Xác định cơ sở phân tử của bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình liên quan đến gen LDLR (low density lipoprotein receptor)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên chuyên đề:

XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH
CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ
TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN
GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN
RECEPTOR)
KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THUÝ
ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG
SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ
MSSV: 1153010494
KHOÁ: 2011 - 2015
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên chuyên đề:

XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH
CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ

TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN
GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN
RECEPTOR)
KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THUÝ
ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG
GVHD ký xác nhận:

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ
MSSV: 1153010494
KHOÁ: 2011 - 2015

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015



Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh
Học trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và quý thầy cô chuyên ngành Vi
sinh - Sinh học phân tử đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức,
kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Huyền Ái Thuý, ThS. Lao Đức
Thuận - phụ trách, nghiên cứu và làm việc tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,
các anh chị và các bạn làm khoá luận tại Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp
đỡ em tận tình trong suốt thời gian khoá luận tốt nghiệp.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trƣơng Kim Phƣợng

đã hết lòng giúp đỡ, trực tiếp hƣớng dẫn em trong suốt quá trình làm thực tập tốt
nghiệp. Cô đã chỉ dạy em không chỉ nhiều kiến thức bổ ích mà còn tinh thần làm
việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc và hiệu quả.
Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ và gia đình đã nuôi
dƣỡng, dạy bảo để con có đƣợc ngày hôm nay. Xin cảm ơn anh chị em trong gia
đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận
tốt nghiệp.
Xin Chân Thành Cảm Ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc Mỹ

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang i


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ApoB

Apolipoprotein B - 100

ApoE

Apolipoprotein E

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CHD

Coronary Heart Disease

CVD

Cardiovascular Disease

DGGE

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DNA

Deoxyribonucleic Acid

FH

Familial Hypercholesterolemia

HDL

High Density Lipoprotein

heFH

heterozygous Familial Hypercholesterolemia

hoFH

homozygous Familial Hypercholesterolemia

LDL

Low Density Lipoprotein

LDLR

Low Density Lipoprotein Receptor

LDLRAP1

LDLR adaptor protein 1

MLPA

Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NIH

National Institutes of Health

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9

RER

Rough Endoplasmic Reticulum

SRE

Steroid Response Element

SREBP

Steroid Response Element Binding Protein

SSCP

Single – Strand Conformation Polymorphism

TC

Total Cholesterol

TG

Triglyceride

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang ii


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG
Bảng II.1. Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R .......19
Bảng II.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R
...........................................................................................................................19
Bảng III.1. Số lƣợng công trình nghiên cứu đƣợc thu thập từ PubMed (NCBI) ......21
Bảng III.2. Các công trình nghiên cứu về bệnh FH trên NCBI ................................22
Bảng III.3. Các dạng đột biến điểm trên gen LDLR thu thập đƣợc trên thế giới ......23
Bảng III.4. Số dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các châu lục ...........................25
Bảng III.5. Các dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các quốc gia trên thế giới .....26
Bảng III.6. Số dạng đột biến điểm trên các exon gen LDLR ....................................28
Bảng III.7. Cơ sở dữ liệu gen LDLR đƣợc thu thập trên NCBI ................................31
Bảng III.8. Các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 4 ..........................................33
Bảng III.9. Thông số chi tiết các cặp mồi khuếch đại exon 4 thu thập đƣợc ............34
Bảng III.10. Một số thông số vật lý của bộ mồi........................................................38
Bảng III.11. Giá trị đo mật độ quang của 6 mẫu bệnh phẩm ....................................39
Bảng III.12. Tổng hợp kết quả gải trình tự exon 4 gen LDLR ..................................50
Bảng VI.1. Số lƣợng đột biến trên exon của gen LDLR ...........................................64
Bảng VI.2. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của bộ mồi LDLR13 bằng Annhyb…….78
Bảng VI.3. Thông số của các mẫu bệnh phẩm thu thập đƣợc……………………...79

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang iii


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH
Hình I.1. Con đƣờng chuyển hóa của thụ thể LDL [27] .............................................4
Hình I.2. Xơ vữa động mạch [75] ...............................................................................5
Hình I.3. Một số biểu hiện ở bệnh nhân FH [57] ........................................................8
Hình I.4. Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 (Genecards) ...............................9
Hình I.5. Các vùng chức năng của thụ thể LDL [7]..................................................10
Hình III.1. Tỉ lệ đột biến gen LDLR trên exon 4 .......................................................29
Hình III.2. Biểu đồ thể hiện các phƣơng pháp xác định đột biến trên gen LDLR ....30
Hình III.3. Đánh giá độ tƣơng đồng của trình tự gen LDLR bằng công cụ Bioedit .32
Hình III.4. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi LDLR13_F bằng công cụ BLAST..........36
Hình III.5. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi LDLR13_R bằng công cụ BLAST .........37
Hình III.6. Xác định vị trí bắt cặp của mồi LDLR13_F và LDLR13_R bằng công cụ
Annhyb...............................................................................................................37
Hình III.7. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại gen LDLR với bộ mồi LDLR13_F
và LDLR13_R....................................................................................................40
Hình III.8. Kết quả điện di khuếch đại gen LDLR với bộ mồi LDLR13_F và
LDLR13_R ........................................................................................................40
Hình III.9. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A2F bằng công cụ BLAST
...........................................................................................................................44
Hình III.10. Một số vị trí nghi ngờ xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A2F ........44
Hình III.11. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A6F bằng công cụ
BLAST ...............................................................................................................45
Hình III.12. Sắp gióng cột trình tự A6F với NM_000527.4 bằng công cụ BioEdit .45
Hình III.13. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A7F bằng công cụ
BLAST ...............................................................................................................46

Hình III.14. Sắp gióng cột trình tự A7F với NM_000527.4 bằng công cụ BioEdit .46
Hình III.15. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A1F bằng công cụ
BLAST ...............................................................................................................47
Hình III.16. Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A1F ........................47

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang iv


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình III.17. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A3F bằng công cụ
BLAST ...............................................................................................................48
Hình III.18. Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A3F ........................48
Hình III.19. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A4F bằng công cụ
BLAST ...............................................................................................................49
Hình III.20. Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A4F ........................49
Hình VI.1. Tỉ lệ đột biến trên exon của gen LDLR [49] ...........................................64
Hình VI.2. Mức độ tƣơng đồng của trình tự NG_009060 và NM_000527.4 ...........65
Hình VI.3. Kết quả khảo sát độ tƣơng đồng của trình tự NG_009060.1 bằng công cụ
BLAST ...............................................................................................................65
Hình VI.4. Kết quả khảo sát độ tƣơng đồng của trình tự NM_000527.4 bằng công
cụ BLAST ..........................................................................................................66
Hình VI.5. Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_F ..................................................67
Hình VI.6. Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_R ..................................................68
Hình VI.7. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của trình tự mồi LDLR13_R bằng công cụ
BLAST ...............................................................................................................68
Hình VI.8. Kết quả giải trình tự mẫu A1 ..................................................................71
Hình V.9. Kết quả giải trình tự mẫu A2 ....................................................................72

Hình V.10. Kết quả giải trình tự mẫu A3 ..................................................................73
Hình V.11. Kết quả giải trình tự mẫu A4 ..................................................................74
Hình V.12. Kết quả giải trình tự mẫu A6 ..................................................................75
Hình V.13. Kết quả giải trình tự mẫu A7 ..................................................................76

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang v


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
PHẦN I. TỔNG QUAN ............................................................................................3
I.1. TỔNG QUAN VỀ CAO CHOLESTEROL ......................................................3
I.1.1. Cholesterol ..................................................................................................3
I.1.2. Bệnh rối loạn mỡ máu (Dyslipidemia) .......................................................4
I.1.2.1 Khái niệm..............................................................................................4
I.1.2.1 Nguyên nhân .........................................................................................4
I.1.2.1 Dấu hiệu và triệu chứng ........................................................................5
I.1.2.1 Chẩn đoán .............................................................................................6
I.1.3. Bệnh cao cholesterol có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia) ...6
I.1.3.1 Khái niệm..............................................................................................6
I.1.3.1 Đột biến gen và bệnh FH ......................................................................7
I.1.3.1 Chẩn đoán .............................................................................................8
I.2. TỔNG QUAN VỀ GEN LDLR .........................................................................9
I.2.1. Gen LDLR ...................................................................................................9
I.2.2. Protein LDLR .............................................................................................9
I.2.3. Thụ thể LDL .............................................................................................10

I.2.4. Các dạng ảnh hƣởng của gen LDLR đến thụ thể LDL .............................11
I.3. KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR .............................12
I.3.1. Giải trình tự tự động: ................................................................................12
I.3.2. Single Strand Conformation Polymorphism - SSCP................................13
I.4. MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH CAO CHOLESTEROL
CÓ TÍNH GIA ĐÌNH ............................................................................................13
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................15
II.1. VẬT LIỆU .....................................................................................................15
II.1.1. Các công cụ tin sinh học: ........................................................................15

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang vi


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

II.1.2. Các trang web sử dụng: ...........................................................................15
II.1.3. Mẫu bệnh phẩm .......................................................................................15
II.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................15
II.2.1. Khai thác dữ liệu .....................................................................................15
II.2.2. Khảo sát in silico gen LDLR ...................................................................16
II.2.2.1 Thu thập trình tự gen, xác định cấu trúc gen LDLR ..........................16
II.2.2.1 Đánh giá bộ mồi thu thập đƣợc .........................................................16
II.2.3. Khảo sát thực nghiệm..............................................................................16
II.2.3.1 Tách chiết DNA.................................................................................16
II.2.3.1 Kiểm tra chất lƣợng DNA thu nhận đƣợc .........................................17
II.2.3.1 Phƣơng pháp điện di ..........................................................................19
II.2.3.1 Phƣơng pháp giải trình tự ..................................................................20
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................21

III.1. KHAI THÁC DỮ LIỆU ...............................................................................21
III.1.1. Nguồn dữ liệu về bệnh FH .....................................................................21
III.1.2. Dữ liệu dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các quốc gia, châu lục ...22
III.1.3. Tính chất đột biến điểm trên các exon thuộc gen LDLR .......................27
III.2. KHẢO SÁT IN SILICO GEN LDLR ...........................................................31
III.2.1. Thu thập trình tự gen, xác định cấu trúc gen LDLR ..............................31
III.2.2. Đánh giá bộ mồi khuếch đại exon 4 trong xác định đột biến trên gen
LDLR liên quan đến bệnh FH ............................................................................32
III.3. KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM .....................................................................39
III.3.1. Tách chiết DNA .....................................................................................39
III.3.2. Kết quả phản ứng PCR và điện di .........................................................39
III.3.3. Phân tích kết quả giải trình tự ................................................................41
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................52
IV.1. Kết luận ........................................................................................................52
IV.1.1. Khai thác dữ liệu....................................................................................52

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang vii


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

IV.1.2. Khảo sát in silico ...................................................................................52
IV.1.3. Khảo sát thực nghiệm ............................................................................52
IV.2. Kiến nghị ......................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................54
PHỤ LỤC .................................................................................................................64

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang viii


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cao cholesterol máu có tính gia đình (Familial hypercholesterolaemia, FH) là
dạng rối loạn di truyền mang tính trội trên nhiễm sắc thể số 19, ảnh hƣởng đến quá
trình chuyển hóa lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein, LDL), đặc
trƣng bởi nồng độ cholesterol LDL trong máu cao bất thƣờng từ 190 mg/ dL đến
hơn 450 mg/dL [48]. Hằng năm, trên thế giới ƣớc tính có hơn 10 triệu ngƣời mắc
bệnh FH và 200.000 ngƣời chết do bệnh tim mạch vành [53].
FH thể dị hợp có tỉ lệ mắc bệnh là 1:500 dân số thế giới và phổ biến hơn ở
một số cộng đồng ngƣời Afikan ở Nam Phi và ngƣời Canada gốc Pháp [13].
Cholesterol lắng đọng trong các cơ quan và nội tạng dẫn đến các biểu hiện đặc
trƣng của bệnh nhƣ: tích tụ các khối xanthomas ở gân (Tendon Xanthomas), cung
giác mạc (Corneal Arcus) hoặc tích tụ cholesterol ở thành động mạch, làm tăng
nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease, CHD) trƣớc 50 tuổi ở
nam giới và trƣớc 60 tuổi ở nữ giới [39]. FH thể đồng hợp có tỉ lệ mắc bệnh là
1:1.000.000 dân số thế giới, dẫn đến xuất hiện các khối xanthomas ở gân, cung giác
mạc, bệnh tim mạch từ khi mới sinh hoặc bị nhồi máu cơ tim, đột quỵ và có khả
năng dẫn đến tử vong trƣớc 30 tuổi [13].
Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh FH là tính chất đột biến điểm trên
gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor) [61], với tỷ lệ mắc bệnh là 85 - 90%
[9]. Gen LDLR nằm trên vị trí 19p13.1 – 19p13.3, gồm 18 exon và 17 intron [16],
mã hóa cho thụ thể LDL tham gia vào quá trình chuyển hóa cholesterol, acid béo
trong máu và ở tế bào [32] Một số công trình ngiên cứu trên thế giới đã xác định
khoảng 1.200 – 1.700 dạng đột biến trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH [48,32].
Trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu nhằm xác định tính chất đột biến

điểm trên gen LDLR. Năm 1938, Muller và cộng sự ghi nhận bệnh cao cholesterol
có tính chất gia đình là dạng rối loạn di truyền trong quá trình chuyển hóa
lipoprotein [61]. Năm 1986, Brown và cộng sự (1986) phát hiện nguyên nhân dẫn
đến bệnh FH là do các dạng đột biến trên gen LDLR [15]. Sau đó, công trình nghiên
cứu của nhóm Humphries và cộng sự (2014) phân tích các dạng đột biến điểm trên

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 1


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

gen LDLR bằng phƣơng pháp PCR kết hợp giải trình tự [40]. Tuy nhiên, hiện nay
có rất ít công bố đề cập đến vấn đề di truyền phân tử của bệnh FH tại Việt Nam.
Do đó, việc xác định một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh FH trên bệnh
nhân Việt Nam, cụ thể là tính chất đột biến điểm trên gen LDLR có ý nghĩa khoa
học, thiết thực đối với việc tiên lƣợng, chẩn đoán và điều trị của bệnh FH. Vì vậy,
chúng tôi thực hiện chuyên đề khoá luận tốt nghiệp: “Xác định cơ sở phân tử của
bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình liên quan đến gen LDLR
(Low Density Lipoprotein Receptor)”.
o Mục tiêu:
Xác định cơ sở phân tử (tính chất đột biến điểm) trên gen LDLR liên quan
đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình.
o Nội dung nghiên cứu:
 Thu thập dữ liệu về cơ sở phân tử của bệnh FH, tập trung vào tính chất đột
biến điểm nổi trội trên các exon thuộc gen LDLR liên quan đến bệnh FH trên
thế giới và ở Việt Nam.
 Khảo sát in silico bộ mồi của quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác
định tính chất đột biến điểm nổi trội ở gen LDLR liên quan đến bệnh FH.

 Thực hiện quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến điểm
nổi trội trên gen LDLR ở Việt Nam, cụ thể trên các mẫu bệnh phẩm cao
cholesterol của một số bệnh viện thuộc khu vực Thành phố Hồ Chí Minh.

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 2


PHẦN I.
TỔNG QUAN



Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẦN I. TỔNG QUAN
I.1. TỔNG QUAN VỀ CAO CHOLESTEROL
I.1.1. Cholesterol
Cholesterol (Cholest-5-en-3β-ol) là một thành viên của nhóm hợp chất
polycyclic (sterols), đƣợc xác định lần đầu tiên vào thế kỉ 17. Cholesterol là thành
phần thiết yếu cho hoạt động của tế bào động vật, là tiền chất tham gia sản xuất acid
mật, hormone tuyến thƣợng thận, tuyến sinh dục và vitamin D, đƣợc tìm thấy trong
hầu hết tế bào của cơ thể. 25 - 30% cholesterol đƣợc cung cấp cho cơ thể thông qua
chế độ ăn uống và 70 - 75% đƣợc tổng hợp ở gan [39].
Cholesterol là dạng lipid không phân cực (không hoà tan trong nƣớc) nên
đƣợc vận chuyển trong huyết tƣơng bởi các dạng lipoprotein: lipoprotein mật độ
thấp (Low - Density Lipoproteins, LDL) và lipoprotein mật độ cao (High - Density
Lipoproteins, HDL) [36].
Cholesterol HDL còn đƣợc gọi là "cholesterol tốt". Hạt HDL là những

lipoprotein có kích thƣớc nhỏ nhất, có chức năng vận chuyển cholesterol từ các cơ
quan về gan để bài tiết và tổng hợp acid mật. Nồng độ cholesterol HDL trong máu
cao làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch [61].
Cholesterol LDL còn đƣợc gọi là "cholesterol xấu", có chức năng vận
chuyển cholesterol từ gan đến cung cấp cho các cơ quan khác và từ các cơ quan
khác về gan để bài tiết và tổng hợp acid mật, chủ yếu là tuyến thƣợng thận và các
mô mỡ [39]. Nồng độ cholesterol LDL trong máu cao làm gia tăng nguy cơ nhồi
máu cơ tim và mắc các bệnh tim mạch. Những bệnh nhân mắc bệnh cao cholesterol
máu có tính gia đình có nồng độ cholesterol LDL trong máu cao do cholesterol
LDL không đƣợc chuyển hoá hoặc chỉ đƣợc chuyển hoá một phần ở gan [61].
Nồng độ cholesterol LDL trong máu thông thƣờng ở 200 mg/dL, nồng độ
cholesterol LDL máu từ 200 - 239 mg/dL đƣợc xem là vƣợt giới hạn và nồng độ
cholesterol LDL máu lớn hơn 240 mg/dL đƣợc xem là cao cholesterol máu.
Cân bằng cholesterol nội bào đƣợc điều hoà thông qua con đƣờng thụ thể
LDL (LDL Receptor). Thụ thể LDL đƣợc tổng hợp ở lƣới nội chất, sau đó đƣợc xử

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 3


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

lý ở bộ máy Golgi và đƣợc vận chuyển đến bề mặt tế bào. Thụ thể LDL liên kết đặt
hiệu với các hạt LDL tại vị trí ApoB hình thành phức hợp thụ thể - LDL và xâm
nhập vào bên trong tế bào. 75% hạt LDL đƣợc hấp thụ ở gan. Các túi nội bào liên
kết với lysosome thoái hoá apoprotein, thuỷ phân ester cholesterol thành cholesterol
tự do và vận chuyển đến màng tế bào khi cần thiết. Cuối cùng, cholesterol đƣợc bài
tiết ở mật dƣới dạng cholesterol tự do hoặc tổng hợp thành acid mật ở gan [39].

Hình I.1. Con đƣờng chuyển hóa của thụ thể LDL [27]
I.1.2. Bệnh rối loạn mỡ máu (Dyslipidemia)
I.1.2.1 Khái niệm
Rối loạn mỡ máu là tình trạng tăng nồng độ cholesterol, triglyceride,
cholesterol LDL hoặc giảm nồng độ cholesterol HDL trong huyết tƣơng dẫn đến rối
loạn quá trình chuyển hoá cholesterol trong cơ thể, tích tụ cholesterol ở các cơ quan
dẫn đến xơ vữa động mạch [44].
I.1.2.1 Nguyên nhân
Rối loạn mỡ máu có thể do 2 nguyên nhân chính: nguyên nhân tiên phát (rối
loạn di truyền) và nguyên nhân thứ phát (thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uống, ảnh
hƣởng của một số bệnh lý khác,...) [25].

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 4


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

 Nguyên nhân nguyên phát gây ra do đột biến trên gen LDLR, ApoB, PCSK9,
LDLRAP/ARH,... dẫn đến các rối loạn trong quá trình chuyển hoá cholesterol
trong cơ thể [36].
 Nguyên nhân thứ phát đóng vai trò thúc đẩy quá trình tăng lipid máu ở ngƣời
trƣởng thành. Nguyên nhân thƣờng gặp nhất là do ít vận động, chế độ ăn
giàu chất béo bão hoà, cholesterol và mỡ động vật. Một số nguyên nhân thứ
phát khác nhƣ: bệnh tiểu đƣờng, uống nhiều rƣợu bia, bệnh thận mạn
tính,...[67].
I.1.2.1 Dấu hiệu và triệu chứng
Rối loạn mỡ máu thƣờng không có các dấu hiệu và triệu chứng đặc trƣng,
chủ yếu là do xơ vữa động mạch hình thành các mảng bám trên thành động mạch

làm hẹp động mạch và hạn chế dòng chảy của máu về tim. Theo thời gian, diện tích
mảng xơ vữa vỡ ra hình thành cục máu đông trên bề mặt của mảng bám hoặc chặn
hoàn toàn dòng chảy của máu về tim dẫn đến đau thắt ngực hoặc đau tim [72]. Nếu
không chữa trị kịp thời có thể dẫn đến xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim và tử
vong. Bên cạnh đó cholesterol và các chất béo còn tích tụ bên ngoài cơ thể hình
thành các khối "xantholamas" ở mắt hoặc cung giác mạc, "xanthomas" ở gân, khuỷ
tay hoặc khớp gối [39].

Hình I.2. Xơ vữa động mạch [75]

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 5


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Rối loạn mỡ máu tiên phát với các dấu hiệu lâm sàng nhƣ: xơ vữa động
mạch trƣớc tuổi 50 ở nam giới và trƣớc tuổi 60 ở nữ giới, tiền sử gia đình có ngƣời
mắc bệnh động mạch vành hoặc nồng độ cholesterol trong máu lớn hơn 240 mg/ dL
(6.2 mmol/ L) [44].
I.1.2.1 Chẩn đoán
Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh rối loạn mỡ máu thƣờng đƣợc dựa vào các chỉ
số: cholesterol toàn phần (Total cholesterol), Triglyceride (TG), cholesterol HDL,
cholesterol LDL,...
I.1.3. Bệnh cao cholesterol có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia)
I.1.3.1 Khái niệm
Bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình là một dạng rối loạn di truyền chủ
yếu trên nhiễm sắc thể thƣờng (nhiễm sắc thể số 19) [1], ảnh hƣởng đến quá trình
chuyển hoá lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein, LDL), với biểu hiện

nồng độ cholesterol LDL lƣu thông trong máu cao gấp nhiều lần so với ngƣời bình
thƣờng (lớn hơn 200 mg/dL) [39,18].
Bệnh FH dẫn đến cholesterol lắng đọng trong các mô và cơ quan gây xơ vữa
động mạch, dẫn đến các bệnh về tim mạch, bệnh u vàng gân,...[14,20,27] làm tăng
nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành sớm (20 - 39 tuổi) gấp 100 lần so với ngƣời bình
thƣờng [14,63]. Ƣớc tính trên toàn thế giới có hơn 10.000.000 ngƣời mắc bệnh FH
và 200.000 ngƣời chết mỗi năm do bệnh tim mạch vành [38,53].
Bệnh FH ở thể đồng hợp tử (homozygous, hoFH) và FH thể dị hợp tử
(heterozygous, heFH). Bệnh nhân mắc bệnh FH thể đồng hợp tử (homozygous,
hoFH) có chỉ số cholesterol tổng trong khoảng 650 - 1.000 mg/dL (17 - 26 mmol/L)
và chỉ số cholesterol LDL trong máu lớn hơn 600mg/dL (15.5mmol/L). Bệnh nhân
mắc bệnh FH thể dị hợp tử (heterozygous, heFH) có chỉ số cholesterol tổng trong
khoảng 350 - 550 mg/dL (9 - 14 mmol/L) và cholesterol LDL trong máu lớn hơn
200 mg/dL (5 mmol/L) ảnh hƣởng đến 1:500 dân số thế giới [1,18].
Cholesterol LDL tích tụ trong các cơ quan và nội tạng dẫn đến một số biểu
hiện: tích tụ các khối xanthomas ở gân (Tendinous) và cung giác mạc (Corneal

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 6


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Arcus) hoặc tích tụ trong động mạch gây ra các triệu chứng của bệnh tim mạch
(Cardiovascular Disease, CVD) trƣớc tuổi trung niên ở cả nam giới (40 - 50 tuổi) và
nữ giới (50 - 60 tuổi) [1].
I.1.3.1 Đột biến gen và bệnh FH
Dựa trên các công trình nghiên cứu của Müller và cộng sự (1938), Brown
(1968), Ajmal (2010),... xác định bệnh FH xảy ra là do các dạng đột biến điểm trên

gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), ApoB (Apolipoprotein B), PCSK9
(Pro - protein convertase subtilisin/kexin 9) [1].
Hiện nay, có hơn 1700 dạng đột biến điểm ở gen LDLR liên quan đến bệnh
FH đã đƣợc xác định [11,1]. Các dạng đột biến dị hợp tử trong những gen này có
thể dẫn đến sự gia tăng gấp 2 - 3 lần nồng độ cholesterol LDL trong huyết tƣơng và
làm gia tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch so với ngƣời bình thƣờng [11].Công
bố nghiên cứu của Fouchier và cộng sự (2011) xác định nguyên nhân phổ biến nhất
gây ra bệnh cao cholesterol có tính gia đình là do các dạng đột biến điểm ở gen
LDLR, ảnh hƣởng đến quá trình vận chuyển cholesterol LDL trong máu [6].
Các dạng đột biến điểm trên gen ApoB làm mất khả năng liên kết của các hạt
LDL với thụ thể LDL trên bề mặt tế bào dẫn đến nồng độ cholesterol LDL lƣu
thông trong máu cao [1]. Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Fisher và cộng sự đã xác
định đột biến R3500Q ở 21 bệnh nhân đƣợc khảo sát và 6 bệnh nhân mang đột biến
R3500W trên gen ApoB. Đột biến trên gen ApoB không phổ biến bằng đột biến trên
gen LDLR [29].
Năm 2003, nghiên cứu của Abifadel và cộng sự đã xác định hai dạng đột
biến trên gen PCSK9 liên quan đến bệnh FH. Gen PCSK9 mã hóa cho enzyme
“neural apoptosis regulated convertase 1” tham gia vào quá trình phân hủy protein
LDLR trong lysosome của tế bào để ngăn quá trình tái chế LDLR [11]. Các dạng
đột biến trên gen PCSK9 đƣợc phát hiện năm 2003 dẫn đến mất chức năng gắn kết
và nhập bào của phức hợp LDLR - LDL và giảm khả năng thoái hoá của lysosome
[2].

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 7


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình I.3. Một số biểu hiện ở bệnh nhân FH [57]
I.1.3.1 Chẩn đoán
Bệnh FH thƣờng đƣợc chẩn đoán dựa trên kết quả xét nghiệm các chỉ số
cholesterol trong máu kết hợp với các yếu tố nguy cơ khác nhƣ lịch sử gia đình có
ngƣời thân bị mắc bệnh FH, hút thuốc, huyết áp cao hoặc xuất hiện các khối
xanthomas trên cơ thể [1].
Cao cholesterol máu có tính gia đình là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể
thƣờng, vì vậy những thành viên trong gia đình bệnh nhân là những đối tƣợng có
nguy cơ mắc bệnh cao với tỉ lệ 50% số thành viên trong gia đình có thể bị bệnh
[62]. Do đó, những thành viên trong gia đình của bệnh nhân nên đƣợc xét nghiệm
các chỉ số cholesterol trong máu để phát hiện bệnh sớm khi chƣa có triệu chứng lâm
sàng và kịp thời thực hiện chế độ ăn kiêng và can thiệp bằng thuốc trƣớc khi xuất
hiện các triệu chứng tổn thƣơng tim mạch [69].

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 8


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

I.2. TỔNG QUAN VỀ GEN LDLR
I.2.1. Gen LDLR

Hình I.4. Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 (Genecards)
Gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor) có kích thƣớc 45 kb, nằm ở
vị trí 19p13.2 trên nhiễm sắc thể số 19, gồm 18 exon và 17 intron, mã hoá cho thụ
thể LDL. Sản phẩm phiên mã dài 5,3 kb, trong đó vùng không dịch mã dài 2,7 kb,
mã hoá cho chuỗi peptide dài 860 amino acid [28,34].
I.2.2. Protein LDLR

Protein LDLR (160 kD) là một thụ thể nằm trên bề mặt tế bào, đóng vai trò
trung gian hấp thụ cholesterol LDL bằng quá trình nhập nội bào, giúp cho LDL
trong máu đƣợc hấp thu vào gan [23,71]. Protein LDLR bao gồm 860 acid amin
đƣợc sắp xếp trong các vùng "domain" chức năng tƣơng ứng với các exon là: trình
tự tín hiệu ở đuôi amino tận cùng (exon 1), vùng bám với phối tử (exon 2 - 6), vùng
có yếu tố tăng trƣởng biểu bì (exon 7 - 14), vùng liên kết với nhóm đƣờng O (exon
15), vùng xuyên màng (exon 16 và 41 bp của exon 17), vùng tế bào chất (phần còn
lại của exon 17 và exon 18) [50].

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 9


Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình I.5. Các vùng chức năng của thụ thể LDL [7]
I.2.3. Thụ thể LDL
Thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor) là một glycoprotein đƣợc
tìm thấy trên bề mặt tế bào, có nhiệm vụ gắn kết với ApoB - 100 của cholesterol
LDL khi ở trạng thái bình thƣờng. Thụ thể LDL đƣợc tổng hợp ở lƣới nội chất
nhám (Rough Endoplasmic Reticulum, RER) và sau đó đƣợc vận chuyển đến bộ
máy Golgi (Golgi apparatus) để gắn chuỗi carbohydrate tạo thành thụ thể LDL hoàn
chỉnh. Sau đó, thụ thể LDL hoàn chỉnh đƣợc tiếp tục di chuyển và tập trung ở "phần
lõm áo" trên bề mặt tế bào. Tại đây, thụ thể LDL liên kết với các lipoprotein có

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 10

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

chứa ApoB - 100, ApoE hoặc ApoB - 100 và ApoE hình thành phức hợp thụ thể lipoprotein. Sau khi phức hợp thụ thể - lipoprotein đƣợc gắn với nhau, một loại bọc
clathrin đƣợc hình thành nhằm đƣa phức hợp phối tử - thụ thể vào trong nội bào
cùng với các protein khác thông qua tƣơng tác với LDLR adaptor protein 1
(LDLRAP1). Trong tế bào, phức hợp phối tử - thụ thể bị phân tách, cholesterol tự
do đƣợc sử dụng bên trong tế bào và thụ thể LDL đƣợc phục hồi trên màng tế bào
[27].
Cholesterol đƣợc xem nhƣ là "chìa khoá" trong việc điều hoà quá trình tổng
hợp thụ thể LDL. Khi nồng độ cholesterol trong tế bào tăng, quá trình tổng hợp thụ
thể LDL bị ức chế. Ngƣợc lại, khi nồng độ cholesterol trong tế bào giảm, quá trình
tổng hợp thụ thể LDL tăng [27]. Sự điều hòa sản xuất thụ thể LDL trong nhân theo
các con đƣờng: (1) protein Steroid Response Element Binding Protein (SREBP) gắn
kết với Steroid Response Element (SRE) trên DNA kích thích gen LDLR phiên mã
để làm giảm cholesterol nội bào; (2) thụ thể trong nhân trung gian sterol LXR, giúp
tạo ra IDOL (Inducible Degrader of the LDLR) kích hoạt quá trình thoái hoá
cholesterol LDL. Con đƣờng này nhằm đảm bảo sự hấp thu cholesterol LDL trong
máu phù hợp với nhu cầu của cơ thể [27].
I.2.4. Các dạng ảnh hƣởng của gen LDLR đến thụ thể LDL
Đột biến trên gen LDLR là đột biến phổ biến nhất gây bệnh FH, chiếm
khoảng 70 - 80% trƣờng hợp mắc bệnh FH đƣợc chẩn đoán dựa trên các triệu chứng
lâm sàng. Kể từ khi đƣợc phát hiện và nghiên cứu từ năm 1986, số lƣợng đột biến
gen LDLR gia tăng liên tục. Theo cơ sở dữ liệu của Trƣờng Đại học London năm
2008, có tổng cộng 1.066 dạng đột biến trên gen LDLR đƣợc phát hiện bao gồm:
689 dạng đột biến thay thế DNA, 260 dạng đột biến tái sắp xếp DNA nhỏ (<100 bp)
và 117 dạng đột biến tái sắp xếp DNA lớn (>100 bp) [50]. Đột biến trên gen LDLR
đƣợc chia thành 5 nhóm chính [13]:
 Đột biến gen LDLR dẫn đến không tổng hợp đƣợc thụ thể LDL trong lƣới
nội chất: đây là nhóm đột biến phổ biến nhất, chiếm một nửa số lƣợng đột

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

Trang 11