Bao cao sắc ký bảng mỏng tlc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH
KHOA HÓA HỌC ỨNG DỤNG
----------

BÁO CÁO THỰC HÀNH
HÓA PHÂN TÍCH 2

Người hướng dẫn:
Huỳnh Thị Hồng Hoa

Sinh viên thực hiện: Nhóm 9
Nguyễn Minh Lưng
Thạch Ngọc Sơn
Lê Tuấn Sang

Trà Vinh, 1 /6/2017


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

NHẬN XÉT
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
.............................................................................................................

Trà Vinh, ngày 1 tháng 6

năm 2017
Người hướng dẫn

Huỳnh Thị Hồng Hoa
GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

2

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh

Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

MỤC LỤC
Nội dung

trang

SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ
1.Lịch sử hình thành sắc ký

4

2.Định nghĩa Sắc ký.

4

3.Phân loại sắc ký :

4

4.Những kĩ thuật sắc ký phổ biến.

5

SẮC KÝ LỚP MỎNG
1.Sơ lược về sắc ký

5

2.Định Nghĩa

5

3.Thành phần hệ thống sắc ký bản mỏng.

6

4.Nguyên tắc hoạt động

8

5.Quá trình chuẩn bị và cách tiến hành

9

6.Các hiện tượng thường gặp trong TLC

16

7.Ưu điểm và nhược điểm

17

8.Tài liệu tham khảo

17

GVHD

Huỳnh Thị Hồng Hoa

3

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ
1. Lịch sử hình thành sắc ký.
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát
minh ra kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll [2].
Chữ sắc trong sắc ký có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga,
và vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp
tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc.
Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington
Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố.[3]
Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu
nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách
khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện
sắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau.
2. Định nghĩa Sắc ký.
Sắc ký là một phương pháp tách hỗn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của
chúng giữa hai pha động và tĩnh thành các thành phần để phân tích, nhận biết, tinh chế
hoặc định lượng hỗn hợp hay các thành phần.

+ Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu.(lớp chất cố
định).Trì hoãn sự di chuyển các thành phần trong CPT tùy thuộc cấu trúc CPT.
Giữ mạnh : ra trễ .
Giữ yếu : ra xớm .
+ Pha động : những dung môi được đưa lên lien tục .sau khi cho mẫu vào.pha
động sẽ di chuyển trong cột do trọng lực và đem các cấu tử khác nhau theo chúng .quá
trình này gọi là sự rửa giải.nếu các thành phần này di chuyển với những tốc độ khác
nhau thì chúng sẽ tách ra khỏi nhau và có thể thu hồi cùng với pha động .
+ Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước .
+ Hợp chất có ái lực nhiều với pha tỉnh thì bị giử lâu hơn trong cột và ra sau.
3. Phân loại sắc ký :
Theo cơ chế của quá trình tách :
+ Sắc ký hấp phụ .
+ Sắc ký phân bố .
+ Sắc ký trao đổi ion .
GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

4

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

+ Sắc ký rây phân tử

4. Những kĩ thuật sắc ký phổ biến.
Sắc lý lỏng (Liquid Chromatography-LC).
Sắc ký khí (Gas Chromatography- GC).
Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC.
Sắc ký giấy ( Paper Chromatography.
Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography).

SẮC KÝ LỚP MỎNG
(Thin layer chromatography)
1. Sơ lược về sắc ký
Phương pháp sắc ký lớp mỏng đã được 2 nhà bác học Nga Izmailov và Shraiber
mô tả từ năm 1938 nhưng mãi đến 1958 - 1959 sau khi các công trình của E.Stahl được
công bố thì nó mới được ứng dụng rộng rãi và ngày càng được cải tiến .
2. Định Nghĩa
Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa
chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung
môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel). Pha tĩnh
được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay
tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này
được gọi là sắc ký lớp mỏng.

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

5

SVTH
Nhóm 9

Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Hình 1
3. Thành phần hệ thống sắc ký bản mỏng.
Bình sắc ký: Một chậu, hủ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu
(silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm,
hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một lọai
polymer hữu cơ.
Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác
nhau. Sử dụng khoảng 1 𝜇l dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi
quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phải cao hơn một chút so với
mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình.
Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo
tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính
mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực
của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

6

SVTH
Nhóm 9

Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu
chất trong dung môi.

Bảng 1

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

7

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Hình 2 : Thành phần hệ thống sắc ký bản mỏng
4. Nguyên tắc hoạt động .
Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt
các chất cần tách
Giọt dung dịch mẫu được nhỏ trên đường xuất , còn rìa bản được nhúng vào
dung môi thích hợp .

Dưới tác dụng của lực mao quản , dung môi sẽ chuyển động dọc theo lớp hấp
phụ và chuyển vận các cấu tử chủa hỗn hợp với các vận tốc khác nhau đưa đến việc
tách các cấu tử
Sự khếch tán các cấu tử trong lớp hấp phụ vừa theo chiều dọc vừa theo chiều
ngang vì vậy có thể xem quá trình sắc ký thực hiện theo 2 chiều .

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

8

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Hình 3: Nguyên tắc hoạt động
5. Quá trình chuẩn bị và cách tiến hành
a. Quá trình chuẩn bị.
* Bản mỏng sắc ký:
- Phải chuẩn bị một bản sắc ký bản mỏng tráng silicagel.

Hình 4 :Bảng mỏng tráng silicagel
GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

9

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

* Chuẩn bị Dung môi.
Dung môi phải là loại tinh khiết, thường dùng hỗn hợp 2-3 các dung môi. Các
dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy, phản hấp phụ): hexan, heptan,
cyclohexan, carbon tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ethet, ethyl acetat,
pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước.
* Bình sắc ký.
Có thể là bình chuyên dụng hoặc các lọ rộng miệng, ống hình trụ, có nắp.
* Ống vi quản

Hình 5: Ống vi quản
Hai tay cầm ống thủy tinh hơ trên ngọn lửa xanh của đèn cồn vừa xoay tròn để
vi quản nóng đều
Khi vi quản vừa nóng chảy vừa đem vi quản ra khỏi lửa vừa kéo dài 2 đầu ống
ra xa khoảng từ 4 đến 5 cm rồi giữ yên cho thủy tinh đặc cứng trở lại.

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

10

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

b.Cách tiến hành .
* Chấm dung dịch lên bản mỏng.
Kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới của bản
mỏng 1 cm làm vạch xuất phát. Dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung
dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó. Các vết phải cách nhau và cách mép bản mỏng ít
nhất 1 cm.

Hình 6 : Chấm dung dịch lên bản mỏng
* Khai triển sắc ký
Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh. Đặt
bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà hơi dung môi của pha động, mép phía chấm mẫu
được nhúng vào dung môi động nhưng không được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực
tiếp vào dung môi động. Sau khi dung môi chạy được nửa hay hai phần ba bản mỏng
ta lấy ra để khô hay sấy khô.

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

11

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Hình 7: Khai triển sắc ký

c. Phát hiện các vết trên bản mỏng mắt thường không nhìn thấy :
*phương pháp vật lý:
Sử dụng đèn chiếu tia UV 254 nm : ánh sáng này dung để nhận ra các hợp chất
có thể hấp thụ tia uv.các hợp chất tạo thành vết có màu nâu sẩm .
Đèn chiếu tia UV 366nm ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất có
tính huỳnh quanh .các vết của chất mẫu có màu sáng nên nền bản mỏng sẩm màu.

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

12

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Hình 8: Sắc phổ quan sát trong ánh sáng thường và đèn UV

* Phương pháp hóa học.
Ninhydrin (2,2-dihydroxyindane-1, 3-dion) là một hóa chất được sử dụng để
phát hiện amoni hoặc các amin bậc nhất và thứ cấp . Khi phản ứng với các amin tự do
này cho một màu xanh đậm hoặc tím được gọi là tím Ruhemann được sản xuất.
Ninhydrin được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện dấu vân tay , vì
các amin cuối cùng của dư lượng lysine trong các peptide và các protein bị đứt trong
các dấu vân tay phản ứng với ninhydrin.

Hình 9 : Phương pháp hóa học.

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

13

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

d. Đọc kết quả
Vị trí của vết là cơ sở để định tính một chất. Trong SKLM, vị trí vết được biểu

thụ bằng chỉ số Rf. (retention factor-hệ số lưu giữ). Có thể nói, nếu trên sắc đồ có một
vết chất chưa biết nằm ngang (có cùng chỉ số Rf) với vết của chất chuẩn thì chất chưa
biết đó chính là chất chuẩn.
Rf của chất X được tính như sau: Rf = x1/xo . với 0 < Rf < 1

X1 X0

Hình 10

Ví dụ 1:

Hình 11:

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

14

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Ví dụ 2:Tách chất màu thực vật trong lá xanh làm với các hệ dung môi
khác nhau bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng?
Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm đường kính miệng 10 cm,

có nắp đậy kín. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung
quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi
để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều
giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và
để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60F 254 của hãng Merck được cắt bằng kéo
thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 12 cm và bản tự chế tạo từ tinh bột sắn
dây kích thước 4 cm x 12 cm.
Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản
mỏng. Thể tích dung dịch từ 0,001ml đến 0,005ml đối với trường hợp đưa mẫu lên
bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới
dạng vạch. Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2cm và cách
bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 -6mm và
cách nhau 15mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng 1cm.
Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt
của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung
môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu
mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo
khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách.Tính Rf

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

15

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh

Khoa Hóa Học Ứng Dụng

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Hình 12
6. Các hiện tượng thường gặp trong TLC.
Hiện tượng

Nguyên nhân

Cách khắc phục

Vết di chuyển không Mẩu còn nhiều tạp chất Loại bỏ tạp chất trước
hoàn toàn
Vết trái

phân cực
dài

ngăn cách

khi tiến hành sắc ký

không Chọn hệ dung môi chưa Thay đổi tỉ lệ dung môi
tốt

cho phù hợp

Các vết lân cận trùng Chấm các vết quá gần

Chấm khoảng cách theo

nhau

quy định

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

16

SVTH
Nhóm 9


Trường Đại học Trà Vinh
Khoa Hóa Học Ứng Dụng
Vết hình móng ngựa

Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Vết chấm hình tròn quá Chấm mẫu nhỏ lại
lớn

Vết loang

Vết Khuếch tán do bay Vẽ ,chụp hình ngay sau
hơi vì để lâu hoặc nhúng khi hiện màu xong
thử thuốc quá lâu .

Bảng 2
7. Ưu điểm và nhược điểm
a.Ưu điểm
Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích
Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều
kiện phân tích.
Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc
ký lớp mỏng. Đơn giản Nhanh chóng, Không tốn kém .
b.Nhược điểm:
Không chính xác để định lượng
Bảo vệ độ cứng của sắc ký đồ và khả năng lặp lại của hệ số Rf là rất khó.
8. Tài liệu tham khảo
/>m%E1%BB%8Fng
/> />
HẾT

GVHD
Huỳnh Thị Hồng Hoa

17

SVTH
Nhóm 9