng (Vibrio cholerae,
Vibrio alginolyticus,…) và ngược lại, các vi khuẩn không có
3


khả năng sử dụng sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh (Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio vulnificus…) [7 ; 8.]
Bảng 1.1 Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trƣờng

thạch TCBS
Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS
Loài

Màu khuẩn lạc

Vibrio cholera

Khuẩn lạc màu vàng

Vibrio parahaemolyticus

Xanh

Vibrio anguillarum

Vàng

Vibrio harveyi

Màu xanh ở trung tâm, xung quanh vàng

V. alginolyticus

Vàng

Vibrio vulnificus

Vànglục

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio
Các vi khuẩn Vibrio cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, lên men
yếm khí, các chủng vi khuẩn phát sáng đều phát triển tốt ở môi trường có 3% NaCl,
sinh indole và có khả năng tạo axít từ mannitol và trehalose, không sinh H2S và
Urease. Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129. Hầu hết các vi khuẩn thuộc
nhóm Vibrio có thể tồn tại và nhân rộng ở các vùng nước bị tăng độ nhiễm mặn (nồng độ
muối cao, có thể lên tới 6% NaCl) và ở nhiệt độ 10-30oC. Khi sinh trưởng trong môi trường
TCBS, một số loài Vibrio có khả năng lên men đường sucrose
(Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus…) nên cho khuẩn lạc màu vàng [6; 8; 45].
1.1.4. Một số Vibrio gây bệnh trên ngƣời và động vật thuỷ sản
1.1.4.1. Lịch sử phát hiện bệnh gây ra do Vibrio
Vào những năm 1970, bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện bởi
Tukiash. Vào thời gian này, dịch bệnh gây chết với tỷ lệ >50% ở động vật thuỷ sản như cua xanh
(Callinectes sapidus). Sau đó, năm 1977, Fisher đã công bố kết quả nghiên cứu bệnh
trên các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus americarus), châu Á (Panulirus homarus) và công
bố nguyên nhân bệnh là do nhiễm phải nhóm vi khuẩn Vibrio [20].
4


Năm 1990, Hasawai cho rằng tác nhân gây bệnh đỏ thân ở tôm Sú (Thái Lan)
là do phẩy khuẩn. Còn ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng nguyên nhân của bệnh đỏ
thân là do tôm ăn Artemia và tảo già. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Viện nuôi trồng thuỷ
sản 3 thì bệnh đỏ thân ở tôm là do vi khuẩn Vibrio alginolyticus (1 loài vi khuẩn thuộc chi
Vibrio) [42; 43; 44].
Bệnh vibriosis (bệnh do các vi khuẩn Vibrio gây ra) có thể quan sát được ở khắp mọi
nơi có nghề nuôi trồng thuỷ sản nước lợ và nước mặn. Từ mẫu tôm, cá bị mắc bệnh, thậm chí
là mẫu đất nơi mà Vibrio thường có mặt, ta có thể phân lập được nhiều loài vi khuẩn Vibrio.
1.1.4.2. Vi khuẩn Vibrio harveyi
Vibrio harveyi là vi khuẩn thuộc chi Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm của
vi khuẩn này là: hình que, Gram âm, phát quang sinh học, di động nhờ roi cực, ưa mặn và có

khả năng trao đổi chất lên men và hô hấp. Chúng không phát triển ở nhiệt độ 4°C hoặc trên
35°C. Có thể tìm thấy Vibrio harveyi sống tự do trong vùng biển nhiệt đới, trong ruột của
động vật biển và là mầm bệnh cơ hội của tôm, cá bơn, tôm hùm…Chúng gây ra hiện tượng phát
sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển.
Tôm khi nhiễm vi khuẩn này thường phát bệnh sau khi nuôi một tháng. Tôm nhiễm bệnh
có đặc điểm là bơi lội không định hướng, phản xạ chậm, khả năng bắt mồi giảm, một số con dạt
vào bờ. Quan sát vỏ và thân thấy màu cáu bẩn, cơ có màu đục, gan teo, ruột rỗng; trong bóng tối phát
ánh sáng xanh. Vi khuẩn Vibrio harveyi có thể sống được ở độ mặn từ 0 - 40‰, phát triển
mạnh ở độ mặn 20 - 30‰. Khi xâm nhập cơ thể tôm, vi khuẩn tấn công tế bào gan, dẫn tới
viêm loét gan, suy giảm chức năng gan [21; 27].
1.1.4.3. Vi khuẩn Vibrio cholerae
Giống như Vibrio harveyi, Vibrio cholerae là vi khuẩn thuộc chi Vibrio,
nhóm Gram âm. Đặc điểm của vi khuẩn này là: hình dấu phẩy, có một roi ở một cực tế bào. V.
cholerae lần đầu tiên được phân lập từ mẫu bệnh dịch tả bởi nhà giải phẫu học người Ý Filippo
Pacini năm 1854. Vibrio cholerae thường gây bệnh tả cho
người [13 ; 14]
5


1.1.4.4. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Vi khuẩn này có dạng hình uốn cong, Gram âm, được tìm thấy trong nước lợ
và nước mặn. Vibrio parahaemolyticus bao gồm các chủng có độc tố có khả năng gây bệnh
và các chủng không gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. V. parahaemolyticus có khả năng
chịu đựng với các độ mặn, pH, nhiệt độ và dễ dàng đeo bám trên các sinh vật phù du di chuyển
theo dòng chảy. V. parahaemolyticus rất phổ biến trong môi trường ở các vùng cửa sông, và một
số ít hiện diện trong môi trường nước ngọt.
Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm do Lightner (Đại học
Arizona, Mỹ) nghiên cứu phát hiện ra. Tôm mắc bệnh này thường bị sưng gan tuỵ dẫn đến chết.
Ngoài ra, vi khuẩn này còn gây bệnh phồng đuôi ở tôm, tuy không lan thành dịch lớn nhưng cũng
ảnh hưởng đến năng suất nuôi [23].

1.1.4.5. Vi khuẩn Vibrio alginolyticus
Vibrio alginolyticus là những vi khuẩn hình que ngắn, Gram âm, khi nuôi cấy
trên TCBS cho khuẩn lạc màu vàng do có khả năng lên men sucrose. Vibrio alginolyticus
thường gây bệnh đỏ thân ở tôm làm tôm và ấu trùng chết hàng loạt và bệnh xuất huyết, lở loét ở cá
chẽm. Vi khuẩn gây bệnh khi môi trường sống của
thuỷ sản bị ô nhiễm nặng, thức ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém [37 ; 39].
1.1.5. Phân loại Vibrio bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá
Dựa vào các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước…) và các đặc điểm
sinh lý, sinh hoá, người ta có thể phân loại Vibrio thành các loài khác nhau. Theo C.V.L. Jayasinghe
và cs, các loài Vibrio được phân loại dựa vào màu sắc khuẩn lạc mọc trên TCBS (xanh hay vàng),
phản ứng oxidase và VP test, khả năng mọc trên môi trường 0% NaCl, phản ứng ONPG,
phản ứng D-cellobiose, phản ứng Lysine Decarboxylase (hình 1.1) [25].

6


Hình 1.1 Sơ đồ phân loại các loài Vibrio bằng các phản ứng sinh hoá [25]. Chú thích:Growth on TCBS (Sinh trƣởng trên
môi trƣờng TCBS, Y (màu vàng), G (màu xanh)
7


1.2. Hiện tƣợng cảm ứng mật độ (Quorum sensing) 1.2.1.
Lịch sử phát hiện quá trình quorum sensing
Nghiên cứu đầu tiên về quorum sensing trên vi khuẩn Vibrio fischeri được
thực hiện vào năm 1960. Kết quả nghiên cứu này cho thấy hiện tượng phát sáng xảy ra khi có mặt số
lượng lớn tế bào vi khuẩn. Giả thuyết ban đầu của các nhà nghiên cứu là: môi trường chứa chất ức
chế sự phát sáng và chất này bị loại bỏ khi vi khuẩn hiện diện với số lượng lớn.
Các nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh rằng: Sự phát sáng do tích lũy phân tử hoạt hóa
gọi là autoinducer. Autoinducer do vi khuẩn tạo ra và hoạt hóa sự phát sáng khi nó ở nồng độ
cao. Vi khuẩn có thể cảm nhận được mật độ tế bào thông qua nồng độ autoinducer [48].

Sau đó, một loạt nghiên cứu đã tìm ra hệ thống quorum sensing trên các loài vi khuẩn
khác như Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus…
1.2.2. Khái niệm quorum sensing
Quorum sensing là cơ chế thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào, phối hợp
với sự biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn để đáp ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải
phóng và dò tìm các phân tử tín hiệu nhỏ, được gọi là các phân tử autoinducer.
Quorum sensing ảnh hưởng tới sự biểu hiện của nhiều quá trình tế bào, bao gồm các quá
trình hoạt động của các gen gây bệnh như phát quang sinh học, quá trình swarming, sự hình
thành bào tử, hình thành biofilm, sản xuất các chất kháng sinh, sự tạo thành độc tố,
siderophore… Ở Vibrio harveyi, sự biểu hiện của các protein huỳnh quang sinh học được mã hoá
bởi operon lux bị ảnh hưởng bởi mật độ vi khuẩn qua hiện tượng cảm ứng mật độ [1].
1.2.3. Cơ chế phân tử của quá trình QS ở một số vi khuẩn Vibrio
Quá trình quorum sensing được phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn Vibrio
fisheri, và là nền tảng để khám phá hệ thống quorum sensing ở các Vibrio khác. Tín hiệu tham gia vào
quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm nói chung đó là các phân tử hoá học nhỏ, ví
dụ như N-acyl homoserine lactones (AHLs), alkyl
quinolones (AQs),…

8


1.2.3.1. Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri
Khi mật độ tế bào V.fischeri thấp, autoinducer (3-oxo-C6-HSL, một AHL) ở
nồng độ thấp. Ở mật độ tế bào cao, mức độ của autoinducer trở nên đủ để hoạt hoá sự phiên mã
của các gen sản xuất các enzyme luciferase, dẫn đến phát quang sinh học (Hình 1.2). Thật
vậy, một tế bào đơn lẻ không có khả năng sản xuất đủ luciferase để gây hiện tượng phát
quang có thể nhìn thấy được. Sử dụng quorum sensing, các tế bào có thể tiết kiệm năng lượng
của mình cho đến khi các tế bào tương tự hội tụ đủ xung quanh, sau đó kết hợp hoạt động tạo ra ánh
sáng có thể nhìn thấy được [9;10].

Hình 1.2 Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri. Chú thích: Target genes
(gen đích); protein I (protein sản xuất), protein R (protein điều hoà).
Các phân tử tín hiệu AHL được tạo ra bởi protein sản xuất, sau đó AHL sản sinh từ các tế bào
xung quanh được gắn vào protein điều hoà, protein điều hoà cùng với phân tử tín hiệu này hoạt hoá
phiên mãcác gen đích.
1.2.3.2. Quorum sensing ở Vibrio harveyi
Quorum sensing ở V. harveyi sử dụng 3 hệ thống phân tử tín hiệu tế bào mà
có chức năng song song để điều hoà tích cực sự phát quang sinh học, sản xuất
metalloprotease, siderophore, exopolysaccharide và điều hoà âm hệ thống tiết loại III theo
cách thức phụ thuộc mật độ tế bào. Hệ thống LuxM/N dựa vào HAI-1 được tổng hợp bởi LuxM.
Hệ thống LuxS/PQ sử dụng phân tử tín hiệu AI-2 và được tổng hợp bởi LuxS. Hệ thống
CqsA/S sử dụng phân tử tín hiệu CAI-1 mà phụ thuộc vào
9


CqsA để tổng hợp chính nó. Ba phân tử tín hiệu này là riêng biệt và làm việc "hợp
tác" trong quá trình điều hoà gen. Các protein cảm biến (sensors) cho HAI-1, AI-2 và CAI-1
gọi là LuxN, LuxQ và CqsS tương ứng, là những protein thuộc hệ thống tín hiệu hai thành phần.
Ở mật độ tế bào thấp, nồng độ phân tử tín hiệu thấp, LuxO bị phosphoryl hoá kích hoạt sự biểu
hiện của các sRNA đi kèm với Hfq gây bất ổn mRNA mã hoá protein LuxR - yếu tố điều hoà
tổng thể quorum sensing (Master quorum sensing regulator - MQSR). Ở mật độ tế bào cao,
các phân tử tín hiểu sản xuất bởi LuxM, LuxS và CqsA được tích luỹ và bám vào các sensor tương
ứng của chúng. Tín hiệu liên kết được chuyển tới LuxN, LuxQ và CqsS thành phosphatase, dẫn tới
LuxO bị dephosphoryl hoá. Kết quả, LuxO bị bất hoạt, các sRNA không được sao chép,
mRNA của luxR được ổn định và dịch mã. LuxR sản xuất phát quang sinh học và sản xuất
exopolysaccharide, siderophore và metalooprotease và ức chế hệ thống tiết loại III (hình 1.3)
[9;15;16;18;19;28;29;33;38].
1.2.3.3. Quorum sensing ở Vibrio parahaemolyticus

Hình 1.3 Quorum sensing ở vi khuẩn Vibrio harveyi [9]. Chú thích: At low cell

density (mật độ tế bào cao); at high cell density (mật độ tế bào thấp).
Quá trình quorum sensing ở Vibrio parahaemolitycus cũng tương tự như ở
Vibrio harveyi, tuy nhiên yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing ở V.
parahaemolyticus là opaR (một homolog của luxR V.harveyi) (Hình 1.3).
10


1.2.4. Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi
khuẩn Vibrio
Quorum sensing là quá trình phổ biến và được bảo tồn ở các loài Vibrio,
tham gia vào nhiều quá trình sinh lý khác nhau và đặc biệt ảnh hưởng đến hệ thống độc lực của nhiều
vi khuẩn thuộc loài này.
1.2.4.1. Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi
khuẩn Vibrio
Ngoại độc tố (Exotoxin) đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của vi
khuẩn bằng cách tạo ra các enzyme phân huỷ và tạo lỗ thủng trên màng tế bào vật chủ, do đó cho phép
vi khuẩn xâm nhập và lây lan sang các tế bào, mô xung quanh. Ở vi khuẩn Vibrio harveyi, độc
lực của V. harveyi (chủng 47.666-1) liên quan đến việc sản xuất một protein ngoại bào
được gọi là độc tố T1 với một khối lượng phân tử khoảng 100 kDa. Các protein ngoại bào
được sản xuất trong giai đoạn giữa pha log và có độc lực tương tự liên quan đến các protein
trong Salmonella, Shigella, và các loài Bacillus. Ngoài ra, quá trình quorum sensing ở vi khuẩn phát
sáng này còn điều hoà âm sự sản xuất các chitinase, phospholipase, siderophore, hệ thống tiết
loại III [30]. Đối với Vibrio alginolyticus, yếu tố gây độc chính của vi khuẩn này là một
serine protease kiềm ngoại bào - Asp có liên quan mật thiết với hệ thống quorum sensing
và cách thức sản xuất của độc tố này phụ thuộc vào mật độ tế bào. Thực tế, sự biểu hiện ở mức độ
thấp của yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing LuxR, gây giảm biểu hiện của Asp. Giả
thuyết đặt ra là: LuxR kích hoạt phiên mã của gen asp bằng cách trực tiếp bám vào vùng
promoter của nó. Ở V. cholerae, hai yếu tố độc lực chính là độc tố cholerae (CT) và các sợi
phối hợp điều hoà độc tố (toxin coregulated pilus - TCP), mã hóa tương ứng bởi cụm gen ctx
và gen tcp được gián tiếp hoạt hoá bởi AphA. Ở mật độ tế bào thấp, các sRNA (small RNA)

được phiên mã khi LuxO bị phosphoryl hoá. Các sRNA gây bất ổn mRNA của hapR nhưng
thúc đẩy sự biểu hiện của AphA. Ở mật độ tế bào cao, HapR được biểu hiện và ức
chế sự phiên mã AphA, dẫn đến ức chế sự hình thành các yếu tố độc lực [32; 35].

11


1.2.4.2. Quorum sensing ảnh hƣởng đến kiểu hình liên quan tới độc lực khác
nhau trong các vi khuẩn Vibrio
Quorum sensing trong các vi khuẩn Vibrio cũng tham gia vào sự điều hoà
của nhiều yếu tố độc lực khác liên quan, như hình thành màng sinh học, khả năng vận động,
siderophore... Trong V. cholerae, trái ngược với các vi khuẩn khác khi kích thích hình thành
biofilm (màng sinh học) ở mật độ cao, vi khuẩn này sản xuất màng sinh học dày hơn khi mật độ
tế bào thấp. CqsA hoạt động thông qua HapR ức chế sự biểu hiện của các operon tổng hợp
polysaccharide [13].
Sự biểu hiện của hiện tượng phát quang sinh học trong V. harveyi từ lâu đã gắn liền
với độc lực ở các chủng gây bệnh của loài này. Biểu hiện kiểu hình phát quang của V. harveyi
được kiểm soát ở mức độ phiên mã bởi một hệ thống quorum sensing không điển hình (không
hoàn toàn giống hệ thống ở các Vibrio khác). Kiểu hình phát sáng liên quan đến QS ở V.
harveyi có tương quan mật thiết đến sự sản xuất của metalloprotease và độc tố ngoại bào [30].
1.3. Các phƣơng pháp ức chế quá trình quorum sensing đƣợc sử dụng hiện nay
Việc sử dụng các chất kháng sinh để tiêu diệt mầm bệnh trong nuôi trồng
thuỷ sản đã làm cho vi khuẩn gây bệnh trở nên kháng thuốc. Hiện nay, không những một số thuốc
kháng sinh không còn hiệu quả mà còn gây ô nhiễm môi trường sống của thuỷ sản, làm mất
cân bằng sinh thái. Do đó, nhiều phương pháp hữu hiệu hơn đã được nghiên cứu, đặc biệt là
việc ứng dụng các hiểu biết về quá trình quorum sensing trên vi khuẩn Vibrio. Việc ngăn chặn
quá trình này nhằm làm bất hoạt khả năng gây độc của vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến
chúng sẽ là một hướng tiếp cận mới. Một số hướng tiếp cận làm gián đoạn quorum sensing
đã được nghiên
cứu, bao gồm:

- Ức chế tổng hợp các phân tử tín hiệu autoinducer
- Sử dụng chất đối kháng quorum sensing
- Gây bất hoạt quorum sensing dựa vào enzyme
- Ứng dụng các chất tương đồng kích thích quorum sensing
1.3.1. Sử dụng chất đối kháng quorum sensing
Dựa vào các phân tử tín hiệu như AI-2 và AHL để ứng dụng chất đối kháng
quorum sensing. Đối với phân tử AHL, người ta đã tìm ra hợp chất furanone chứa
12


halogen ở tảo đỏ có cấu trúc tương tự. Dựa vào sự tương đồng này, đưa furanone
gắn lên chất đáp ứng điều hoà khiến cho gen đích không được hoạt hoá. Ngoài ra, các nhà nghiên
cứu trước đây còn sử dụng phân tử AHL đối kháng (những AHL có kích thước 8C trở xuống
để kích thích, còn những AHL có kích thước 10C trở lên dùng để ức chế) và phân tử AHL
tổng hợp (sử dụng AHL tổng hợp (5Z)-4-bromo- 5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone để ức
chế QS và qua đó làm tăng mức độ mẫn cảm của biofilm đối với kháng sinh) [11; 12; 34].
Đối với phân tử AI-2, một số nghiên cứu đã tìm ra một furanone chứa
halogen thứ 2 chứa trong tảo đỏ Delisea pulchra. Chất này có tác dụng giảm khả năng điều
hoà AI-2, giảm sự hình thành biofilm ở E.coli và giảm khả năng phát sáng ở Vibrio harveyi.
1.3.2. Bất hoạt phân tử tín hiệu dựa vào enzym
Phân tử tín hiệu AHL hầu như phổ biến ở các vi khuẩn. Những enzyme có
khả năng ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm ß- Proteobacteria,
α-Proteobacteria và γ-Proteobacteria cũng như ở một số loài thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.
Các enzym có khả năng phân huỷ sinh học phân tử tín
hiệu AHL đó là AHL lactonase và AHL cyclase. [31; 36]

Hình 1.4 Hai enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL.
Dưới xúc tác của enzym AHL acylase, phân tử tín hiệu AHL bị bẻ gãy mạch
carbon và phân tách thành axít béo và homoserine lactone, nhưng không làm thay đổi nhiều đến
cấu trúc của AHL. Còn enzyme AHL lactonase xúc tác mở vòng lactone tạo thành N-acyl

homoserine (hình 1.4).

13


Tác động của enzym này khiến cho phân tử AHL bị thay đổi về cấu trúc, gây
trở ngại đến việc gắn kết của AHL với protein điều hoà phiên mã ra LuxR. Các nghiên cứu
đã phát hiện ra rằng, enzym AHL lactonase được mã hoá bởi gen aiiA. Gen aiiA lần đầu tiên
được tìm thấy ở chủng Bacillus sp 240B1. Sau đó, các homolog (tương đồng) của gen
aiiA đã được tìm thấy ở nhiều loài Bacillus khác, gồm có Bacillus thuringiensis, B. subtilis,
B. cereus, B. mycoides... Các gen này có độ tương đồng cao (89 - 96%) so với gen aiiA của
chủng 240B1.
1.4. Nghiên cứu về vi khuẩn ức chế quorum sensing và đối kháng với một số vi
khuẩn Vibrio
Như đã biết, enzyme AHL lactonase được mã hoá bởi gen aiiA, và gen này
được tìm thấy ở các chủng Bacilus. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cs sử dụng
chủng Bacillus cereus được phân lập từ nước nuôi cá tra ở Đồng Tháp để khuếch đại gen
aiiA từ chủng này bằng phương pháp PCR [40]. Gen này được gắn vào vector, nhân dòng và
biểu hiện nhờ vật chủ E.coli. Gen aiiA mã hoá cho enzyme AHL lactonase được biểu hiện và
tách chiết, sau đó được đem thử hoạt tính trên đĩa 96 giếng theo tỉ lệ 1:1 (50µl dịch nuôi Vibrio
harveyi qua đêm đã pha loãng 5000 lần và 50µl AHL lactonase tách chiết từ E.coli). Kết quả
cho thấy, cường độ phát sáng của chủng hoang dại BB120 đã bị suy giảm ngay ở thời điểm
sau 2 giờ, khi enzyme AHL-lactonase tái tổ hợp được bổ sung. Việc bổ sung enzyme
AHL- lactonase tái tổ hợp ở các nồng độ khác nhau đã không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng
của V. harveyi. Như vậy, protein AiiA tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng Bacillus cereus
có hoạt tính ức chế quá trình quorum sensing ở Vibrio harveyi mà không ức chế sự sinh
trưởng của vi khuẩn này.
Theo R. Chythanya và cs, Pseudomonas I-2 - một loài vi khuẩn biển, sản xuất các
hợp chất ức chế các vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm bao gồm Vibrio harveyi, V. fluvialis,
V. parahaemolyticus, V. vulnificus và V.damsela. Chất ức chế đã được tìm thấy là một hợp

chất có phân tử lượng thấp, hòa tan trong chloroform và bền với nhiều enzym thuỷ phân
protein. Pseudomonas I-2 có khả năng ứng dụng để kiểm soát Vibrio sp. gây bệnh trên tôm
trong nuôi trồng thủy sản. Ngoài ra, dịch nổi (không có tế bào) chiết từ Pseudomonas I-2 có khả
năng ức chế hoàn toàn vi
14


khuẩn Vibrio harveyi chỉ sau 12h. Như vậy, rất có thể Pseudomonas I-2 đã tạo ra
một số thành phần anti-vibrio ngoại bào. Những kết quả này là rất quan trọng vì vi khuẩn V.
harveyi là một vấn đề lớn trong sản xuất tôm giống [5].
Hiện nay, việc tìm được những chủng vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình
quorum sensing mà các vi khuẩn Vibrio này sử dụng để "liên lạc" với nhau, để tạo độc tố gây
bệnh là rất cần thiết. Nếu tìm được những chủng VSV có hoạt tính này sẽ hạn chế được các
bệnh do Vibrio gây ra mà không làm ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái vi sinh vật.

15