Đánh giá một số đặc tính sinh lý của bốn dòng nấm có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ phân lập từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT
----------

CAO TRƯỜNG SƠN
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA BỐN DÒNG
NẤM PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA
HUYỆN LAI VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT

CẦN THƠ, 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT
----------

CAO TRƯỜNG SƠN
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA BỐN DÒNG
NẤM PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA
HUYỆN LAI VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. NGUYỄN KHỞI NGHĨA

CẦN THƠ, 2016


1

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ts. Nguyễn Khởi Nghĩa

Cao Trường Sơn

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Luận văn với tên đề tài: “Đánh giá một số đặc tính sinh lý của 4 dòng nấm có khả
năng phân hủy vật liệu hữu cơ phân lập từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong
Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp”, do sinh viên Cao Trường Sơn thực hiện
với sự hướng dẫn của Ts. Nguyễn Khởi Nghĩa. Luận văn này đã báo cáo và được
hội đồng chấm luận văn thông qua.

Cần Thơ, ngày…. tháng…. năm 2016.
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

I


2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và cán bộ hướng
dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai
công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.

Cán bộ hướng dẫn

Tác giả luận văn

Ts. Nguyễn Khởi Nghĩa

Cao Trường Sơn

3

4
5
6

II


7

THÔNG TIN CÁ NHÂN

I. LÝ LỊCH SƠ LƯỢC
Họ và tên: Cao Trường Sơn
Ngày sinh: 02-08-1995

Giới tính: Nam
Nơi sinh: Long An

Quê quán: Huyện Thủ Thừa, Tỉnh Long An - Dân tộc: Kinh
Địa chỉ liên lạc: L40/18/19, đường 30, KDC Ngân Thuận, Bình Thủy, TP Cần
Thơ
Di động: 01283.717.585
E-mail:
II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
Năm 2000 – 2005, học tại trường Tiểu học Bình Thủy, quận Bình Thủy, Thành
phố Cần Thơ.
Năm 2006 – 2010, học tại trường THCS Trà Nóc, phường Trà An, quận Bình
Thủy, Thành phố Cần Thơ.
Năm 2010 – 2013, học tại trường THPT Bình Thủy, phường Bình Thủy, quận
Bình Thủy, Thành phố Cần Thơ.
Năm 2013 – 2017, học tại Trường Đại Học Cần Thơ, đường 3/2, phường Xuân
Khánh, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
Cần Thơ, ngày....tháng....năm 2016.
Ký tên

Cao Trường Sơn
8

III


9

LỜI CẢM ƠN

Kính dâng!
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì sự nghiệp và tương lai của chúng con!
Thành kính biết ơn!
Thầy Nguyễn Khởi Nghĩa đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và
truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành luận văn này.
Chân thành biết ơn,
Thầy Dương Minh Viễn, cô Đỗ Thị Xuân, anh Đỗ Hoàng Sang, chị
Nguyễn Thị Kiều Oanh cùng các anh, chị và các bạn thuộc phòng Sinh Học Đất,
Bộ Môn Khoa Học Đất đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành thí nghiệm.
Quý thầy cô và các anh chị trong Bộ môn Khoa Học Đất, khoa Nông Nghiệp
và Sinh Học Ứng Dụng đã nhiệt tình truyền thụ những kiến thức nền tảng vững
vàng cho tôi.
Thân ái gởi về,
Tập thể lớp Khoa học đất, khóa 39 lời chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành
đạt.
Trân trọng!

Cao Trường Sơn

IV

10 MỤC LỤC
1 CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG............................................................................i
2 LỜI CAM ĐOAN......................................................................................................ii
7 THÔNG TIN CÁ NHÂN.........................................................................................iii
8

.....................................................iii

9 LỜI CẢM ƠN...........................................................................................................iv
10 MỤC LỤC...............................................................................................................v
11 DANH MỤC BẢNG.............................................................................................vii
12 DANH MỤC HÌNH.............................................................................................viii
13 TÓM LƯỢC...........................................................................................................ix
MỞ ĐẦU.......................................................1
14 CHƯƠNG II............................................................................................................2
15 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.......................................................................................2
16 CHƯƠNG III.........................................................................................................10
17 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................................10
Hình 3.1. Hai dạng cuống bào tử nấm điển hình cho 4 dòng nấm: (A) cuống bào tử
dòng nấm PH-L4 và PH-C5; (B) cuống bào tử dòng nấm PH-L3 và PH-L6 được quan
sát trên kính viển vi ở vật kính 100............................................................................12
18

b. Phương pháp Slide Culture được tiến hành như sau: .................................15

19

Mục tiêu của nội dung này nhằm khảo sát ảnh hưởng của các mức pH môi

trường khác nhau lên sự phát triển sinh khối nấm trong môi trường nuôi cấy ME lỏng.

16
20

Tham khảo mục 3.5.3.a..............................................................................18

21 CHƯƠNG IV.........................................................................................................22
22 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................................22
23 CHƯƠNG V..........................................................................................................47
24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................47

V


25 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................48
26 PHỤ CHƯƠNG.....................................................................................................43

VI


11 DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Môi trường nuôi cấy Hoagland.....................................................................10
Bảng 3.2. Đặc tính hình thái khuẩn lạc của bốn dòng nấm thử nghiệm………………11

VII


12 DANH MỤC HÌNH

Hình 3.3. Sơ đồ mô tả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng giữa bốn dòng nấm thử

nghiệm. 14
Hình 3.4. Sơ đồ mô tả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng giữa bốn dòng nấm thử
nghiệm với dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani. *Ghi chú: FS:
Fusarium solani..........................................................................................................16
Hình 3.5. Hạt giống lúa nảy mầm trên môi trường agar bán lỏng 1% sau 5 ngày ủ.20
Hình 4.1 Sự đối kháng và ức chế lẫn nhau giữa 4 dòng nấm thử nghiệm trên môi
trường ME...................................................................................................................23
Hình 4.2. Hình thái tế bào của sợi nấm và bào tử dòng nấm gây bệnh Fusarium solani
chụp dưới kính hiễn vi quang học ở độ phóng đại 100X. ........................................24
Hình 4.3. Đối kháng giữa 4 dòng nấm thí nghiệm và dòng nấm gây Fusarium solani.
*Ghi chú: FS: Fusarium solani...................................................................................26
Hình 4.6. Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-C5 trong các khoảng pH khác nhau.
Các cột có những số có chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa theo phép
thử Duncan..................................................................................................................29
Hình 4.13. Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L4 ở các khoảng nồng độ muối. Các
cột có những số có chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa theo phép thử
Duncan. 35

VIII


Cao Trường Sơn, 2016. “Đánh giá một số đặc tính sinh lý của bốn dòng nấm có
khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ phân lập từ nền đất thâm canh lúa tại xã
Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp”. Luận văn đại học chuyên ngành
Khoa học đất, Bộ môn Khoa Học Đất, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng,
Trường Đại học Cần Thơ.
Người hướng dẫn khoa học: Ts. Nguyễn Khởi Nghĩa.

13 TÓM LƯỢC
Trong tự nhiên nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân

hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao
đổi vật chất. Bên cạnh đó nấm cũng được xem là vi sinh vật chủ yếu tham gia phân
giải lignin và cellulose. Mục tiêu của đề tài nhằm đánh giá một số đặc tính sinh lý của
bốn dòng nấm có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ được phân lập từ nền đất thâm
canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp. Một số đặc tính sinh lý
của bốn dòng nấm này được khảo sát gồm pH, nhiệt độ và nồng độ muối NaCl nhằm
tìm ra môi trường thích hợp cho sự phát triển của chúng. Bên cạnh đó, việc kiểm tra
tính đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm, khả năng phòng trừ sinh học của chúng
đối với dòng nấm gây bệnh thối rễ trên cây cam sành Fusarium solani cũng như việc
kiểm tra tiềm năng gây bệnh và khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của bốn
dòng nấm này đối với hạt giống cây đậu xanh, rau muống và lúa là rất cần thiết . Kết
quả thí nghiệm cho thấy điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển sinh khối
IX


của cả bốn dòng nấm PH-L3, PH-L4, PH-C5 và PH-L6 là nhiệt độ 30ºC và pH = 3.
Riêng dòng nấm PH-L4 có thể phát triển tốt khi nhiệt độ môi trường lên đến 40ºC và
dòng PH-L6 có thể phát triển tốt khi pH môi trường đạt 6. Bốn dòng nấm này cũng có
khả năng chịu được độ mặn của môi trường lên đến 3%. Cả bốn dòng nấm thí nghiệm
đều thể hiện khả năng ức chế lẫn nhau khi chúng được nuôi cấy trên cùng một môi
trường, tuy nhiên, cường độ ức chế lẫn nhau của bốn dòng nấm này khác nhau. Đặc
biệt cả bốn dòng nấm thử nghiệm đều thể hiện khả năng đối kháng rõ rệt đối với dòng
nấm gây bệnh thối rễ trên cam sành Fusarium solani. Bên cạnh đó, cả bốn dòng nấm
này không phải là tác nhân gây bệnh cũng không ức chế phát triển đối với 3 loại cây
trồng thử nghiệm gồm đậu xanh, rau muống và lúa. Do đó, bốn dòng nấm thử nghiệm
có tiềm năng rất cao trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi trong sản xuất nông
nghiệp.

X

CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, các đề tài nghiên cứu về các dòng nấm có tiềm năng
phân hủy lignin và cellulose đã được quan tâm và chú ý nhiều hơn, các nghiêm cứu
này góp phần cho sự đa dạng về các dòng nấm bản địa có tiềm năng phân hủy cao
cellulose và lignin trên các hệ sinh thái khác nhau, đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông
Cửu Long. Một số đề tài được thực hiện đã phân lập và đánh giá hiệu quả phân hủy
cellulose và lignin của một số dòng nấm đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩm
nông nghiệp trong điều kiện tiệt trùng và không tiệt trùng nhằm chuyển hóa phế thải
nông nghiệp thành phân bón hữu cơ cung cấp dinh dưỡng cho đất và cây trồng vùng
ĐBSCL. Trong số đó, có đề tài “Phân lập một số dòng nấm bản địa có khả năng
phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin từ nền đất thâm canh lúa tại xã
Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp” của Võ Thị Ngọc Cẩm và ctv.,
(2015) đã phân lập được bốn dòng nấm phân hủy tốt vật liệu hữu cơ chứa cellulose và
lignin. Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ dừng lại ở mức định danh các dòng nấm chứ
chưa tìm hiểu sâu về các đặt tính sinh lý của các dòng nấm này cũng như khả năng đối
kháng lẫn nhau và với các dòng nấm gây bệnh trên cây trồng. Tiềm năng gây bệnh
cũng như khả năng kích thích sự phát triển một số cây trồng của bốn dòng nấm này
chưa được nghiên cứu và tìm hiểu rõ. Vì vậy, đề tài “Đánh giá một số đặc tính sinh
lý của bốn dòng nấm có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ phân lập từ nền đất
thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp” này được thực
hiện nhằm mục tiêu:………………………………………..

1


14 CHƯƠNG II
15 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1. Sơ lược về nấm phân hủy vật liệu hữu cơ
Trong tự nhiên có rất nhiều nhóm vi sinh vật tham gia phân hủy vật liệu hữu cơ
chứa lignin và cellulose, tuy nhiên, nấm được xem là vi sinh vật chủ yếu tham gia
phân giải lignin và cellulose. Chúng bao gồm các loài sau: 1) Các dòng nấm thuộc
nhóm nấm bất toàn: Clasdosporium sp., Heminthosporium sp., Humicola sp.,
Dematium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp., Metarrhizum sp. và Gliocladium sp,..; 2)
Các dòng nấm thuộc lớp nấm Đảm: Agaricus sp., Marasmius sp., Pleurotus sp.,
Polyporus sp., Trametes sp., Ustulina sp...3) Một số nấm ăn được trồng trên mùn cưa:
Pleurotus sp. (nấm bào ngư), Auricularia sp., Polytricha sp. (nấm mèo), nấm
Trametes sp.. Các nấm làm mục gỗ được xếp thành hai nhóm: a) Nhóm nấm làm thối
gỗ có màu nâu: Là nhóm nấm phân giải cellulose mà không phân giải được lignin và
b) Nhóm nấm làm thối gỗ có màu trắng: Có thể phân giải cả cellulose lẫn lignin gồm:
Polystictus sp., Armillaaria sp., Polyporus sp., Stereum sp., Ganoderma sp., Pleurotus
sp., Trametes sp., Fomes sp., Ustulina sp. (Phạm Văn Kim, 2000). Những vi sinh vật
phát triển trên hợp chất chứa cellulose thường tiết ra các loại enzyme này để phân hủy
chuyển hóa cellulose (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2003). Một số loại nấm sau đây có
khả năng phân hủy tốt lignin như: Polysitctus versicolor, Stereum hisutum, Pholiota
sp., Clytocye sp... Trichoderma là một trong những chi nấm được nghiên cứu nhiều
nhất và đặc biệt là Trichoderma reesei. Ưu điểm của dòng nấm này là có hệ enzyme
hoạt động rất mạnh và có khả năng phân giải hoàn toàn cellulose tự nhiên (Markku
Saloheimo và ctv., 2012). Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy nấm Trichoderma sp.
tổng hợp một lượng lớn endo-glucanase và exo-glucanase, nhưng chỉ một lượng ít βglucosidase, trong khi đó các chủng thuộc giống Aspergillus sp. thường sinh ra một
lượng lớn endo-glucanase và β-glucosidase nhưng một lượng ít exo-glucanase
(Bothast và Saha, 1997). Exo-glucanase được tạo ra từ Trichoderma sp., Aspergillus
sp. và Penicillium sp. nhưng nhiều nhất từ Aspergillus sp. đặc biệt là Aspergillus niger
(Shen và ctv., 2003), trong khi ezyme β-glucosidase được tiết ra nhiều từ Trichoderma
sp. và Aspergillus oryzae (Fareeha và ctv., 2011). Enzyme cellulase tiết ra từ
Trichoderma reesei thích hợp với khoảng pH = 6 ở nhiệt độ là 40oC (Han và ctv.,
2

2010). Cellulase thu được từ Aspergillus sp. hoạt động tốt ở khoảng pH =7 và ở 30oC
(Chandra và ctv., 2012). Deschams và ctv (1985) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
cellulase của Trichoderma haianum trên môi trường gồm hỗn hợp rơm lúa mì (80%)
và cám (20%) với ẩm độ 74% và pH 5,8. Trichoderma virde có khả năng phân hủy
cellulose khá cao: 80% trong vòng 3 ngày (Lars và ctv., 2005). Một số loài nấm có khả
năng sinh ra một lượng lớn cellulase để phân giải cellulose, phần lớn chúng thuộc
giống Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium…. Trong đó
hai giống Trichoderma và Aspergillus được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản
xuất cellulase (Bothast và Saha, 1997). Theo Mandels và Reese (1964) thì nhiều loài
nấm có khả năng tổng hợp enzyme Cx (exoglucanza), nhưng rất ít loài có khả năng sản
sinh enzyme C1 (endogluanase). Trong khi đó, Teho Reese (1984) thì cho rằng C1 là
"tiền nhân tố thủy phân", là enzyme không đặc hiệu, nó làm trương cellulose tự nhiên
thành các chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn và bị enzyme Cx tiếp tục phân
cắt tạo thành các đường tan và cuối cùng thành glucose.
Hầu hết nấm phân hủy lignin thuộc chi Basidiomycetes gồm: Phanerochaete
chrysoporium, Phlebia radiata, Trametes versicolor, Bjerkandera adusta, Chrysonilia
sitophila, Streptomyces badius và Streptomyces flavovirens (Kirk và Farrell, 1987;
Blanchette, 1991). Ngoài ra, còn một số dòng nấm phân hủy lignin thuộc nhóm
Ascomycetes sp. (Duranvà ctv., 1987) và Actiomyces sp. (Crawford ctv., 1983;
Ramachandra và ctv., 1987). Ngoài ra, một vài loài nấm sống trong đất và gỗ có khả
năng phân hủy lignin cao như: Paraconiothyrium sp. có khả năng sử dụng một số dạng
hợp chất tiêu biểu của lignin sau 40 ngày nuôi cấy với tỷ lệ lignin được phân hủy là
22,99 % (Nilsson và ctv., 2011). Bên cạnh đó, nấm Chrysonilia sitophila làm giảm
59,6% trọng lượng lignin của cây thông trong môi trường lỏng sau 12 ngày, trong khi
đó trên môi trường agar có bổ sung glucose thì tỷ lệ này là 25% trong 3 tháng (Ferraz
và Duran, 1994 và 1995).
2.2. Sơ lược về nhóm nấm Penicilium
Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, quá trình định
danh cho nhiều loài vi sinh vật cũng dễ dàng hơn với thiết bị hiện đại hơn. Nhiều loại

vi sinh có lợi, hại được biết đến rõ ràng hơn. Trong đó, giống nấm mốc Penicillium đã
được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế. Tiêu biểu như loài
Penicillium roqueforti được sử dụng trong việc làm chín phomat xanh, một sản phẩm
3


quen thuộc đối với người dân châu Âu hay Penicillium notatum được dùng trong sản
xuất kháng sinh Penicillin. Ngoài ra, giống Penicillium còn có một số loài khác như:
Penicillium italicum và Penicillium digitatum, hai loài này thường gây bệnh mốc xanh
trên các loại cây ăn quả có múi, nhất là giai đoạn tồn trữ sau thu hoạch. Hoặc loài
Penicillium marneffei gây bệnh lở loét toàn thân trên người. Ainsworth (1973) chia
ngành phụ Ascomycotina thành 6 lớp: Hemiascomycetes, Loculoascomycetes,
Plectomycetes, Laboulbeniomycetes, Pyrenomycetes và Discomycetes. Alexopoulos và
Mim (1979) chia lớp Plectomycetes thành 4 lớp phụ trong đó lớp phụ Plectomycetidae
có 5 bộ trong đó 2 bộ Eurotiales và bộ Erysiphales. Chi Penicillium thuộc họ
Eurotiaceae, bộ Eurotiales. Giới: • Fungi Ngành phụ: • Ascomycotina Lớp: •
Plectomyceste Bộ: • Eurotiales Họ: • Eurotiaceae • Chi: Penicillium. Chi Penicillium
đặc trưng bởi các đặc điểm: Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu
nhạt, đôi khi màu sẫm. Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi
có màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác
nhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòa
tan tương ứng. Khuẩn lạc có hoặc không có vết khía xuyên tâm hay đồng tâm, có hoặc
không có giọt tiết (exudat). Bộ máy mang bào tử trần (còn gọi là "chổi", penicillius)
hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá (cấu tạo một vòng,
monoverticillate), hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống tể bình (metulae)
ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình (cấu tạo hai
vòng, biverticillate). Trường hợp các giá bào tử trần mang một hoặc nhiều nhánh
(branch) ở phần ngọn giá, sau đó các nhánh mang các cuống thể bình và các cuống thể
bình lại mang các th ể bình cũng được coi là cấu tạo hai vòng. Khi các cuống thể bình
xếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo hai vòng đó gọi là cấu tạo hai vòng đối

xứng, trường hợp các cuống thể bình xếp không đều đặn trên phần ngọn giá hoặc có
nhánh, cấu tạo này được gọi là cấu tạo hai vòng không đối xứng. Trường hợp giá bào
tử trần mang nhiều nhánh và các nhánh này cùng với các cuống thể bình, các thể bình
xếp đều đặn và sát nhau, bộ máy mang bào tử tr ần có cấu tạo nhiều vòng
(polyverticillate). Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát
mặt môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau và
khẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate). Giá bào tử trần có th ể là nhánh của các sợi
nấm khí sinh, khuẩn lạc trong trường hợp này có m ặt dạng len hoặc xốp bông (lanate,
4


floccose). Trường hợp các giá bào t ử tr ần là các nhánh của các bó sợi hoặc bản thân
chúng tụ họp lại với nhau thành các bó giá, khuẩn lạc đặc trưng bởi sự có mặt c ủa các
bó sợi (funiculose) ho ặc của các bó giá (fasciculate). Tế bào sinh bào tử trần của các
loài thuộc chi Penicillium là các thể bình. Thể bình ở nhiều loài của chi nấm này có
phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần, phần đỉnh này thường có đường kính vào khoảng ⅓
đường kính của phần thân. Bào tử trần của các loài thuộc chi Penicillium thuộc tip
phialoconidi (tip cơ bản euconidi), không có vách ngăn, hình cầu, gần cầu, hình trứng,
elip, đôi khi hình trụ. Khi riêng rẽ, các bào tử trần không màu hoặc màu nh ạt. khi t ụ
họp thành đám, thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám. Các bào tử trần
này tọa thành chuỗi dài trên miệng thể bình. Bào tử trần cũng như giá bào tử trần, các
nhánh, các cuống th ể bình, các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai
hoặc sần sùi, gồ ghề. Một số ít loài tạo thành hạch nấm (sclerotium). Hạch nấm cấu t
ạo bởi các tế bào có vách dày, có thể rất cứng hoặc mềm, hình cầu, gần cầu, không
màu hoặc có màu sắc khác nhau, đơn độc hoặc thành cụm. Một số loài như đã nói, có
bào tử túi (ascosporum). Thể quả túi là những thể quả kín (cleisthothecium), có vỏ thể
quả cứng hoặc mềm, có hoặc không có các sợi nấm bao quanh, thể sinh túi cuộn xoắn
hoặc thẳng, túi bào tử (ascus) đơn độc hoặc thành chuỗi, bào tử túi không ngăn vách,
có hoặc không có rãnh và gờ quỹ đạo. Penicillium sinh sản vô tính với cọng bào tử và
đính bào tử, cọng bào tử có thể không phân nhánh, phân nhánh bậc 1, 2 hay 3.... và tận

cùng của cọng bào tử là các thể bình, nếu cọng bào tử không phân nhánh thì tận cùng
là các thể bình và các chuổi đính bào tử giống như cây cọ vẽ của các hoạ sĩ nên còn
gọi là thể bình vẽ (metulae), cán (ramus) và cọ vẽ (penicillus). Penicillium có mặt hầu
hết các vùng có khí hậu khác nhau và phát triển phổ biến trong đất, trong vùng nuớc
mặn hay nước ngọt, hoại sinh trên xác bã động thực vật và ký sinh trên thực vật và
động vật. Nhiều loài thuộc chi Penicillium phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý trên
Trái Đất, có mặt ở nhiều cơ chất tự nhiên, trên nhiều sản phẩm công nông nghiệp và
gây mốc cho các sản phẩm này. Nhiều loài đã được phát hiện có ở Việt Nam trên các
cơ chất tự nhiên. Nấm Penicillium sống chủ yếu trên các chất hữu cơ phân hủy sinh
học. Vì vậy nấm Penicillium có mặt trong hầu hết các chế phẩm phân hủy vật liệu hữu
cơ (Cao Ngọc Điệp, 2005).

2.3. Sơ lược về nhóm nấm Aspergillus
5


Aspergillus là một trong những chi có tên lâu đời nhất của nấm. Đến năm 1926,
Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc nỗi tiếng và được nghiêm
cứu nhiều nhất. Cuối thế kỉ thứ 19, một số công trình nghiên cứu cho biết một số sản
phẩm lên men của một số loài thuộc giống Aspergillus là axit hữu cơ như axit oxalic,
axit citric,..và do đó Aspergillus bắt đầu được chú ý nghiên cứu về nhiều mặt như: sinh
hóa, lên men, phân loại. Nấm Aspergillus là một trong những chủng nấm lớn nhất, có
mặt ở khắp nơi trên thế giới, có khoảng 100 loài, hiện tại có khoảng 20-30 loài gây
bệnh cho người, những chủng quan trọng là A. fumigatus, A. flavus, A. niger
như: A.aureus, A.flavus gây

viêm

da; A.niger gây

viêm

tai,

phổi,

dị

ứng,

hen; A.nidulans, A.versicolerr, A.terreuss gây viêm da ở chân, tay, viêm quanh
móng; A.keratitis gây viêm giác mạc; đặc biệt A.fumigatus và A.flavus hay gây viêm
phổi. Nấm Aspergillus sống hoại sinh trên đất, sản sinh ra hàng tỷ bào tử bay trong
không khí, người suy giảm miễn dịch (HIV/AIDS, ung thư, dùng hóa liệu pháp,
glucocorticoides kéo dài…) có nhiều nguy cơ mắc bệnh thể lan tràn. Bệnh có liên quan
nghề nghiệp: giặt áo lông, cạo ống khói, nông dân, nuôi súc vật…. Phương thức gây
bệnh của Aspergillus là đầu tiên có thể gây bệnh ở da sau đó tiến triển gây bệnh hệ
thống hoặc ngược lại. Aspergillus fumigatus là một loại nấm thuộc giống
Aspergillus và là một trong những loài nấm Aspergillus thường gặp nhất và gây bệnh ở
những đối tượng suy giảm miễn dịch. Chi Aspergillus thuộc lớp lớp bất toàn (Fungi
Imperfecti), được chia làm 7 nhóm. Phương thức gây bệnh của Aspergilluss là đầu tiên
có thể gây bệnh ở da sau đó tiến triển gây bệnh hệ thống hoặc ngược lại
( />A. fumigatus có bộ gen đơn bội ổn định, không có biết rõ chu kỳ hữu tính của loài
nấm này và sinh sản bằng cách hình thành bào tử dính (conidiospores) và giải phóng
vào trong môi trường. Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37°C (cùng thân nhiệt
của người), bào tử là các chất ô nhiễm do hít phải gặp nhiều nhất ở người; tuy nhiên,
chúng cũng bị loại trừ nhanh chóng nhờ hệ miễn dịch ở trên những người khỏe mạnh.
Giống Aspergillus có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang và phát triển chủ yếu
trên bề mặt cơ chất, tế bào chất có nhiều nhân và những nhân này có thể di chuyển qua
lại giữa các tế bào với một lổ nhỏ ở cách ngăn. Đặc điểm đại thể chính trong các loài

nấm này là các chỉ điểm như tỷ lệ phát triển của nấm, màu sắc, khuẩn lạc và sự dung
nạp với nhiệt độ. Ngoại trừ Aspergillus nidulans và Aspergillus glaucus, tỷ lệ phát
6


triển là từ nhanh đến trung bình. Trong khi Aspergillus nidulans và Aspergillus
glaucus phát triển chậm và đạt đến kích cỡ khuẩn lạc 0.5-1cm sau khi ủ ở nhiệt độ
25°C trong 7 ngày trên môi trường thạch Czapek-Dox, các loài còn lại thì đạt kích
thước đường kính 1-9cm trong môi trường đặc biệt. Sự khác biệt về tỷ lệ phát triển
như vậy đã giúp các nhà khoa học định loài rõ ràng hơn. Các khuẩn lạc
của Aspergillus thì lấm chấm đến bột trên sợi. Màu sắc bề mặt có thể khác nhau tùy
theo loài và đảo ngược màu sắc về vàng nhạt trong hầu hết các phân lập. Tuy nhiên,
đảo màu sắc có thể từ màu tí đến màu oliu trên một vài dòng của nấm Aspergillus
nidulans và từ màu cam sang màu tía trên dòng Aspergillus versicolor. Aspergillus
fumigatus là một loại nấm dung nạp tốt với nhiệt độ và phát triển tốt ở nhiệt độ trên
400C. Đặc tính này là duy nhất chỉ có ở riêng Aspergillus fumigatustrong số các
loàiAspergillus. Aspergillus fumigatus có thể phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 20-50°C.
Nấm mốc Aspergillus là vi nấm không chỉ gây hại ở thực vật mà còn gây nhưng bệnh
nguy hiểm ở người. Sau đây là một số loài: Aspergillus flavus là một loại nấm thuộc
chi Apspergillus- là một tác nhân gây bệnh của con người, gắn liền với aspergillosis
phổi gây ra các bệnh nhiễm trùng giác mạc. Nhiều chủng sản xuất ra độc tố aflatoxinmột hợp chất gây ung thư gan. Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những
loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm
mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, và đậu phộng, và là
một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm. Aspergillus niger là một trong những
nguyên nhân phổ biến nhất của nhiễm trùng tai nấm, mà có thể gây đau, thính lực tạm
thời mất mát, và trong trường hợp nghiêm trọng, thiệt hại cho ống tai và màng
tympanic ( />.

Các loài nấm thuộc giống Aspergillus phân bố rộng rãi trên cơ chất tự nhiên,

trong các sản phẩm công nông nghiệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới nên
chúng được sử dụng rất rộng rải trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Một số loài đặc biệt
là loài A.oryzae đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men truyền thống để
chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật
bản,....Trong công nghệ sinh học đã và đang sử dụng một số loài thuộc giống
Aspergillus như: A. niger, A.oryzae để sản xuất enzyme như amylase, chitinase,
protease, cellulase, pectinase,...; trong công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm như:
tương chao, nước mắm, nước tương,...;công nghiệp sản xuất một số axit hữu cơ như:
7


acid citric, acid glucomic,...Một số loài thuộc giống Aspergillus khác có khả năng tạo
chất kháng sinh, như A.fumigatus tạo thành fumagilin có tác dụng lên Entamoabae
histolyca; A.humicola, A.nidulans tạo thành humicolin, nidulin có tác dụng ức chế đối
với với các loại vi khuẩn,...trong số các chất này thực sự dùng trong công nghiệp dược
phẩm hiện nay chỉ có loài A.fumigatus sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị amip.
Nhiều loài giống Aspergillus có khả năng biến đổi sinh học, một số khác tạo ra các
loại độc tố, đặc biệt chú ý tới loại độc tố gây ung thư gan như loài A.flavus,
A.paraciticus tạo thành Aflatoxin ( />Chủng A. ninger GM156 (ĐB106) là một variant đột biến của chủng dại A. ninger
GM56, có khả năng sinh tổng hợp xylanaza trên các phế phụ phẩm nông nghiệp.
Xylanaza là một loại enzym quan trọng được dùng rộng rãi trong nhiều ngành công
nghiệp và gần đây được sử dụng nhiều để tăng trọng trong chăn nuôi
( />2.4. Sơ lược về nhóm nấm Rhizomucor
Dòng nấm Rhizomucor có khuẩn ty đơn bào phân nhánh mạnh, sinh bào tử.
Chúng mọc ở các loại hạt, thức ăn gia súc, thực phẩm bị ẩm thành một lớp lông tơ màu
xanh. Một số dòng nấm Rhizomucor có khả năng lên men rượu và oxy hóa. Chúng
được dùng trong sản xuất acid hữu cơ và chế phẩm enzym. Bào tử túi
(sporangiopores) ở nấm Rhizomucor chứa trong túi bào tử động (zoosporangium) và
túi bào tử (sporangium) được mang bỡi cuống túi bào tử (sporangiophores). Nấm
Rhizomucor là tác nhân chủ yếu gây bệnh nấm Mucorales. Bệnh khởi phát ở mũi và

xoang cạnh mũi tạo ra một bệnh cảnh lâm sàng đặc trưng: sốt nhẹ, đau âm ỉ vùng
xoang, có thể có sung huyết mũi hay chảy nước mũi loãng có lẫn máu; mấy ngày sau
bệnh nhân bị song thị, sốt cao, mất tri giác. Khám thấy giảm vận động một mắt, phù
kết mạc, lồi mắt; xương xoăn mũi ở vách đỏ sậm hay hoại tử; có thể hoại tử một vùng
ở khẩu cái cứng; viêm da gò má; dễ bị mù do nấm xâm nhập vào nhãn cầu hay động
mạch mắt. Nấm khó phát triển ở mô bị nhiễm, chỉ gồm những sợi nấm rộng, hiếm khi
có vách, đường kính khoảng 6 - 50mm, trong khi nó mọc nhanh chóng và đa dạng ở
những môi trường cấy trong nhiệt độ phòng. Bệnh nấm Mucorales hay gặp ở những
bệnh nhân trước đây đã từng mắc các bệnh nặng khác. Bệnh khởi phát từ những xoang
cạnh mũi và mũi hay gặp ở bệnh nhân đái tháo đường. Bệnh ở xoang hoặc phổi lại gặp
8


nhiều ở các bệnh nhân cấy ghép cơ quan, bệnh máu ác tính. Bệnh tại đường tiêu hóa
xuất hiện ở những bệnh nhân bị ure máu cao, suy dinh dưỡng nặng hay bị tiêu chảy
mạn tính. Người mắc bệnh từ tự nhiên, không lây từ người này sang người khác. Mọi
thể bệnh do nấm Mucorales gây ra có đặc điểm nổi bật là sợi nấm xâm nhập mạch
máu; thiếu máu hay hoại tử xuất huyết là đặc điểm tổ chức học cần lưu ý
( />2.5. Khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ của bốn dòng nấm thử nghiệm
Qua các nghiên cứu trước đây cho thấy khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ của
các dòng nấm Aspergillus, Penicillium và Rhizomucor rất cao. Trong đó, Aspergillus
fumigatus là dòng nấm phân hủy rất hiệu quả đối với các loại vật liệu hữu cơ rơm, bã
cà phê và mùn cưa. Penicillium janthinellum là dòng nấm phân hủy rất hiệu quả đối
với hai vật liệu hữu cơ: xác mía và mụn dừa. Rhizomucor variabilis là dòng nấm phân
hủy rất hiệu quả vật liệu hữu cơ vỏ (Võ Thị Ngọc Cẩm và ctv..., 2015). Tuy dòng nấm
Rhizomucor gây các bệnh lí trên con người là chủ yếu, nhưng ở đề tài trước cũng đã
phát hiện được dòng nấm này cũng có khả năng phân hủy tốt vật liệu hữu cơ (Võ Thị
Ngọc Cẩm và ctv..., 2015).
.

9


16 CHƯƠNG III
17 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Đề tài được thực hiện từ 01/2016 đến 06/2016, tại Phòng thí nghiệm Sinh học
Đất, Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp và SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ thí nghiệm: cốc thủy tinh, ống đong, bình tam giác, đĩa petri, que và kim
cấy, pipet và đầu pipet các loại cùng các dụng cụ thí nghiệm cần thiết khác dùng cho
quá trình nuôi cấy.
Thiết bị thí nghiệm: tủ sấy, máy lắc, tủ hút, tủ cấy hiệu ESCO, máy vortex, tủ lạnh
4°C, Máy đo pH, máy sấy ẩm độ MA35 Sartorius, cân 2 số lẻ, 4 số lẻ.
3.3. Môi trường dùng trong thí nghiệm
Các thí nghiệm bố trí sử dụng môi trường Malt Extract (ME), thành phần môi
trường gồm: 1.3g K2HPO4.3H2O, 1g KH2P04, 1g NH4NO3, 0.02g CaCl2, 0.2g
MgS04.7H20, 13.3g Agar, 10g Malt Extract trong 1L nước khử khoáng, lỏng tiệt trùng
được điều chỉnh nhiệt độ, pH, nồng độ muối cho phù hợp với các thí nghiệm riêng
biệt. Môi trường Agar bán lỏng 1% (1g Agar trong 1L nước khử khoáng).
Bảng 3.1. Môi trường nuôi cấy Hoagland.
Thành phần

Stock Solution

mL Stock Solution/1L

Thành phần đa lượng
2M KNO3
1M Ca(NO3)2•4H2O

Iron (Sprint 138 iron chelate)
2M MgSO4•7H2O
1M NH4NO3

202 g/L

2.5

236 g/0.5L

2.5

15 g/L

1.5

493 g/L

1

80 g/L

1

Thành phần vi lượng
H3BO3

2.86 g/L

10

1


MnCl2•4H2O

1.81 g/L

1

ZnSO4•7H2O

0.22 g/L

1

CuSO4•5H2O

0.051 g/L

1

H2MoO4•H2O or

0.09 g/L

1

Na2MoO4•2H2O

0.12 g/L

1

Phosphate
1M KH2PO4 (pH to 6.0)

136 g/L

0.5

3.4. Vật liệu thí nghiệm
3.4.1. Nguồn nấm:
Bốn dòng nấm đã được định danh: Penicillium janthinellum PH-L3, Aspergillus
fumigatus PH-L4, Aspergillus fumigatus PH-C5 và Rhizomucor variabilis PH-L6 sử
dụng trong thí nghiệm được phân lập và tuyển chọn từ đề tài nghiên cứu khoa học của
Võ Thị Ngọc Cẩm và ctv., (2014) với tên đề tài: “Phân lập một số dòng nấm bản địa
có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin từ nền đất thâm canh lúa
tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp”. Đặc tính hình thái khuẩn lạc và
dạng bào tử của bốn dòng nấm thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 2.3 và Hình 3.1,
Hình 3.2.
Bảng 2.3. Đặc tính hình thái khuẩn lạc của bốn dòng nấm thử nghiệm.
STT

Ký hiệu

1

PH-L3

2

PH-L4

3

PH-C5

4

PH-L6

Màu sắc và hình dạng
khuẩn lạc
Màu xanh xám, tròn, không
nhô
Màu xanh xám nhiều bào tử
Màu xám, dạng tròn, không
nhô
Màu vàng cam và nhô lên

11

Màu khuẩn lạc ở
mặt dưới đĩa
petri

Đường kính
khuẩn lạc
(cm)

Trắng đục

1,7

Xanh đen

2,5

Xám

5,8

Vàng cam

9,0


A

B

Hình 3.1. Hai dạng cuống bào tử nấm điển hình cho 4 dòng nấm: (A) cuống bào tử
dòng nấm PH-L4 và PH-C5; (B) cuống bào tử dòng nấm PH-L3 và PH-L6
được quan sát trên kính viển vi ở vật kính 100.

Hình 3.2. Hai dạng bào tử nấm điển hình cho 4 dòng nấm phân lập: (A) bào tử dạng
hình cầu của dòng nấm PH-L3, PH-L4 và PH-L6 và (B) bào tử dạng hình hạt
lúa dòng nấm PH-C5 được quan sát trên kính viển vi ở vật kính 100.
3.5. Nội dung nghiên cứu:

3.5.1. Nội dung 1: Kiểm tra tính đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm
PH-L3, PH-L4, PH-C5 và PH-L6 thử nghiệm
Mục tiêu của nội dung nghiên cứu 1 nhằm kiểm tra khả năng đối kháng với
nhau giữa bốn dòng nấm thử nghiệm.

12


a. Chuẩn bị nguồn nấm
Mẫu nấm được trữ và bảo quản trong môi trường glycerol trong tủ đông -30 oC trước
khi sử dụng. Trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm, nấm được nuôi cấy riêng biệt trên
môi trường Malt Extract trong 4 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm để các dòng nấm
này gia tăng sinh khối. Dùng Pasteur Pipet tiệt trùng có đường kính 2 mm để cắt khối
agar chứa nấm.
b. Bố trí thí nghiệm
Cấy mỗi hai dòng nấm khác nhau lên các đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy Malt
Extract. Dùng bút lông chia thành 4 phần bằng nhau cho mỗi đĩa agar, khối nấm với
kích thước 2 mm chứa mỗi dòng nấm được đặt xen kẽ với nhau ở mỗi một phần tư của
đĩa (Hình 3.1). Dán parafilm bên ngoài để tránh nhiễm mẫu. Đĩa petri được đặt trong
tối ở điều kiện phòng thí nghiệm trong 6 ngày. Sau đó quan sát và chụp hình để ghi
nhận khả năng đối kháng lẫn nhau giữa các dòng nấm thí nghiệm.

13