Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LÊ THANH QUANG

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG
TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 12/2015

i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LÊ THANH QUANG

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG
TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Động vật học
Mã số: 60 42 01 03

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VIỆT LINH

HÀ NỘI, 12/2015

i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Linh,
chủ nhiệm đề tài, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi
để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán bộ nghiên cứu
Phòng Công nghệ Phôi đặc biệt là TS. Nguyễn Văn Hạnh, Ths. Nguyễn Thị
Hiệp, Ths. Nguyễn Thị Nhung đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ và góp ý để tôi
hoàn thành luận văn này.
Luận văn được hoàn thành với sự tài trợ của Quỹ Phát triển khoa học và
công nghệ quốc gia trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của giọt
noãn bào chất đơn tính lên sự hoạt hóa trứng và sự phát triển của phôi” mã số
106.12-2012.93 do TS. Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm.
Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện về
thủ tục hành chính để tôi bảo vệ luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, những người đã
luôn sát cánh, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

11

tháng

12 năm 2015

Học viên

Lê Thanh Quang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
i – ĐHTN




MỤC LỤC
NỘI DUNG

Số trang

LỜI CẢM ƠN

i

MỤC LỤC

ii

DANH MỤC BẢNG

v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

vii

PHẦN I. MỞ ĐẦU

1

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1 Cơ sở khoa học

3

2.1.1 Buồng trứng và quá trình hình thành nang trứng

3

2.1.1.1

Đặc điểm của buồng trứng

3

2.1.1.2

Quá trình hình thành và phát triển của nang trứng

3

2.1.1.3

Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng

6

2.1.2 Sự thành thục của tế bào trứng

9

2.1.3 Sự thụ tinh của tế bào trứng động vật có vú

11

2.2Sự thành thục trứng lợn in vitro (In vitro maturation – IVM)

12

2.3 Thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi in vitro (In vitro
fertilization, In vitro Culutre – IVF, IVC)
2.3.1 Thụ tinh ống nghiệm ở lợn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
ii – ĐHTN

14

14




2.3.2 Quá trình nuôi phôi

15

2.4 Quá trình nuôi phôi với tế bào đệm (co culture)

15

PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

20

3.1

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

20

3.2

Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

20

3.3

Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi

20

3.4. Phương pháp nghiên cứu

20

1. Phương pháp thu nhận chất lượng tế bào trứng
2. Phương pháp phân loại chất lượng trứng
3. Phương pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn in vitro (In
vitro maturation - IVM)
4. Phương pháp đo nồng độ GSH nội bào
5. Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi thành thục in
vitro (IVM)
6. Phương pháp thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng lợn với
tinh trùng đông lạnh, giải đông
7. Phương pháp nuôi phôi
8. Phương pháp đánh giá chất lượng phôi nang
9. Phương pháp xử lý số liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

iii – ĐHTN




PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

28

Phần I. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường
nuôi thành thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới khả

28

năng thành thục của tế bào trứng lợn
Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành
thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới khả năng thành thục

28

của tế bào trứng lợn
Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành
thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới nồng độ Glutahinone

31

(GSH) tế bào trứng lợn
Phần II. Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới sự phát
triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

34

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

42

5.1. Kết luận

42

5.2 Đề nghị

42

ẢNH MINH HỌA

43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
iv – ĐHTN




DANH MỤC BẢNG

Tên bảng

Trang

Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ cysteine lên sự thành thục in vitro
tế bào trứng lợn ở nồng độ oxy 5%.
Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ cysteine lên sự thành thục in vitro
tế bào trứng lợn ở nồng độ oxy 20 %.

28

29

Bảng 3. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine tới nồng độ
Glutathione trong tế bào trứng lợn sau khi nuôi thành thục in vitro ở

32

nồng độ oxy 5%
Bảng 4. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi
tới nồng độ Glutathione trong trứng ở nồng độ 20% oxy
Bảng 5. Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới khả năng phân
chia của trứng lợn thụ tinh ống nghiệm.
Bảng 6. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới khả năng phát triển phôi vượt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
v – ĐHTN

33

35

36


qua giai đoạn 2-16 tế bào.
Bảng 7. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển của phôi lợn thụ
tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang
Bảng 8. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển của phôi lợn thụ
tinh ống nghiệm đến chất lượng phôi nang

38

40

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Tên Biểu đồ

Trang

Biểu đồ 1. So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine ở mức nồng
độ oxy khác nhau tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn.
Biểu đồ 2. So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine ở mức nồng
độ oxy khác nhau tới nồng độ GSH tế bào trứng lợn.
Biểu đồ 3. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phân chia và
sự phát triển phôi tới giai đoạn 2-16 tế bào của trứng lợn TTON
Biểu đồ 4. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phân chia và
hình thành phôi nang của trứng lợn TTON

31

34

37

39

Biểu đồ 5. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển phôi
đến giai đoạn 2-16 tế bào và hình thành phôi nang của trứng lợn

40

TTON
Biểu đồ 6. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự hình thành
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
vi – ĐHTN



41


phôi nang và chất lượng phôi nang của trứng lợn TTON

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh bào thai bê

FM

Fertilization medium

Môi trường thụ tinh

FSH

Follicle stimulating hormone

Hormone kích thích nang trứng

GSH

Glutathione

IVC

In vitro Culture

Nuôi phôi

IVF

In vitro fertilization

Thụ tinh ống nghiệm

IVM

In vitro muaturation

Thành thục ống nghiệm

LH

Luteinsing hormone

Hormone thể vàng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
vii – ĐHTN




MI

Metaphase I

Trung kỳ I

MII

Metaphase II

Trung kỳ II

MPN

Male pronuclear

Tiền nhân đực

MEF

Mouse embryonic fibroblast

Tế bào sợi thai chuột

NCSU 23

NCSU 37

North Carolina State

Môi trường nuôi trứng, phôi

University 23
North California State

Môi trường nuôi trứng, phôi

University 37

NST

Nhiễm sắc thể

Ống dẫn trứng

ODT

pFF

POEC

PEEC

PMSG

TCM

Porcine follicle fluid
Porcine

oviductal

Dịch nang trứng lợn
epithelial Tế bào biểu mô ống dẫn trứng

cell

lợn

Porcine endometrial epithelial
cell
Pregnant

mare’s

serum

gonadotropin
Tissue Culture Medium

TN

Tế bào nội mạc tử cung lợn

Huyết thanh ngựa chửa
Môi trường nuôi cấy
Thí nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
viii – ĐHTN




tt/ml

Tinh trùng/ml

TTON

Thụ tinh ống nghiệm

vcs

Và cộng sự

ZP

Zona pellucide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
ix – ĐHTN

Màng trong suốt




PHẦN I. MỞ ĐẦU
Sự phát triển của công nghệ sinh học sinh sản góp phần nâng cao hiệu
suất vật nuôi, bảo tồn đa dạng sinh học. Lợn là một trong các đối tượng ngày
càng được quan tâm nghiên cứu đặc biệt trong lĩnh vực y sinh bởi sự tương đồng
về cấu tạo, sinh lý, di truyền với con người. Do vậy, việc tạo ra các sản phẩm
phôi ống nghiệm ở lợn kết hợp với chuyển gene sẽ tạo ra nhiều cơ hội cho việc
sử dụng động vật biến đổi gene như là thiết bị kiểm tra các phản ứng sinh học

của sản phẩm dược, con cho trong ghép mô khác loài, tạo các dòng tế bào gốc
phôi hay là sử dụng làm mô hình trong nghiên cứu các bệnh ở người (Katska,
2006, Nguyễn Thị Ước vcs, 2008).
Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) là một trong những kỹ
thuật chủ yếu tạo phôi ống nghiệm. Lợn con đầu tiên sinh ra từ kỹ thuật này
được công bố bởi Cheng vcs, 1986. Sau đó kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm ở lợn
tiếp tục được nghiên cứu và cải thiện, tuy nhiên hiệu suất tạo phôi in vitro (với
các khâu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm, nuôi phôi) ở lợn còn thấp so với
phôi phát triển trong cơ thể (in vivo) hay so với các loài động vật khác như bò,
cừu ... Một trong những nguyên nhân của hiệu suất tạo phôi thấp có thể là sự
không thành thục về tế bào chất của trứng lợn; hiện tượng đa thụ tinh; điều kiện
môi trường nuôi in vitro …
Việc cải thiện môi trường nuôi thành thục trứng hoặc nuôi phôi dựa trên
những hiểu biết về sự trao đổi chất hoặc bắt chước các điều kiện trong cơ thể là
một trong những ý tưởng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Việc bổ sung
cysteine vào môi trường nuôi thành thục trứng lợn và bổ sung tế bào đệm vào
môi trường nuôi phôi nằm trong hướng đi của ý tưởng bắt chước điều kiện trong
cơ thể sống. Cysteine là một amino acid then chốt cấu thành glutathione (GSH)
mà GSH được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong việc tạo cho tế bào
một vi môi trường giúp bảo vệ tế bào, chống lại tác động của tổn thương oxy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
1 – ĐHTN




hóa. Việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục có thể giúp cải thiện
sự thành thục tế bào chất và quá trình thụ tinh in vitro ở trứng lợn.
Đối với hiệu suất tạo phôi lợn in vitro, mặc dù một số tác giả đã công bố
sự thành công của hiện tượng mang thai và tạo con non ở lợn sau khi chuyển

phôi lợn ở giai đoạn 2-4 tế bào tạo ra từ hệ thống IVM-IVF. Tuy nhiên, tiềm
năng phát triển phôi tạo ra từ hệ thống in vitro vẫn thấp hơn so với phôi phát
triển trong cơ thể (in vivo) (Thompson, 2000; Kikuchi vcs, 1995; Rath vcs,
1998). Hơn nữa, một số phôi tạo ra từ hệ thống IVM-IVF có thể phát triển đến
giai đoạn phôi nang nhưng không phát triển đến giai đoạn phôi thai sau khi được
cấy chuyển vào con nhận (Rath vcs, 1995; Koo vcs, 1997). Nguyên nhân của
hiện tượng này có thể do điều kiện nuôi phôi chưa tối ưu cho sự phát triển phôi
(Quian và cs, 2005). Cải thiện hiệu suất tạo phôi trong ống nghiệm có thể dựa
trên những hiểu biết về sự trao đổi chất hoặc bắt chước các điều kiện trong cơ
thể (Dobrinsky vcs, 1996). Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp các điều kiện
sinh lý cho sự phát triển phôi ở giai đoạn sớm trong cơ thể và góp phần quan
trọng trong sự thành công của việc mang thai (Pushpakumara, 2002).
Mặc dù đã có những cải tiến, kết quả tạo phôi lợn in vitro vẫn còn thấp
hơn so với hiệu suất tạo phôi của các loài khác như bò, cừu… cũng như khả
năng tạo phôi trong cơ thể. Vì những lý do trên, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu
nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn” với mục đích đánh giá ảnh
hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trứng lợn tới
khả năng thành thục của tế bào trứng lợn và đánh giá ảnh hưởng của việc bổ
sung tế bào đệm vào môi trường nuôi phôi tới khả năng phát triển phôi in vitro
của tế bào trứng lợn. Nghiên cứu này sẽ góp phần hoàn thiện hệ thống tạo phôi
in vitro ở lợn ở Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
2 – ĐHTN




PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Buồng trứng và quá trình hình thành nang trứng
2.2.1.1

Đặc điểm của buồng trứng

Ở động vật có vú, buồng trứng thuộc tuyến sinh dục cái có hai chức năng
chính là sản xuất, nuôi dưỡng trứng thành thục phục vụ cho quá trình thụ tinh
nhằm duy trì nòi giống và tiết ra các loại hormone sinh dục kích thích các bộ
phận sinh dục thứ cấp phát triển, tác động đến chức năng của tử cung và thay đổi
tính biệt giữa con đực và con cái. Hoạt động sinh dục ở gia súc được điều hòa
bởi sự phối hợp thần kinh - nội tiết trong trục dưới đồi - tuyến yên - buồng
trứng. GnRH sinh ra LH và FSH, thông qua vòng tuần hoàn vào buồng trứng
kích thích buồng trứng tiết ra estrogen, progesteron và inhibin.
Cấu tạo của buồng trứng: Bên ngoài là lớp màng liên kết chắc chắn, bên
trong chia làm hai miền: Miền vỏ và miền tủy, hai miền này được cấu tạo bằng
mô liên kết sợi xốp có tác dụng như một chất đệm ... ở miền tủy có mạch máu
nhiều hơn và tổ chức mô xốp cũng dầy hơn. Miền vỏ có tác dụng sinh lý vì ở đó
quá trình phát triển nang trứng, quá trình phát triển trứng chín và sự rụng trứng
được diễn ra.
2.2.1.2

Quá trình hình thành và phát triển của nang trứng

Các giai đoạn phát triển của nang trứng bao gồm: Từ nang nguyên thủy
phát triển thành nang sơ cấp, nang thứ cấp và cuối cùng là nang trứng chín (De
Graff):
 Nang nguyên thủy sinh ra từ biểu mô mầm chỉ có ở cơ thể con vật trong giai
đoạn bào thai. Sau khi con vật được sinh ra thì các nang nguyên thủy sẽ phát
triển thành nang thứ cấp. Nang nguyên thủy bao gồm một hoặc hai tế bào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3 – ĐHTN




trưng (ovocyt I) và được bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng, dẹt. Nang
nguyên thủy của lợn rất lớn khoảng 12000 - 86000 nang.
 Nang sơ cấp: bao gồm một ovocyt I có đường kính khoảng 30 - 60 m, nhân
to, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng. Hạt Balliani là
thể noãn đặc biệt chứa: có tính ưa axit, dạng hạt nhỏ, đóng vai trò quan trọng
trong việc hình thành noãn hoàng. Nang nguyên thủy và nang sơ cấp là
những nang trứng không có hốc nang.
 Nang thứ cấp được hình thành từ sự phát triển của nang sơ cấp, gồm một
ovocyt I đã phát triển lớn hơn, chứa nhiều noãn hoàng hơn. Vỏ của ovocyt I
dầy lên tạo thành mang trong suốt. Xung quanh có nhiều lớp tế bào bao
quanh.
 Nang trứng chín (Nang De Graff) do nang thứ cấp phát triển thành gồm một
ovocyt I có đường kính 120 – 150 m, có nhiều noãn hoàng hơn, nhân to,
tròn, rõ, vẫn còn hạt Balliani. Bao quanh tế bào trứng là mang trong suốt,
bên ngoài màng trong suốt là màng phóng xạ. Xung quanh hai bên của
ovocyt I là phần tế bào hạt dày lên để giữ tế bào trứng gọi là đĩa trứng. Nang
trứng chín có hai lớp vỏ: lớp vỏ bên ngoài mỏng, lớp vỏ bên trong dày hơn
có chứa các mạch quản, lót trong màng trong là lớp tế bào hạt (lớp tế bào
màng hạt). Giữa lớp màng hạt và màng phóng xạ của trứng là xoang nang
chứa dịch nang có hormone estrogen và protein. Lợn là loài động vật đa thai
sinh sản không theo mùa, một chu kỳ rụng trứng thì có nhiều trứng rụng vì
vậy có nhiều nang trứng chín cùng phát triển trong một chu kỳ.
Quá trình phát triển từ nang không có hốc thành nang có hốc thì trứng
được di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, sau khi từ nang có hốc
phát triển thành nang trứng chín thì trứng lại di chuyển ngược lại từ trung tâm

nang trứng ra bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
4 – ĐHTN




Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sản
cho ta thấy nang sơ cấp (nang bậc I – primary follicle). Sau giai đoạn nang sơ
cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát
triển. Một tế bào trứng có khả năng phát triển được bao quanh bởi hai hay nhiều
lớp tế bào hạt được gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle). Trong
quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời
và hình thành một xoang. Khi một xoang đã được hình thành tế bào tiếp tục phát
triển cho đến khi chín và rụng ra khỏi buồng trứng.

Hình 2.1. Cấu tạo buồng trứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
5 – ĐHTN




2.2.1.3

Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng

Quá trình hình thành tế bào trứng xảy ra ở lớp vỏ của buồng trứng từ
những noãn bào nguyên thủy được phân bố vùng ngoại biên. Noãn bào nguyên

thủy được hình thành rất sớm khi cơ thể khi vẫn còn trong giai đoạn bào thai từ
những biểu mô phôi thai. Đa số nang nguyên thủy sẽ không tiếp tục phát triển
mà bị tiêu biến bên trong buồng trứng, chỉ có một phần nhỏ được phát triển tạo
ra tế bào trứng.

Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng
Trứng là loại tế bào lớn nhất trong cơ thể chỉ mang n nhiễm sắc thể, có
dạng hình cầu, ở lợn trứng có đường kính từ 0,12 - 0,17 mm.
Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: Nhân, nguyên sinh chất và màng bao
 Nhân: bao gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều hạt nhân
 Phần nguyên sinh chất: Bao gồm các thành phần chủ yếu là nước, vật chất
hữu cơ, muối khoáng và các vật chất khác.
 Màng: Bao gồm ba lớp màng từ trong ra ngoài: Màng trong, mang giữa và
màng ngoài.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
6 – ĐHTN




o

Lớp màng trong: Là lớp màng mỏng bao bọc nguyên sinh chất, còn
được gọi là màng noãn hoàng hay là màng nguyên sinh chất. Màng
này có tác dụng nuôi dưỡng tế bào trứng đã thụ tinh. Trong màng có
chứa men Muraminidaza.

o

Lớp màng giữa (màng trong suốt): Bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra

từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dưỡng tế bào trứng. Tác dụng chủ yếu
của màng này là đảm bảo dinh dưỡng cho tế bào trứng trong buồng
trứng và ngăn không cho tình trùng khác loài có thể đi vào nhân trong
quá trình thụ tinh do trong màng chứa mem Zonalizin đặc hiệu cho
từng loài. Giữa màng trong suốt và màng nguyên sinh chất một khoảng
trống. Khoảng trống này có độ dày khoảng 14 - 24 m, có độ PH 3 - 5,
chứa dịch có nồng độ ion cao.

o

Lớp màng ngoài: Bao gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp.
Những tế bào này được phân bố xung quanh tế bào trứng nên được gọi
là màng phóng xạ, hay màng tia. Các tế bào này liên kết với nhau bởi
axít Hyaluronilic. Khi tinh trùng gặp trứng ở phần acrosom (phần đầu
tinh trùng) tiết ra men Hyaluronidaza để phân giải và thủy phân axít
Hyaluronilic làm cho màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện cho quá
trình thụ tinh xảy ra.

Ngoài cùng là lớp tế bào hạt cùng với lớp màng phóng xạ, lớp tế bào hạt
tạo nên cho tế bào trứng lớp tế bào cumulus có vai trò rất quan trọng tới sự phát
triển và chất lượng của trứng thành thục
Lớp tế bào Cumulus: Có ảnh hưởng rất lớn tới sự thành thục của tế bào
trứng về cả tế bào chất và nhân. Những tế bào này đóng vai trò như lớp trung
gian liên hệ giữa tế bào trứng với môi trường dịch nang hay là môi trường nuôi
trứng trong ống nghiệm (in vitro) (Kidson vcs, 2004). Các tế bào cumulus liên
kết với tế bào trứng thông qua các đoạn nối trống, tạo điều kiện thuận lợi cho
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
7 – ĐHTN

các tế bào cumulus tiếp xúc trực tiếp với màng trong suốt (giới hạn bởi màng
nguyên sinh chất) (Allworth vcs, 1993). Vì thế nên tế bào trứng luôn luôn có
quan hệ mật thiết với môi trường ngoài. Những chất dinh dưỡng cần thiết cho sự
phát triển của trứng được chuyển trực tiếp vào bên trong nội bào thông qua mối
liên kết trên (Tanghe S vcs, 2002). Các tế bào cumulus đóng vai trò bảo vệ và
trao đổi chất trong sự thành thục của tế bào chất, cần thiết cho sự hình thành tiền
nhân đực (Male Pronuclear - MPN) và khả năng phát triển của trứng, chống lại
stress oxi hóa bằng cách biến đổi cystine thành cysteine và hấp thụ cysteine có
trong trứng (Tatemoto H vcs, 2000). Trong quá trình nuôi thành thục in vitro
mức độ giãn nở (bông tơi) của lớp tế bào cumulus cũng là một chỉ tiêu có thể
đánh giá sự thành thục của trứng về nhân và tế bào chất. Hầu hết động vật có vú,
tế bào trứng đều được bao quanh bởi tế bào cumulus khi rụng trứng. Sự có mặt
của lớp tế bào cumulus trong giai đoạn nuôi thành thục có ý nghĩa rất lớn trong
sự thành thục của nhân (Metaphase II - MII), lượng glutathione (GSH) trong tế
bào, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng, sự hình thành tiền nhân (MPN).
Quá trình phát triển từ noãn bào nguyên thủy đến hình thành trứng trải
qua ba giai đoạn.
 Giai đoạn tăng số lượng noãn nguyên bào: Nhờ quá trình nguyên phân liên
tiếp nhiều lần mà số lượng noãn nguyên bào được tăng lên. Do cơ chế của
quá trình nguyên phân nên các noãn bào được hình thành đều mang bộ
nhiễm sắc thể là 2n và được bao bọc bởi lớp tế bào biểu mô. Giai đoạn này
diễn ra khi cơ thể con cái chưa thành thục về tính. Đến khi cơ thể thành thục
thì các noãn nguyên bào sẽ lần lượt được phát trình thành trứng chín.
 Giai đoạn sinh trưởng: Noãn nguyên bào tích lũy chất dinh dưỡng, tăng kích
thước và khối lượng hình thành nên các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I,
tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
8 – ĐHTN

 Giai đoạn hình thành trứng: Nhờ cơ chế giảm phân noãn bào cấp I giảm
phân thông qua hai lần phân bào liên tiếp.
o

Lần phân bào I: Noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II
(Noãn bào thứ cấp) có khối lượng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàn của
noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thước bé (cực cầu thứ nhất)

o

Lần phân bào II: Noãn bào cấp II phân chia hình thành tế bào trứng lớn
và cực cầu bé thứ hai. Trong lúc đó cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia
thành hai cực cầu bé.
Kết quả sau quá trình giảm phân từ một noãn bào cấp I cho một trứng lớn

và ba cực cầu bé. Trứng và cực cầu bé đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội n.
Trứng có khối lượng và kích thước lớn vì đã nhận toàn bộ khối noãn hoàng từ
noãn bào cấp I điều đó có ý nghĩa phát triển của trứng, kết thúc giai đoạn giảm
phân thì trứng chín.
2.2.2 Sự thành thục của tế bào trứng
Sau khi trải qua quá trình hình thành và đạt được kích thước cực đại,
trứng sẽ chuyển sang giai đoạn thành thục. Các noãn bào trong nang trước khi
có thể thụ tinh phải trải qua hai lần phân bào giảm nhiễm. Khi sinh ra noãn bào I
bị kìm hãm ở kỳ đầu của lần phân chia giảm nhiễm I. Sự phát triển sau này là
quá trình phức tạp gọi là sự thành thục của noãn bào. Quá trình này bao gồm
toàn bộ những biến đổi tế bào học và chuyển hóa làm cho noãn bào I có khả

năng thụ tinh, đảm bảo các hình thành các tiền nhân cái và tiền nhân đực và cho
phép bắt đầu phát triển phôi nhờ các chất dự trữ ( mRNA, riboxom, các loại
protein được tạo ra ở giai đoạn tăng trưởng). Thành thục trứng bao gồm sự thành
thục về nhân, tế bào chất và sự thay đổi của màng noãn bào I.
 Quá trình thành thục nhân: Là tiếp tục quá trình giảm phân và đạt tới giai
đoạn Metaphase II. Trong noãn hoàng chuẩn bị thành thục , nhân có kích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
9 – ĐHTN




thước rất lớn và được gọi là túi phôi (Germinal Vesicle - GV). Sau khi bị
kích thích bởi các kích dục tố hoặc điều kiện thích hợp của môi trường nuôi
thành thục in vitro, nhân lại nhanh chóng tiếp tục các kỳ của quá trình giảm
phân (Meiosis). Kết thúc quá trình giảm phân I hình thành nên hai tế bào: Tế
bào thứ nhất gồm có nhân và một chút tế bào bào chất tách ra khỏi noãn bào
và nằm ngoài màng sinh chất nhưng bên trong màng trong suốt được gọi là
thể cực thứ nhất. Tế bào thứ hai là noãn bào II. Noãn bào này sẽ bị kìm hãm
ở kỳ giữa của lần phân bào giảm nhiễm thứ hai (giai đoạn Metaphase II) cho
đến khi thụ tinh.
 Quá trình thành thục tế bào chất: Tế bào chất là nơi quan trọng trong việc
tổng hợp các protein thiết yếu, chuẩn bị các điều kiện cho noãn bào có thể
thụ tinh và phát triển phôi sớm. Biểu hiện của sự thành thục tế bào chất là
việc tăng sinh các thể hạt (Mitochondries), xuất hiện thể Golgi, có sự di
chuyển các hạt vỏ (Granules corticales) tới chu vi noãn bào ngay dưới màng
dịch tương. Những hạt này chứa Ovoperpxidase có tác dụng ngăn không cho
nhiều tinh trùng có thể xâm nhập vào một trứng (ngăn chặn hiện tượng đa
tinh trùng)
 Quá trình thành thục màng noãn bào: Gồm toàn bộ các quá trình cho phép

tinh trùng chấp nhận riêng biệt noãn bào. Màng trong được tổng hợp ở giai
đoạn tăng trưởng, đóng vai trò quan trọng trong quá trinh thụ tinh, màng có
tác dụng chỉ cho tinh trùng có khả năng thụ tinh mới được xâm nhập vào
noãn bào, tạo điều kiện thích hợp cho sự phối hợp giữa tinh trùng và trứng
và bảo vệ noãn bào không bị thụ tinh đa tinh trùng. Vùng trong (Zone
pellucide) gồm 95% của ba gycoprotein được cấu tạo thành các sợi dài hợp
nhất: ZP1, ZP2, ZP3. Chỉ có ZP3 được tinh trùng chấp nhận và có phản ứng
thể đỉnh (Acrosomique). ZP2 có tác dụng cố định tạm thời đầu tinh trùng
trong quá trình thụ tinh (khi tinh trùng đi qua vùng trong). ZP1 chiếm ít nhất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
10 – ĐHTN




khoảng 10% có tác dụng bảo đảm độ bền vững của vùng trong cho đến giai
đoạn phôi bào.
2.2.3 Sự thụ tinh của tế bào trứng động vật có vú
Sự thụ tinh của tế bào động vật có vú là sự kết hợp tự nhiên giữa trứng và
tinh trùng trong đường sinh dục của con cái (Trần Tiến Dũng vcs, 2002)
Khi noãn bao thành thục, tế bào trứng được giải phóng khỏi nang buồng
trứng, rơi vào loa kèn và đi vào ống dẫn trứng. Quá trình thụ tinh thường
diễn ra ở một phần ba phía trên ống dẫn trứng. Nếu tế bào trứng không
được thụ tinh ở thời điểm này, chúng sẽ đi xuống phía dưới ống dẫn trứng
hoặc vào tử cung và không còn khả năng thụ thai. Ở lợn, mỗi chu kỳ có
khoảng 15-20 noãn bao chín.
Khi trứng di chuyển vào ống dẫn trứng, nó tiết ra một chất kích thích quá
trình thụ tinh làm cho tinh trùng hoạt động mạnh và tiến tới bao vây
trứng. Đồng thời tinh trùng tiết ra men Hyaluronidaz để phá vỡ lớp tế bào
vành phóng xạ bao quanh trứng. Nếu số lượng tinh trùng quá ít sẽ không

đủ lượng men để phá vỡ màng phóng xạ bao quanh trứng, từ đó làm giảm
hiệu quả quá trình thụ tinh.
Sau khi tinh trùng phá vỡ được lớp màng phóng xạ, tinh trùng đi vào
khoảng trống giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng. Có khoảng vài
chục tinh trùng vào được khoảng trống giữa hai màng này. Tuy nhiên, ở
hầu hết các loài, sau khi phá vỡ được lớp màng noãn hoàng thì chỉ có một
tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng.
Ngoài ra ở màng trong suốt có men Zolalizin và ở màng noãn hoàng có
men Muraminidaza. Hai men này đặc hiệu theo loài nên chỉ cho phép tinh
trùng cùng loài đi vào tế bào trứng để tham gia thụ tinh. Những khe hở mà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
11 – ĐHTN




tinh trùng đi qua được mở, đóng theo cơ chế đông máu, với sự tham gia
của ion Ca 2+
Khi tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng thì phần đầu của tinh trùng đến kết
hợp với nhân của tế bào trứng và xảy ra quá trình đồng hóa, dị hóa giữa
hai tế bào. Phần thân và đuôi của tinh trùng được nguyên sinh chất của tế
bào trứng đồng hóa và tiêu tan.
Khi đầu của tinh trùng và nhân của tế bào trứng có sự phối hợp chọn lọc
tạo thành những đường thoi trên bề mặt của mỗi loại và có sự phối hợp
đầu tinh trùng với nhân tế bào trứng tạo thành hai tiền nhân mới và chúng
lớn lên rất nhanh trong thời gian khoảng vài giờ. Quá trình này diễn ra
trên đường đi của trứng tới nơi làm tổ (ống dẫn trứng tới tử cung). Ở lợn,
hợp tử làm tổ ở hai bên sừng tử cung.
Kết quả của quá trình thụ tinh là tạo ra hợp tử từ sự kết hợp trứng và tinh

trùng. Hợp tử này duy trì được giống loài và bảo tồn được đặc tính của tổ
tiên, bố mẹ di truyền cho.
2.2 Sự thành thục trứng lợn in vitro (In vitro maturation – IVM)
Quá trình thành thục in vitro là quá trình sử dụng các môi trường và điều
kiện nhân tạo cần thiết cho các tế bào trứng ban đầu chưa thành thục sau khi
nuôi sẽ thành thục , có khả năng thụ tinh và phát triển sau thụ tinh. Đây là bước
tiến căn bản có ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng trứng, khả năng thụ tinh và sự
phát triển của phôi. Cơ sở khoa học chính của quá trình thành thục in vitro là
dựa vào những hiểu biết quá trình thành thục tự nhiên trong cơ thể động vật (in
vivo).
Ở các loài động vật có vú, quá trình thành thục in vivo noãn bào được đặt trong
điều kiện tối ưu, do đó loại trừ được các ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển và
thành thục của trứng. Còn quá trình thành thục in vitro rất phức tạp và chịu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
12 – ĐHTN




nhiều ảnh hưởng rất nhiều của các yếu tố bên ngoài. Đã có rất nhiều các nghiên
cứu của các nhà khoa học trên thế giới về vấn đề này nhằm mục đích giảm thiểu
các yếu tố ảnh hưởng tối ưu và nâng cao chất lượng của trứng thành thục.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng điều kiện nuôi cấy in vitro thấp hơn so với
trứng được thành thục tự nhiên trong cơ thể sống (in vivo), nên quá trình thành
thục in vitro thường không được trọn vẹn, trung bình có 60 - 85% số noãn bào
invitro được thụ tinh và phân chia thì chỉ có 25 - 30 % phát triển được tới giai
đoạn phân bào. Vì vậy còn có rất nhiều các yếu tố ảnh hưởng cần được xác định
và khắc phục. Việc tìm ra điều kiện tốt nhất cho quá trình thành thục của trứng
trong ống nghiệm là yêu cầu rất cần thiết trong quá trình nuôi trứng cũng như
các thí nghiệm khác.

Cơ sở khoa học của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục
Bổ sung môi trường IVM với cysteine (Yoshida vcs, 1993) hoặc
cysteamine (Grupen vcs, 1995; Yamauchi vcs, 1999) hoặc sử dụng môi trường
giàu cysteine (chẳng hạn Waymouth MB 75211) cải thiện sự hình thành tiền
nhân đực của trứng lợn IVM sau IVF. Cysteine là một amino acid then chốt cấu
thành glutathione (GSH). GSH được chỉ ra là có đóng vai trò quan trọng trong
cung cấp tế bào với một môi trường thu nhỏ để bảo vệ chống lại tác động có hại
của tổn thương oxy hóa (Meister vcs, 1983), đặc biệt là khi những tế bào được
nuôi dưới điều kiện có nồng độ oxy cao. Ở trâu bò, Sutovsky và Schatten chỉ ra
rằng sự giảm GSH trong IVM gây cản trở sự hình thành tiền nhân đực do không
có sự tháo rời đuôi tinh trùng và ngăn cản sự ghép tiền nhân trong quá trình thụ
tinh.
Hơn nữa, De Matos vcs chỉ ra GSH là hợp chất sulphydryl không phải
protein trong tế bào động vật có vú. Vì thế, tác động tăng GSH trong trứng IVM
lên sự hình thành MPN được nghiên cứu để phối hợp theo nhiều cách: GSH tăng
sự phá vỡ cầu nối disulfide của protamin trong đầu tinh trùng bởi sự thay đổi tế
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
13 – ĐHTN




bào chất của trứng trong quá trình oxy hóa khử, và/ hoặc đáp ứng chất nền của
enzyme glutathione peroxidaza và tác động như một chất tiêu diệt các gốc tự do
trong trứng, làm tăng khả năng của chúng nói chung (Nagai vcs, 1996). Do đó,
trong thực hành, đánh giá mức GSH trong trứng là một trong những cách dễ
dàng nhất để tăng cơ hội thành công của phát triển phôi lợn. Những thông tin có
giá trị về tác động của đánh giá GSH trong trứng lợn nuôi trong môi trường
IVM bổ sung cysteine lên sự phát triển phôi sau IVF và IVC còn hạn chế.
2.3 Thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi in vitro (In vitro fertilization, In

vitro Culutre – IVF, IVC)
2.3.1. Thụ tinh ống nghiệm ở lợn
Thụ tinh ống nghiệm là quá trình tế bào trứng được thụ tinh bằng tinh
trùng diễn ra bên ngoài cơ thể. Quá trình thụ tinh ống nghiệm có thể diễn ra
giữa tế bào trứng thành thục trong cơ thể (in vivo) hoặc tế bào trứng thành
thục ngoài cơ thể (in vitro) với tinh trùng cùng loài được kiện toàn năng lực
thụ tinh. Trong phần này tôi trình bày quá trình thụ tinh ống nghiệm giữa
trứng thành thục in vitro với tinh trùng đông lạnh, giải đông. Do đó, nguyên
liệu của quá trình thụ tinh ống nghiệm gồm
- Tế bào trứng thành thục in vi tro (IVM)
- Tinh trùng đông lạnh, giải đông được kiện toàn năng lực thụ tinh.
Ngoài ra, để quá trình thụ tinh ống nghiệm được thực hiện thì cần các yếu tố:
- Môi trường hoạt hóa, kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng
- Môi trường diễn ra quá trình (Fertilization medium - FM)
- Điều kiện thụ tinh:Hàm lượng oxy, nhiệt độ, độ ẩm của tủ nuôi
- Thời gian thụ tinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
14 – ĐHTN