Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ TOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH
SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU
CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02
PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số:62.64.01.02

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2017
1


Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN
2. PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT

Phản biện 1:

PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 2:

PGS.TS. TÔ LONG THÀNH
Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng

Phản biện 3:

PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ
Hội Thú y

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi

giờ, ngày

tháng

năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
-

Thƣ viện Quốc gia Việt Nam

-

Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi. Bệnh xuất
hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 (Keffaber, 1989), rất nhanh chóng sau đó
bệnh lan sang Canada và sau đó lan sang các nước Châu Âu. Năm 1991,
virus được tìm thấy tại Hà Lan (Terpstra et al., 1991). Năm 1998, bệnh
được phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực Châu Á. Từ năm
2005 trở lại đây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới. Bệnh tai
xanh do một loại virus gây ra, virus tấn công là các đại thực bào dẫn đến
hiện tượng suy giảm miễn dịch ở lợn, tạo điều kiện cho các virus, vi khuẩn
gây bệnh khác tấn công.Tác nhân gây bệnh - virus PRRS (PRRSV) là một
thành viên của giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales (Collins
et al., 1992). PRRS lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam vào năm 1997,
thực tế cho thấy virus vẫn tồn tại và không ngừng biến đổi, cần có những
nghiên cứu mới về PRRSV tại Việt Nam, để thấy rõ có sự khác biệt hay
không với các chủng cổ điển đã phân lập trên thế giới cũng như trả lời cho
câu hỏi tại sao vắc-xin PRRS được sử dụng mà dịch bệnh vẫn thường
xuyên xảy ra. Nguyên nhân chúng ta chưa có thông tin chính xác về các
chủng PRRSV thực tế đang lưu hành tại Việt Nam, cũng như những đặc
tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus này.
Trong các nghiên cứu gần đây của Khoa Thú y – Học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu được một số triệu chứng lâm sàng, đặc
điểm bệnh lý của lợn mắc PRRS tự nhiên và cũng đã phân lập được một số
chủng PRRSV gây bệnh từ đàn lợn nuôi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam
trên môi trường tế bào Marc 145. Trong các chủng phân lập được, có các
chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được phân lập từ các lợn có
triệu chứng và bệnh tích khá điển hình của lợn mắc PRRS, gây tỷ lệ ốm, tỷ
lệ chết cao. Tuy nhiên vẫn chưa đánh giá hết được đặc tính sinh học và sinh
học phân tử của các chủng virus này. Để phục vụ mục đích lựa chọn chủng
chế tạo vắc-xin, đánh giá hiệu quả của vắc-xin hoặc sản xuất chế phẩm sinh

học phòng, trị bệnh cho vật nuôi thì việc nghiên cứu các đặc tính sinh học
và sinh học phân tử của các chủng virus phân lập được là vô cùng quan
trọng và cấp thiết.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu chung
Mục tiêu của luận án nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có
đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ
gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu như: sản xuất vắc-xin phù


hợp có hiệu quả bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị
PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí
nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm
chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng
dùng trong dịch tễ học phân tử.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
Xác định được một số đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus
PRRS HUA 01, PRRS HUA 02.
Xác định được một số đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus
PRRS HUA 01, PRRS HUA 02.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 đã được khoa Thú y –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi về không gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên
đối tượng là chủng virus PRRS HUA 01 được phân lập tại tỉnh Hải Dương
(năm 2013) và chủng virus PRRS HUA 02 được phân lập tại tỉnh Hưng
Yên (năm 2013).
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh

học Thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý, khu nuôi động vật thí
nghiệm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện từ năm 6/201412/2016.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Những vắc-xin được sử dụng để phòng bệnh tại Việt Nam hiện nay
chưa mang lại hiệu quả rõ rệt. Điều này cho thấy có một sự sai khác đáng
kể về tính kháng nguyên của chủng virus PRRS gây bệnh trên đàn lợn ở
Việt Nam với chủng virus PRRS của vắc-xin nhập ngoại vì vậy mà kháng
thể kháng virus PRRS có trong lợn được tiêm phòng không thể bảo hộ
được chúng khỏi các chủng virus PRRS thực địa. Nghiên cứu sự tương
đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS phân lập và các chủng
virus vắc-xin cho phép xác định được tính tương đồng giữa các chủng virus
này, từ đó đưa ra các thông tin chính xác về sự lưu hành của các chủng
virus PRRS ở Việt Nam. Đồng thời cho phép lựa chọn được các chủng
virus PRRS thích hợp để sử dụng làm vắc-xin.
Luận án nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của một số
chủng virus PRRS đã được phân lập từ trước đó là một trong những nghiên
cứu mới và cần thiết để lựa chọn ra được các chủng virus điển hình cho
virus gây bệnh tại Việt Nam và có tiềm năng để sản xuất vắc-xin, thử độc
2


lực của vắc-xin hoặc các chế phẩm sinh học nhằm phục vụ cho chẩn đoán,
phòng, trị bệnh cho lợn.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Các thông tin khoa học, những kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh
học và sinh học phân tử của 02 chủng PRRSV phân lập được tại một số tỉnh
phía Bắc Việt Nam là cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu sâu
hơn về PRRS như nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng, nghiên cứu sản

xuất vắc-xin, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán, bảo tồn nguồn gene virus
thực địa với các đặc tính sinh học rõ ràng và đầy đủ.
Kết quả của luận án sẽ chỉ ra được các đặc tính sinh học và sinh học
phân tử cũng như độc lực của một số chủng PRRSV sẽ rất có ích cho lĩnh
vực thú y nói riêng và lĩnh vực công nghệ sinh học nói chung. Tạo ra được
những tiến bộ khoa học, phát triển các hướng nghiên cứu về công nghệ sinh
học trong lĩnh vực thú y.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả của luận án sẽ đưa ra những thông tin về đặc tính sinh học, sinh
học phân tử của một số chủng virus PRRS nghiên cứu để có thể lựa chọn được
chủng virus tiềm năng dùng để chế vắc-xin phòng bệnh hoặc chế kháng
nguyên chẩn đoán bệnh hoặc làm chủng cường độc để thử hiệu lực của vắcxin. Như vậy các chủng virus này có thể giúp ích cho các công ty sản xuất
vắc-xin hoặc các cơ sở nghiên cứu. Sản xuất được vắc-xin trong nước, giúp
chúng ta không phải lệ thuộc vào sự nhập khẩu vắc-xin và có thể chủ động
trong việc phòng chống dịch PRRS nhằm giảm thiểu tối đa thiệt hại kinh tế
cho người chăn nuôi, giúp phát triển một ngành chăn nuôi bền vững.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive
and Respiratory Syndrome - PRRS) được ghi nhận lần đầu tiên trong các
báo cáo về các thiệt hại của ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ. Tại các ổ
dịch có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng của PRRS đã được báo cáo ở
Mỹ vào cuối những năm 80 của thế kỉ trước (1987) người ta thấy số lượng
lợn chết trong điều kiện bình thường tăng lên và lợn chậm lớn. Các triệu
chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi ở lợn
con sau cai sữa, chậm lớn, giảm năng suất và tỷ lệ tử vong tăng (Keffaber,
1989). Hai năm sau các ổ dịch có các triệu chứng lâm sàng tương tự đã
được báo cáo ở CHLB Đức (1990). Năm năm sau kể từ khi có báo cáo đầu
tiên về bệnh, năm 1991 virus được tìm thấy lần đầu tiên tại Hà Lan.

3


(Terpstra et al., 1991). Sau đó không lâu, virus PRRS được Mỹ đặt tên là
ATCC VR – 2332) (Collins et al., 1992).
2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam
Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên
đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam. Kết quả kiểm tra thấy 10/51
lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS. Toàn bộ số lợn
này đã được xử lý vào thời gian đó. Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo,
các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho
thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3%
cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2007).
Theo thống kê của Cục Thú y, đợt dịch đầu tiên xảy ra vào ngày
12/3/2007 và sau đó lây lan ra khắp cả nước. Từ năm 2007 đến nay, PRRS
luôn là vấn đề thời sự bởi tính nguy hiểm của nó.
2.2. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS
2.2.1. Cấu trúc virus PRRS
Virus PRRS là một virus RNA chuỗi đơn dương, virus này được xếp
vào bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins et al., 1992).
Họ Ateriviridae chỉ có một giống Aterivirus bao gồm hai thành viên là:
Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sảy thai và viêm phổi
ngựa non; Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV)
gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn.
2.2.2. Phân loại virus PRRS
Về tính đa dạng di truyền, virus PRRS có hai prototyp, phân lập ở
châu Âu (virus Lelystad-LV) và phân lập ở Bắc Mỹ (VR-2332). Ngoài sự
khác biệt giữa các lần phân lập người ta đã chứng minh được có sự biến dị
di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập, được khẳng định qua phân tích
trình tự Nucleotid và Aminoacid của các khung đọc mở (ORFs) của LV và

VR-2332. Trình tự Aminoacid của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2),
72% (ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7). Phân tích trình
tự cho thấy các virus đang tiến hóa do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp
trong gene. Theo Murtaugh et al. (1995), Meng et al. (1995) và Nelsen et
al. (1999) các chủng virus này gây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh
cảnh giống nhau nhưng chúng lại đại diện cho 2 genotyp khác biệt.
2.2.3. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS
2.2.3.1. Tính chất nuôi cấy của virus PRRS
Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus. Tuy nhiên
virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế
nang lợn (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (Marc
145, CL2621).
4


2.2.3.2. Một số nghiên cứu về khả năng nhân lên của virus PRRS trên
môi trường tế bào Marc 145 thông qua khả năng gây bệnh tích tế bào
Nghiên cứu của Martha et al. (2009) đã sử dụng 2 dòng tế bào là đại
thực bào phế nang (PAM) và MA104 để phân lập virus PRRS từ các mẫu thu
thập được. Nghiên cứu của Fang et al. (2006) đã chọn chủng virus PRRS là
YA được phân lập từ phổi lợn mắc triệu chứng cấp tính với PRRS tại một tỉnh
của Trung Quốc và được xác định là thuộc serotype Bắc Mỹ độc lực cao.
2.2.3.3. Một số nghiên cứu về quy luật nhân lên của virus PRRS trên môi
trường tế bào
Nghiên cứu của Fang et al. (2006) đã thực hiện nghiên cứu đặc điểm
sinh trưởng của virus trong điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào Marc-145.
Virus được tiến hành gây nhiễm trên môi trường Marc 145 với giá trị MOI
= 0,1. Nghiên cứu của Han et al. (2007) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm
sinh trưởng của virus trên dòng tế bào MA 104 trên môi trường nuôi cấy tế
bào bằng bình T25 với giá trị MOI là 5 x 104 PFU. Nguyễn Thị Lan và

Lương Quốc Hưng (2012) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của một số
chủng phân lập tại Việt Nam.
2.2.4. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS
Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác nhau trên thế
giới (Nelson et al., 1993) PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu
gene: loại I, European gienotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện
là chủng Lelystad (LV), gồm 3 subtype đã được xác định trong đó, subtype
1 được chia thành 12 clade khác nhau, subtype 2 được chia thành 9 clade
(Shi et al., 2010); loại II: Northern American gienotype gồm những virus
thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc Mỹ ATCC - VR2332.
PRRSV phân lập ở Trung Quốc được chỉ định là thành viên của kiểu gene II.
Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng
nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn
Thị Lan, 2007). Sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gene có khoảng 15
kb, mã hóa 9 ORFs. Bộ gene PRRSV bao gồm hai gene polymerase là ORF1a
và ORF1b và bảy gene cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, và 7. Một số nghiên
cứu khác về gene ORF5: ORF5 là gene mã hóa cho một glycoprotein xuất hiện
phần lớn trên bề mặt của virus PRRS. Trình tự protein GP5 được dự đoán có
chứa vùng trình tự tín hiệu (từ amino acid 1-32), 2 vùng trình tự ectodomain
ngắn (từ amino acid 32-64 và amino acid 89-109) và vùng trình tự endodomain
(từ amino acid 110-200) (Li and Murtaugh, 2012; Kim et al., 2014). Nghiên
cứu mức độ tương đồng của gene ORF5 cho thấy, các chủng virus PRRS lưu
hành ở Việt Nam có mức độ tương đồng cao với các chủng của Trung Quốc
(Metwally, 2010). Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất
khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn
5


Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007). Những nghiên cứu còn cho thấy có sự
khác biệt về tính di truyền trong các virus được phân lập từ các vùng địa lý

khác nhau. Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về
chuỗi nucleotid khá cao đến 20% về trình tự và số lượng ribonucleotide,
điển hình là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Nguyễn Bá Hiên và
Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007). Nghiên cứu của Đỗ Hải Quỳnh và cs. (2016) khi
phân tích đa dạng di truyền gene ORF5 của một số chủng virus phân lập tại
miền Bắc Việt Nam từ năm 2011-2013 cũng chỉ ra mức độ tương đồng về
nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng JXA1 là rất cao.
2.3. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ
SINH SẢN Ở LỢN (PRRS)
2.3.1. Truyền nhiễm học
2.3.1.1. Loài vật mắc bệnh
PRRSV gây bệnh cho lợn ở mọi lứa tuổi, nòi giống nhưng mẫn cảm
nhất vẫn là lợn con và lợn nái mang thai. Thông thường virus PRRS chỉ gây
bệnh cho lợn không gây bệnh cho người và các động vật khác. Tuy nhiên,
một số loại gia cầm như vịt trời (Mallard duck) đã được chứng minh là rất
mẫn cảm với virus PRRS và virus có thể nhân lên ở loài vịt này
(Zimmerman et al., 1997).
2.3.1.2. Cơ chế sinh bệnh
Virus có đặc điểm rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực
bào vùng phổi. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt
virus, vì thế virus hấp phụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này
và phá huỷ nó. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và
giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng
của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng
bị nhiễm khuẩn kế phát (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007).
2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích
Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
chủng virus, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường... và sự kế phát của một
số vi sinh vật khác. Theo các tác giả Lê Văn Năm (2007), Phạm Ngọc
Thạch và Đàm Văn Phải (2007) thì lợn con theo mẹ có tỷ lệ ốm và chết cao

nhất. Lợn sau cai sữa, lợn vỗ béo có tỷ lệ chết cao thứ 2. Nái nuôi con và
nái mang thai có tỷ lệ ốm, chết thấp hơn.
Bệnh tích tập trung ở phổi. Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song
cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện đối xứng. Các ổ
viêm, áp xe thường có màu xám đỏ, rắn, chắc. Mô phổi lồi ra và có màu đỏ
xám loang lổ như tuyến ức hay như đá granito. Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào
nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng.
6


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Bộ môn bệnh lý thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học khoa Thú y, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian: từ tháng 6/2014 tới 12/2016.
3.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được Khoa Thú y –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ mẫu bệnh phẩm thu thập từ
02 trang trại thuộc 2 tỉnh Hải Dương và Hưng Yên vào năm 2013.
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ, hóa chất, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS
HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.
Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS
HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào

Khôi phục tế bào; Cấy chuyển tế bào; Thu tế bào.
3.4.2. Phƣơng pháp gây nhiễm virus
Gây nhiễm virus lên môi trường tế bào; Quan sát bệnh tích tế bào;
Thu virus.
3.4.3. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml)
Tế bào Marc 145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2,0 x 104 tế
bào/giếng). Huyễn dịch virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên
bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứa tự đánh dấu trước (25µl/giếng),
mỗi độ pha loãng lặp lại 5 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM (10%
TBP) được bổ sung vào (100 µl/giếng). CPE được quan sát hàng ngày cho
đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định theo công thức
Spearman-Karber.
3.4.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus
Tế bào Marc 145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5×104 tế
bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên.
Virus PRRS phân lập được và chủng virus vắc-xin được gây nhiễm
lên tế bào ở MOI = 0.01. Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn
dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng
0.5 ml PBS. Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi
trường nuôi cấy 100µl/giếng. Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong
7


tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các bình gây
nhiễm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm
virus. Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng
virus. Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là
log10 của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus.
3.4.5. Phƣơng pháp RT-PCR
Quy trình tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo hướng dẫn đi

kèm của bộ Kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức).
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR
theo bộ Kit Qiagen One-step RT-PCR.
3.4.6. Phƣơng pháp Realtime RT-PCR
Thự hiện phản ứng Realtime RT-PCR theo TCVN 8400-21:2014.
3.4.7. Phƣơng pháp giải trình tự gene
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gene tự
động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại
Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y. Quá trình thực hiện giải trình tự
bao gồm các bước: Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR, thực hiện
phản ứng PCR sequence, tinh sạch sản phẩm PCR sequence.
3.4.8. Phƣơng pháp gây bệnh thực nghiệm
Bước 1: Chọn lợn
Bước 2: Theo dõi lợn trước khi gây nhiễm
Bước 3: Gây nhiễm cho lợn.
Bước 4: Theo dõi lợn sau khi gây nhiễm
3.4.9. Phƣơng pháp khám lâm sàng
Tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn tại một số ổ
dịch từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên đến hết thời gian theo dõi.
3.4.10. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể
Lợn thí nghiệm được mổ khám theo quy trình quy định trong TCVN
8402:2010.
3.4.11. Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản
Thực hiện theo quy trình làm tiêu bản vi thể của bộ môn Bệnh lý Thú y.
3.4.12. Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Thực hiện theo quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch của Bộ môn
Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.4.13. Xử lý số liệu
Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene
của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx và MEGA6 (Molecular

Evolutionary Genetics Analysis). Để xử lý các số liệu thống kê như: thân nhiệt
của lợn thí nghiệm trước và sau gây nhiễm, hàm lượng kháng thể của lợn thí
nghiệm, luận án sử dụng Microsoft Office Excel 2007 để phân tích.
8


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS
PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA
BẮC VIỆT NAM
4.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng
virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tế bào Marc 145 để gây
nhiễm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 và chủng PRRSV
vắc-xin (vắc-xin nhược độc chủng JXA1) nhằm xác định hiệu giá virus
(TCID50), kết quả được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus PRRS HUA 01,
PRRS HUA 02 và chủng virus vắc-xin
STT
1
2
3

Tên chủng virus
PRRS HUA 01
PRRS HUA 02
Chủng virus PRRS vắc-xin (JXA1)

Hiệu giá virus TCID50/25µl
3,16x105

1,74x106
1,74x106

Nghiên cứu đã tiến hành xác định hiệu giá virus (TCID50/25µl) của
02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 và 01 chủng virus PRRS
vắc-xin. Qua kết quả xác định hiệu giá virus (TCID50) của 03 chủng virus
PRRS được gây nhiễm trên môi trường tế bào Marc 145, chúng tôi thấy
rằng các chủng virus này có hiệu giá tương đối cao, có khả năng phát triển
và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc 145.
4.1.2. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của
02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02
Tiến hành gây nhiễm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA
02 và chủng virus vắc-xin lên môi trường tế bào Marc 145 nhằm đánh giá
khả năng nhân lên của các chủng virus này trên môi trường tế bào ở các
thời điểm sau khi gây nhiễm virus.
Bệnh tích tế bào (CPE) của 02 chủng virus nghiên cứu xuất hiện
sớm, chủng virus PRRS HUA 01 xuất hiện bệnh tích sau 24 giờ gây nhiễm
và ở 36 giờ sau khi gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 tế bào đã bắt
đầu phá hủy. Tế bào bị phá hủy muộn nhất là 84 giờ sau khi gây nhiễm. So
sánh bệnh tích tế bào với các chủng vắc-xin chúng tôi thấy có sự khác biệt
về thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào và thời gian tế bào bị phá hủy hoàn
toàn. Chủng vắc-xin có thời gian xuất hiện bệnh tích sớm tại thời điểm 24
giờ sau gây nhiễm, CPE đạt 10%, và bệnh tích đạt 40% ở thời điểm sau
gây nhiễm 36 giờ, tốc độ nhân virus nhanh, sau 60 giờ - 72 giờ virus đã
phá hủy hoàn toàn tế bào.
9


Bảng 4.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus
PRRS HUA01, PRRS HUA 02

PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 Chủng vắc-xin
24 giờ
10*
0
10
36 giờ
35
10
40
CPE theo thời
48 giờ
70
50
85
gian sau khi
60 giờ
100
90
100
gây nhiễm
72 giờ
B
100
B
virus
84 giờ
B
B
B
96 giờ

B
B
B
108 giờ
B
B
B
(Tính theo % diện tích tế bào bị phá hủy so với tổng số diện tích đáy bình nuôi cấy)
Chú thích : B: Toàn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy 10*: 10% tế bào bị
phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy (ước lượng bằng mắt khi soi trên
kính hiển vi soi nổi).
Mẫu

4.1.3. Kết quả nghiên cứu xác định sự ổn định của các đời virus qua
các đời cấy chuyển
Quan sát bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS đang nghiên cứu
qua các đời cấy chuyển và xác định hiệu giá TCID50 tại các đời cấy chuyển
của các chủng virus này. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.4 và bảng 4.5.
Bảng 4.3. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS
HUA 01, PRRS HUA 02 qua các đời cấy chuyển
Virus

PRRS HUA 01

PRRS HUA 02

Giờ
24 giờ
36 giờ
48 giờ

60 giờ
72 giờ
84 giờ
96 giờ
24 giờ
36 giờ
48 giờ
60 giờ
72 giờ
84 giờ
96 giờ

Đời 1
10
35
70
100
B
B
B
0
10
50
90
100
B
B

CPE (%)
Đời 3

10
30
75
100
B
B
B
0
10
50
85
100
B
B

Đời 5
10
35
70
100
B
B
B
0
10
50
90
100
B
B

Hiệu giá và khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS
mà chúng tôi nghiên cứu tương đối ổn định, chứng tỏ các chủng virus có
khả năng thích ứng gây bệnh tích trên tế bào Marc 145 ngày càng cao.
Thời điểm gây xuất hiện bệnh tích tế bào của chủng virus PRRS HUA 01
10


sớm hơn tại 24 giờ sau gây nhiễm. Bệnh tích tế bào của chủng virus PRRS
HUA 02 xuất hiện sau 36 giờ gây nhiễm và các tế bào bị phá hủy nhiều
nhất ở 60 đến 84 giờ sau gây nhiễm.
Bảng 4.4. Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02
qua các đời cấy chuyển
Virus
PRRS HUA 01
PRRS HUA 02

Đời 1
3,16 x 105
1,74 x 106

Hiệu giá (TCID50/25µl)
Đời 3
6,67 x 105
1,74 x 106

Đời 5
3,16 x 105
1,74 x 106

4.1.4. Kết quả nghiên cứu xác định đƣờng biểu diễn sự nhân lên của 02
chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02
Cả chủng virus vắc-xin và 02 chủng virus nghiên cứu đều thể hiện
rằng chúng xâm nhập và nhân lên trong tế bào mạnh hay yếu tùy từng thời
điểm nhất định. Như vậy, sự nhân lên của virus khi nuôi cấy trên môi
trường tế bào không phải là một quá trình liên tục và đồng đều. Trong đó,
những thời điểm phát triển mạnh trong tế bào hay ngoài tế bào của các
chủng virus không giống nhau hoàn toàn trong toàn bộ thời gian sau khi
đem gây nhiễm virus trên môi trường tế bào Marc 145. Kết quả của chúng
tôi phù hợp với kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Lương
Quốc Hưng (2012) và Nguyễn Bá Hiên và cs. (2015).

Hình 4.1. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 01

Hình 4.2. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 02
11


Qua nghiên cứu một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus PRRS
HUA 01 và PRRS HUA 02, chúng tôi thấy rằng cả 2 chủng virus PRRS
nghiên cứu và chủng virus PRRS vắc-xin đều có khả năng gây bệnh tích tế
bào trên môi trường Marc 145, có quy luật nhân lên trong môi trường tế
bào là giống nhau. Virus giải phóng ra ngoài tế bào có hiệu giá cao hơn
virus ở trong tế bào. Thời điểm hiệu giá virus đạt cao nhất được xác định
trong khoảng 60 giờ đến 84 giờ sau gây nhiễm.
4.1.5. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của 02 chủng virus PRRS HUA
01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam
4.1.5.1. Kết quả xét nghiệm lợn trước khi gây nhiễm virus
Các lợn thí nghiệm được chọn có thân nhiệt ở ngưỡng sinh lý bình
thường, không có hàm lượng kháng thể kháng virus PRRS, và không có

mặt của các virus gây bệnh trong cơ thể.
4.1.5.2. Kết quả gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01,
PRRS HUA 02 cho lợn thí nghiệm
a. Kết quả nghiên cứu chỉ tiêu virus huyết và thân nhiệt ở lợn gây bệnh
thực nghiệm
* Kết quả nghiên cứu chỉ tiêu virus huyết ở lợn gây bệnh thực nghiệm
Kết quả cho thấy cả 2 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02
sau ngày gây nhiễm thứ 3 đã có sự xuất hiện của virus PRRS trong máu,
đến ngày thứ 5 sau gây nhiễm thì thấy virus xuất hiện ở dịch ngoáy mũi
của các lợn thí nghiệm. Trong khi đó, lợn đối chứng cho kết quả âm tính và
hoàn toàn khỏe mạnh. Hàm lượng virus trong máu đạt cao nhất ở ngày số 7
đối với lô được gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 và đạt cao nhất ở
ngày số 9 đối với lô được gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02.
* Thân nhiệt của lợn được gây bệnh thực nghiệm PRRSV

Hình 4.3. Thân nhiệt trung bình của lợn sau khi gây bệnh thực nghiệm
bằng 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (0C)
Lợn thí nghiệm được gây nhiễm sau 2 ngày, nhiệt độ dao động trong
phạm vi sinh lý bình thường, sau 3 - 4 ngày gây bệnh, lợn bắt đầu có biểu
12


hiện sốt, theo nghiên cứu này, thân nhiệt trung bình của lợn thí nghiệm đạt
mức cao nhất vào ngày số 7 sau gây nhiễm và sốt kéo dài khoảng 13 ngày.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các công bố của Ishibata et al.
(2000), Li et al. (2014) và Nguyễn Thị Lan và cs. (2014).
b. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể trên lợn thí nghiệm
Tiến hành kiểm tra sự tạo kháng thể kháng virus PRRS bằng phương
pháp ELISA để đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của 02 chủng virus
PRRS HUA 01, PRRS HUA 02, kết quả được thể hiện ở hình 4.4.

Hình 4.4. Hàm lƣợng kháng thể trung bình của lợn thínghiệm đƣợc
gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02
Lô TN1: Lô lợn thí nghiệm được gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01
Lô TN2: Lô lợn thí nghiệm được gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02
Lô ĐC: Lô lợn đối chứng 1 và lô đối chứng 2
Từ ngày thứ 7 sau gây nhiễm đã thấy sự xuất hiện của kháng thể
kháng virus PRRS trong cơ thể lợn TN1.2, TN1.3 ở lô gây nhiễm chủng
virus PRRS HUA 01 và lợn TN2.1, TN2.2 ở lô gây nhiễm của chủng virus
PRRS HUA 02. Kháng thể được tạo ra chính là kháng thể kháng lại chủng
virus PRRS HUA 01, và chủng virus PRRS HUA 02 được gây nhiễm. Đến
ngày thứ 9 tất cả các lợn thí nghiệm đều xuất hiện kháng thể kháng virus
PRRS của chủng được gây nhiễm. Hàm lượng kháng thể tăng dần và đạt
cao nhất vào ngày thứ 13 sau gây nhiễm ở tất cả lợn thí nghiệm.
c. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn gây nhiễm thực nghiệm bằng
chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02
Triệu chứng chủ yếu của mắc PRRS bao gồm: sốt cao, ho, khó thở,
tím tai, sưng mí mắt, chảy nước mũi, phát ban, táo bón và tiêu chảy. Kết
quả nghiên cứu này phù hợp với công bố của Halbur et al. (1995), Kim et
al. (2015), Leng et al. (2012) và Park et al. (2014).
13


Hình 4.5. Mí mắt sƣng, có nhiều rử
Hình 4.6. Lợn xuất huyết
d. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn thực nghiệm
* Kết quả bệnh t ch đại thể của lợn được gây nhiễm chủng virus PRRS
HUA 01, PRRS HUA 02
Kết thúc thí nghiệm tiến hành mổ khám lợn thí nghiệm để quan sát
bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm 02 chủng virus PRRS nghiên cứu.

Bảng 4.5. Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm
2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02
Lô gây
nhiễm
PRRS
HUA 01
5/5
5/5
4/5
5/5
4/5
5/5
3/5
5/5
4/5

Tỷ
lệ
%
(+)
100
100
80
100
80
100
60
100
80

Lô gây
nhiễm
PRRS
HUA 02
5/5
5/5
5/5
5/5
4/5
5/5
4/5
5/5
4/5

Tỷ
lệ
%
(+)
100
100
100
100
80
100
80
100
80

Xuất huyết

5/5

100

5/5

Sung huyết

5/5

100

Xuất huyết

5/5

100

Cơ
quan

Bệnh tích các cơ
quan

1

Phổi

Viêm kẽ phổi
Phổi xuất huyết

Mặt cắt phổi nhớt
Viêm màng phổi
Viêm phổi hóa mủ
Phổi hoại tử
Phổi nhục hóa
Phổi tụ máu
Khí phế thũng

2

Hạch
phổi

3

Hạch
amidan

STT

0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6

Tỷ
lệ
%
(+)
0
0
0
0
0
0
0
0
0

100

0/6

0

5/5

100

0/6

0

5/5

100

0/6

0

Lô
đối
chứng

Kết quả cho thấy khi mổ khám các lợn thí nghiệm ở 02 lô được gây
nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 và chủng virus PRRS HUA 02 đều có
biểu hiện bệnh tích ở phổi, hạch lympho chiếm tỷ lệ cao nhất. Các bệnh
tích chủ yếu như phổi viêm, xuất huyết, mặt cắt phổi nhớt, phổi tụ máu,
viêm kẽ phổi, có nhiều dịch viêm trong lòng phế quản, hạch phổi và hạch
amidan: sưng, xuất huyết, hạch ruột xuất huyết, lách sưng, thận xuất huyết.
Kết quả này phù hợp với nhận định của nhiều tác giả trong các nghiên cứu
14


của Phạm Ngọc Thạch và Đàm Văn Phải (2007), Done et al. (1996) và
Nguyễn Thị Lan và cs. (2010).

Hình 4.7. Hạch bẹn nông sưng, xuất huyết Hình 4.8. Phổi xuất huyết
* Kết quả bệnh t ch vi thể của lợn được gây nhiễm chủng virus PRRS HUA
01, PRRS HUA 02.
Kết quả bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm được trình bày tại bảng 4.6.
Bảng 4.6. Bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm
2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02
Lô gây

Lô gây
nhiễm PRRS
nhiễm
HUA 01
PRRS HUA
STT Cơ quan Bệnh tích các cơ quan
(n=15)
02 (n=15)
Tỉ lệ
Tỉ lệ
n+
n+
%
%
Xuất huyết
15
100
15
100
Sung huyết
15
100
15
100
Phổi
1
Thâm nhiễm tế bào viêm
15
100
15

100
Phế quản- phế viêm
13
86,7
15
100
15
100
15
100
Hạch Xuất huyết
15
100
15
100
2
lympho Sung huyết
Tăng sinh nang lympho
12
80
15
100
Sung
huyết
6
40
7
46,7
Gan
3

Thoái hóa tế bào
9
60
12
80
13
86,7
15
100
Lách Xuất huyết
4
Thoái hóa tế bào
13
86,7
13
86,7
Viêm kẽ thận
14
93,3
15
100
Thận
Sung huyết
14
93,3
14
93,3
5
Xuất huyết
12

80
14
93,3

Lô đối
chứng
(n=18)
n+
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

Tỉ lệ
%
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
0
0

Ghi chú: n+ là số tiêu bản có bệnh tích vi thể.

Qua kết quả bệnh tích vi thể của các lợn thí nghiệm được gây nhiễm
chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02, chúng tôi thấy rằng biểu hiện
của bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm tập trung chủ yếu ở phổi, hạch lympho
15


ngoài ra bệnh tích còn có ở gan, lách, thận, ruột, não, dạ dày và tim. Mức độ
nặng nhẹ của bệnh tích vi thể ở 02 lô thí nghiệm là tương tự nhau.
e. Kết quả nghiên cứu sự phân bố của virus PRRS trên lợn thực nghiệm
Để xác định sự phân bố của virus PRRS tại các cơ quan của lợn,
chúng tôi tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch nhằm xác định sự có mặt của
kháng nguyên PRRSV
Bảng 4.7. Kết quả xác định virus PRRS ở lợn gây bệnh thực nghiệm
bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch
Lô gây nhiễm
Lô gây nhiễm
Lô đối chứng
PRRS HUA 01 PRRS HUA 02

(n=18)
(n=15)
(n=15)
n+
Tỉ lệ % n+
Tỉ lệ %
n+ Tỉ lệ %
+++
12
80
13
86,67
0
0
Phổi
1
++
3
20
2
13,33
0
0
0
0
0
0
18
100
+++

13
86,67
13
86,67
0
0
Hạch
lympho
2
++
2
13,33
2
13,33
0
0
0
0
0
0
18
100
++
7
46,67
9
60
0
0
Lách

3
+
7
46,67
6
40
0
0
1
6,66
0
0
18
100
++
7
46,67
9
60
0
0
4
Thận
+
6
40
6
40
0
0

2
13,33
0
0
18
100
Gan
+
12
80
14
93,33
0
0
5
3
20
1
6,67
0
0
6
Ruột
+
13
86,67
13
86,67
0
0

2
13,33
2
13,33
18
100
Ghi chú: +++ : Đám, hạt bắt màu nâu vàng nhiều và rõ; + : Đám, hạt bắt màu nâu vàng ít;
++ : Đám, hạt bắt màu nâu vàng trung bình - : Không có đám, hạt bắt màu nâu vàng
n: Số tiêu bản hóa mô miễn dịch
ST
T

Cơ
quan

Mức độ
phân bố
virus

Chúng tôi đã phát hiện được virus ở phổi, hạch, tim, lách, gan,
thận, ruột non, dạ dày, và não. Tỷ lệ nhiễm cao nhất chúng tôi xác định được ở
phổi, và thấp nhất mẫu dạ dày, não. Ở phổi, kháng nguyên virus tập trung
nhiều nhất là trong đại thực bào vùng phổi, tế bào biểu mô vách phế nang,
phế quản. Tại hạch lympho: virus phân bố lan tràn trên toàn bộ tổ chức
hạch lympho. Virus nằm trong tế bào bạch cầu, lâm ba cầu, tế bào lympho.
Ngoài ra virus còn phân bố ở một số cơ quan khác như: lách, thận, gan,…
Qua kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch các cơ quan của lợn được gây
16

nhiễm virus PRRS chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 là tương tự nhau
về mức độ và vị trí phân bố virus tại các cơ quan.
4.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02
CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI
MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM
4.2.1. Kết quả phản ứng RT-PCR
Sau khi tách chiết RNA từ các chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS
HUA 02, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng RT-PCR lần lượt với các
cặp mồi phát hiện gene ORF5 và phát hiện gene ORF7.

720pb

372pb

A
B
Hình 4.9. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A)
và ORF5 (hình B)
[Hình A: Đoạn gene ORF7 có kích thước 372bp; Hình B: Đoạn gene ORF5 kích
thước 720bp, thang chuẩn M 100bp; Từ trái qua phải: giếng 1: PRRS HUA 01, giếng 2:
PRRS HUA 02, giếng 3: đối chứng âm, giếng 4: đối chứng dương]

Qua hình A, B là kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR của
02 chủng nghiên cứu với lần lượt cặp mồi ORF7 và cặp mồi ORF5. Vạch band
DNA phát sáng có kích thước bằng 372bp trùng đúng với thiết kế của đoạn
mồi ORF7 và 720 bp trùng đúng với thiết kế của cặp mồi ORF5.
4.2.2. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu
Cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, mỗi đỉnh màu của giản đồ đều
xác nhận một loại nucleotide, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc
nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu

tương ứng trong đó Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine
cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen. Chuỗi gene của đoạn ORF7
có độ dài 372bp và chuỗi gene của đoạn ORF5 có độ dài 603bp. Như vậy
việc tách chiết RNA tổng số, quá trình thực hiện RT-PCR và giải trình tự
đã được thực hiện thành công.
4.2.3. Kết quả truy cập ngân hàng gene
4.2.3.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn ORF7 giữa 02
chủng virus nghiên cứu và một số chủng tham chiếu
Đoạn gene ORF7 qua xử lý trình tự gene thu được đoạn gene có độ
dài 372bp ở 2 chủng nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Qua việc so
17


sánh trình tự nucleotide giữa 2 chủng virus PRRS và chủng virus tham
chiếu, chúng tôi đã chỉ ra được 34 vị trí sai khác về nucleotide được trình
bày ở hình 4.10.

Hình 4.10. Kết quả so sánh trình tự gene ORF7 của các chủng virus
PRRS nghiên cứu
4.2.3.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn ORF5 giữa 02
chủng virus nghiên cứu và một số chủng tham chiếu
Chúng tôi nhận thấy trình tự gene ORF5 của 2 chủng virus nghiên
cứu được giải trình tự gene có sự sai khác tương đối về thành phần
nucleotide với nhau và khác so với chủng virus tham chiếu. Đoạn gene
ORF5 qua xử lý trình tự gene thu được đoạn gene có độ dài 603bp ở 2
chủng nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Qua việc so sánh trình tự
nucleotide giữa 2 chủng virus PRRS và chủng virus tham chiếu, chúng tôi
đã chỉ ra được 75 vị trí sai khác về nucleotide được trình bày ở hình 4.11.
Như vậy, khi so sánh về thành phần nucleotide ở đoạn gene ORF7
giữa hai chủng nghiên cứu và các chủng tham chiếu thì các chủng này có

độ sai khác về nucleotide là 9,13% tổng số các nucleotide và ở đoạn gene
ORF5 là 12,43% tổng số các nucleotide
18


Hình 4.11. Kết quả so sánh trình tự gene ORF5 của các chủng virus
PRRS nghiên cứu
4.2.3.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của các chủng virus nghiên cứu
Sau khi xác định được trình tự nucleotide cần xác định tiếp thành
phần amino acid của đoạn gene đó để có kết quả chính xác về sự biến đổi ở
mức độ phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02.
Kết quả của đề tài cho thấy giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và
chủng virus tham chiếu có sự sai khác trong trình tự amino acid được mã
19


hóa tương ứng từ đoạn gene ORF7 là 10 vị trí và đoạn gene ORF5 tương là
32 vị trí. Điều này sẽ dẫn đến sự sai khác trong tính kháng nguyên giữa các
chủng virus PRRS nghiên cứu.
4.2.4. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide giữa các
chủng virus nghiên cứu
Qua kết quả giải trình tự đoạn gene ORF7 và ORF5 của các chủng
PRRS nghiên cứu, tiến hành xử lý bằng chương trình MEGA6 để so sánh
mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng nghiên cứu và tham chiếu
với chủng virus vắc-xin. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8 và 4.9.
Bảng 4.8. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene ORF7 giữa
các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%)
PRRS HUA 01
PRRS HUA 02
HENZK1/

China/2014
HCM.D06/
Vietnam/2010
ATCC_VR2332
JXA1

PRRS
HUA 01
100,00
98,64

PRRS
HENZK1/
HCM.D06/ ATCC_
HUA 02 China/2014 Vietnam/2010 VR2332

JXA1

100,00

98,37

99,73

100,00

96,43

97,34

97,03

100,00

93,13
98,92

93,44
99,73

93,13
99,46

91,57
97,65

100,00
93,74

100,00

Bảng 4.9. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa
các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%)
PRRS HUA 01
PRRS HUA 02
HCMC-3336/
Vietnam/2010
ZQ5-GD-11/
China/2014
ATCC_VR2332

JXA1

PRRS PRRS HCMC-3336/
Hua 01 Hua 02 Vietnam/2010
100,00
97,29 100,00
99,67

97,29

100,00

97,98
87,98
98,32

99,33
87,41
98,66

97,98
87,97
98,66

ZQ5-GD-11/ ATCC_
China/2014 VR2332

100,00
88,20
99,33

JXA1

100,00
88,19 100,00

Kết quả cho thấy 2 chủng PRRS nghiên cứu có mức độ tương đồng
về nucleotide ở gene ORF7 và gene ORF5 đạt tỷ lệ khá cao lần lượt là
98,64% - 100% và 97,29% - 100%. Như vậy thành phần nucleotide của các
chủng này giống nhau tương đối cao.
Sự tương đồng về nucleotide ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 2
chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ lần lượt là
93,13% - 99,73% và 87,41% - 99,67%. Điều này cho thấy sự gần gũi trong
mối quan hệ di truyền giữa 2 chủng PRRS trong nghiên cứu và các chủng
virus tham chiếu.
20


4.2.5. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid giữa các
chủng virus nghiên cứu
Dựa trên sự mã hóa nên các amino acid tương ứng từ gene ORF7 và
gene ORF5, phần mềm đã phân tích và kết quả được trình bày ở bảng 4.10,
bảng 4.11.
Bảng 4.10. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa
các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%)
PRRS HUA 01
PRRS HUA 02
HENZK1/China/2014
HCM.D06/Vietnam/2010
ATCC_VR2332

JXA1

PRRS
PRRS HENZK1/ HCM.D06/Vi ATCC_
JXA1
HUA 01 HUA 02 China/2014 etnam/2010 VR2332
100,00
100,00 100,00
99,20
99,20
100,00
93,99
95,07
94,06
100,00
95,15
95,15
94,32
83,10
100,00
100,00 100,00
99,20
96,07
95,15 100,00

Bảng 4.11. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa
các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%)
PRRS PRRS HCMC-3336/ ZQ5-GD-11/ ATCC_
Hua 01 Hua 02 Vietnam/2010 China/2014 VR2332 JXA1
PRRS HUA 01

100,00
PRRS HUA 02
94,26 100,00
HCMC-3336/ Vietnam/2010 98,97 94,28
100,00
ZQ5-GD-11/ China/2014
96,37 97,94
96,38
100,00
ATCC_VR2332
87,51 84,24
87,55
86,51
100,00
JXA1
96,89 96,38
97,94
98,46
87,05 100,00

Kết quả cho thấy 2 chủng PRRS nghiên cứu có mức độ tương đồng
về amino acid tương ứng ở gene ORF7 và gene ORF5 đạt tỷ lệ khá cao lần
lượt là 100,0% và 94,26% - 100,0%.
Mức độ tương đồng về amino acid tương ứng ở gene ORF7 và gene
ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu với các chủng virus tham chiếu đạt
tỷ lệ dao động lần lượt là 93,99% - 100% và 84,24% - 98,97%. Điều này
cho thấy sự tương đồng giữa kết quả so sánh mức độ tương đồng giữa trình
tự nucleotide và trình tự amino acid.
4.2.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus
nghiên cứu

4.2.6.1. Kết quả xây dựng cây phả hệ gene ORF5
Từ kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài theo sự sai khác
nucleotide gene ORF5 ở hình 4.12 cho thấy: 2 chủng virus PRRS HUA
01và PRRS HUA 02 mà chúng tôi nghiên cứu nằm trong cùng một nhánh
phát sinh thuộc sublineage 8.7 thuộc lineage 8.
21


AB856285/Viet nam/2012/HUA-Vet .lab P RRS3
HQ540646/HCMC-3336/Viet nam/2010
61

JQ860389/Viet nam/2012/DT 9
JQ860378/Viet nam/2010/DN11
HUA-P RRS-01
AB856287/Viet nam/2013/HUA-Vet .lab P RRS5

45

AB856284/Viet nam/2011/HUA-Vet .lab P RRS2
JQ860362/Viet nam/2008/DN444
JQ860382/Viet nam/2012/CT .C1

84

53 JQ860391/Viet nam/2012/HG.RV2
AB856286/Viet nam/2012/HUA-Vet .lab P RRS4
KM244763/Viet nam/2013/MN1
AB856283/Viet nam/2011/HUA-Viet .labP RRS1
77 LC102500/Viet nam/2015/KT Y P RRS 02

55
JQ860372/Viet nam/2009/DN292
52

Sublineage 8.7

JQ860375/Viet nam/2010/DN1

Lineage 8

EF112445/China/2006/JXA1
KP 771739/China/2014/NVDC-SC1-2014
LC102501/Viet nam/2015/KT Y P RRS 03
34
KC263023/China/2011/HUAY2-11
99
66 KU556995/China/2014/HENHB1
45 JN642707/China/2010/SHZ-2010
KC263033/ZQ5-GD-11/China/2014
KF699846/Viet nam/2013/HUA/HP 1

76
61

LC102499/Viet nam/2015/KT Y P RRS 01

98

HUA-P RRS-02
FJ536165/China/2004/NB/04

35

AY032626/China/1995/CH-1a
EF532801/USA/2004/INGELVAC AT P
12

AF176476/USA/2000/P RRSV55
AF339494/USA/2001/98-31701-1

21
5

22

AY656993/USA/2005/SDSU73
Lineage 9

EU556160/USA/2008/2000-5424
U66380/USA/1996/34075-NE

Lineage 6

23
U87392/USA/1990/AT CC VR-2332

43
96

11

Lineage 7

AB546105/Japan/2008/Miyagi08-2
AF121131/T aiwan/1997/MD-001
AY297118/T hailand/2002/02SP 3

10
48

Lineage 5

GU187014/Singapore/2009/BCL-P S 100

DQ779791/USA/1998/P rime-P ac

Lineage 4
Lineage 3
Lineage 1

EU758940/USA/2007/P RRSV0000008973
M96262/Net herlands/1991/Lelyst ad virus

Lineage 2
PRRSV type 1

0.2

Hình 4.12. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene
ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu

Hai chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 nằm trong line 8
khác với các line từ 1 đến 7 và line 9 thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ), khác
với nhánh phát sinh của chủng PRRS type 1 (Châu Âu).
4.2.6.2. Kết quả xây dựng cây phả hệ gene ORF7
Chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 mà chúng tôi nghiên
cứu nằm trong 1 nhánh phát sinh thuộc Line 1. Khác với các line 2 và line 3
thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ), khác với nhánh phát sinh của chủng PRRS
type 1 (Châu Âu).
Kết luận: Hai chủng này cùng nhánh với chủng độc lực cao của
Trung Quốc và thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ). Điều này chứng tỏ có sự lây
truyền bệnh qua biên giới giữa các quốc gia trên thế giới.
22


PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học của 02 chủng virus
PRRS HUA 01 và virus PRRS HUA 02
- 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 đều thích nghi
tốt và gây bệnh tích tế bào trên môi trường tế bào Marc 145.
- Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 24 giờ gây
nhiễm chủng PRRS HUA 01, và sau 36 giờ sau gây nhiễm chủng PRRS
HUA 02. CPE đạt 100% tại 60 giờ và bong tróc hoàn toàn tại 72 giờ sau
khi gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01. CPE đạt 80% tại 60 giờ và
100% tại 72 giờ sau khi gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02. Từ 84 –
108 giờ sau gây nhiễm các tế bào đều bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy.
- Cả 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus PRRS vắc-xin
có quy luật nhân lên trong môi trường tế bào là giống nhau. Virus giải
phóng ra ngoài tế bào có hiệu giá cao hơn virus ở trong tế bào.
- Thời điểm hiệu giá virus đạt cao nhất được xác định trong khoảng

60 giờ đến 84 giờ sau gây nhiễm.
- Kết quả khả năng gây bệnh của 02 Chủng PRRS HUA 01 và PRRS
HUA 02:
+ 02 chủng PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được gây nhiễm trên
lợn thí nghiệm là có độc lực với triệu chứng và bệnh tích rất điển hình của
lợn mắc PRRS. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn được gây nhiễm là:
sốt, ho, khó thở, giảm ăn, phát ban, sưng phù mí mắt.
+ Chỉ tiêu virus huyết: sau khi gây nhiễm 03 ngày thì xuất hiện virus
PRRS trong máu và sau 05 ngày thì thấy virus xuất hiện ở dịch ngoáy mũi,
virus kéo dài trong máu đến hết thời gian theo dõi thí nghiệm (21 ngày).
+ Bệnh tích đại thể chủ yếu của các lợn thí nghiệm: phổi viêm, xuất
huyết. hạch lympho: sưng, tụ máu, xuất huyết. Thận xuất huyết điểm. Lách
nhồi huyết.
+ Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn thí nghiệm: Phổi xuất huyết, phế
quản - phế viêm, tế bào viêm tràn lan trong phổi. Hạch lympho xuất huyết,
thâm nhiễm tế bào viêm, các nang lympho tăng sinh. Thận có hiện tượng
viêm kẽ thận, xuất huyết.
+ Sự phân bố của virus được nghiên cứu qua phương pháp nhuộm
hóa mô miễn dịch cho thấy ở lợn được gây nhiễm thực nghiệm, virus PRRS
tập trung chủ yếu ở hạch lympho và phổi.
2) Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 2 chủng
virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02
- Đã xác định được trình tự nucleotide và amino acid của đoạn gene
ORF5 và ORF7 của 02 chủng virus PRRS nghiên cứu. Đoạn gene ORF5 có kích
23