Nghiên cứu phương pháp phân tích nồng độ estriol ở người bằng phương pháp huỳnh quang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI

ĐÀM THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
NỒNG ĐỘ ESTRIOL Ở NGƢỜI
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HUỲNH QUANG

Chuyên ngành: Hóa học phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Tạ Văn Thạo

HÀ NỘI, 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân
tôi. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết
quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố
trước đó.
Tôi chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Hà Nội, tháng 6 năm 2017


LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Hóa Phân tích- Khoa Hóa họcTrường Đại học Sư phạm Hà Nội.

Bằng tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Tạ
Văn Thạo – người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt
quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Em xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô giáo trong Bộ môn Hoá Phân tích
- Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho em trong suốt quá trình học tập.
Em xin chân thành cảm ơn các em sinh viên trong phòng thí nghiệm tổ
bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giúp
đỡ hỗ trợ em.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn cao học K25
Hóa Phân tích, bạn bè và người thân đã ủng hộ và động viên em hoàn thành
luận văn này.
Hà Nội, tháng 6 năm 2017
Học viên

Đàm Thị Hà

2



MỞ ĐẦU
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Estriol (E3), hoặc oestriol, còn được gọi là 16α-hydroxyestradiol hoặc estra-1,3,5
(10) -triene-3,16α, 17β-triol; là một estrogen steroid tự nhiên và là một trong ba dạng
estrogen chính trong cơ thể con người. Ở phụ nữ không mang thai buồng trứng gần như
không sản xuất Estriol, tuy nhiên lại tăng cao ở phụ nữ mang thai. Estriol có thể đo được
trong máu hoặc nước tiểu của phụ nữ mang thai và có thể được sử dụng như một dấu hiệu
của sức khỏe của thai nhi .
Các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra mối liên hệ giữa hàm lượng của Estriol và các

dị tật bẩm sinh của thai nhi liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể (như bệnh Down,
Edwards, Patau). Việc sàng lọc các dị tật bẩm sinh (DTBS) cho thai nhi trước khi sinh
thông qua định lượng chỉ số Estriol đã được tiến hành thường quy ở các nước tiên tiến,
cho thấy vai trò quan trọng của Estriol đối với người mang thai.
Trong những thập niên gần đây, phân tích hóa sinh đã trở thành một trong những
lĩnh vực nghiên cứu bùng nổ, minh chứng rõ nhất là các báo cáo khoa học liên quan đến
lĩnh vực này luôn có số lượng lớn nhất. Các nghiên cứu cũng chỉ ra những tiến bộ vượt
bậc trong việc nâng cao độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu của phép phân tích từ cấp độ
nguyên tử, phân tử, đại phân tử đến tế bào, cho phép ứng dụng không chỉ trong lĩnh vực y
học mà còn có ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác như hóa học, môi trường hay
thực phẩm. Trong đó, protein chip là một hướng nghiên cứu mới, có tiềm năng trong
tương lai, giúp các phép phân tích trở nên đơn giản, gọn nhẹ, tiết kiệm mà vẫn chính xác.
Các Protein chip đang sẵn sàng trở thành một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong
lĩnh vực sinh học quy mô lớn vì tiềm năng to lớn của chúng trong nghiên cứu cơ bản,
chẩn đoán và khám phá dược phẩm. Việc chế tạo các Protein chip phụ thuộc rất nhiều
vào kỹ thuật cố định các phân tử thu lên bề mặt đế (điện cực, màng hay các giếng
polymer), các kỹ thuật này quyết định trực tiếp đến độ nhạy, độ bền, độ lặp lại của phép
phân tích. Trong 3 kỹ thuật cố định phổ biến hiện nay gồm: 1) liên kết hóa học, 2) tương
tác sinh học và 3) hấp phụ vật lý thì kỹ thuật thứ 2 có các ưu điểm hơn hai phương pháp

2


còn lại là đơn giản. Hơn nữa, việc lựa chọn kỹ thuật dò trong chế tạo Protein chip cũng
đóng vai trò quan trọng quyết định đến độ nhạy của chip. Phương pháp đo phổ huỳnh
quang được xem là phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao, các nghiên cứu gần đây
cho phép việc ứng dụng các phân tử phát huỳnh quang trong đánh dấu các phân tử thu trở
nên dễ dàng và thuận lợi hơn nhiều. Vì vậy việc áp dụng phổ huỳnh quang trong phân
tích sinh hóa ngày càng được các nhóm nghiên cứu quan tâm.
Với những lí do trên chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng phƣơng

pháp phân tích nồng độ Estriol ở ngƣời bằng phƣơng pháp huỳnh quang”.
II. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Mục đích của đề tài này bao gồm:
1) Tìm ra điều kiện tối ưu để cố định kháng thể Estriol lên bề mặt giếng polystyren
theo phương pháp hấp phụ vật lý.
2) Ứng dụng phân tích uE3 trên các mẫu chuẩn và mẫu thật dựa trên việc đo tín hiệu
huỳnh quang của kháng thể dò.

III. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Kháng thể Estriol và bề mặt giếng polystyrene.
- Mẫu máu của thai phụ ở thai kỳ hai.

IV. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp thu thập, phân tích số liệu: Tổng quan, phân tích các tài liệu khoa
học có liên quan đến vấn đề nghiên cứu.
- Phương pháp thực nghiệm: Phương pháp thu thập mẫu, tách triết mẫu; phương
pháp đo phổ huỳnh quang…
- Phương pháp quan sát: Được vận dùng thường xuyên trong suốt quá trình nghiên
cứu đề tài.
- Phương pháp phân tích tổng hợp và đánh giá.

V. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
3


- Nghiên cứu phương pháp cố định kháng thể lên bề mặt polystyren của giếng.
- Xây dựng quy trình phân tích nồng độ kháng thể được cố định dựa trên phương
pháp huỳnh quang.
- Ứng dụng phân tích nồng độ Estriol ở thai phụ.

4


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
I.1. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN CHIP
I.1.1. Khái niệm và vài nét lịch sử
Một microarray protein (hoặc protein chip) là một phương pháp thông lượng
cao được sử dụng để theo dõi các tương tác và hoạt động của protein, và để xác
định, định lượng và phân tích chức năng của protein trong nghiên cứu cơ bản và
trên quy mô lớn[19] . Ưu điểm chính của nó là ở chỗ số lượng lớn các protein có
thể được theo dõi song song. Chip bao gồm một bề mặt hỗ trợ như một tấm kính
trượt, màng nitrocellulose, hạt hoặc tấm microtitre, mà một mảng protein được gắn
cố định ràng buộc. [17] Các phân tử protein, thường được dán nhãn với thuốc
nhuộm huỳnh quang, được thêm vào mảng. Bất kỳ phản ứng nào giữa đầu dò và
protein cố định phát ra tín hiệu huỳnh quang được đọc bởi máy quét laze. [18] Các
phân tử protein cực nhanh, tự động, tiết kiệm, và rất nhạy cảm, tiêu thụ một lượng
nhỏ các mẫu và thuốc thử. [20] Khái niệm và phương pháp của các mô hình
protein chip lần đầu tiên được giới thiệu và minh hoạ trong các mô hình kháng thể
- kháng thể (còn gọi là ma trận kháng thể) vào năm 1983 trong một ấn bản khoa
học [3] và một loạt các bằng sáng chế. [24] Công nghệ thông lượng cao đằng sau
protein chip tương đối dễ phát triển vì nó được dựa trên công nghệ phát triển cho
các mô hình ADN, [7] đã trở thành các vi phân được sử dụng rộng rãi nhất.
I.1.2. Cấu tạo chung của protein chip
Cấu tạo chung gồm 4 phần cơ bản là bề mặt rắn( chất nền hay giếng), phần cố
định, mẫu và đầu dò.

5


Đầu dò

Mẫu

Phần cố định
Chất nền
Hình I.1 Cấu tạo của Protein chip
a. Chất nền (bề mặt rắn hay giếng)
Các protein được bố trí trên bề mặt rắn như các mặt trượt kính hiển vi,
màng, hạt hoặc các tấm vi trùng. Chức năng của bề mặt này là giúp protein được
cố định trên bề mặt. Nó phải thể hiện tính chất liên kết tối đa, đồng thời duy trì
protein trong cấu hình ban đầu để duy trì khả năng ràng buộc. Kính hiển vi slide
được làm bằng thủy tinh hoặc silicon là một sự lựa chọn phổ biến vì chúng tương
thích với các máy thu thập dữ liệu và máy quét laser đã được phát triển cho công
nghệ vi hạt ADN. Tấm giếng Nitrocellulose được sử dụng rộng rãi như chất kết
dính protein cao nhất đối với các ứng dụng protein chip.
Bề mặt rắn đã được lựa chọn sau đó được phủ một lớp phủ phải đáp ứng các
chức năng đồng thời của việc giữ ổn định protein, ngăn ngừa sự biến tính của
protein, định hướng protein theo hướng thích hợp để có thể tiếp cận các vị trí liên
kết và cung cấp môi trường ưa nước, trong đó phản ứng liên kết có thể xảy ra.
Ngoài ra, bề mặt rắn cần phải tương thích với các hệ thống phát hiện khác nhau.
Các tác nhân cố định bao gồm các lớp nhôm hoặc vàng, polyme ưa nước, và gel
polyacrylamide, hoặc xử lý các amin, aldehyde hoặc epoxy. Các công nghệ màng

6


mỏng như lắng đọng hơi vật lý (PVD) và lắng đọng hóa học (CVD) được sử dụng
để phủ lớp phủ lên bề mặt đỡ.
Môi trường nước là điều cần thiết ở tất cả các giai đoạn sản xuất mảng và
hoạt động để ngăn chặn sự biến đổi protein. Do đó, bộ đệm mẫu chứa một lượng

glycerol cao (để hạ điểm đóng băng) và độ ẩm của môi trường sản xuất được điều
chỉnh cẩn thận. Microwells có lợi thế kép là cung cấp một môi trường nước trong
khi ngăn ngừa sự lây nhiễm chéo giữa các mẫu.
Để đạt được sự gắn chặt protein bề mặt chip và bền vững, trong khi giữ lại
hoạt động và chức năng của các protein, một số nhóm nghiên cứu đã tạo ra những
phản ứng cộng hóa trị trên kính có thể liên kết cộng hóa trị với các protein [29, 15,
30] . Nói chung, một liên kết chéo bifunctional được sử dụng để thay đổi bề mặt
chip; những liên kết chéo này có một nhóm chức năng phản ứng với các nhóm
hydroxyl trên bề mặt rắn và một chất khác có thể phản ứng trực tiếp với các nhóm
amin của các protein mong muốn (ví dụ: aldehyde, epoxy, hoặc NHS-ester nhóm)
hoặc có thể thay đổi về mặt hóa học để đạt được độ đặc hiệu tối đa [16, 11]. Một
bề mặt chip cụ thể có thể được dẫn xuất bằng một liên kết chéo chức năng hoặc kết
hợp các liên kết chéo chức năng khác nhau để cải thiện khả năng liên kết protein,
[22]
b. Phần cố định
Các phần cố định được gắn trên bề mặt rắn có thể là kháng thể, kháng
nguyên, aptamers (các phối tử gốc nucleic), các chất affibodies (các phân tử nhỏ
được thiết kế để bắt chước các kháng thể đơn dòng) hoặc các protein dài. Các phần
cố định này được lựa chọn hết sức cẩn thận để khi gắn lên bề mặt rắn, chúng không
bị biến tính và duy trì tính đặc hiệu của protein gắn vào chúng.

7


Protein rất nhạy cảm với những thay đổi trong môi trường vi mô. Điều này
thể hiện một thách thức trong việc duy trì mảng protein trong điều kiện ổn định
trong một khoảng thời gian dài. Các phương pháp liên quan đến việc tổng hợp các
protein trên chip khi được yêu cầu, trực tiếp từ ADN sử dụng các hệ thống biểu
hiện protein không có tế bào. Vì ADN là phân tử có độ ổn định cao nên nó không
bị biến đổi theo thời gian và do đó thích hợp để lưu trữ lâu dài. Cách tiếp cận này

cũng thuận lợi ở chỗ nó tránh được sự tốn kém của quá trình lọc protein riêng biệt
và nhân bản ADN vì các protein được tạo ra và cố định cùng một lúc trên bề mặt
chip. Các ví dụ về các kỹ thuật tại chỗ là PISA (protein tại chỗ), NAPPA (mảng
protein lập trình nucleic) và DAPA (mảng ADN đến mảng protein).
c. Đầu dò
Các phương pháp dựa trên phát hiện huỳnh quang thường được ưa chuộng để
phát hiện vì chúng rất đơn giản, an toàn, nhạy cảm và mang lại độ phân giải cao
[23]. Thông thường, một con chip được kiểm tra trực tiếp bằng một phân tử được
đánh dấu bằng huỳnh quang hoặc được thăm dò theo hai bước, bằng cách sử dụng
đầu dò được gắn nhãn (ví dụ biotin) sau đó có thể được phát hiện trong bước thứ
hai sử dụng một chất phản ứng ái lực huỳnh quang (ví dụ: Streptavidin), hoặc bằng
cách sử dụng các kháng thể huỳnh quang cụ thể. Các phương pháp phát hiện khác
cũng có thể được sử dụng. Ví dụ, ELISA đã được sử dụng để phát hiện các protein
trên cả mảng tráng nitrocellulose [2, 13] và mảng kính [6]. Ge et al. [5], và Zhu et
al. [29], đã từng sử dụng việc ghi nhãn đồng vị để nghiên cứu sự tương tác proteinprotein, protein-DNA, và protein-thuốc trên mảng tráng ni-trocellulose, cũng như
sự tương tác kinase-chất nền trong nanowells.

I.1.3. Phân loại

8


Các protein chip có thể phân thành hai loại, tùy thuộc vào ứng dụng của
chúng: các phân tử protein chip phân tích và các tế bào vi phân protein chip chức
năng.
Các protein chip phân tích sử dụng các phân tử có đặc điểm tốt mà đã biết
các hoạt động cụ thể như các đầu dò cố định, như các kháng thể, các phức hợp
peptit-MHC, hoặc các lectins. Nó đã trở thành một trong những nền tảng phát hiện
đa kênh mạnh mẽ nhất và có thể được sử dụng để giám sát biểu hiện protein, nhận
biết biomarker, đánh dấu bề mặt tế bào / mô hình glycosyl hóa, chẩn đoán lâm

sàng hoặc phân tích an toàn môi trường / thực phẩm.[22]
Chip protein chức năng được xây dựng bằng cách cố định số lượng lớn các
protein tinh chế trên bề mặt rắn. [9]. Thường thì các protein cố định này không
được đặc trưng tốt .Nhiều protein khác nhau, hoặc thậm chí là tổng số protome của
một cơ thể, được phát hiện riêng trên một protein chip chức năng. Các protein chip
chức năng chủ yếu được sử dụng để sàng lọc các loại hoạt động của protein, bao
gồm protein-protein, protein lipid, protein-DNA, protein-thuốc và protein-peptid
tương tác; Để xác định các chất nền enzyme; Và để mô tả phản ứng miễn dịch.[22]

9


Hình I.2 Ứng dụng của Protein chip
I.1.3. Các mô hình protein chip
Có ba mô hình protein chip hiện đang được sử dụng để nghiên cứu các hoạt
động sinh hóa của protein.

Hình I.3 Các mô hình protein chip
Hình C và D:

10


Trong mô hình này, các protein và protein gắn kháng thể đánh dấu được
đính trực tiếp vào giếng. Những kháng thể này thường được phát hiện bằng các thử
nghiệm phát quang hóa học, huỳnh quang vật lý hoặc colorymetric (nhuộm màu).
Các peptide được gắn trên các giếng để cho phép định lượng protein của lysates
mẫu.
Tuy nhiên, phương pháp này thường có nhược điểm là làm biến tính các
protein do quá trình đính trực tiếp lên giếng . Phương pháp này cho phép xác định

sự có mặt của các protein thay đổi hoặc các chất khác có thể là kết quả của bệnh.
Cụ thể, sửa đổi sau khi chuyển đổi, thường bị thay đổi do bệnh tật có thể được phát
hiện.[8]
Hình A: Mô hình “protein bánh kẹp”
Trong mô hình này, rất nhiều kháng thể, aptamers hoặc affibodies được gắn
trên bề mặt hỗ trợ của bề mặt rắn. Chúng được sử dụng như các phân tử thu nhận
vì mỗi tế bào liên kết cụ thể với một protein cụ thể. Hệ thống phân tích vi mô còn
được gọi là các mảng chụp. Mảng được khảo sát với một phức hợp protein phức
tạp như một lysate tế bào. Phân tích các phản ứng liên kết kết quả bằng cách sử
dụng các hệ thống phát hiện khác nhau hoặc các phép đo liên kết ràng buộc và đặc
trưng, có thể cung cấp thông tin về mức biểu hiện của các protein đặc biệt trong
mẫu.
Mô hình “Protein bánh kẹp” này có ưu điểm là tính ổn định cao, triệt tiêu
các cân bằng phụ, đặc biệt hữu ích trong việc so sánh biểu hiện protein trong các
dung dịch khác nhau. Ví dụ, phản ứng của các tế bào với một yếu tố đặc biệt có thể
được xác định bằng cách so sánh các lysates của các tế bào được điều trị bằng các
chất cụ thể hoặc được nuôi trong điều kiện nhất định với các lysates của tế bào
kiểm soát. Một ứng dụng khác là xác định và mô tả các mô bệnh.

11


Hình B: Các protein và protein đánh dấu cạnh tranh nhau để gắn với kháng
thể đính cố định trên giếng.
Phương pháp này kém ổn định hơn so với mô hình “ protein bánh kẹp”
dosinh ra nhiều cân bằng phụ trong quá trình cạnh tranh. Tuy nhiên, nó có thể sử
dụng trong phân tích các mẫu với nồng độ không cao (cỡ nano), khoảng thay đổi
nồng độ hẹp, làm tăng độ phân giải. Phương pháp được ứng dụng để xác định các
tương tác protein-protein, protein-DNA, protein-RNA, protein-phospholipid và các
phân tử protein-nhỏ khảo nghiệm hoạt động enzym và phát hiện kháng thể và

chứng minh tính đặc hiệu của chúng. Các protein chip này được sử dụng để nghiên
cứu các hoạt động hóa sinh của toàn bộ proteome trong một thí nghiệm.
I.1.5. Vai trò của protein chip
Protein chip có thể được dùng để chẩn đoán lâm sàng hoặc phân tích an toàn
môi trường / thực phẩm. Protein chip phân tích liên quan đến một chất phản ứng ái
lực mật độ cao (ví dụ: kháng thể hoặc kháng nguyên) được sử dụng để phát hiện
các protein trong hỗn hợp phức tạp. Chip protein chức năng được xây dựng bằng
cách cố định số lượng lớn các protein tinh chế trên bề mặt rắn, có tiềm năng rất lớn
trong việc khảo sát các hoạt động sinh hóa khác nhau (ví dụ protein-protein,
protein-lipid, protein-nucleic-acid và tương tác enzyme-chất nền) cũng như tương
tác với thuốc và xác định ma túy.

12


Hình I.4 Vai trò của Protein chip

I.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH PROTEIN
Cố định protein (hay kháng thể, antibody) là quá trình gắn các phân tử
protein lên một bề mặt đế sử dụng làm các đầu thu sinh học. Trong một số trường
hợp nhất định, việc cố định có thể làm mất một phần hoặc toàn bộ hoạt tính của
13


protein vì khuynh hướng gắn ngẫu nhiên và dễ bị biến dạng cấu trúc. Vì vậy, để
quá trình cố định các kháng thể không làm mất hoạt tính sinh học của protein thì
việc lựa chọn bề mặt và phương pháp cố định đóng vai trò quyết định. Bề mặt đế
cũng như quá trình cố định phải không làm ảnh hưởng đến cấu tạo và chức năng
của các protein sau khi được cố định.[4]
Nhiều kĩ thuật cố định đã được phát triển trong những năm qua, chủ yếu dựa

trên ba cơ chế là: hấp phụ vật lý, liên kết hóa học và tương tác sinh học (Hình 1.3).
I.2.1. Cố định hóa học
Việc cố định protein dựa trên liên kết hóa học là quá trình sử dụng các phản
ứng hóa học liên kết protein với bề mặt đế. Các phản ứng được lựa phải căn cứ vào
các nhóm chức sẵn có của protein (-NH2, -COOH, -SH) và bề mặt đế (-OH, Au, NH2….)[xx] (Bảng 1.1). Các phản ứng hóa học sử dụng trong cố định protein phải
đáp ứng các yêu cầu khắt khe như: không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của protein,
có thể phản ứng trong môi trường nước và diễn ra trong nhiệt độ thấp hơn hoặc
bằng nhiệt độ phòng. Việc dùng các liên kết hóa học để cố định protein giúp quá
trình cố định bền và ổn định hơn, làm tăng độ lặp của phép phân tích. Tuy nhiên,
do các nhóm chức dùng cho quá trình liên kết của protein được phân bố ngẫu
nhiên, có nghĩa là bất cứ vị trí nào trên bề mặt protein cũng có thể tham gia vào
phản ứng cố định, điều này dẫn đến việc sắp xếp các protein trên bề mặt đế là ngẫu
nhiên, không theo trật tự nhất định. Vì vậy, hoạt tính của các protein (đầu thu sinh
học) sẽ giảm đi đáng kể (Hình 1.3.b). Hơn nữa, Khi các nhóm chức trên bề mặt
protein tham gia phản ứng sẽ ít nhiều làm giảm hoạt tính (biến dạng, biến tính),
ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của cảm biến sinh học.[21,4,28]
Bảng I.1: Các phản ứng hóa học sử dụng trong cố định hóa học.

14


I.2.2. Cố định vật lý (Hấp phụ vật lý)
Cố định vật lý là phương pháp dựa trên tương tác hấp phụ vật lý giữa bề mặt
đế và chất cần phân tích (kháng thể). Trong phương pháp cố định vật lý, dung dịch
kháng thể cố định được đưa trực tiếp lên bề mặt đế trong một khoảng thời gian
nhất định để sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác giữa các phân tử, mà tương tác chủ
yếu ở đây là các tương tác yếu như tương tác kị nước, tương tác tĩnh điện, tương
tác Van der Van. [4,12]

15

Hình I.5. Cố định vật lý
Ưu điểm của phương pháp cố định vật lý là nó đơn giản, dễ thực hiện, và nổi
trội hơn cả so với hai phương pháp đã nêu trên đó là phương pháp này dựa trên cơ
chế hấp phụ nên tính chất, chức năng của protein không bị biến tính trong quá trình
cố định. [4]
Tuy nhiên, nhược điểm của cơ chế hấp phụ là định hướng ngẫu nhiên, sử
dụng các tương tác yếu, độ bền chắc của tương tác lại bị phụ thuộc nhiều vào tính
chất bề mặt đế, pH, thời gian hấp phụ và nồng độ chất phân tích (protein), các
nhược điểm này làm cho protein dễ bị rửa trôi bởi một số bộ đệm hoặc chất tẩy rửa
khi thực hiện phân tích các chất. Ngoài ra, các vấn đề liên quan đến hiệu ứng phát
tín hiệu tập trung và tín hiệu nền cao phát ra từ tương tác đặc hiệu có thể dẫn đến
tính toán sai lầm của nồng độ chất phân tích. Như vậy, cần phải tìm ra một loại
giếng có thể đảm bảo được tính định hướng, hiệu suất gắn kết kháng thể trên bề
mặt cao, khó bị mất trong quá trình sử dụng chất tẩy rửa và kháng thể sau khi cố
định cũng có tính ổn định. Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi khắc phục được
nhược điểm và đã tìm ra loại giếng phù hợp được làm từ vật liệu polystiren (PS).
Loại giếng làm từ vật liệu PS đảm bảo được tính đinh hướng.[14]

16


I.2.3. Cố định sinh học
Cố định sinh học là phương pháp cố định protein lên bề mặt đế dựa trên
tương tác của các phân tử sinh học (tương tác sinh học). Trong phương pháp cố
định sinh học thì bề mặt đế và protein cố định sẽ được gắn thêm các phân tử sinh
học có tương tác với nhau, làm cầu nối giữa bề mặt đế và protein cố định. Các
tương tác sinh học thường được dùng như: protein A – kháng thể, streptavidin
(STV) – biotin, ADN-ADN…[4] Các protein cố định theo phương pháp này có trật

tự sắp xếp cao, tương tác tương đối bền nên cảm biến sinh học dạng này sẽ có độ
nhạy và độ lặp cao. Tuy nhiên, việc cố định protein theo phương pháp này cũng có
các hạn chế nhất đinh như: 1) cũng giống như phương pháp cố định hóa học, các
protein cố định cũng cần được gắn thêm các phân tử sinh học khác có tương tác
với bề mặt đế. Việc dùng các phản ứng hóa học để gắn các phân tử sinh học sẽ làm
bề mặt protein thay đổi, giảm một phần hoạt tính. 2) Việc bảo quản và lưu giữ các
protein đã biến tính cũng trở nên khó khăn hơn, thời hạn sử dụng ngắnn hơn. 3)
Việc biến tính cũng làm tăng giá thành của sản phẩm. Và, 4) Quá trình phân tích sẽ
phải thực hiên qua nhiều bước, tốn thời gian phân tích hơn các phương pháp khác.
Một trong các tương tác hay sử dung trong cố định sinh học là tương tác
giữa streptavidin và biotin. Hình 1.4 mô tả quá trình cố định Lectin-FITC thông
qua tương tác của biotin-streptavidin-biotin.
Lectin-FITC

Lectin-FITC

HO HO HO HO
O O
O O

HO HO HO HO
O O
O O

STV

STV

STV

STV

Hình I.6. Cô định Lectin-FITC trên bề mặt bằng biotin-streptavidin-biotin.

17


Sau đi đã khắc phục được nhược điểm và xem xét đến ưu điểm của các
phương pháp cố định, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp cố định sinh học để sử
dụng trong quá trình nghiên cứu của mình.

I.3. TỔNG QUAN VỀ uE3 VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH uE3.
I.3.1. Vai trò, ý nghĩa của uE3
Estriol không liên hợp là một dạng steroid có nguồn gốc từ bào thai. Estriol
được sản xuất trong nhau thai từ 16 alpha- OH DHEA ( dehydroepiandrosterone),
được lấy từ bào thai,có nguồn gốc từ 16 alpha - OH DHEA - S
(dehydroepiandrosterone sulfate). Trong huyết thanh của thai phụ, Estriol có thể
được đo ở dạng không liên hợp, uE3. Estriol cũng liên kết với Estriol sunfat và
glucuronid trong gan của người mẹ. Estriol do đó, tồn tại trong huyết thanh người
mẹ ở cả dạng liên hợp và không liên hợp. Estriol tuần hoàn trong huyết thanh
người mẹ có thời gian bán hủy từ 20-30 phút. Những tác động trong việc sản sinh
Estrogen ở thai nhi được nhanh chóng phán ánh qua sự thay đổi nồng độ Estriol
trong huyết thanh người mẹ.

Hình I.7 Cấu tạo của Estriol

18


Trong suốt giai đoạn mang thai không biến chứng, nồng độ Estriol toàn phần

và không liên hợp trong cơ thể tăng lên trong suốt thai kỳ. UE3 chiến khoảng 9%
tất cả các dạng Estriol của thai nhi, nồng độ Estriol trong huyết thanh của người mẹ
bị ảnh hưởng bởi sự lưu thông tĩnh mạch ở hậu môn.
Nồng độ estriol huyết thanh của người mẹ giảm đi khoảng một phần tư trong
các trường hợp mang thai bị ảnh hưởng bởi hội chứng Down và có thể được sử
dụng như là một phần của các chương trình sàng lọc đa trật tự trong thái kỳ I và
thai kỳ II cùng với hCGb tự do hoặc hCG toàn phần và hAFP có hoặc không có
inhibin A. Mức độ cũng giảm trung bình trong các trường hợp mang thai bị ảnh
hưởng bởi hội chứng Edwards và hội chứng Smith-Lemli-Opitz.
Nồng độ estriol ở mẹ cũng được sử dụng để theo dõi tình trạng thai nhi trong
thai kỳ. Mức uE3 ở mẹ ở mức thấp trong thai kỳ I và thai kỳ II của thai kỳ được
báo cáo ở trẻ sơ sinh non trẻ có cân nặng sơ sinh thấp. Giảm mức độ estrogen
không liên hợp hoặc tổng số đã được tìm thấy để cho thấy đau thai bào trong thời
kỳ mang thai. Vì vậy, việc sàng lọc các dị tật bẩm sinh cho thai nhi trước khi sinh
thông qua định lượng chỉ số uE3 đã được tiến hành thường quy ở các nước tiên
tiến, cho thấy vai trò quan trọng của uE3 đối với người mang thai.

I.3.2. Các phƣơng pháp phân tích uE3
I.3.2.1. Phƣơng pháp UV-VIS ( ELISA cạnh tranh)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật phân tích
sinh hóa để định lượng kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích dựa
vào phổ UV-VIS. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu trong đó có lĩnh vực y học.[10]

19


Trong phương pháp này, thuốc thử cần cho một Enzyme Immunoassay bao
gồm: kháng thể, liên hợp enzyme-kháng nguyên và kháng nguyên tự nhiên.
Về nguyên tắc, phương pháp ELISA dùng cho phân tích uE3 dựa trên

nguyên tắc cạnh tranh ràng buộc giữa liên hợp enzyme-kháng nguyên và kháng
nguyên tự nhiên với một số lượng giới hạn các vị trí liên kết với kháng thể. Phản
ứng được mô tả theo cân bằng sau:

Trong đó:
AbBtn: Kháng thể Biotin ( Biotinylated Antibody)
Ag: Kháng nguyên tự nhiên ( Native Antigen)
Enz

Ag: Liên hợp enzyme-kháng nguyên ( Enzyme- Antigen conjugate)

AgAbBtn: Phức hợp kháng nguyên và kháng thể ( Antigen- Antibody Complex)
Enz

AgAbBtn: Phức hợp (liên hợp enzyme-kháng nguyên) và kháng nguyên

(Enzyme- Antigen conjugate – Antibody Complex)
ka: hằng số cần bằng quá trình thuận
k-a:hằng số cân bằng quá trình nghịch
k: ka/ k-a : hằng số cân bằng
Tuy nhiên, theo phương pháp này, một phản ứng đồng thời khác xảy ra giữa
Biotin gắn với kháng thể và Streptaviđin cố định trên giếng, gây ảnh hướng đến sự
phân tách của kháng thể.

20


Trong đó: StreptavidinCW: Streptavidin cố định trên giếng.
Hoạt tính của enzyme trong phần gắp kết tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng
nguyên tự nhiên. Bằng cách sử dụng một vài nồng độ kháng nguyên đã biết trước,

ta sẽ vẽ được một đường cong phi tuyến cho phép xác định được nồng độ của
kháng nguyên cần tìm.

I.3.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ (LC-MS/MS)
Trong phương pháp này, mẫu phân tích thường được ly trích bằng một dung
môi hữu cơ và được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau
đó dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ
thống HPLC với các đầu dò UV, PDA, FLD hoặc MS/MS. Đối với đầu dò khối
phổ, cấu tử ra khỏi cột được đưa vào đầu dò MS, và ở đây cấu tử được ion hóa,
phân mành và được phát hiện dựa vào thông số m/z. Trên cơ sở này, đầu dò MS có
thể định danh và định lượng một cách dõ dàng, khẳng định về một hợp chất nào đó
[1].

21


Hình I.8 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng đầu dò khối phổ.

a).Hệ thống bơm
Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:
- Áp suất có thể đạt tới 1000 bar.
- Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng cách 0,01 – 10 ml/ min
- Thể tích chết nhỏ
- Trơ với dung môi của pha động
- Có thể trộn hai hay nhiều dung môi với nhau
b).Hệ thống tiêm mẫu
Đặc điểm của hệ thống tiêm mẫu:
- Có tác dụng tiêm mẫu
- Tự động ngắt khi áp suất cao
- Có thể bơm tuần hoàn

c).Buồng cột
Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích
d).Cột sắc ký
22