Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi aspergillus oryzae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Nguyễn Thị Khuyến

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN
GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Nguyễn Thị Khuyến

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN
GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn thạc sĩ của mình, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới
TS. Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trƣởng Phòng Genomic, Phòng thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự
nhiên– Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và luôn tạo
điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thành viên Phòng thí nghiệm
Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã giúp đỡ, cung cấp cơ sở vật chất và tạo
điều thuận lợi cho em hoàn thành tốt nghiên cứu của mình. Em cũng vô cùng biết
ơn các thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học và Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa
học Tự nhiên đã nhiệt tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ
em trong quá trình học tập.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và các em, các anh
chị Phòng Genomic đã khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và
trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 11 năm 2016
Học viên

Nguyễn Thị Khuyến


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AS

Acetosyringone

ATMT

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation

bp

Base pair

CAM

Coconut agar medium

CD

Czapek-Dox

cDNA

Complementary deoxyribonucleic acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

GFP

Green fluorescent protein

IM

Induction medium (Môi trƣờng cảm ứng)

ITS

Internal transcribed spacer

kb

Kilo base pair

Mb

Megabase

kDa

Kilodalton

LB

Luria- Bertani
Left Border

PCR

Polymerase chain reaction

PDA

Potato dextrose agar

PSM

Phytase-screening medium

RB

Right Border

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các gen liên quan trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin…………...….8
Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu………………...………...20
Bảng 2.2. Mồi PCR dùng trong nghiên cứu……………………………...………..22


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi

3

Aspergillus oryzae RIB40
Hình 1.2. Mối quan hệ phát sinh loài và sự khác biệt trong hệ gen của A.

7

oryzae và A. Flavus
Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens gây khối u trên thực vật

11

Hình 1.4. Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể cho chuyển gen

12

vào nấm thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens
Hình 1.5. Biểu hiện gen GFP ở nấm sợi Aspergillus fumigatus

18

Hình 1.6. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi Fusarium oxysporum

19

Hình 3.1. Hình thái A. oryzae và A. flavus trên đĩa môi trƣờng PDA và

36

dƣới kính hiển vi quang học
Hình 3.2. Kiểm tra sự phát quang của độc tố aflatoxin trên môi trƣờng

37

CAM của các chủng A. flavus NRRL 3357, A. oryzae RIB40 và
A. oryzae VS1
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR phân tử phân biệt A. oryzae với A.

39

flavus
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và tiết enzyme amylase của A. oryzae

41

VS1 so với chủng RIB40
Hình 3.5. Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của một số chủng

42

A. Oryzae
Hình 3.6. Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen pyrG ở nấm sợi A. oryzae

44

Hình 3.7. Các bƣớc xóa gen pyrG ở A. oryzae sử dụng phƣơng pháp

45

ATMT
Hình 3.8. Kiểm tra khả năng sinh trƣởng của các chủng xóa gen trên các

46

môi trƣờng Czapek-Dox có và không có 5-FOA, uridine, uracil
Hình 3.9. Xác nhận các chủng xóa gen pyrG bằng PCR

47


Trang
Hình 3.10. Xóa gen pyrG ở chủng chuẩn quốc tế A. oryzae RIB40

49

Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nồng độ uridine (uri) và uracil (ura) đến mứcđộ

50

sinh trƣởng của chủng A. oryzae VS1 và A. oryzae VS1 xóa pyrG
Hình 3.12. Tạo vector pEX1 chứa marker trợ dƣỡng pyrG và gen huỳnh

52

quang xanh GFP
Hình 3.13. Tạo vector pEX2 chứa marker trợ dƣỡng pyrG và gen huỳnh

53

quang đỏ DsRed
Hình 3.14. Tạo vector pEX3 biểu hiện enzyme phytase

54

Hình 3.15. Quy trình chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil

56

sử dụng phƣơng pháp ATMT
Hình 3.16. Chuyển gen chỉ thị huỳnh quang GFP và DsRed vào các

57

chủng A. oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.17. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở chủng A. oryzae VS1 trợ

59

dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.18. Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở chủng A. oryzae AUT1-

60

PlD trợ dƣỡng uridine/uracil
Hình 3.19. Chuyển gen vào chủng A. oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil

61

Hình 3.20. Biểu hiện gen DsRed ở chủng AUT1-PlD trợ dƣỡng

63

uridine/uracil
Hình 3.21. Biểu hiện gen phyA ở nấm sợi A. oryzae trợ dƣỡng

65

uridine/uracil
Hình 3.22. Khả năng phân giải phytate của một số chủng chuyển gen trên

66

môi trƣờng PSM
Hình 3.23. Xác nhận các chủng chuyển gen phyA bằng PCR

67


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae ..............................................3
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae ...................................3
1.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae .................................................4
1.1.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae ....................................................................5
1.1.4. Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 6
1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi ......................................................9
1.2.1. Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) ........................9

1.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation) ..........................10
1.2.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT) ..10
1.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen ............................14
1.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm ................................17
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..........................................................20
2.1. Nguyên liệu .....................................................................................................20
2.1.1. Chủng vi sinh vật ......................................................................................20
2.1.2. Thiết bị và hóa chất ..................................................................................22
2.1.3. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu......................................................25
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................26
2.2.1. Thu nhận bào tử nấm ................................................................................26
2.2.2. Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA..............................................27
2.2.3. Quan sát hình thái và kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa ............28


2.2.4. Phân biệt A. oryzae và A. Flavus bằng các kỹ thuật sinh học phân tử ....29
2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen ...........................................30
2.2.6. Chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae ..........................................................33
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................36
3.1. Xác nhận chủng A. oryzae an toàn để sử dụng cho chuyển gen .....................36
3.1.1. Phân biệt các chủng A. oryzae an toàn và chủng Aspergillus flavus sinh
độc tố aflatoxin ...................................................................................................36
3.1.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen ................................40
3.2. Lựa chọn marker chuyển gen vào A. oryzae...................................................41
3.3. Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ..............43
3.3.1. Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil ................43
3.3.2. Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen vào A. oryzae trợ dƣỡng
uridine/uracil ......................................................................................................50
3.4. Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP và
DsRed .....................................................................................................................54

3.4.1. Chuyển gen GFP và DsRed vào nấm sợi A. oryzae trợ dƣỡng
uridine/uracil ......................................................................................................54
3.4.2. Xác nhận các thể chuyển gen ...................................................................57
3.5. Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA mã hóa
enzyme phytase của A. fumigatus ở A. oryzae .......................................................63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................68


MỞ ĐẦU

Aspergillus oryzae là loài nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực
phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nƣớc châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung
Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines. Loài nấm này đã
đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn
(GRAS). Ở Việt Nam, A. oryzae đƣợc sử dụng để sản xuất tƣơng truyền thống tại
một số địa phƣơng ở các tỉnh phía Bắc. A. oryzae có khả năng tiết một lƣợng lớn
các enzyme khác nhau vào môi trƣờng. Do đó, loài nấm này đƣợc sử dụng nhƣ nhà
máy tế bào để sản xuất thƣơng mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên
và tái tổ hợp. Gần đây chủng A. oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại
Nhật Bản đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen. Sự hiểu biết tƣờng tận về hệ gen của
A. oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm
sợi an toàn này.
Hiện nay, hai phƣơng pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là
chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Tuy nhiên việc chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae cho đến nay chỉ sử
dụng phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần. Phƣơng pháp này tƣơng đối phức
tạp và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn với chi phí
hợp lý. Tuy nhiên chƣa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành

công ở nấm sợi A. oryzae. Bên cạnh đó, A. oryzae có khả năng kháng lại hầu hết các
hợp chất kháng sinh thƣờng đƣợc sử dụng cho chuyển gen. Do đó phát triển các
chủng A. oryzae trợ dƣỡng để sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải
biến di truyền cũng nhƣ biểu hiện gen ở A. oryzae.
Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cho nấm sợi A. oryzae
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens nhằm phục vụ hƣớng nghiên cứu bền vững về
biểu hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài

1


―Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae‖ với những nội dung chính nhƣ sau:
-

Xác nhận các chủng A. oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tƣợng
chuyển gen.

-

Tạo chủng A. oryzae đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen
pyrG.

-

Tạo một số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu
hiện gen ở nấm sợi A. oryzae.

-

Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh
quang GFP và DsRed.

-

Bƣớc đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạo đƣợc để biểu hiện gen
phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae
Nấm sợi A. oryzae thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus, trong họ
Trichocomaceae. A. oryzae có cấu tạo đa bào, khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng
đĩa thạch, hệ sợi có màu trắng xám sau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt
đến xanh. Hệ sợi nấm A. oryzae sinh trƣởng rất nhanh và phân mảnh, chiều ngang
có kích thƣớc 5-7 µm. Trên những sợi này hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi
là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của A. oryzae thƣờng dài 1-2 mm. Trên
cuống phồng lên tạo thành bọng, từ bọng này mọc lên các tế bào nhỏ, thuôn dài
hình chai, xếp sát nhau, gọi là thể bình; trên thể bình có đính những chuỗi bào tử
màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (còn gọi là bào tử đính) [31, 53, 80, 99]. Hình
thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của nấm sợi A. oryzae đƣợc Machida và cộng
sự mô tả chi tiết nhƣ trong Hình 1.1.

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi
Aspergillus oryzae RIB40 [53]
3

Nấm sợi A. oryzae sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng có thể sinh
trƣởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau nhƣ các mảnh vụn
thực vật, cây lá, gỗ mục nát, các loại hạt, thức ăn gia súc... A. oryzae phân bố rộng
rãi trên toàn thế giới, đặc biệt phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới. Trong quá trình sinh
trƣởng và phát triển, A. oryzae tiết ra môi trƣờng một lƣợng lớn các enzyme thủy
phân nhƣ cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase [36, 53].
1.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae
Gần đây, chủng A. oryzae RIB40 đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất
các thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ
gen, theo đó hệ gen của A. oryzae gồm 8 nhiễm sắc thể với tổng kích thƣớc là 37
megabase (Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25%-30% so với
các loài khác thuộc chi Aspergillus. Chẳng hạn, hệ gen của A. oryzae lớn hơn loài A.
nidulans (loài chuẩn dùng cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm) và A. fumigatus
(tác nhân gây bệnh cơ hội ở ngƣời) lần lƣợt là 29% và 34% [53]. Hệ gen của A.
oryzae lớn hơn chủ yếu do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa. Việc mở
rộng kích thƣớc hệ gen dƣờng nhƣ đặc trƣng cho các loài có quan hệ gần gũi với A.
oryzae nhƣ A. niger và A. flavus, các loài này có kích thƣớc hệ gen tƣơng đƣơng
nhau. Đặc biệt loài có quan hệ rất gần gũi với A. oryzae là A. flavus có độ tƣơng
đồng DNA đến 99,5% [2, 53, 85].
A. oryzae có khả năng phân giải mạnh nhiều loại cơ chất có trong tự nhiên do
loài này sở hữu các gen mã hóa enzyme thủy phân khác nhau. Các loài A. oryzae, A.
fumigatus và A. nidulans chứa lần lƣợt 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease,
chiếm khoảng 1% tổng số các gen trong hệ gen. Tất cả các gen mã hóa protease
đƣợc tìm thấy trong A. fumigatus và/hoặc A. nidulans đều có mặt trong A. oryzae,
tuy nhiên các gen mã hóa một số enzyme aminopeptidase có mặt trong A. oryzae lại
không có mặt trong hệ gen của A. fumigatus và A. nidulans. Ngoài ra, A. oryzae còn
sở hữu thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả năng hoạt động trong môi

4

trƣờng có tính axit. Sự gia tăng các protease hoạt động trong pH axit của A. oryzae
có thể hình thành trong quá trình thuần hóa của con ngƣời [53]. Sự hiểu biết tƣờng
tận về hệ gen của Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu
cải biến di truyền ứng dụng loài nấm an toàn này trong sản xuất các sản phẩm nhằm
phục vụ mục đích con ngƣời.
1.1.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae
Nấm sợi A. oryzae đƣợc thuần hóa từ ít nhất 2000 năm trƣớc và hiện nay
đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm ở Nhật Bản, Trung Quốc và các
nƣớc Đông Á nhƣ lên men đậu nành, làm nƣớc sốt, tƣơng và một số đồ uống có cồn
nhƣ huangjiu, sake, makgeolli và shochu [4, 36, 111]. A. oryzae đƣợc sử dụng rộng
rãi trong thực phẩm do đặc tính sinh trƣởng nhanh, tiết lƣợng lớn các enzyme thủy
phân nhƣ amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh
trƣởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho các sản phẩm lên men [37]. Trong lên men
truyền thống, A. oryzae thƣờng đƣợc nuôi ở môi trƣờng rắn, điều kiện này thích hợp
cho sự phát triển hiếu khí của sợi nấm. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở
môi trƣờng rắn giúp tăng khả năng sản sinh các enzyme và các chất chuyển hóa mà
thƣờng sẽ không đƣợc sản xuất trong điều kiện lên men lỏng [99].
Ngoài vai trò trong sản xuất các thực phẩm truyền thống, nấm sợi A. oryzae
còn đƣợc sử dụng trong một số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh
tế cao nhƣ glucoamylase, α-amylase và một số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo,
đồ uống. Glucoamylase và α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần
20% tổng sản lƣợng enzyme đƣợc sản xuất, trong đó chủ yếu đƣợc sản xuất bởi
nấm sợi A. oryzae [16, 81, 98, 113]. Nguồn cung cấp enzyme protease cho công
nghiệp sản xuất thực phẩm và các chất tẩy rửa đến từ các loài nấm sợi thuộc chi
Conidiobolus, Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó phải kể đến loài
sinh protease rất cao là A. oryzae [1, 106].

5

Bên cạnh những lợi ích về kinh tế, A. oryzae còn đƣợc coi là vi sinh vật mô
hình dùng cho nghiên cứu về biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp. Ngoài ra
nghiên cứu chuyển gen còn hỗ trợ trong việc tìm ra chức năng cũng nhƣ vai trò của
các gen mới [54].
1.1.4. Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố
aflatoxin
Hiện nay, tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ tăng lên ngày một tăng cao. Một
trong những nguyên nhân chính là do ăn phải thực phẩm chứa các chất gây ung thƣ,
trong đó có độc tố nấm aflatoxin. Độc tố aflatoxin đƣợc sinh ra bởi nấm mốc
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên các loại hạt nông sản quan trọng
không đƣợc bảo quản tốt nhƣ gạo, lạc, ngô, đậu tƣơng... Hình thái của A. flavus gần
nhƣ giống hệt với loài A. oryzae mà thƣờng đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp
thực phẩm [17, 26, 80].
A. flavus và A. oryzae là hai loài thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus.
Tƣơng tự nhƣ A. oryzae, nấm sợi A. flavus có khả năng tồn tại ở nhiệt độ từ 12ºC
đến 48ºC và sinh trƣởng tối ƣu nhất ở 28ºC đến 37ºC. Hầu hết trong chu trình sống
A. flavus tồn tại ở dạng hệ sợi và sinh sản bằng bào tử đính. Giống với một số chủng
A. oryzae, dƣới điều kiện bất lợi, sợi nấm A. flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt
gọi là hạch nấm (sclerotia). Hạch nấm giúp chúng có thể tồn tại dƣới các điều kiện
khắc nghiệt. Khi điều kiện trở nên thuận lợi, các hạch nấm sẽ phát triển thành dạng
sợi và từ đó sinh ra các cuống mang bào tử đính, phát tán ra ngoài môi trƣờng đất và
không khí [17, 26].
Trong tự nhiên, rất khó để có thể phân biệt hai loài A. oryzae và A. flavus bởi
hình thái rất giống nhau. Hơn nữa, khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài,
nhận thấy genome của chủng A. oryzae RIB40 và A. flavus NRRL 3357 có độ tƣơng
đồng 99,5% DNA và 98% protein [85]. Phân tích tiến hóa trên một số chủng thuộc
hai chi này, nhận thấy A. flavus và A. oryzae có mức độ tƣơng đồng tùy thuộc vào
6

từng chủng. Ví dụ nhƣ hai chủng A. flavus SRRC 1357 và SRRC 2112 có mối quan
hệ gần gũi với A. oryzae hơn các chủng A. flavus khác, do có nhiều đặc điểm của A.
oryzae hơn (Hình 1.2). Từ các dữ liệu về hệ gen, A. oryzae đƣợc cho rằng có nguồn
gốc phát sinh từ loài A. flavus [18].

Hình 1.2. Mối quan hệ phát sinh loài và sự khác biệt trong hệ gen của A. oryzae và
A. flavus (màu xanh lam là A. oryzae, màu xanh lá cây là A. flavus) [18]
A. oryzae khác với A. flavus ở việc mất khả năng sinh độc tố aflatoxin trong
quá trình sinh trƣởng do trong quá trình tiến hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và
đột biến mất đoạn ở một số gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin [8]. Con đƣờng
sinh tổng hợp aflatoxin bắt nguồn từ axit norsolorinic (NOR), trải qua ít nhất 23 quá trình
chuyển hóa trung gian, nhờ các enzyme đƣợc mã hóa bởi 25 gen nằm trong một vùng
DNA kích thƣớc 70 kb để tạo thành aflatoxin có độc tính cao nhất là aflatoxin B1 (AFB1)
[47, 97, 112].
Các bƣớc chuyển hóa đƣợc thực hiện bởi các enzyme có chức năng riêng biệt.
Các gen liên quan đến từng bƣớc chuyển hóa trong quá trình sản xuất aflatoxin trong tế
bào nấm đƣợc liệt kê tại Bảng 1.1.

7


Bảng 1.1. Các gen liên quan trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin.
Các gen liên quan

Quá trình chuyển đổi

aflA (fas-2), aflB (fas-1), và aflC (pksA)

Acetate -> NOR

aflD (nor-1), aflE (norA), và aflF (norB)

NOR -> AVN

aflG (avnA)

AVN -> HAVN

aflH (adhA)

HAVN -> AVF

aflI (avfA)

AVF -> VHA

aflJ (estA)

VHA -> VAL

aflK (vbs)

VAL -> VERB

aflL (verB)

VERB -> VERA

aflM (ver-1) và aflN (verA)

VERA -> DMST

aflO (omtB, dmtA)

DMST -> ST; DMDHST -> DHST

aflP (omtA)

ST -> OMST; DMST -> DHOMST

aflQ (ordA)

OMST -> AFB1, AFG1
DMDHST -> AFB2, AFG2

Trong hai thập kỷ qua, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc sử dụng để
phân biệt các loài thuộc phân nhóm Flavi nhƣ kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction) [10], RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) [38], AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism) [66], phân tích so sánh trình tự vùng
ITS (Internal Transcribed Spacer) của DNA ribosome [41] hoặc phân tích tính đa

8


hình nucleotide đơn SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [45]. Tuy nhiên, các
phƣơng pháp kể trên vẫn còn những hạn chế nhất định trong việc phân biệt A.
oryzae và A. flavus hoặc thiếu sự ổn định trong các lần lặp lại thí nghiệm [8]. Dựa
trên sự khác biệt về trình tự DNA của nhóm gen liên quan đến sinh tổng hợp

aflatoxin ở A. flavus và A. oryzae, một số cặp mồi PCR đặc hiệu cho các gen này đã
đƣợc thiết kế và sử dụng để phân biệt A. flavus và A. oryzae [10].

1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi
Các nghiên cứu về di truyền học phân tử của nấm sợi đã có những đóng góp
đáng kể cho sự hiểu biết của con ngƣời về cơ chế gây bệnh và các con đƣờng sinh
tổng hợp enzyme, protein. Chuyển gen là một công cụ không thể thiếu trong các
nghiên cứu này.
Hiện nay, nhiều phƣơng pháp chuyển gen đƣợc sử dụng nhƣ chuyển gen
thông qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng
súng bắn gen và chuyển gen sử dụng vi sinh vật trung gian là vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Mỗi phƣơng pháp đều có những ƣu, nhƣợc điểm riêng
và tùy thuộc vào từng loài mà hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phƣơng
pháp. Tuy nhiên phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất ở nấm sợi là chuyển gen
qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện (electroporation) và chuyển
gen trung gian qua vi khuẩn A.tumefaciens [6, 51, 62, 63].
1.2.1. Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)
Ðể chuyển gen vào nấm thông qua tế bào trần, tế bào nấm cần đƣợc xử lý
enzyme nhằm loại bỏ thành tế bào, từ đó tạo protoplast giúp DNA dễ dàng xâm
nhập vào tế bào. Phƣơng pháp này có thể đƣợc sử dụng để chuyển trực tiếp các
đoạn DNA hoặc các vector mang gen mong muốn vào tế bào. Ðể nâng cao hiệu quả
chuyển gen, protoplast thƣờng đƣợc xử lý với PEG (polyethylene glycol) hoặc bằng
xung điện. Phƣơng pháp chuyển gen này khá hiệu quả, đặc biệt đối với những loài
mà các phƣơng pháp chuyển gen khác không thể thực hiện đƣợc. Tuy nhiên, quá
trình chuẩn bị protoplast cũng nhƣ các bƣớc chuyển gen khá phức tạp, tốn nhiều
9


công sức, chi phí cao và không ổn định, đòi hỏi ngƣời thực hiện phải có nhiều kinh
nghiệm, không thể áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ. Đặc biệt

protoplast phải đƣợc sử dụng ngay sau khi chuẩn bị [51, 57].
1.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện là phƣơng pháp cơ học đƣợc sử dụng
để đƣa các phân tử DNA vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phƣơng pháp
này, một xung điện cao thế trong thời gian rất ngắn (vài phần nghìn giây) tạo ra các
lỗ thủng tạm thời giúp cho các phân tử DNA ngoại lai từ môi trƣờng có thể xâm
nhập vào bên trong tế bào. Phƣơng pháp xung điện đã đƣợc áp dụng thành công trên
nhiều loại tế bào, trong đó có tế bào nấm sợi [6, 7]. Trƣớc khi xử lý với xung điện,
bào tử nấm nảy chồi sẽ đƣợc loại bỏ thành tế bào bằng một số enzyme để tạo tế bào
trần. Sau đó tế bào trần đƣợc trộn với DNA và đƣợc đƣa vào máy tạo xung điện để
chuyển DNA vào trong tế bào nấm [7]. Phƣơng pháp này mới chỉ áp dựng thành
công với một số loài nấm sợi và đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá
trình chuyển gen.
1.2.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT)
1.2.3.1. Cơ chế chuyển gen vào tế bào chủ của A. tumefaciens
Vi khuẩn A. tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc
chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae. Vi khuẩn A. tumefaciens là tác nhân gây khối
u trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u
(Ti-plasmid) của nó vào tế bào thực vật. Các gen nằm trên T-DNA mã hóa cho các
enzyme ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng mất kiểm soát của tế bào thực vật là nguyên
nhân chính dẫn đến sự hình thành khối u [28, 108]. Quá trình chuyển gen gây khối u
nằm trên Ti-plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc mô tả trên Hình 1.3.

10


Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens gây khối u trên thực vật [95]
Ti plasmid có kích thƣớc 200 kb-800 kb, bao gồm đoạn T-DNA đƣợc giới
hạn bởi biên trái (LB) và biên phải (RB), các biên có kích thƣớc khoảng 25 bp.
T-DNA mang gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine. Các gen này sẽ tích hợp vào

hệ gen của thực vật ở một vị trí ngẫu nhiên. Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có
vùng gen độc, chứa các gen vir mã hóa các protein (virA, virG, và một số protein
khác) giúp vận chuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật [28]. Các gen vir này
chính là yếu tố quyết định khả năng chuyển T-DNA vào tế bào chủ của vi khuẩn
Agrobacterium. Sự hoạt động của các gen vir đƣợc cảm ứng bởi hợp chất
phenolic có nguồn gốc từ thực vật, có tên là acetosyringone (AS) [63]. Khi có mặt
chất cảm ứng, gen vir hoạt động dẫn tới quá trình chuyển T-DNA trên Ti plasmid
vào tế bào.
1.2.3.2. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Trong điều kiện có chất cảm ứng, vi khuẩn A. tumefaciens sẽ chuyển một
phần DNA trên Ti plasmid (còn gọi là T-DNA) của nó vào tế bào thực vật. T-DNA
sau đó đƣợc tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen [24, 28]. Lợi dụng cơ chế này, vi khuẩn
A. tumefaciens đƣợc sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ

11


những năm 1980, sau đó vào năm 1998 vi khuẩn này lần đầu tiên đƣợc ứng dụng
thành công để chuyển gen vào nấm [12].
Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đƣợc coi là
phƣơng pháp đơn giản nhất để chuyển gen vào nấm sợi. Phƣơng pháp ATMT
chuyển gen vào nấm dựa trên cơ chế chuyển đoạn T-DNA trên Ti-plasmid có mặt
trong tế bào vi khuẩn sau đó tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen nấm. Các gen cần
chuyển sẽ đƣợc gắn vào vùng T-DNA, sau đó đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A.
tumefaciens dùng cho chuyển vào nấm. Phƣơng pháp chuyển gen này đã đƣợc thực
hiện thành công trên nhiều loài nấm sợi khác nhau [12, 23, 62, 63, 93].
Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens cần một hệ thống
gồm hai plasmid là plasmid trợ giúp (vir helper) có chứa các gen vir (virulence)
giúp vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ, và một vector nhị thể (binary vector) chứa
đoạn T-DNA đã đƣợc cải biến cho mục đích chuyển gen [63]. Trên vectornhị thể có

chứa gen kháng kháng sinh dùng để chọn lọc vi khuẩn mang vector và vùng T-DNA
giới hạn bởi hai biên LB (left border) và RB (right border) có chứa marker chọn lọc
thể chuyển gen và một vùng DNA có thể đƣợc cải biến tùy vào mục đích chuyển
gen [27, 74]. Mô hình hệ thống vector nhị thể hiện trong Hình 1.4.

Hình 1.4. Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể cho chuyển gen vào nấm
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [46]
Một trong những ƣu điểm lớn nhất của phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens là có thể tạo ra một loạt các thể đột biến ngẫu nhiên do

12


T-DNA từ tế bào vi khuẩn chèn ngẫu nhiên vào hệ gen của vi nấm. Một số nghiên
cứu chỉ ra rằng A. tumefaciens chèn T-DNA vào hệ gen của nấm chủ yếu chỉ ở dạng
một bản đơn và đoạn T-DNA này có thể phá hủy một gen duy nhất ở thể biến nạp
tƣơng ứng. Từ việc nghiên cứu các thể đột biến chèn ngẫu nhiên có thể giúp xác
định chức năng của gen. Ngoài chức năng biểu hiện và tạo các thể đột biến ngẫu
nhiên, phƣơng pháp chuyển gen bằng A. tumefaciens còn đƣợc sử dụng trong việc
xóa các gen nhờ cơ chế trao đổi chéo tƣơng đồng trong tế bào nấm [49].
Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã đƣợc ghi
nhận chuyển thành công ở một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus (A. fumigatus,
A. awamori, A. japonicas, A. niger), tuy nhiên chƣa có một nghiên cứu nào đề cập
đến việc chuyển gen vào A. oryzae thông qua vi khuẩn A. tumefaciens [12, 23, 62,
63, 93].
1.2.3.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens thực hiện đơn giản
hơn nhiều so với các phƣơng pháp khác, tuy nhiên thời gian tiến hành dài hơn do
cần thời gian đồng nuôi cấy cảm ứng giữa nấm và vi khuẩn [62]. Nguyên liệu của
chuyển gen có thể sử dụng hệ sợi hoặc bào tử nấm mà không cần bất cứ khâu xử lý

bổ xung nào nhƣ chuyển gen qua protoplast hay chuyển gen bằng xung điện. Thậm
chí, chỉ sử dụng phƣơng pháp này mới khả thi đối với một số loài nấm [90, 102].
Hiệu quả chuyển gen vào nấm sợi khi sử dụng vi khuẩn Agrobacterium thu đƣợc số
thể chuyển cao hơn nhiều lần so với chuyển gen bằng tế bào trần nhờ PEG [61, 86].
Bên cạnh đó, các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng việc xóa gen ở nấm nhờ cơ
chế trao đổi DNA tƣơng đồng nhờ A. tumefaciens đạt hiệu quả cao hơn so với xóa
gen bằng các phƣơng pháp khác. Hiệu quả xóa gen khi sử dụng protoplast chỉ đạt
1%-50%, nhƣng khi sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens hiệu quả có thể đạt đến 97%
[11].

13


1.2.3.4. Ứng dụng của phương pháp ATMT trong cải biến di truyền
Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã đƣợc
chứng minh lợi thế hơn các phƣơng pháp chuyển gen thông thƣờng. Nguyên liệu
ban đầu có thể đƣợc sử dụng nhƣ sợi nấm, tế bào trần hoặc bào tử. Chuyển gen
bằng phƣơng pháp ATMT tạo một tỷ lệ cao các thể đột biến ngẫu nhiên do T-DNA
chèn vào hệ gen vật chủ [12, 61, 68]. Ngoài ra, chuyển gen bằng phƣơng pháp này
có thể tạo ra các trao đổi chéo tƣơng đồng. Do đó là công cụ hữu ích để xóa và xác
định các chức năng của gen [63].
Để xác định chức năng của một gen cụ thể, phƣơng pháp hữu hiệu nhất là
gây đột biến xóa hoặc làm hỏng gen đó. Xóa một gen cụ thể ở Saccharomyces
cerevisiae đạt hiệu quả cao và chỉ cần hai đoạn tƣơng đồng nhỏ (50 bp) ở hai phía
trình tự mã hóa [91]. Tuy nhiên, ở nấm sợi cần hai đoạn tƣơng đồng kích thƣớc lớn
hơn. Xóa gen sử dụng phƣơng pháp ATMT đƣợc ghi nhận là có hiệu quả cao hơn so
các phƣơng pháp chuyển gen khác. Hiệu quả xóa gen dao động từ 14% đến 75%,
cao hơn hẳn so với các phƣơng pháp chuyển gen thông thƣờng [63].
1.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen
Hiện nay, marker dùng trong chọn lọc các thể chuyển gen gồm 2 loại là gen

kháng kháng sinh và các gen liên quan đến sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất
thiết yếu trong quá trình sinh trƣởng của nấm.
1.2.4.1. Gen kháng kháng sinh dùng trong chuyển gen ở nấm
Các loại kháng sinh kháng nấm thông dụng nhất đƣợc sử dụng trong chọn lọc
thể chuyển gen là hygromycin B, phleomycin và nourseothricin. Hygromycin B là
một loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, đƣợc sản xuất từ xạ khuẩn
Streptomyces hygroscopicus. Chúng có thể tiêu diệt vi khuẩn, nấm và các tế bào
nhân chuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein [76]. Phleomycin đƣợc sản xuất bởi
xạ khuẩn Streptomyces verticillus, là một kháng sinh phổ rộng có hiệu quả chống lại
hầu hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, thực vật và tế bào động vật. Kháng

14


sinh phleomycin thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide, gây chết tế bào bằng cách
bám vào DNA và làm phá vỡ sợi kép của DNA dẫn đến các hoạt động của tế bào bị
ngừng và chết [9]. Nourseothricin, với tên thƣơng mại là clonNAT, thuộc nhóm
kháng sinh aminoglycoside có nguồn gốc từ loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces.
Kháng sinh này hoạt động bằng cách gây lỗi mã hóa trong quá trình dịch mã dẫn tới
không tổng hợp đƣợc protein. ClonNAT đƣợc dùng rất phổ biến làm marker chọn
lọc thể chuyển gen gồm cả vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tế bào thực vật [39].
1.2.4.2. Gen trợ dưỡng dùng làm marker cho chuyển gen
Chủng nấm đột biến trợ dƣỡng là các chủng mất khả năng sinh tổng hợp một
loại axit amin hoặc một hợp chất cần thiết trong quá trình sinh trƣởng, việc mất khả
năng tự tổng hợp khiến chúng không còn khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng tối
thiểu mà cần phải bổ sung thêm axit amin hoặc hợp chất tƣơng ứng. Gen trợ dƣỡng
đƣợc sử dụng nhiều nhất trong chọn lọc thể chuyển gen là gen pyrG (mã hóa protein
tham gia quá trình tổng hợp uridine/uracil) [49, 59, 94]. Ngoài ra còn có các gen trợ
dƣỡng khác cũng đƣợc sử dụng nhƣ adeA (gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp
adenine), met (gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp methionine), trp (gen mã hóa

enzyme tham gia quá trình tổng hợp tryptophan), argB (gen mã hóa enzyme tham
gia quá trình tổng hợp arginine) …[30, 116].
Các marker dùng cho chọn lọc các thể chuyển gen giữ vai trò hết sức quan
trọng, quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen. Phần lớn các nghiên cứu
chuyển gen vào nấm sợi sử dụng các chất kháng sinh diệt nấm. Tuy nhiên, các
kháng sinh này thƣờng có giá thành rất cao, khiến việc chuyển gen bị hạn chế. Bên
cạnh đó, nhiều loài nấm sợi (tiêu biểu là A. oryzae) có khả năng kháng tự nhiên với
nhiều loại kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh rất cao. Do đó việc
sử dụng kháng sinh trong chọn lọc thể chuyển gen là không khả thi [96]. Để khắc
phục nhƣợc điểm này, một số loài nấm sợi đã đƣợc cải biến di truyền để có thể sử
các gen trợ dƣỡng dụng làm các marker chuyển gen. Chuyển gen vào các chủng trợ

15


dƣỡng giúp giảm chi phí, an toàn đối với môi trƣờng và có tiềm năng ứng dụng vào
sản xuất thực tiễn.
1.2.4.3. Marker pyrG
Uridine 5’-monophosphate (UMP) và uracil là những hợp chất quan trọng
trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của tế bào, bởi chúng liên quan đến sự tổng
hợp các axit nucleic cần thiết cho mọi tế bào sống. Sinh tổng hợp UMP đƣợc thực
hiện bởi enzyme orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase)
đƣợc mã hóa bởi gen pyrG ở nấm sợi hoặc gen URA3 ở nấm men [13, 49]. Gen
pyrG giúp tế bào nấm tự tổng hợp UMP trong quá trình sinh trƣởng. Tuy nhiên với
những chủng đột biến hỏng gen pyrG, chúng chỉ có thể sinh trƣởng đƣợc trong điều
kiện môi trƣờng ngoại bào có bổ sung uridine hoặc uracil. Khi gen pyrG đƣợc đƣa
trở lại các chủng đột biến này, chúng có thể sinh trƣởng bình thƣờng. Chính vì lý do
đó nhiều nghiên cứu trƣớc đây đã sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc trong quá
trình chuyển gen [13, 58, 73, 104, 107].
Với chủng tự nhiên (wild type), hoạt động của enzyme OMP decarboxylase

mã hóa bởi gen pyrG sẽ chuyển hóa hợp chất 5-fluoroorotic acid (5-FOA) không
độc thành chất gây độc tế bào là 5-fluorouracil. Ngƣợc lại, các chủng bị đột biến sai
hỏng về gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa hợp chất 5-FOA và các chủng này có
thể sinh trƣởng bình thƣờng trên môi trƣờng chứa 5-FOA. Chính vì vậy 5-FOA
thƣờng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng trong quá trình chọn lọc các chủng vi nấm đột
biến hỏng hoặc mất gen pyrG. Việc đƣa gen pyrG quay trở lại thể đột biến tƣơng
ứng sẽ giúp thể đột biến tự tổng hợp uridine/uracil và sinh trƣởng đƣợc trên môi
trƣờng tối thiểu (không bổ sung uridine/uracil) [116].
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm tạo ra các chủng nấm sợi trợ dƣỡng
uridine/uracil, trong đó có các loài thuộc chi Aspergillus. Phƣơng pháp phổ biến
nhất để tạo chủng đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil là chiếu tia UV sau đó sàng lọc
trên môi trƣờng chọn lọc có chứa hợp chất 5-FOA, uridine và uracil [34, 49, 104].
Ngoài cách chiếu UV, thể đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil còn đƣợc tạo ra nhờ
16