NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd. Et Wils, Magnoliaceae)

Header Page 1 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.
Et Wils, Magnoliaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2012

Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.

Et Wils, Magnoliaceae)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HOÀNG THỊ MỸ NHUNG

Hà Nội – Năm 2012

Footer Page 2 of 126.


Header Page 3 of 126.

LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
PGS.TS. Trần Công Yên, người thầy đã tạo nên trong tôi niềm ham
thích với lĩnh vực nghiên cứu ung thư và thu nhận tôi vào nhóm Ung thư
thực nghiệm. Thầy đã luôn thấu hiểu và động viên những khi tôi gặp khó
khăn trong những ngày đầu vào nhóm. Tôi luôn cảm thấy mình may mắn khi
đã được học và làm việc dưới sự hướng dẫn của thầy dù thời gian đó không
dài.
PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, người đồng sáng lập nhóm Ung thư thực
nghiệm. Cô đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo lý thuyết và các kỹ năng thực
nghiệm từ khi tôi còn là sinh viên đại học, tạo nền tảng giúp tôi phát triển
luận văn của mình sau này. Tôi cũng như các anh chị, các bạn học viên, sinh
viên trong nhóm luôn muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô, cảm ơn cô đã
luôn quan tâm và chia sẻ, ủng hộ các thế hệ sinh viên chúng tôi tiếp bước

con đường đóng góp cho khoa học.
TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, người có ảnh hưởng lớn đến việc thôi thúc
tôi gia nhập nhóm Ung thư thực nghiệm mặc dù thời điểm đó tôi chưa có cơ
hội được làm việc cùng cô. Cô không chỉ là người gợi mở, giúp đỡ tôi thực
hiện thí nghiệm mà còn tạo nên trong tôi lòng tin tưởng, mong muốn được
chia sẻ những khó khăn, khúc mắc gặp phải trong công việc và chủ động nêu
lên ý kiến của mình. Tôi đã học được ở cô không chỉ kiến thức, kỹ thuật mà
còn cả tính lạc quan, bình tĩnh xử lý và tháo gỡ những khó khăn gặp phải. Cô
đã, đang và sẽ luôn là một tấm gương cho tôi học tập và cố gắng.
ThS. Bùi Thị Vân Khánh, chị là người tôi có cơ hội được làm việc cùng
ngay từ những ngày đầu gia nhập nhóm nghiên cứu. Với vai trò là thành viên
cơ hữu dày kinh nghiệm, chị đã luôn tận tâm chỉ bảo, chia sẻ những kinh
nghiệm thực nghiệm quý báu và những khúc mắc trong cuộc sống với những

Footer Page 3 of 126.


Header Page 4 of 126.

thế hệ học viên, sinh viên đi sau như tôi. Đặc biệt trong khoảng thời gian
chuẩn bị bảo vệ, chị đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học
nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh nói
riêng đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, cách tư duy, làm việc, tạo
nền tảng vững chắc giúp tôi thực hiện luận văn cũng như công việc của mình
sau này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới những người bạn lớp K51B
Công nghệ Sinh học, các anh chị, các bạn và các em sinh viên đã và đang là
thành viên trong nhóm Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi –
Lý sinh, Khoa Sinh học đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ với tôi những khi tôi gặp

khó khăn trong công việc và cuộc sống. Tôi rất may mắn có được những
người bạn, những người anh chị em thực sự như vậy.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm, ĐH
Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ và TS. Phương Thiện Thương, Viện
Dược liệu Trung ương đã cung cấp mẫu để chúng tôi thực hiện nghiên cứu
này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã luôn ủng
hộ và tin tưởng tôi, góp ý và tôn trọng những lựa chọn của tôi trong suốt
thời gian tôi học tập xa nhà, giúp tôi có một chỗ dựa vững chắc hoàn thành
những lựa chọn của mình.
Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí từ đề tài Trọng điểm
Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QGTĐ 10.28
Hà Nội, tháng 12 năm 2012
Học viên

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

Footer Page 4 of 126.


Header Page 5 of 126.

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ viii
DANH MỤC HÌNH MINH HỌA .............................................................................. ix
BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT ............................................................................. xiii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1.

T ng u n

ung hư .............................................................................. 3

1.1.1.

Một số đặc điểm củ ung hư ................................................... 3

1.1.2.

Các gi i đoạn phá riển củ ung hư ........................................ 5

1.2.

Các m h nh sàng ọc huốc chống ung hư ............................................ 8

1.2.1.

Nu i cấy cơ u n...................................................................... 8

1.2.2.

Nu i cấy tế bào......................................................................... 8

1.2.3.

Nu i cấy khối cầu đ

bào ung hư (mu ice u r umor

spheroid)………………….. ...................................................................................... 10
M h nh in i o ...................................................................... 12

1.2.4.
1.3.

Mộ số

ng ế bào ung hư ................................................................... 14

1.3.1.

D ng ế bào ung hư biểu m ruột kết ở người - HCT116..... 14

1.3.2.

D ng ế bào ung hư biểu m c tử cung ở người - Hela....... 14

1.3.3.

D ng ế bào ung hư biểu m

1.3.4.

D ng ế bào ung hư ú ở người - KPL4 ............................... 16

1.4.

ú ở người - MCF7 ................ 15

Chế ph m Hono io M gno o Derrone à huốc T o ..................... 16

1.4.1.

Hono io (H) à M gno o (M).............................................. 16

1.4.2.

Derrone (D) ............................................................................ 19

Footer Page 5 of 126.


Header Page 6 of 126.

1.4.3.
1.5.

Taxol (Paclitaxel) ................................................................... 20
Enzyme Aurora kinaza .......................................................................... 22

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 25
2.1.

Đối ượng nghiên cứu ............................................................................ 25

2.2.

Máy móc

2.3.

Hó chất sử dụng ................................................................................... 26

2.4.

Phương pháp hoạ hó

2.5.

Phương pháp hử độc ính MTS ............................................................ 28

2.6.

Phương pháp hử độc ính rên m h nh spheroi ................................. 30

2.7.

Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ....................................... 31

ụng cụ ................................................................................. 25

à nhân nu i các

ng ế bào in vitro............... 27

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 33
3.1.

Kế

u

h o sá độc ính củ Hono io M gno o

à Derrone rên m

h nh 2D……………. ................................................................................................. 33
3.1.1.

Với

ng HCT116 .................................................................. 33

3.1.2.

Với

ng He ........................................................................ 38

3.1.3.

Với

ng MCF7 ..................................................................... 41

3.1.4.

Với

ng KPL4 ...................................................................... 44

3.2.

Kế

u nghiên cứu ác động củ Hono io rên m h nh 3D hối cầu đ

bào MCF7………….................................................................................................. 51
3.2.1.

Kết qu

hí nghiệm heo õi sự ăng rưởng khối spheroid

MCF7………………………. ................................................................................... 51
3.2.2.

Kết qu

hí nghiệm kiểm r

ác động củ Hono io ên uá

r nh ạo khối spheroid MCF7 ................................................................................... 54
3.2.3.

Kết qu

hí nghiệm kiểm r

ác động củ Hono io ên sự

ăng rưởng của khối spheroid MCF7 ....................................................................... 56

Footer Page 6 of 126.


Header Page 7 of 126.

3.3.

Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên hệ vi sợi actin ......... 59

3.4.

Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Derrone ên sự phosphory hó

Histon H3 tại vị rí Serine 10 .................................................................................... 62
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 66
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 68

Footer Page 7 of 126.


Header Page 8 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục bảng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao ..........................................................................25
Bảng 2: Thiết bị sử dụng ...........................................................................................26
Bảng 3: Hóa chất sử dụng ........................................................................................26
Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng ......................................28
Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol,
Magnolol và Taxol ....................................................................................................35
Bảng 6: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol và Taxol với dòng HCT116 .............38
Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol và Taxol ....................................39
Bảng 8: Giá trị IC50 của Honokiol và Taxol với dòng Hela .....................................41
Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) của MCF7 với Honokiol và Taxol ..........................43
Bảng 10: Giá trị IC50 của Honokiol (H) và Taxol với dòng TBUT MCF7 ...............44
Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone
và Taxol .....................................................................................................................47
Bảng 12: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol với dòng KPL4 50
Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC50 và chỉ số tương quan R2 của Honokiol, Magnolol,
Derrone và Taxol ......................................................................................................50
Bảng 14:Thể tích của khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau khi hạ giọt treo .........52
Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 trong 15 ngày theo dõi ủ với
Honokiol ....................................................................................................................58

Footer Page 8 of 126.


Header Page 9 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục hình minh họa

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư .................................................................3
Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc .................................................8
Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy .....................................9
Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư ....10
Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người .............................14
Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro ................................15
Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd. Et wils (trái) và cấu trúc
phân tử của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải) .......................................16
Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền
tin dẫn đến apoptosis của tế bào ...............................................................................18
Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo
Derrone .....................................................................................................................19
Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol ..............................................................................20
Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis ................................22
Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin ..........................22
Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza..................................................................24
Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng .....................27
Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .....................33
Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................33
Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................34

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
ix

Footer Page 9 of 126.


Header Page 10 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái);
0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) ..............................................................34
Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H)
...................................................................................................................................36
Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Magnolol (M)
...................................................................................................................................36
Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Taxol ..........37
Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) ...........................38
Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol ở nồng độ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................38
Hình 24: Tế bào Hela ủ Taxol nồng độ 0,003 (trái), 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải)
(100x) ........................................................................................................................39
Hình 25: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Honokiol (H) ....40
Hình 26: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của Hela với Taxol ................40
Hình 27: Tế bào MCF7 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) ........................41
Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol ở nồng độ 5 (trái); 20 (giữa) và
50µg/mL (phải) (100x) ..............................................................................................42
Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), và
30µg/mL (phải) (100x) ..............................................................................................42
Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Honokiol (H) .43

Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Taxol ..............44
Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .........................45
Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................45

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
x

Footer Page 10 of 126.


Header Page 11 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................45
Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ 5 (trái) và 20µg/mL (phải)
(100x) ........................................................................................................................46
Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................46
Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H) ..48
Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M) .48
Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D) ....49
Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol ...............49
Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25

ngày kể từ khi hạ giọt treo.........................................................................................52
Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo ........53
Hình 43: Khối spheroid MCF7 ở mẫu ĐCSH sau 5 (a) và 7 (b) ngày, ủ với
Honokiol NĐ 5µg/mL sau 5 (c) và 7 (d) ngày và không tạo khối khi ủ Honokiol NĐ
10µg/mL (e) ...............................................................................................................55
Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo ....56
Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 và 15
ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) .............................................56
Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 và 15
ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) .............................................57
Hình 47: Các khối spheroid dưới tác động của Honokiol trở nên lỏng lẻo về mặt
cấu trúc, các tế bào bên ngoài bong tróc ra khỏi khối từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt
treo (400x) .................................................................................................................57

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
xi

Footer Page 11 of 126.


Header Page 12 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của
Honokiol (H) .............................................................................................................58

Hình 49: Ảnh hưởng của Honokiol lên hình thái tế bào Hela. Tế bào đối chứng
(trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam:
nhân tế bào ................................................................................................................60
Hình 50: Sự rối loạn phân bố của F-actin dưới tác động của Honokiol tại NĐ 10
µg/mL sau 48h ủ. .......................................................................................................60
Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol tại NĐ 20µg/mL. .............................61
Hình 52: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của
tế bào. ........................................................................................................................64
Hình 53: So sánh biểu hiện của H3PS10 tại các mẫu tế bào xử lý với Derrone (b);
Magnonol (c); Honokiol (d) và mẫu đối chứng (a). .................................................65

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
xii

Footer Page 12 of 126.


Header Page 13 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT
VIẾT ĐẦY ĐỦ

VIẾT TẮT
ADN

Acid deoxiribinucleic

ARN

Acid ribonucleic

c-FLIP

FLICE-like inhibitory protein

D

Derrone

ĐCDM

Đối chứng ung m i

ĐCSH

Đối chứng sinh học

DMEM

Du becco’s mo ifie E g e me ium

FBS

Huyế h nh h i bê – Fetal bovine serum

FLICE

Caspase 8

H

Honokiol

HCT116

Human colorectal carcinoma cell line

HeLa

Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line

KHV

Kính hiển vi

KPL4

Human breast cancer cell line

M

Magnolol

MCF7

Human breast adenocarcinoma cell line
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-

MTS

carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium)

NĐ

Nồng độ

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
xiii

Footer Page 13 of 126.


Header Page 14 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

NST

Nhiễm sắc thể

PBS

Đệm phosphate saline – Phosphate buffered saline

PMS

Phenazine methosulfate

TBUT

Tế bào ung hư

TNF

Tumor necrosis factor

TRAIL

TNF-related apoptosis-inducing ligand

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
xiv

Footer Page 14 of 126.


Header Page 15 of 126.

Luận văn cao học

Mở đầu

MỞ ĐẦU
Ung hư à nguyên nhân gây chế hàng đầu ở các nước có n n kinh tế phá
triển à hứ hai ở các nước đ ng phá riển. Gánh nặng ung hư ở các nước đ ng
phá riển ăng ên o hậu qu của sự ăng ân số già hó

ân số cũng như sự du

nhập lối sống có i m năng gây ung hư như hú huốc á í

ận động à hực ph m

“Tây hó ”. Theo T chức Y tế thế giới – WHO có ho ng 12.7 triệu c ung hư à
7,6 triệu ca tử ong o ung hư được ghi nhận rong năm 2008 rong đó 56% số ca
à 64% rường hợp tử ong à ở các nước đ ng phá riển. Cũng heo dự báo của
WHO, tới năm 2020, số người mắc ung hư rên oàn cầu có hể ăng ên đến 15
triệu ca mới mỗi năm. Tỷ lệ chế

o ung hư có hể chiếm 25% t ng số ca tử vong.

Theo số liệu c ng bố tại Hội th o Quốc gi ph ng chống ung hư năm 2010 Việt
N m có 126.300 c mắc mới. Căn bệnh n n y này đ ng ăng nh nh so ới 10 năm
rước [1].
Vốn à mộ đấ nước được hiên nhiên ưu đãi nằm rong ùng nhiệ đới gió
mù Việ N m có một th m thực vậ

cùng phong phú à đ

oài hực vật bậc c o hác nh u. Từ nhi u thế kỷ nay, thực vậ

ạng với hơn 12.000
h ng chỉ à nguồn

cung cấp inh ưỡng cho con người mà c n à những phương huốc chữa bệnh hết
sức uý giá b o gồm thuốc chống ung hư nói riêng à các bệnh hác nói chung.
Bởi vậy, nghiên cứu m r các hợp chất từ nguồn ược liệu hiên nhiên có h năng
chữ ung hư à mộ hướng nghiên cứu được nhi u nhà hoa học à hầy thuốc đầu
ư ập rung nghiên cứu trong nhi u năm n y.
Trong u hướng này chúng

i iến hành nghiên cứu hoạ ính háng u của

ba chất Hono io M gno o được ách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis
Rehd. Et wils, Magnoliaceae

à Derrone được ách chiết từ cây V ng nem

Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp
cho nhóm Nghiên cứu Ung hư hực nghiệm, Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa
học Tự Nhiên Đại học Quốc gi Hà Nội nhằm mục đích:

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
1

Footer Page 15 of 126.

Header Page 16 of 126.

Luận văn cao học
Kh o sá

Mở đầu
nh hưởng của ba chất Honokiol, M gno o

sự tăng rưởng của một số

à Derrone ên

ng ế bào ung hư nu i cấy đơn ớp 2D.

Nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên m h nh 3D hối cầu đ bào
các tế bào ung hư.
Bước đầu nghiên cứu cơ chế ác động của Hono io ên hệ thống vi
sợi à ác động của ba chấ ên hoạ động của enzyme Aurora kinaza ở
tế bào ung hư.

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
2

Footer Page 16 of 126.

Header Page 17 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1.

T n

an

n

h

1.1.1. Một số đặc điểm của ung thư
Trong uá r nh đ gi i đoạn h nh hành hối u, tế bào ung hư (TBUT) thu
nhận à biểu hiện nhi u đặc điểm rong đó có sáu kh năng sinh học n i bật tạo nên
đặc ính phức tạp v mặt t chức của bệnh, bao gồm: duy r ín hiệu ăng sinh; rốn
ránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân ên gần
như bất tử; c m ứng h nh hành mạch máu à hoạ hó
Nguyên nhân sâu

uá r nh âm ấn à i căn.

của những đặc điểm đặc rưng này à sự bất n của hệ gen

trong TBUT dẫn đến những biến đ i v mặt di truy n đồng thời cũng hỗ trợ các

chức năng rên. Ngoài r

những nghiên cứu gần đây đ xuất hêm h i đặc rưng

hác củ ung hư b o gồm sự ái ập r nh r o đ i năng ượng à sự trốn ránh hệ
thống miễn dịch. Tuy nhiên cần những nghiên cứu sâu hơn để h i đặc rưng mới
này được c ng nhận rộng rãi [14].

Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
3

Footer Page 17 of 126.


Header Page 18 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

V mặ h nh hái TBUT có sự h y đ i há rõ né so ới tế bào b nh hường:


V nhân: Nhân ăng ích hước đ

ạng, nhi u hùy đặc biệ có những

nhân h ng lồ phân chi mạnh gọi à nhân uái nhân chi . Màng nhân
ày ên à đường vi n h ng đ u.


V tỷ lệ giữ nhân à nguyên sinh chấ : Nhân o ên rong hi nguyên
sinh chất hẹp lại.



V nguyên sinh chấ : Có nhi u t n hương hoái hó như nhi u hang,
hốc… Nguyên sinh chất chứ các chất chế tiết, thể ùi.



Kh ng c n h năng ức chế tiếp úc nên ễ bong ra khỏi u.

V mặt chức năng TBUT biệ hó

ém

h ng hực hiện được những chức

năng b nh hường à ễ hoại tử. Đặc biệ chúng iế r các chất chỉ điểm được gọi
à m r er như µFP CA125 (ung hư buồng trứng) CA25 (ung hư đại ràng) HCG
(ung hư nhau thai inh hoàn)…
Khi u n sá

uần thể TBUT các nhà ho học đã đư r ba học thuyế

hác

nhau nhằm gi i hích nguồn gốc quần thể này:


Thuyế đơn

ng: Là u n niệm inh điển cho rằng khối u phá sinh ừ

một tế bào mẹ nhân ên. Ví ụ: Ở bệnh bạch cầu tủy rên phụ nữ
thấy đồng nhất loại tế bào hương

đen

n NST số 10. Các ế bào này đ u tiết

men Glucose-6-phosphate dehydroglubuline.


Thuyế đ

ng: Dự

rên ết qu

u n sá h nh hái à chức năng cho

thấy t chức ung hư có nhi u loại tế bào nên hi chu n đoán ế bào học
dễ nhầm lẫn à có nhi u marker sinh học.


Thuyết v

ém n định gen của TBUT: Có hể b n đầu à mộ

ng

o

gen ung hư h ng n định nên có các ế bào biến dị sinh r hàng oạ các
tế bào hỗn hợp. Ví ụ: u lympho ác ính ế bào ớn, tế bào nhỏ hoặc các
loại ung hư ph i thể hỗn hợp ung hư m

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
4

Footer Page 18 of 126.

iên ết thể hỗn hợp.


Header Page 19 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

1.1.2. Các giai đoạn phát triển của ung thư

Theo Doug s à Rober Weinberg

uá r nh iến triển củ ung hư có hể

chi àm 6 gi i đoạn chính:


Gi i đoạn khởi phá : Các TBUT nhận được các ín hiệu húc đ y sự ăng

sinh à phân bào. Các ín hiệu này có hể xuất hiện do sự h y đ i củ các yếu
tố ngoại bào hoặc do sự h y đ i bên rong hệ thống truy n ín hiệu nội bào
dẫn tới sự ăng sinh à phân bào. Thậm chí rong một số rường hợp đặc biệt,
các ín hiệu ích hích phân bào có hể được tạo ra từ chính các TBUT. Khi đó
tế bào được ích hích phân chi
à hoàn ất trong mộ

h ng giới hạn. Quá r nh này iễn ra nhanh

ài giây h ng hể đ o ngược được. Trong cuộc đời một

con người có nhi u tế bào rong cơ hể có hể tr i u

uá r nh hởi phá

nhưng h ng ph i tất c các ế bào đ u phá sinh bệnh. Đ số các ế bào hởi
phá hoặc h ng iến triển, hoặc chế đi hoặc bị cơ chế miễn dịch


Gi i đoạn húc đ y: Các ế bào rở nên “

hiệu hó .

c m” mộ cách bấ hường với

các ín hiệu ức chế phân bào. Trong các ế bào b nh hường, sự phân bào
hường được ích hoạt bởi các ín hiệu nhấ định; à ồn tại song song với
chúng à các ín hiệu ức chế phân bào. B nh hường h i cơ chế này cùng tồn
tại à phối hợp với nhau ở mức cân bằng
à có

ậy sự phân bào iễn ra n định

chức. Ở các TBUT h sự ngăn c n phân bào bị ê iệ

hi đó ế bào sẽ

u n được chuyển từ ph G1 s ng S để tiến hành s o chép ADN à bước ào
mộ chu r nh ế bào mới bất kể các s i hỏng ADN có được khắc phục hay
h ng. Các ế bào s u gi i đoạn ăng rưởng này sẽ tiếp tục phá riển hành
các hối u ác ính.


Gi i đoạn chuyển biến: Như

đã biết, protein p53 giữ

i r

u n rọng

rong uá r nh b o vệ cơ hể chống lại sự ích ũy s i hỏng ADN có hể gây
nguy hiểm cho cơ hể. Khi p53 bị mất chức năng này h con đường apoptosis
của tế bào h ng hoạ động. V

ậy tế bào hỏng có hể sống à iếp tục nhân

ên nh nh chóng. Những tế bào này có u hướng tạo r các hế hệ tế bào con

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
5

Footer Page 19 of 126.


Header Page 20 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

có mức độ sai hỏng c n c o hơn chính nó. Hậu qu

à mỗi tế bào con h nh

hành đ u có nguy cơ chuyển hành các TBUT. Như ậy có hể nói
hoá

hỏi cơ chế chế

h năng

heo chương r nh à “cột mốc” u n rọng để một

TBUT phá riển hành hối u ác ính.


Gi i đoạn n ràn: Các TBUT có h năng s o chép

tế bào som

ận. Ở người, mỗi

hường chỉ có h năng s o chép rung b nh ho ng 60 – 70 lần.

Tuy nhiên các TBUT có hể ượ

uá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần

đầu mú nhiễm sắc thể được éo ài nhờ hoạ động mạnh của enzyme ADN
telomeraza. Khi các TBUT đạ đến gi i đoạn này chúng được gọi à các ế bào
bất tử. Gi i đoạn này có hể ngắn ài háng hoặc cũng có hể éo ài ài năm.
Trong gi i đoạn này

hối u bành rướng gi

ăng có hể từ 100 đến 1 triệu tế

bào nhưng ẫn c n uá nhỏ để các phương pháp ho học phá hiện được.



Gi i đoạn củng cố: Các ế bào phá riển hệ thống tự nu i ưỡng. Các m

rong cơ hể đ bào đ u cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh
ưỡng. Các ế bào hối u ti n ác ính hường ăng rưởng chậm o chúng được
nu i ưỡng bởi hệ tuần hoàn b nh hường. Nhưng ở các TBUT, khi khối u phá
triển đến một mức nhấ định h

uất hiện sự h nh hành mạch máu mới. Lúc

này các hối u được nu i ưỡng à phá riển rất mạnh. Đây à mộ bước
“củng cố” các TBUT ác ính h nh hành mạch máu mới nu i ưỡng các hối u,
giúp hối u phá riển mạnh mẽ à gây nguy hiểm cho cơ hể.


Gi i đoạn âm ấn à i căn: Ở gi i đoạn này các TBUT có h năng
âm ấn ào các ùng m

hác à h nh hành hối u mới. Hơn 90% số bệnh

nhân bị ung hư đ u chế

ào gi i đoạn hi các TBUT đã i căn ới các phần

hác nh u củ cơ hể. Khi các hối u i căn các TBUT rời khỏi khối u nguyên
phá

à i chuyển dọc heo đường máu hoặc đường bạch huyết tới các ị rí

hác nh u rong cơ hể rước hi chúng rú ngụ ở vị rí mới à h nh hành hối
ung hư mới. Di căn heo đường bạch huyế hường gặp nhi u rong ung hư
biểu m

có hể

n ràn heo đường bạch huyết tại chỗ à đ i hi àm ắc, rồi

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
6

Footer Page 20 of 126.


Header Page 21 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

n đến mạch bạch huyế

ùng. Trong phương hức i căn heo đường kế cận,

các TBUT đi heo mạch máu à hần kinh, theo lối í
hư ạ ày

n u

ớp thanh mạc ào

hi bị c n trở như ung

bụng đến buồng trứng… Di căn heo

đường máu hường gặp nhi u ở ung hư m

iên ế . Khi đó ế bào ế húc ở

mao mạch à ăng rưởng ở đó. Như ậy kết qu

i căn à sự h nh hành các

khối u thứ cấp ở vị rí có hể cách rất xa vị rí hối u nguyên phá b n đầu. Khi
ung hư đã iến triển đến gi i đoạn này h sự kiểm soá

à đi u trị cực kỳ hó

hăn. Đây à gi i đoạn cuối cùng à nguy hiểm nhấ rong uá r nh phá riển
củ ung hư. Với khối u ành ính, gi i đoạn này h ng
trong khối u ành ính sinh s n chậm à bám ào các m

y ra. Các ế bào
iên ết tại chỗ, khối

u có r nh giới rõ ràng à h ng gây c m giác đ u cho người bệnh nếu ích
hước khối u h ng uá o h y chèn ép ào ây hần inh. Do đó hối u ành
h ng gây nguy hiểm cho người bệnh à ễ chữa trị [14, 32, 36].

Kể từ hi ung hư uất hiện, lịch sử oài người đã sử dụng à phá riển nhi u
phương pháp hác nh u để chống lại căn bệnh này như gi i phẫu, vậ ý rị liệu hó
trị liệu, miễn dịch trị liệu đi u trị hướng đích…
Trước đây huốc chống ung hư được đư

ào nhóm phương pháp hó

liệu, trị liệu hóc m n à miễn dịch trị liệu. Trong đó hó

rị liệu lại bao gồm nhi u

nhóm hác nh u ùy theo cấu rúc hó học à cơ chế ác động như nhóm
nhóm háng sinh nhóm chống chuyển hó
nhóm ức chế phân bào các hợp chấ p

rị

y hó

nhóm ức chế topoisomeraza I à II

inum à các hợp chấ

hác. Tuy nhiên

nhóm cuối cùng này ẫn đ ng ngày càng mở rộng nên các nhà ho học đã đ xuất
cách hức phân oại mới dự

rên đích ác động. Cụ thể các nhà ho học cho rằng

thuốc chống ung hư có hể ác động ở nhi u mức độ hác nh u: TBUT, nội m
chất n n ngoại bào h y hệ thống miễn dịch. TBUT có hể trở hành đích ác động ở
mức độ ADN, ARN hay protein. Hầu hế các ác nhân hó

rị liệu ương ác ới

ADN của TBUT rong hi các háng hể đơn

ng à các phân ử nhỏ được thiết kế

để ác động ở mức độ protein, mức độ nội m

à mức độ chất n n ngoại bào. Dù ở

mức độ nào các hợp chấ để được phá riển hành huốc sử dụng cho người đ u cần

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
7

Footer Page 21 of 126.


Header Page 22 of 126.

Luận văn cao học
tr i qua mộ

Tổng quan

uá r nh sàng ọc nghiêm ngặt rên nhi u đối ượng cũng như uy m

hác nh u. Trong lịch sử phá riển ĩnh ực sàng ọc thuốc, đã có một số m h nh
được sử dụng như:
1.2.

C c

h nh

n

ọc h

c ch n

n

h

1.2.1. Nuôi cấy cơ quan
Đây à oại m h nh được sử dụng từ những năm 1950. Các cơ u n được
ách r

hỏi cơ hể đem nu i cấy in vitro. S u đó chúng được ương ác ới các hợp

chất cần thử. Ưu điểm củ m h nh này à uy r được ính nguyên ẹn củ m
cũng như mối quan hệ giữa tế bào ới tế bào nhờ vậy mà nó có ính ương đồng cao
với đi u kiện in vivo. Tuy nhiên

o những hó hăn trong hác biệt v mẫu mà

việc đánh giá hiệu qu của thuốc có nhi u sai số, do vậy việc sử dụng m h nh này
bị hạn chế

à hó để áp ụng ào sàng ọc thuốc uy m

ớn [4].

Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc

1.2.2. Nuôi cấy tế bào
Như

đã biế các hử nghiệm độc ính b n đầu được tiến hành rên sinh

thiết khối u nu i cấy nhân ạo rong m i rường có hành phần h ng ác định, do
vậy uá r nh định ượng rấ

hó hăn. Năm 1950, nhờ sự phá riển củ c ng nghệ

nu i cấy tế bào hành ạng đơn ớp 2D rong đĩ Pe ri hủy tinh hoặc nhựa, kết hợp

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
8

Footer Page 22 of 126.

Header Page 23 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

với sự phá riển củ m i rường có hành phần ác định v mặ hó học nên uy
r nh sàng ọc thuốc được tiến hành đơn gi n hơn rên các tế bào nu i cấy 2D này.
Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng
quan hệ đáp ứng li u giữ các

ác định được mối

ng ế bào hác nh u ới các nồng độ thuốc thử

hác nh u [39].
Các tế bào hi được phân ập đem nu i cấy in vitro hường phá riển hành
dạng hoặc r i n i, hoặc bám ính, hoặc hỗn hợp c 2 loại. Các oại TBUT sống r i
n i như ế bào u ympho TBUT máu h y ế bào ung hư m

iên ết Sarcoma-180.

Các ế bào này phá riển giống những h n đ o nhỏ r i n i rong m i rường nu i
cấy. Nhi u tế bào sống ở dạng bám ính như nguyên bào sợi, TBUT c tử cung
HeLa, TBUT ú KPL4… Một số tế bào sống ở dạng hỗn hợp c bám ính c

r i

n i như TBUT biểu m ph i 3LL [11, 27, 39].

Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy

Sử dụng m h nh tế bào 2D có nhi u ưu điểm như hời gi n sàng ọc ngắn,
cho phép h o ác ới nhi u

ng ế bào nhi u hợp chấ

hác nh u à

i nồng độ

rộng cùng mộ úc. Tuy nhiên m h nh này có nhược điểm à ương ác giữa TBUT
với hợp chất chỉ theo một chi u, thiếu sự ương ác giữa TBUT với hệ miễn dịch

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
9

Footer Page 23 of 126.


Header Page 24 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

cũng như của hệ miễn dịch với hợp chấ . Như ậy m h nh này h ng m phỏng
được đi u kiện in vivo củ cơ hể [39].
1.2.3. Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư (multicellular tumor spheroid)
M h nh nu i cấy khối cầu đ bào ung hư gọi tắ à m h nh spheroi

à

một khối h nh cầu được tạo nên ừ TBUT. Để tạo được m h nh này người ta tiến
hành nu i cấy giọ reo các TBUT. Dưới ác dụng của trọng lực cùng ới các iên
kết giữ các ế bào các TBUT tập trung lại à iên ết với nhau tạo nên các hối
cầu nhỏ. S u đó các hối cầu nhỏ này được đư

ào các đĩ nu i cấy chứ m i

rường nu i cấy ương ứng đã phủ một lớp giá đỡ bên ưới [11, 39].

Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư

Cấu rúc của một khối spheroid bao gồm:


Lớp

ng ngoài: Gồm kho ng từ 2-3 lớp tế bào sống phân chi mạnh

xếp hí nh u. Độ ày mỏng của lớp này ùy huộc từng

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm

10

Footer Page 24 of 126.

ng ế bào hác


Header Page 25 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

nh u ùy đi u kiện m i rường à ùy nguồn tế bào b n đầu ùng để tạo
spheroid.


Lớp trung gian: Gồm những tế bào ẫn sống nhưng đã ngừng phân chi .
Các ế bào củ
ngoài hoặc

ùng này có hể h

nhập để hành những tế bào củ

ng

ng rong ùy thuộc đi u kiện nu i cấy (có mạch máu hoặc

h ng nồng độ g ucozơ pH…). V i r củ

ùng này há u n rọng

rong các hí nghiệm đi u trị ung hư bằng hó chất, xạ trị.


Lớp rong cùng: à õi hoại tử, bao gồm những tế bào đã chết, có nhân
kế đặc lại nên ánh sáng u ng học h ng hể uyên u được,
này có màu đen hi u n sá

ậy lớp

ưới ính hiển i. Độ ày mỏng của lớp này

ùy huộc ào ừng gi i đoạn hác nh u của uá r nh sinh rưởng khối
spheroid [34].
So với m h nh nu i cấy tế bào đơn ớp h cấu rúc của spheroid gần giống
với hệ thống in vivo hơn. Các nghiên cứu gần đây cho hấy các tế bào được nu i cấy
rong m h nh 3D biểu hiện các đặc ính hác so ới khi nu i cấy 2D. Những sự
hác biệ này được coi như à yếu tố giúp m h nh 3D ph n ánh ố hơn sự ương ác
giữ các TBUT với m i rường in vivo như:


V đặc điểm h nh hái: Các TBUT nu i cấy 2D có h nh hái r i rộng
h ng ự nhiên c n các TBUT nu i cấy 3D có sự iên ết chặt chẽ ba
chi u, co cụm giống với khối u in vivo.



V tốc độ ăng rưởng: Các TBUT nu i cấy 3D phá riển chậm hơn so

với hi nu i cấy 2D. Tốc độ phá riển ở m h nh 3D ph n ánh các m
h nh oán học động học của khối u in vivo tốt hơn so ới m h nh 2D.



Các TBUT rong m h nh 3D cũng biểu hiện uá r nh đường phân nhi u
hơn à có sự hác biệt trong biểu hiện ở các gene chịu rách nhiệm trong
uá r nh ăng sinh mạch máu như VEGF ( scu r en o he i

grow h

factor), chemokine, IL-8 à các gene chịu rách nhiệm rong uá r nh i

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
11

Footer Page 25 of 126.