Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------

Dƣơng Thị Nhàn

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH
SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR
ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------

Dƣơng Thị Nhàn

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH
SALBUTAMOL TRONG MẪU NƢỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR
ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC
Chuyên ngành : Hóa Phân Tích
Mã số

: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội - 2016

2


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo, PGS.TS. Phạm
Thị Ngọc Mai đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp em thực hiện luận luận văn này.
Em xin chân thành cám ơn nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Quỳnh Hoa đã hỗ
trợ em trong quá trình thực hiện đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn GS. Peter C. Hauser, TS. Mai Thanh Đức và ThS.
Bùi Duy Anh đã thiết kế lắp đặt và hỗ trợ các trang thiết bị cũng như tư vấn kỹ thuật
trong quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Em xin chân thành cám ơn công ty 3SAnalysis đã cung cấp thiết bị CE-C4D
cho nghiên cứu này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói
riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên em trong
suốt thời gian em học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, các anh, chị nghiên cứu sinh, các bạn
học viên, các em sinh viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên tinh thần,
tận tình giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015
Học viên

Dương Thị Nhàn

3


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN................................................................................... 11
1.1. Tổng quan về Salbutamol ................................................................................ 11
1.1.1. Giới thiệu chung về Salbutamol ..................................................................... 11
1.1.2. Vấn đề sử dụng Salbutamol trên thế giới ........................................................ 12
1.1.3. Vấn đề sử dụng Salbutamol ở Việt Nam ........................................................ 13
1.2. Các phƣơng pháp xác định Salbutamol ......................................................... 14
1.2.1. Phương pháp điện hóa ....................................................................................... 5
1.2.2. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ....................... 6
1.2.3. Các phương pháp sắc ký ................................................................................... 7
1.2.3.1. Các phương pháp sắc ký lỏng ........................................................................ 7
1.2.3.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) .................................................. 8
1.2.4. Các phương pháp điện di mao quản .................................................................. 8
1.3. Phƣơng pháp xác định Salbutamol bằng CE-C4D ........................................ 18
1.3.1. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của hệ CE cơ bản ....................................... 18
1.3.2. Giới thiệu về detector đo độ dẫn không tiếp xúc C4D .................................... 20
1.3.3. Một số công trình xác định Salbutamol bằng CE ........................................... 21
1.4. Các phƣơng pháp làm giàu chất phân tích .................................................... 23
1.4.1. Phương pháp chiết lỏng – lỏng ....................................................................... 23
1.4.2. Phương pháp chiết pha rắn (SPE) .................................................................. 24
1.4.2.1. Nguyên tắc của chiết pha rắn ...................................................................... 25
1.4.2.2. Cơ chế của chiết pha rắn ............................................................................. 26
1.4.2.3. Các loại cột SPE .......................................................................................... 28
1.4.2.4. Một số công trình làm giàu Salbutamol bằng chiết pha rắn ....................... 29

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 32
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu.................................................................... 32
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................ 32
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 32

4


2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 32
2.2.1. Phương pháp phân tích .................................................................................... 32
2.2.2. Phương pháp lấy mẫu phân tích ...................................................................... 33
2.2.3. Phương pháp xử lý mẫu .................................................................................. 33
2.2.4. Quy trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn ................... 34
2.2.5. Quy trình xử lý mẫu thịt bằng phương pháp chiết pha rắn ............................. 36
2.3. Trang thiết bị và hóa chất ............................................................................... 37
2.3.1. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng ............................................................. 37
2.3.2. Hóa chất .......................................................................................................... 39
2.3.2.1. Chất chuẩn ................................................................................................... 39
2.3.2.2. Hóa chất dung môi ....................................................................................... 39
2.3.2.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất ................................................................. 39
2.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích .................... 40
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .............................. 40
2.4.2. Độ lặp lại của phương pháp ............................................................................ 40
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp ...................................... 41
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 42
3.1. Đánh giá phƣơng pháp phân tích CE-C4D .................................................... 42
3.1.1. Xây dựng đường chuẩn cho Salbutamol ......................................................... 42
3.1.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn phát hiện (LOQ) của thiết bị ................. 43
3.1.3. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị ....................................................................... 44
3.2. Nghiên cứu, tối ƣu các điều kiện chiết pha rắn làm giàu Sabutamol trong

mẫu nƣớc tiểu .......................................................................................................... 45
3.2.1. Khảo sát lựa chọn cột chiết ............................................................................. 45
3.2.2. Khảo sát đệm chiết .......................................................................................... 46
3.2.3. Khảo sát quá trình rửa tạp ............................................................................... 47
3.2.4. Khảo sát dung môi rửa giải ............................................................................. 48
3.2.5. Đánh giá phương pháp phân tích Salbutamol trong mẫu nước tiểu bằng kĩ
thuật CE-C4D kết hợp chiết pha rắn .......................................................................... 50

5


3.2.5.1. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp ........................ 50
3.2.5.2. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp ......................................................... 51
3.2.5.3. Đánh giá độ đúng của phương pháp ............................................................ 51
3.2.6. Phân tích mẫu thực tế ...................................................................................... 52
3.3. Nghiên cứu, tối ƣu các điều kiện trong quá trình chiết pha rắn làm giàu
Sabutamol trong mẫu thịt lợn ................................................................................ 53
3.3.1. Chuẩn bị mẫu .................................................................................................. 53
3.3.2. Khảo sát lựa chọn cột chiết ............................................................................. 53
3.3.3. Khảo sát lựa chọn quy trình rửa tạp ................................................................ 54
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích Salbutamol trong mẫu thịt bằng kĩ thuật
CE-C4D ..................................................................................................................... 56
3.4.1. Đánh giá hiệu suất thu hồi ............................................................................... 56
3.4.2. Đánh giá độ lặp của phương pháp phân tích Salbutamol bằng CE-C4D ........ 57
3.4.3. Kết quả phân tích mẫu thịt lợn thực tế ............................................................ 57
3.5. Kết quả phân tích đối chứng với phƣơng pháp LC/MS/MS ........................ 58
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 62

6

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các phương pháp phân tích Salbutamol ...................................................14
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của Salbutamol..........................42
Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của Salbutamol xác định bằng phương pháp điện di
mao quản CE-C4D ....................................................................................43
Bảng 3.3. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng
Salbutamol ................................................................................................44
Bảng 3.4. Kết quả hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiết ......................................46
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp dựa trên thêm chuẩn
Salbutamol ................................................................................................51
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn
Salbutamol ................................................................................................52
Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng Salbutamol trong 08 mẫu nước tiểu được
cung cấp. ...................................................................................................52
Bảng 3.8. Kết quả hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiết ......................................54
Bảng 3.9. Kết quả hiệu suất thu hồi của từng quy trình rửa tạp ...............................56
Bảng 3.10. Khảo sát đánh giá độ thu hồi ..................................................................56
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp dựa trên thêm chuẩn
Salbutamol ................................................................................................57
Bảng 3.12. Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS...................58

7


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản ..................19
Hình 2.1. Các bước chiết pha rắn ..............................................................................34
Hình 2.2. Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt Nam .............................38

Hình 3.1. Đường chuẩn của Salbutamol ...................................................................43
Hình 3.2. Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng (1) cột C18,(2) cột SCX
3ml và (3) cột SCX 6ml .............................................................................45
Hình 3.3. Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khảo sát đệm chiết (1) đệm photphat
pH = 6, (2) đệm axetat pH=5,2. .................................................................47
Hình 3.4. Điện di đồ kết quả khảo sát với các quy trình rửa tạp khác nhau (1; 2; 3; 4
tương ứng với quy trình 1; 2; 3; 4) ............................................................48
Hình 3.5. Điện di đồ kết quả khảo sát với các quy trình rửa giải (1; 2; 3 tương ứng
với quy trình 1; 2; 3) ..................................................................................49
Hình 3.6. Điện di đồ giới hạn phát hiện Salbutamol trong mẫu nước tiểu ...............50
Hình 3.7. Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng(1) cột C 18 , (2) cột SCX
3ml và (3) cột SCX 6ml. ............................................................................54
Hình 3.8. Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng các dung dịch rửa tạp
khác nhau (1; 2; 3 tương ứng với quy trình 1; 2; 3)...................................55
Hình 3.9. Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng các dung dịch rửa tạp
khác nhau (4; 5; 6 tương ứng với quy trình 4; 5; 6)...................................55
Hình 3.10. Điện di đồ kết quả phân tích mẫu thịt thực tế .........................................58

8


DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

Ace

Acetic

Arg

L- arginin

C4D

Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

CE

Phương pháp điện di mao quản

EOF

Dòng điện di thẩm thấu

GC

Sắc ký khí

GC-MS

Sắc ký khí khối phổ

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC-MS

Sắc ký lỏng hiệu năng cao – khối phổ…

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực

LC-ESI-MS/MS

Sắc ký lỏng ghép với ion hóa khối phổ

MeOH

Methanol

Ppm

Parts per million: phần triệu

%RSD

% độ lệch chuẩn tương đối

Sal

Salbutamol

SD

Độ lệch chuẩn

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

9


LỜI MỞ ĐẦU
Sử dụng chất tạo nạc mà phổ biến là Salbutamol trong chăn nuôi hiện nay
đang là vấn đề nóng của nước ta. Lợn ăn thức ăn có chứa Salbutamol sẽ tăng trọng
nhanh, tỉ lệ nạc cao, thịt có màu đỏ tươi. Tuy nhiên thịt lợn chứa dư lượng
Salbutamol gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người tiêu dùng như làm tăng huyết áp,
tim đập nhanh, nhức đầu, tay chân run, buồn nôn, rối loạn tiêu hóa... Mặc dù vậy,
một số người chăn nuôi và các thương lái vì lợi nhuận đã bất chấp sức khỏe của
người tiêu dùng, sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi gây hoang mang trong dư
luận,. Để đảm bảo sức khỏe cho người dân, lấy lại niềm tin của người tiêu dùng vào
ngành chăn nuôi lợn cũng như đảm bảo tính công bằng cho những người chăn nuôi
chân chính, việc nghiên cứu phát triển quy trình phân tích, kiểm tra hàm lượng
Salbutamol có trong thức ăn chăn nuôi và các đối tượng chăn nuôi, thực phẩm... là
cần thiết. Việc xác định Salbutamol ở nước ta chủ yếu được thực hiện tại các phòng
thí nghiệm bằng phương pháp HPLC với quy trình phân tích phức tạp, giá thành
phân tích cao. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không

tiếp xúc (CE-C4D) gần đây được biết đến là một phương pháp phân tích mới với
nhiều ưu điểm, đã được nghiên cứu, ứng dụng để phân tích Salbutamol trong mẫu
thức ăn chăn nuôi [9, 20]. Tuy nhiên, do nền mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn khá phức
tạp và thường có hàm lượng Salbutamol thấp mà giới hạn phát hiện, giới hạn định
lượng của phương pháp CE-C4D còn hạn chế nên việc phân tích Salbutamol bằng
phương pháp CE-C4D trong các nền mẫu này gặp khó khăn [12, 14]. Vì vậy, việc
nghiên cứu kỹ thuật làm sạch mẫu và làm giàu Salbutamol trong mẫu nước tiểu,
mẫu thịt lợn sẽ làm tăng độ nhạy của phương pháp, giúp xác định được hàm lượng
nhỏ của Salbutamol trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn bằng phương pháp CE-C4D,
góp phần quản lý việc sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi. Do đó chúng tôi đã lựa
chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định Salbutamol trong
mẫu nƣớc tiểu và thịt lợn bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng
detector độ dẫn không tiếp xúc”.

10


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Salbutamol
Salbutamol là một chất thuộc nhóm chất tạo nạc - nhóm β-agonists.
Salbutamol có tác dụng liên kết với một protein đặc biệt trên màng tế bào, làm giãn
cơ trơn của đường khí phế quản. Vì vậy trong y học, Salbutamol được dùng làm
thuốc, giúp các bệnh nhân hen suyễn, tắc nghẽn đường phổi hô hấp bình thường trở
lại hoặc kích thích nhịp tim, điều trị suy tim cấp…Tuy nhiên nếu sử dụng với liều
cao, Salbutamol kích thích tuyến thượng thận sản sinh corticoid, làm tăng phát triển
của động vật, làm vật nuôi mau lớn, đồng thời tác động đến quá trình chuyển hóa
tinh bột (gluxit), mỡ (lipit) chuyển thành đạm (nạc), làm tích tụ nạc tại các cơ vân
(mông, lưng, đùi..) nên vật nuôi sẽ trở nên siêu nạc. Salbutamol là một trong những
chất thuộc nhóm β-agonists đứng đầu trong danh mục 18 chất kháng sinh, hóa chất
bị cấm sử dụng trong chăn nuôi ở VN và hầu hết các nước trên thế giới [1, 2].

1.1.1. Giới thiệu chung về Salbutamol
Công thức phân tử: C13H21O3N
pKa = 9,3; 10,7

Công thức cấu tạo:
Khối lượng phân tử: 239,152 đvC
Độ tan: Salbutamol tan được trong các dung môi phân cực, tan tốt tron
metanol.
Tên gọi: 2–(tert–Butylamino)–1-(3–hydroxyethyl–2–hydroxyphenyl)ethanol
Salbutamol được sử dụng chủ yếu ở ba dạng uống, hít, tiêm, dùng trong thăm
dò chức năng hô hấp, điều trị cơn hen, ngăn cơn co thắt phế quản do gắng sức, điều
trị tắc nghẽn đường dẫn khí hồi phục được, viêm phế quản mạn tính, giãn phế
nang… Ngoài ra, Salbutamol cũng được sử dụng trong sản khoa, Salbutamol dạng

11


dịch truyền có thể được sử dụng như là thuốc đỡ đẻ, làm giãn cơ mềm tử cung có
tác dụng làm chậm sự đẻ non.
Tác dụng phụ thường thấy khi sử dụng Salbutamol là gây khó chịu, nhức đầu,
hoa mắt, chóng mặt, buồn nôn, bồn chồn, run các đầu chi, tim đập nhanh, loạn nhịp
tim, biến đổi huyết áp, co giật, có thể hạ kali huyết nhất là run, lo lắng, đau đầu, khô
họng, hồi hộp… Các triệu chứng phụ khác có thể bao gồm phù, nổi mày đay, hạ
huyết áp, trụy mạch, thiếu máu cục bộ cơ tim, rối loạn giấc ngủ và hành vi…
Salbutamol dùng với lượng lớn gây hiện tượng tim đập nhanh, hệ thống thần kinh
hưng phấn quá mức.
Bên cạnh tác dụng dùng trong y học, Salbutamol còn là một chất chuyển đổi
tương đối hiệu quả, làm giảm tỉ lệ mỡ, tăng tỉ lệ nạc ở gia súc, gia cầm. Do đó, một
số người chăn nuôi đã lợi dụng đặc tính này để kích thích cho lợn nở vai, bung đùi,
tạo nạc trong một thời gian ngắn tăng hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên, trong vật nuôi

vẫn tồn đọng Salbutamol ở thịt, gan, thận, nội tạng mà không bị phân hủy khi chế
biến, gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người.
1.1.2. Vấn đề sử dụng Salbutamol trên thế giới
Vào tháng 4 năm 2002, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đã ban hành một danh
mục các loại thuốc thú y và một số hợp chất tổng hợp bị cấm sử dụng trong chăn
nuôi [24]. Danh mục này áp dụng cho cả các loại thuốc sản xuất trong nước và nhập
khẩu. Đứng đầu danh sách này là Clenbuterol, Salbutamol, Cimaterlo và các muối
của chúng đã bị cấm sử dụng trong mọi loại thức ăn chăn nuôi.
Tại Hồng Công, Trung Tâm Y tế công cộng đã đưa ra quy định về các chất
cấm trong thú y bao gồm Clenbuterol, Salbutamol và các hóa chất nông nghiệp khác
đồng thời nghiêm cấm mua bán các loại thịt và nội tạng động vật bị nhiễm độc [26].
Các văn bản pháp luật liên quan đến vấn đề này có hiệu lực từ ngày 31 tháng 12
năm 2001. Việc thử nghiệm trước khi giết mổ lợn được thực hiện ngay tại các lò mổ
nhằm bảo đảm an toàn đối với thực phẩm trước khi đưa ra thị trường. Trung bình,
mỗi năm có hơn 60000 mẫu nước tiểu lợn được kiểm tra, tất cả các lô hàng có kết
quả dương tính đều bị tiêu hủy.

12


Tại Malaysia, trong những năm qua đã có sự gia tăng đột biến về việc sử
dụng Salbutamol trong thức ăn gia súc nhằm tăng độ nạc và giảm tỉ lệ mỡ trong các
loại vật nuôi [27]. Trung tâm kiểm soát chất kích thích của trường đại học Sains
Malaysia đã đưa ra báo cáo vào tháng 1 năm 2007 về việc xác định tồn dư
Salbutamol trong mẫu thịt bò, lợn, cừu và thịt vịt. Kết quả cho thấy, Salbutamol có
mặt trong 2 trên tổng số hơn 100 mẫu được phân tích. Năm 1996, Malaysia đã cấm
sử dụng toàn bộ các chất thuộc nhóm β-agonist.
1.1.3. Vấn đề sử dụng Salbutamol ở Việt Nam
Theo thông tư 57 ngày 7.11.2012 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn quy định việc kiểm tra, giám sát và xử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm

Beta-agonist trong chăn nuôi
Theo quyết định về một số loại kháng sinh, hóa chất cấm sử dụng trong sản
xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi ban hành ngày 20/06/2002 của Bộ Nông
Nghiệp và Phát triển Nông thôn, Salbutamol là một trong những chất bị cấm sử
dụng hoàn toàn [1, 2]. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi
đang là một vấn đề nóng ở Việt Nam, đặc biệt là tại khu vực phía Nam. Vật nuôi ăn
thức ăn chứa Salbutamol được bài tiết dần qua nước tiểu, nhưng vẫn tích tụ trong
gan, thận, thịt. Đây cũng là nguyên nhân khiến người tiêu dùng bị ngộ độc khi sử
dụng thực phẩm nhiễm Salbutamol. Gần đây, việc sử dụng Salbutamol trong chăn
nuôi đang có chiều hướng gia tăng đáng báo động ở các địa phương. Điều này
không chỉ có tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng mà còn làm phương hại đến sản
xuất ngành chăn nuôi trong nước, nhất là trong lúc sức ép của các loại thực phẩm
ngoại nhập đang ngày một gia tăng.
Tại cuộc họp báo vào ngày 31/8/2015, Bộ NN-PTNT đã công bố kết quả
kiểm tra việc sử dụng chất cấm trong chăn nuôi, đoàn đã phát hiện nhiều cơ sở chăn
nuôi sử dụng chất tạo nạc Salbutamol. Tại thành phố Hồ Chí Minh, cơ quan chức
năng kiểm tra đột xuất 227 mẫu lợn giết mổ, phát hiện 31 mẫu dương tính với
Salbutamol. Phần lớn tỷ lệ mẫu lợn tồn dư Salbutamol có xuất xứ từ trang trại chăn
nuôi ở Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Tây Ninh, Bến Tre…Cũng tại thành phố

13


Hồ Chí Minh, theo Chi cục Thú y, đoàn thanh tra đã kiểm tra đột xuất trên 61 lô lợn
tại 10 lò giết mổ trên địa bàn thành phố. Kết quả cho thấy có 12 lô dương tính với
Salbutamol, trong đó lợn xuất xứ từ Đồng Nai dẫn đầu với năm lô dương tính với
Salbutamol.
Qua kiểm tra, đoàn thanh tra liên ngành ở Đồng Nai đã phát hiện ba cơ sở
chăn nuôi ở thành phố Biên Hòa sử dụng Salbutamol. Các cơ sở này đều bị xử phạt
hành chính và cấm xuất bán lợn ra thị trường nếu chưa được sự cho phép của cơ

quan thú y tỉnh.
Để chấn chỉnh tình trạng này, cần kiểm tra thức ăn chăn nuôi và nhất là nước
tiểu vật nuôi ở giai đoạn vỗ béo, trước khi xuất bán tại các trang trại chăn nuôi
nhằm phát hiện, ngăn chặn vật nuôi có sử dụng chất cấm đưa ra thị trường. Còn tại
các lò mổ, chợ cần kiểm tra các mẫu thịt, gan, thận trước khi đến tay người tiêu
dung, đảm bảo sức khỏe của người dân.
1.2. Các phƣơng pháp xác định Salbutamol
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định Salbutamol trong
nhiều đối tượng mẫu khác nhau (nước tiểu, thịt lợn, huyết thanh, dược phẩm...) như:
điện hóa, ELISA [16], sắc ký, điện di mao quản Khoảng tuyến tính, các giá trị LOD,
LOQ, hiệu suất thu hồi, sai số tương đối của mỗi phương pháp cho kết quả tương
đối tốt.
1.2.1. Phƣơng pháp điện hóa
Xiaoyun Lin và các cộng sự đã nghiên cứu một loại điện cực mới phân tích
các β-agonist. Sự có mặt của Ractopamin và Salbutamol trong các mẫu thịt lợn và
mẫu nước tiểu người được Muniyandi Rajkumar và các cộng sự nghiên cứu và phát
triển bằng việc sử dụng quy trình chế tạo điện cực màng cacbon thuỷ tinh biến tính
với poly taurine/hạt nano Zirconi (ZrO2) [18]. Trong phương pháp vôn-ampe quét
thế tuyến tính, poly taurine/hạt nano Zirconi (ZrO2) được trực tiếp sử dụng để xác
định Ractopamin và salbutamol. Thế oxi hoá hấp phụ của Ractopamin là 0,65V và
của salbutamol là 0,71V trên bề mặt điện cực. Điện cực biến tính xác định được tín
hiệu oxi hoá của Ractopamin trong khoảng tuyến tính từ 1 đến 28 μM và salbutamol

14


trong khoảng tuyến tính từ 5 đến 220 μM. Điện cực này cũng có thể dùng để xác
định tín hiệu của Ractopamin (1 - 26μM) trong các mẫu thịt lợn và salbutamol (1 114μM) trong các mẫu nước tiểu của người.
1.2.2. Phƣơng pháp ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Nguyên lý của phương pháp ELISA xác định clenbuterol và salbutamol là

dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng thể- kháng nguyên. Phương pháp ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với
enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu
giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi
cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng,
enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã
xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ
màu sẽ biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Kĩ thuật này
khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một
nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). Tuy nhiên các thiết bị này đòi hỏi trang thiết bị
đắt tiền và chỉ có ở các phòng thí nghiệm hiện đại.
J. Pleadin, A. Vulic, N. Persi cùng với các cộng sự đã nghiên cứu là đánh giá
sự của enzyme liên kết xét nghiệm miễn dịch (ELISA) trong việc xác định sự có
mặt của các b-agonist clenbuterol và salbutamol trong huyết tương và huyết thanh
động vật . Phương pháp có độ thu hồi và độ lặp cao (trên 70%) [16], . Cho thấy
ELISA có thể áp dụng cho việc xác định định lượng của cả hai chất phân tích trong
cả huyết tương và huyết thanh, tốt nhất trong huyết tương. Ông đã xác định và
kiểm soát nồng độ của clenbuterol và salbutamol trong huyết thanh và huyết tương
mà không cần chuẩn bị mẫu. Trong quá trình xác nhận, cho cả hai phân tích, các
LOD và LOQ tính được là 0,3 và 0,6 mg / L trong huyết tương và 0,5 và 1,0 mg /
L .trong huyết thanh tương ứng. Độ thu hồi của hai chất trong các mẫu huyết thanh
là 77,9 và 74,2% và độ lặp lại của 75,6 và 71,8%, đối với các mẫu huyết tương là
83,1 và 75,4%, và độ lặp lại tỷ lệ 80,0 và 74,9%, tương ứng.

15


Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng một phương pháp ELISA là
phương pháp nhanh chóng, dễ thực hiện và phù hợp cho việc xác đinh bán định
lượng b-agonist trong huyết thanh động vật và mẫu huyết tương.

1.2.3. Các phƣơng pháp sắc ký
Phương pháp phổ khối được sử dụng rộng rãi để xác định lượng vết dư lượng
các chất hữu cơ và các chất gây ô nhiễm cụ thể là phương pháp sắc kí khí và sắc kí
lỏng kết hợp với phương pháp khối phổ được sử dụng để xác định β–agonist trong
các nền mẫu.
1.2.3.1. Các phương pháp sắc ký lỏng
Việc kết hợp hệ tách HPLC và một detector như MS đã tạo thành hệ xác đinh
β-agonist hiệu quả và đang ngày càng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện đại.
Nhiều công trình nghiên cứu theo hướng này đã đạt được những thành tựu nhất định
trong việc định lượng các β-agonist cũng như sự có mặt của chúng trong các mẫu
dược phẩm, thực phẩm.
Mukesh Maithani và Ranjit Singh đã nghiên cứu và phát triển một phương
pháp xác định đồng thời Salbutamol Sulphate và Theophyllinebằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao HPLC (PerkinElmer loại 200) [17]. Dụng cụ được trang bị một loạt mô
hình 200 máy bơm, máy hút khử khí, detector UV-Visible và C-18 cột được sử
dụng. Điều kiện sắc ký : Pha động bao gồm acetonitrile và đệm photphat 65:35 (v /
v) (pH 4,2 ± 0,02, điều chỉnh với trietylamine). Pha động được âm trong 30 phút và
lọc qua một giấy lọc màng 0,45 μ. Tốc độ dòng chảy của pha động là 1,2 mL/phút
và bước sóng sử dụng là 235 nm.
Để xác định độ tuyến tính của phương pháp tác giả đã nghiên cứu ở bảy nồng
độ khác nhau (2, 4, 8, 16, 32, 48 và 64 mg/ml) Của hai loại thuốc đùng trong
nghiên cứu. Kết quả của HPLC được đưa ra như sau. Khoảng nồng độ tuyến tính là
2-64 mg/ml cho cả hai loại thuốc. Các phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng
cho Salbutamol Sulphate và Theophyllinelàtìm thấy là y = 6191.4x + 3064,7 và y =
6370.7x - 1993,7.Các giá trị hệ số hồi quy R2 là 0,9999 và 0,9996. Độ thu hồi của
Salbutamol Sulphate và Theophylline là 99,41 và 101,11. Kết quả cho thấy rằng

16

không có sự ảnh hưởng của các tá dược. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định
lượng (LOQ) là 0,40mg/ml và 0,75mg/ml cho Salbutamol Sulphate và 0,55 và 0,80
mg/ml cho Theophylline.
1.2.3.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)
Trong phương pháp sắc ký khí khối phổ, sau khi ra khỏi cột sắc ký các hợp
chất hữu cơ bị oxi hóa thành các ion phân tử hay ion mảnh phân tử mang điện tích
và các gốc tự do trong điều kiện áp suất thấp. Sau đó các ion được đưa sang bộ phận
phân tích khối lượng. Dựa vào dữ kiện phổ thu được, người ta định tính và định
lượng chất phân tích một cách dễ dàng. Bằng phương pháp này các tác giả Milagro
Reig, Natalia Batlle, José Luis Navarro, Fidel Toldrá đã xác định được salbutamol
trong nước tiểu bò và thức ăn gia súc [22], . Salbutamol được tách ra khỏi nền mẫu
ban đầu bằng axit clohidric, được làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE), đem thổi
khô sau đó được dẫn xuất với methyl boronic axit (MBA) tạo hợp chất salbutamol
đimethyl boronate bằng cách hòa cặn với 50 μl MBA 10mg/ml, lắc trên máy lắc
Vortex, để phản ứng trong 15 phút ở 50 ͦ C.
1.2.4. Các phƣơng pháp điện di mao quản
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác
nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất
điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường (E) nhất định do thế (V)
đặt vào hai đầu mao quản sinh ra.
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng
dụng để tách và xác định các β-agonist trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
Weiyu Wang và các cộng sựđã tách và xác định thành công đồng thời 5 β-agonist
có trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu và gan của lợn (clenbuterol, metoprolol,
Ractopamin, isoxsuprine and salbutamol) sử dụng phương pháp điện di mao quản
với sự phát hiện của detector điện hóa [23]. Điều kiện điện di được thực hiện với
đệm H3BO3–Na2B4O7 100mM (pH =9), điện thế tách là 14kV và thời gian cho

17

quá trình điện di là 15 phút. Giá trị LOD, LOQ của salbutamol là 0,17 μg/ml và
0,59 μg/ml.
Trong một bài báo khác, Tianshu Zhou và các cộng sự [21] đã ứng dụng
phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo dòng (CE-AD) để xác định các
β–agonist: adrenaline, salbutamol và salmeterol trong huyết thanh. Trong công trình
nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng đệm phosphat 0,06 mol/l ở pH = 5,5 với thế
áp vào hai đầu mao quản là 12kV và thời gian bơm mẫu là 8s. Phương pháp có độ
chính xác khá tốt với hiệu suất thu hồi trong khoảng 92,2 † 99,5%, RSD < 4,71%.
Fabiana S. Felix và các cộng sự [15] sử dụng phương pháp điện di mao quản
tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) để tách và định lượng
salbutamol có trong các sản phẩm thuốc dạng xi-rô với thành phần dung dịch đệm
là 10mM CH3COOH/CH3COONa (pH = 4,9), dung dịch tetraethylammonium
(TEA) được dùng làm chất nội chuẩn, thế áp vào hai đầu mao quản là 28kV, thời
gian bơm mẫu là 25s và ở độ cao 10cm. Kết quả thu được với khoảng tuyến tính từ
7,0.10-5 † 3,0.10-4 mol/l, giới hạn phát hiện của salbutamol là 1,0x10-5 mol/l, giới
hạn định lượng là 3,3.10-5 mol/l. Phương pháp có độ lặp lại khá tốt (RSD = 4,7%
với n =10 tại mức nồng độ 7,0.10-5mol/l).
Gần đây, phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không
tiếp xúc (CE-C4D) được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt như hiệu quả tách cao,
thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít… Phương pháp đã được ứng dụng để tách
và xác định các β-agonist trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau [9, 15].
1.3. Phƣơng pháp xác định Salbutamol bằng CE-C4D
1.3.1. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của hệ CE cơ bản
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác
nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất
điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường (E) nhất định do thế (V)
đặt vào hai đầu mao quản sinh ra [4, 6].

18


Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản
Một hệ thiết bị CE cơ bản bao gồm các bộ phận:
- Mao quản tách: thường làm bằng vật liệu silic gọi là mao quản silica, là loại
mao quản phổ biến nhất, với đường kính ngoài (OD) 365 μm, đường kính trong (ID)
từ 10 đến 150 μm (thường là 50 μm). Tổng chiều dài mao quản có thể từ 10 đến 100
cm (thường là 60 cm). Chiều dài hiệu dụng (là chiều dài tính từ đầu bơm mẫu của
mao quản đến vị trí đặt detector) thường dao động từ 25 – 50 cm đối với mao quản
dài 60 cm. Trong quá trình điện di, mao quản được nạp đầy dung dịch đệm điện di.
- Dung dịch đệm điện di: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra
khi áp thế cao vào hai đầu mao quản. Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản
được được đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di.
- Nguồn điện thế cao: thường dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai
đầu mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra.
- Detector (cảm biến): bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân
tích sau quá trình phân tách điện di mao quản, do đó thường được đặt ở phần cuối
(gần cuối hoặc cuối) của mao quản tuỳ theo loại cảm biến. Các loại cảm biến thông
dụng trong phương pháp CE bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang
phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, đo dòng, đo thế và đo độ dẫn.
- Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù
hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích. Hiện nay, bộ phận này còn có

19


thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hoá quá trình phân tích từ khâu bơm mẫu
đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di mao quản.
1.3.2. Giới thiệu về detector đo độ dẫn không tiếp xúc C4D

Trong phương pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn là một trong những
loại detector rất được chú ý, tuy có độ nhạy thấp hơn so với hai kĩ thuật điện hóa
khác nhưng lại có ưu điểm là detector đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất
phân tích khác nhau. Detector này có thể thu nhỏ, thuận lợi khi kết hợp với các mao
quản có đường kính hẹp, thậm chí với các microchip mà không ảnh hưởng đến độ
nhạy và các tính chất khác của detector.
Detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục
xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998. Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm
nghiên cứu của GS Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ) đã phát
triển thành công dòng sản phẩm C4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều cao
(HV-C4D, 200V). Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm nghiên
cứu của GS. Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C4D thương phẩm.
C4D có nhiều tính năng nổi trội như:
- Điện cực không cần tiếp xúc với dung dịch đo nên tránh được hiện tượng
ăn mòn làm hỏng điện cực.
- Thể tích mẫu đo rất nhỏ, chỉ vài nl.
- Là detector vạn năng có khả đáp ứng với tất cả các hợp phần mang điện
tích trong môi trường nước.
- Khác với detector UV, vốn chỉ có thể cố định tại một điểm nơi có cửa sổ
quang trên cột tách, C4D có thể đặt ở bất kì vị trí nào bằng cách di chuyển tùy ý dọc
theo cột phân tích.
- Có thể dùng cho tất cả các cột tách với vật liệu chế tạo khác nhau, đây cũng
là lợi thế của C4D so với detector UV, vốn chỉ phù hợp với những cột trong suốt.
Ngoài ra, C4D không yêu cầu tạo cửa sổ quang trên cột tách silica nóng chảy nên
giảm thiểu nguy cơ gẫy cột như thường xảy ra với detector đo quang.

20


- Độ nhạy của C4D không phụ thuộc vào đường kính cột tách nên có thể sử

dụng được với mao quản nhỏ hơn 25m để tăng hiệu quả tách chất trong khi
detector UV, cột mao quản phải có đường kính trong tối thiểu là 50 m mới tạo dủ
độ dài đường truyền quang
- Đặc biệt là C4D có khả năng thu nhỏ, vận hành được bằng ắc quy và có thể
tự chế tạo được với cơ sở hạ tầng của các xưởng điện tại Việt Nam.
Chính vì những tính năng trên mà C4D đang ngày càng được sử dụng rộng
rãi trong CE.
1.3.3. Một số công trình xác định Salbutamol bằng CE
Gần đây, có nhiều công trình khoa học, bài báo trong nước và quốc tế đã
được công bố về các kết quả nghiên cứu sử dụng phương pháp CE để xác định các
β-agonist nói chung và Salbutamol nói riêng trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
Trong một nghiên cứu gần đây, nhóm nghiên cứu của khoa Hóa học, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã sử dụng phương pháp
điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) xác định
đồng thời Metoprolol, Ractopamine, Sabutamol có trong mẫu dược phẩm và mẫu
thức ăn chăn nuôi [20]. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã xác định được các
điều kiện tối ưu để xác định Metoprolol, Ractopamine, Sabutamol là: mao quản
silica (đường kính trong ID = 50 µm, tổng chiều dài: 60 cm), dung dịch đệm điện di:
Arginine (10mM)/Axit axetic pH = 4,9 bơm mẫu thủy động lực học kiểu xiphông ở
độ cao 10 cm, thời gian bơm mẫu 20 s, thế tách 18 kV. Với điều kiện tối ưu trên
nhóm tác giả đã xác định được giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
lần lượt là 0,5 ppm và 1,7 ppm, hiệu suất thu hồi trong khoảng 98,8% - 103,7%. Từ
đó tiến hành áp dụng vào mẫu thực tế là các mẫu thuốc và thức ăn chăn nuôi. Mẫu
thuốc dạng xiro chứa Salbutamol sulfate (Solmux Broncho của dược phẩm quốc tế,
Bình Dương, Việt Nam) được pha loãng với nước deion. Mẫu thuốc dạng viên nén
5 mg (Dorpharma, Hà Nội và Plendil Plus, AstraZeneca AB, Sodertalje, Thụy Điển)
được nghiền thành bột và sau đó hòa tan với 5 ml nước deion (cho viên có chứa
Salbutamol) hoặc 5 ml MeOH (cho viên có chứa metoprolol). Các dung dịch thu

21

được cho rung siêu âm 10 phút và lọc qua màng 0,45 µm. Đối với mẫu chứa
metoprolol phải thêm một bước ly tâm ở 8000 rpm trong 10 phút để kết tủa tá dược
trước. Mẫu thức ăn chăn nuôi lợn (lấy 2 g) được nghiền thành bột pha loãng 10 ml
hỗn hợp MeOH/H2O (v/v 4/1) sau đó xoáy trộn đều. Hỗn hợp thu được rung siêu
âm trong 2 h sau đó lọc qua màng 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống CE.
Trên thế giới, Weiyu Wang và các cộng sự đã tách và xác định thành công
đồng thời 5 β-agonist có trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu và gan của lợn
(Clenbuterol, Metoprolol, Ractopamin, Isoxsuprine and Salbutamol) sử dụng
phương pháp điện di mao quản với sự phát hiện của detector điện hóa [23]. Điều
kiện điện di được thực hiện với đệm H3BO3–Na2B4O7 100 mM (pH =9), điện thế
tách là 14 kV và thời gian cho quá trình điện di là 15 phút. Giá trị LOD, LOQ của
Salbutamol là 0,17 μg/ml và 0,59 μg/ml.
Peter Mikus, Iva Valášková, Emil Havránek đã phát triển, sử dụng phương
pháp điện di mao quản (CE) để tách, xác định Salbutamol trong dược phẩm (xirô,
dung dịch uống, viên nén) và trong chất lỏng sinh học (nước tiểu, huyết thanh) [15].
Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nghiên cứu bao gồm chất tạp, nồng độ của
các ion mang, ion đối và độ pH của hệ đệm. Trong nghiên cứu này, giới hạn phát
hiện, giới hạn định lượng của Salbutamol tương ứng là 1,30 ppm và 4,33 ppm; RSD
là 1,31%.
Trong một bài báo khác, Tianshu Zhou và các cộng sự đã ứng dụng phương
pháp điện di mao quản sử dụng detector đo dòng (CE-AD) để xác định Adrenalin,
Salbutamol và Salmeterol trong huyết thanh [21]. Trong công trình nghiên cứu này,
các tác giả đã sử dụng đệm photphat 0,06 mol/l ở pH = 5,5 với thế áp vào hai đầu
mao quản là 12 kV và thời gian bơm mẫu là 8 s. Phương pháp có độ chính xác khá
tốt với hiệu suất thu hồi trong khoảng 92,2 † 99,5%, RSD < 4,71%.
Fabiana S. Felix và các cộng sự [15] sử dụng phương pháp điện di mao quản
tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) để tách và định lượng
Salbutamol có trong các sản phẩm thuốc dạng xirô với thành phần dung dịch đệm là

10 mM CH3COOH/CH3COONa (pH = 4,9), dung dịch tetraethylammonium (TEA)

22


được dùng làm chất nội chuẩn, thế áp vào hai đầu mao quản là 28 kV, bơm mẫu ở
độ cao 10 cm trong thời gian là 25 s. Kết quả thu được với khoảng tuyến tính từ
16,74† 71,7 ppm, giới hạn phát hiện của Salbutamol là 2,39 ppm, giới hạn định
lượng là 7,89 ppm. Phương pháp có độ lặp lại khá tốt (RSD = 4,7% với n =10 tại
mức nồng độ 16,74 ppm).
Các công trình nghiên cứu trên đều đưa ra phương pháp nghiên cứu với
những điều kiện khác nhau để phân tích các hợp chất β-agonist nói chung và
Salbutamol nói riêng trong mẫu dược phẩm, thực phẩm, huyết thanh, thịt lợn, nước
tiểu…. Mỗi phương pháp trên đều có những, ưu nhược điểm riêng và tùy từng
trường hợp cụ thể mà các nhà phân tích sẽ lựa chọn phương pháp thích hợp. Trong
đề tài này, nhằm mục tiêu hướng đến xây dựng một phương pháp phân tích nhanh,
đơn giản, hiệu quả, chúng tôi tập trung nghiên cứu phương pháp làm giàu
Salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn nhằm ứng dụng xác định lượng
nhỏ Salbutamol trong các mẫu vật nuôi và dư lượng Salbutamol trong các mẫu thực
phẩm thành phẩm bằng phương pháp CE-C4D.
1.4. Các phƣơng pháp làm giàu chất phân tích
Trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu trước [20] đã đưa ra giới hạn phát
hiện Salbutamol bằng phương pháp điện di mao quản là 0,5 ppm còn giới hạn định
lượng là 1,7 ppm. Tuy nhiên, thực tế phân tích cho thấy hàm lượng Sabutamol trong
nước tiểu lợn và thịt lợn đều thấp hơn giới hạn phát hiện này nhiều nên để đạt được
mục tiêu xác định hàm lượng của Salbutamol trong mẫu thực là khó khăn. Việc làm
giàu Salbutamol trước khi phân tích bằng phương pháp CE vì thế là rất cần thiết. Có
nhiều phương pháp làm giàu chất phân tích khác nhau nhưng phương pháp thông
dụng, đơn giản nhất là phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn SPE.
1.4.1. Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự phân bố chất tan khi giữa hai pha
không trộn lẫn, thường là các dung môi hữu cơ và nước [7].
Sự lựa chọn các dung môi hữu cơ phải đáp ứng các yêu cầu sau:
- Dung môi phải không trộn lẫn với nước.

23


- Các chất cần tách phải hòa tan trong dung môi này và khả năng hòa tan
trong dung môi phải lớn hơn trong nước.
- Tỷ trọng của dung môi này phải lớn hơn nước khi chiết rút được tách ra
trong phễu chiết hoặc một dụng cụ tách chiết liên tục chất lỏng – chất lỏng, ngược
lại dung môi phải có tỷ trọng nhỏ hơn nước khi sự tách chiết vi phân trong bình
thủy tinh nhỏ.
Phụ thuộc vào sự trộn lẫn của mẫu chất lỏng với dung môi, các chất cần tách
sẽ hòa tan vào trong dung môi chiết.Hệ số phân bố sẽ tương ứng tỷ lệ của các chất
hòa tan trong dung môi theo các công thức:
P = Cdung môi/Cnước
Vì P không phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích và là hằng số ở nhiệt độ nhất định
nên khi tăng thể tích dung môi chiết thì lượng chất hòa tan vào chúng sẽ tăng. Trong
trường hợp thể tích dung môi chiết không thay đổi, chia nhỏ và chiết nhiều lần cũng
sẽ tăng hiệu quả của quá trình tách chiết.
Yung Yang và các cộng sự [25] đã dùng phương pháp sắc ký lỏng hai lần để
tách và xác định Salbutamol, Salmeterol và Atenololby sau khi chiết lỏng lỏng. Độ
thu hồi chất phân tích từ 82-90% trong các mẫu nước tiểu. Tác giả lấy 2 hoặc 3 ml
nước tiểu điều chỉnh về pH 6,0 bằng ammonium acetat 200 mM, sau đó lắc xoáy
đều, đun nóng đến 550C trong 2 giờ rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng. Cuối cùng,
dịch chiết được bơm vào cột HILIC (cột sắc kí lỏng ưa nước) để định lượng.
Phương pháp đã đạt được giới hạn phát hiện và định lượng lần lượt nằm trong
khoảng 0,12 † 0,27 ppm và 0,24 † 0,90 ppm. Tuy nhiên, việc chiết lặp hai lần tốn

nhiều thời gian, dung môi hơn và phương pháp chủ yếu chỉ áp dụng cho những chất
có độ phân cực thấp.
1.4.2. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
Chiết pha rắn (SPE: Solid - Phase Extraction) được ra đời vào giữa những
năm 1970, nhưng mãi đến năm 1998 thuật ngữ „„chiết pha rắn“ mới được công nhận
trên toàn thế giới.

24


Chiết pha rắn đang được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích do những
ưu điểm sau:
+ Hiệu suất thu hồi cao
+ Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch
+ Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất
+ Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành loạt
+ Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn
Từ đó đến nay chiết pha rắn được phát triển mạnh mẽ trong lĩnh vực phân
tích, đặc biệt là phân tích lượng vết trong các mẫu môi trường, thực phẩm.
1.4.2.1. Nguyên tắc của chiết pha rắn
Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng được cải tiến thành hấp phụ pha rắn
với các cơ chế khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan
giữa hai pha không tan vào nhau, trong đó mẫu phân tích ở dạng lỏng (pha nước,
hay hữu cơ), còn chất chiết ở dạng rắn, hạt nhỏ, xốp, đường kính 25 – 70 μm. Chất
chiết được gọi là pha tĩnh (pha rắn), và được nhồi vào một cột chiết nhỏ hoặc đĩa.
Chất chiết là các hạt Silica trung tính, các hạt ôxit nhôm, hay các Silicagen trung
tính đã bị alkyl hoá nhóm –OH bằng nhóm mạch cacbon thẳng –C2, -C4, -C8, -C18,...
hay nhân phenyl. Nó được chế tạo trong điều kiện giống như pha tĩnh của sắc ký
HPLC, và các hạt này có độ xốp lớn, với diện tích bề mặt xốp thường từ 50 – 300
m2/gam.

Khi xử lý mẫu, dung dịch phân tích được dội lên cột chiết, pha tĩnh sẽ tương
tác với các chất trong dung dịch phân tích và giữ một nhóm chất phân tích lại trên
cột (trên pha tĩnh), còn các nhóm chất khác sẽ đi ra khỏi cột cùng với dung môi hoà
tan mẫu và khi đó nhóm chất cần phân tích sẽ được thu lại trên pha tĩnh (chất chiết
rắn). Sau đó dùng một dung môi thích hợp hoà tan tốt các chất phân tích để rửa giải
chúng ra khỏi pha tĩnh (cột chiết) sẽ thu được dung dịch có chất phân tích để xác
định theo một phương pháp phân tích công cụ đã chọn.
Theo đặc điểm và bản chất của sự chiết, các chất chiết pha rắn được chế tạo
và phân chia theo các loại chất:

25