Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai gene mrLSU (nuclear ribosomal large subunit)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG
DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI
VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI
GENE nrLSU (NUCLEAR RIBOSOMAL LARGE SUBUNIT)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. LAO ĐỨC THUẬN
SVTH: TRỊNH HOÀNG LUÂN
MSSV: 1153010446
KHÓA: 2011-2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn khoa Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô
trƣờng Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là thầy Lao Đức Thuận và cô
Lê Huyền Ái Thúy – ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực
nghiệm và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với tất cả tinh thần trách nhiệm và lòng
yêu nghề, đã tạo điều kiện cho em đƣợc học tập tốt, có cơ hội củng cố và phát triển
những bài học mà em đã trau dồi trong bốn năm ngồi trên ghế nhà trƣờng nhằm
trang bị cho em những kiến thức để có thể tự tin bƣớc vào đời.

Trong quá trình làm việc, thời gian tuy ngắn nhƣng đã giúp em có đƣợc những bài
học kinh nghiệm từ thực tế với sự giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô.
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp không tránh khỏi những sai sót, em
kính mong quý thầy cô cùng góp ý, chỉ dẫn thêm để đề tài đƣợc hoàn chỉnh hơn.
Cuối cùng, em xin kính chúc thầy cô trƣờng Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
lời chúc sức khỏe và luôn gặt hái đƣợc nhiều thành công trong cuộc sống.

Bình Dƣơng, tháng 05 năm 2015
SINH VIÊN

Trịnh Hoàng Luân

Trang i


DANH MỤC VIẾT TẮT

ATP

: Adenosine triphosphate

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

bp

: base-pair

nu

: nucleotide

DNA

: deoxyribonucleotide triphosphate

RNA

: ribonucleic acid

LSU

: large subunit

rDNA

: ribosomal DNA

rRNA

: ribosomal RNA

Trang ii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ...........................................................15
Bảng 2.2. Các thông số thiết lập cho chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR để khuếch
đại các vùng gene nrLSU ........................................................................................... 22

Bảng 3.1. Kiểm tra cặp mồi với các thông số vật lý trên IDT ...................................25
Bảng 3.2. Kết quả đo OD mẫu DL0038A và DL0038B đƣợc tách chiết theo phƣơng
pháp phenol/chlloroform có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB ......................... 29
Bảng 3.3. Chiều dài trình tự hai mẫu DL0038A, DL0038B trƣớc và sau khi hiệu
chỉnh............................................................................................................................38
Bảng 3.4. Hình ảnh cấu trúc bậc hai của mẫu DL0038A, DL0038B và một số mẫu
nấm khác ..................................................................................................................... 44
Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả định danh hai mẫu nấm DL0038A và DL0038B ........ 47

Trang iii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cordyceps sinensis, một loài nấm kí sinh côn trùng ...................................3
Hình 1.2. Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự nrLSU ...................................9
Hình 2.1. Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038A ..................................................18
Hình 2.2. Hình thái giải phẫu mấm nấm DL0038B...................................................19
Hình 3.1. Kiểm tra mồi bằng BLAST trên NCBI ......................................................26
Hình 3.2. Vị trí mồi xuôi LR05 đƣợc sắp gióng cột với các trình tự dữ liệu ............27
Hình 3.3. Vị trí mồi ngƣợc LR5 đƣợc sắp gióng cột với các trình tự dữ liệu ...........27
Hình 3.4. Kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 với Cordyceps Takaomontana...................28
Hình 3.5. Hình điện di cho phản ứng PCR mẫu DL0038A, DL0038B .................... 29
Hình 3.6. Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038A ...................................................30
Hình 3.7. Hiệu chỉnh trên mạch R mẫu DL0038A ....................................................31
Hình 3.8. Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038A ....................................................32
Hình 3.9. Kết quả hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A trên NCBI - BLAST ............33
Hình 3.10. Hiệu chỉnh cuối mạch R mẫu DL0038B .................................................34
Hình 3.11. Hiệu chỉnh trên mạch R mẫu DL0038B ..................................................35
Hình 3.12. Hiệu chỉnh đầu mạch R mẫu DL0038B...................................................36
Hình 3.13. Kết quả hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B trên NCBI - BLAST ..........37

Hình 3.14. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp
Maximum Likelihood với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần ..........................40
Hình 3.15. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp
Neighbor-Joining với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần .................................41
Hình 3.16. Cây phả hệ phân tử gen nrLSU đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp
Maximum Parsimony với bộ cơ sở dữ liệu với bootstrap 1000 lần ..........................42

Trang iv


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ..............................................................................................................1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1. CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG ...........................................................2
1.1. Đặc điểm chung và thành phần loài ...................................................2
1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ......................................................4
1.3. Tiềm năng ứng dụng ..........................................................................6
2. GENE Nuclear ribosomal large subunits (nrLSU) ..................................................8
3. PHẢ HỆ PHÂN TỬ .................................................................................................9
4. CẤU TRÚC THỨ CẤP..........................................................................................11
5. PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ ......................................................................13
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. CẶP MỒI SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ...................................................15
2. DANH MỤC CÁC PHẦN MỀM SỬ DỤNG .......................................................15
3. TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU ...............................................................................17
4. VẬT LIỆU ..............................................................................................................18
4.1. Dụng cụ và thiết bị ...........................................................................19
4.2. Hóa chất ............................................................................................20
5. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA BỘ GENE .....................................................21
6. PHẢN ỨNG PCR ...................................................................................................22

6.1. Thành phần phản ứng PCR ..............................................................22
6.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .....................................................22
6.3. Điện di ..............................................................................................22
6.4. Giải trình tự ......................................................................................23

Trang v


7. HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ .....................................................................................23
8. XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI
BẰNG PHẦN MỀM MEGA 6.0 ...........................................................................23
9. DỰ ĐOÁN VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BẬC HAI ...........................................24
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1. PHÂN TÍCH MỒI ..................................................................................................15
2. KẾT QUẢ ĐO OD Ở BƢỚC SÓNG 260nm VÀ 280nm .....................................29
3. PCR VÀ ĐIỆN DI GENE nrLSU: .........................................................................29
4. HIỆU CHỈNH .........................................................................................................30
4.1. Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038A .................................................30
4.2. Hiệu chỉnh mạch R mẫu DL0038B .................................................34
5. CÂY PHÁT SINH LOÀI .......................................................................................39
6. CẤU TRÚC BẬC 2 ................................................................................................43
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................50

Trang vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc định danh dựa trên công cụ sinh học phân tử là công cụ đắc lực
trong việc hỗ trợ định danh hình thái. Thông qua việc xây dựng cây phả hệ phân tử,

các nhà nghiên cứu có thể dựa vào các chỉ tiêu nhƣ địa hình học (Topology), giá trị
bootstrap, sự phân nhóm để lý giải mối tƣơng quan của các đối tƣợng trên cây, kết
hợp với các dữ kiện hình thái, giải phẫu học nhằm định danh chính xác các đối
tƣợng quan tâm. Theo Vilgalys và cs, gene nrLSU là một trong những vùng gene
mục tiêu đƣợc ứng dụng trong việc phân tích và xây dựng cây phả hệ để hỗ trợ
trong công tác định danh. Trình tự nrLSU là vùng gene mã hóa RNA 25S-28S của
ribosome (tiểu phần lớn của ribosome). Vùng gene này chứa nhiều thông tin di
truyền có tính bảo tồn cao, đƣợc biết rộng rãi trên thế giới và có khả năng thiết kế
đƣợc cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự của nhiều loài nấm. Cặp mồi
LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát đƣợc sử dụng nhiều trong nhiều nghiên cứu phả hệ
phân tử nấm trong những năm gần đây. Cặp mồi này đƣợc thiết kế để khuếch đại
vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300bp (Sonnenberg và cs,
2007). Vùng D1, D2 là những domain khác nhau nằm trên vùng gene nrLSU có khả
năng giải quyết việc định danh những loài có mối liên quan rất gần gũi với nhau bởi
các domain này chứa nhiều thông tin di truyền, có tính biến động. Và trong khuôn
khổ đề tài, chúng tôi tập trung vào việc định danh hai mẫu nấm ký sinh côn trùng
(DL0038A, DL0038B) dựa trên phân tích phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai
gene nrLSU (sử dụng phần mềm dự đoán cấu trúc Mfold) (Zuker, 2003) với các
thông số thiết yếu nhƣ nồng độ Na+= 0,05M; Mg2+ = 0,00M, nhiệt độ mặc định cho
quá trình tính toán năng lƣợng tiêu hao trong quá trình gấp cuộn (tạo cấu trúc bậc 2)
là 25oC.

Trang 1


PHẦN 1: TỔNG QUAN


1. CÁC LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG
1.1. Đặc điểm chung và thành phần loài

Cordyceps là một chi nấm ký sinh trên côn trùng (Kobayashi, 1982; Spatafora
& Blackwell, 1993) thuộc họ Clavicipitaceae, ngành nấm túi Ascomycota. Điểm nổi
bật của nấm ký sinh côn trùng là những giá trị y dƣợc tiềm năng và quý hiếm. Điển
hình là Cordyceps sinensis, một loại nấm dƣợc liệu quý hiếm, đƣợc ứng dụng nhiều
trong nền tảng y học Trung Quốc trong nhiều thế kỷ. Ở mỗi quốc gia khác nhau
Cordyceps sinensis có nhiều tên gọi khác nhau chẳng hạn nhƣ DongChongXiaCao
(Trung Quốc), Tockukaso (Nhật Bản) đều có nghĩa là Đông trùng hạ thảo (Choi,
1999). Trong tự nhiên, Cordyceps phân bố chủ yếu ở các vùng núi có độ cao từ
3.500 đến 5.000m so với mặt nƣớc biển, chẳng hạn nhƣ cao nguyên Himalaya, Tây
Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam… Do đó Cordyceps luôn luôn là
một dƣợc liệu quý hiếm và có giá trị dƣợc lý cao trong kho tàng dƣợc liệu dân gian
(Nguyễn Lân Dũng, 2005).
Cordyceps nội ký sinh trên ấu trùng và cả trên cá thể trƣởng thành của nhiều
loài côn trùng khác nhau. Quả thể nấm có dạng hình trụ, có thể phân nhánh hay có
hình dạng phức tạp. Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, bào tử nấm sẽ nảy
mầm và phát triển thành hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm xâm chiếm và thay thế các mô vật
chủ và sẽ hình thành quả thể khi gặp điều kiện thích hợp. Do vậy, quả thể của
Cordyceps thƣờng đƣợc tìm thấy trên xác nhộng hoặc ấu trùng của côn trùng sau
một thời gian nhiễm nấm [18].
Về thành phần loài, hơn 400 loài Cordyceps (Sung và cs, 2007) đã đƣợc mô tả.
Phần lớn các công bố đến từ các quốc gia thuộc vùng châu Á, trong đó nổi bật hơn
cả là các nƣớc Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc.

Trang 2


Hình 1.1. Cordyceps sinensis, một loài nấm kí sinh côn trùng
(Nguồn: />Phân loại khoa học:
Giới (Kingdom):

Fungi

Phân giới (Subkingdom):

Dikarya

Ngành (Phylum):

Ascomycota

Phân ngành (Subphylum): Pezizomycotina
Lớp (Class):

Sordariomycetes

Phân lớp (Subclass):

Hypocreomycetidae

Bộ (Order):

Hypocreales

Họ (Family):

Clavicipitaceae

Chi (Genus):

Cordyceps

Năm 2007, Sung và cộng sự đã sắp xếp lại hệ thống nhóm nấm Cordyceps và
Clavicipitaceae, kết quả phân loại thành ba họ đơn ngành: Clavicipitaceae s.s.
(Clavicipitaceae

lớp

A),

Cordycipitaceae

(Clavicipitaceae

lớp

B)

và

Ophiocordycipitaceae (Clavicipitaceae lớp C) (Sung và cs, 2007a, 2007b; Spatafora

Trang 3


và cs, 2007). Việc phân loại phát sinh loài hiện tại của nấm Hypocreleales (Sung và
cs, 2007) nhƣ sau:
Clavicipitaceae s.s: Conoideocrella, Hypocrella, Metacordyceps, Moelleriella,
Orbiocrella, Regiocrella, Samuelsia, Shimizuomyces, Villosiclava …
Ophiocordycipitaceae: Cordyceps s.l., Elaphocordyceps, Ophiocordyceps…
Cordycipitaceae: Ascopolyporus, Cordyceps, Hyperdermium, Torrubiella …

Chi Cordyceps Fr. (Clavicipitaceae, Hypocreales, Ascomycota) gần đây đã đƣợc
chia thành 3 họ Clavicipitaceae, Ophiocordycipitaceae, Cordycipitaceae và 4 chi là
Metacordyceps, Elaphocordyceps, Ophiocordyceps và Cordyceps (Sung và cs,
2007).
1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung liên quan đến việc
thu nhận, khảo sát dƣợc tính của các hợp chất thu nhận các loài Cordyceps, tuy
nhiên các nghiên cứu về thành phần loài vẫn chƣa đƣợc quan tâm. Do vậy, cho đến
nay vẫn chƣa có một công bố đầy đủ nào về thành phần loài của chi nấm này. Sự
thiếu thông tin về thành phần loài làm cho khả năng khai thác các loài nấm trong
nƣớc ứng dụng trong nghiên cứu, xây dựng quy trình nuôi trồng nấm và sản xuất
dƣợc liệu gặp nhiều trở ngại. Tại Việt Nam, những nghiên cứu về thành phần loài
nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc công bố vào những năm 1996 và 2001 có 3 loài nấm
thuộc chi Cordyceps, đó là Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris và Cordyceps
sabrolifera [10] và 2 loài mới đƣợc phát hiện mới cho khu hệ nấm Việt Nam đó là
Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii [14].
Vào năm 2005, Phạm Thị Vƣợng (Viện Bảo vệ Thực vật) và Lƣơng Văn Hà
(Vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng) cùng với các nhà nấm học trƣờng Đại học Quốc gia
Kangwon, Hàn Quốc tiến hành điều tra nhóm nấm ký sinh côn trùng tại vƣờn quốc
gia Cúc Phƣơng. Nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp so sánh hình thái giải phẫu để

Trang 4


phân loại. Kết quả công bố có các loài Cordyceps sp., C. nutans, C. pruinosa, C.
Specocephala, Beauveria bassiana, Beauveria sp., Gibellalus sp., Paecilomyces sp.
Năm 2006, nhóm các nhà nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng của BIOTEC,
Thái Lan đã kết hợp với Viện Sinh học Nhiệt đới khảo sát nhóm nấm này trong
vƣờn quốc gia Cát Tiên. Kết quả công bố vào năm 2007 cho biết họ đã thu đƣợc
tổng cộng 259 mẫu nấm. Sơ bộ định danh bằng hình thái dựa trên hệ thống phân

loại mới cho thấy có tổng cộng 41 loài đƣợc ghi nhận thuộc 17 chi bao gồm
Akanthomyces, Aschersonia, Beauveria, Conoideocrella, Cordyceps, Gibellula,
Hirsutella,

Hymenostilbe,

Hypocrella,

Isaria,

Metarhizium,

Moelleriella,

Nomuraea, Ophiocordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticillium. Tuy nhiên,
trong số này chỉ ghi nhận có 1 loài thuộc chi Cordyceps và 2 loài thuộc chi
Ophiocordyceps (Lê Tấn Hƣng và cs, 2010).
Năm 2009, lần đầu tiên ở Việt Nam, Đái Duy Ban cùng các nhà khoa học uy
tín đã tìm ra và nhân nuôi thành công Đông Trùng Hạ Thảo với công trình “Nghiên
cứu phát hiện mới loài đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae ở Việt Nam và xác
định một số hoạt chất sinh học trong đông trùng hạ thảo”.
Năm 2010, nhóm tác giả Trƣơng Bình Nguyên và cs, đã nghiên cứu phát hiện
các chủng nấm Cordyceps bản địa tại vùng cao nguyên Langbian, Lâm Đồng và
khảo sát đƣợc một số hoạt tính sinh học của các loài nấm này.
Năm 2012, sau bốn năm nghiên cứu, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm
Nông lâm nghiệp Lâm Đồng đã hoàn thiện quy trình nghiên cứu, sản xuất loại nấm
đông trùng hạ thảo dâu tằm (Paeclomyces tenuipes hay Cordyceps takaomontana).
Đây cũng là lần đầu tiên Việt Nam đã hoàn tất quy trình hoàn chỉnh về sản xuất
đông trùng hạ thảo trên con tằm, một loại côn trùng đƣợc ngƣời dân nuôi từ rất lâu
đời và với quy trình này có thể sản xuất đại trà loại dƣợc liệu quý này ngay trên đất

Lâm Đồng.

Trang 5


Năm 2014, nhóm tác giả Đinh Minh Hiệp và cs, đã định danh một số loài nấm
ký sinh côn trùng bằng việc phân tích phân tử vùng ITS1 -5.8S –ITS2 dựa vào kết
quả phát sinh chủng loài và cấu trúc bậc hai. Đề tài đặc biệt nhận giải và hỗ trợ kinh
phí từ Sở Khoa Học và Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
1.3. Tiềm năng ứng dụng
Ở Việt Nam, đông trùng hạ thảo cũng đã đƣợc sử dụng làm dƣợc liệu từ rất
lâu. Đông trùng hạ thảo có một phạm vi ứng dụng rộng, tác dụng hiệu quả trên
nhiều bệnh của con ngƣời nhƣ các bệnh về gan, thận, tim mạch, miễn dịch, thần
kinh và các hoạt tính kháng ung thƣ (Wang & Shiao, 2000). Có thể kể đến một vài
nghiên cứu nhƣ: khả năng điều hoà đáp ứng miễn dịch [31], ức chế sự phát triển của
tế bào khối u [5] gia tăng chức năng gan [38], thúc đẩy việc tiết ra các hormone
tuyến thƣợng thận [56] giảm huyết áp và sự căng cơ (Chou và cs, 2000) điều hòa
đƣờng máu [31]…
Khi các nhà khoa học mở rộng nghiên cứu trên những loài nấm khác trong họ
Clavicipitaceae, các kết quả cho thấy nhiều loài ngoài C. sinensis cũng có những
hoạt tính tƣơng tự. Tiêu biểu nhƣ cordycepin là thành phần chính trong C. sinensis một chất co hoạt tính sinh học trong Cordyceps – phân lập từ C. militaris có cấu
trúc tƣơng tự nhƣ của C.sinensis nhƣng với lƣợng cao hơn (Li và cs, 1995), điều
hoà miễn dịch của C. cicadae (Weng và cs, 2002) và Paecilomyces japonica (Shin
và cs, 2003), khả năng kháng ung thƣ của alkali-soluble polysaccharide thu từ C.
phioglossoides (Yanada, 1984), hạn chế các yếu tố trung gian gây viêm bằng việc
ngăn cản sự hoạt hoá NF-kB từ C. pruinosa (Kim và cs, 2003), hay tác dụng kháng
Ca2+ và chống co thắt cơ tim của loài nấm này (Furuya và cs, 1983), khả năng gây
độc tế bào để chống tế bào ung thƣ của Paecilomyces tenuipes (Shim và cs, 2000;
Ban và cs, 1998)...
Các thành phần có hoạt tính của Cordyceps thƣờng có bản chất là các

nucleoside, polysaccharide, protein, sterol... [18]. Các chất này thƣờng đƣợc phân
lập từ hệ sợi hay quả thể.
Trang 6


Các nucleoside đã đƣợc phân lập từ Cordyseps bao gồm adenin, adenosine,
uracil, uridine, guanidine, guanosine, hypoxanthin, inosine, thymine, thymidine,
deoxyuridine, đặc biệt là cordycepin (3’- deoxyadenosine). Cordycepin đƣợc nghiên
cứu và phân lập từ C.militaris từ năm 1964 (Kaczka và cs, 1964; Melling và cs,
1972) có tác dụng kháng ung thƣ (Wang và cs, 2008), ngăn cản quá trình tổng hợp
RNA của tế bào HeLa (Siev và cs, 1969), ức chế tổng hợp protein và sự bám dính tế
bào (Wong và cs, 2010)...
Các polysaccharide hay những hợp chất có nguồn gốc từ đƣờng của
Cordyceps bao gồm d-mannitol (cordycepic acid), beta-glucan, beta-mannan và một
số các polysaccharide phức tạp kết hợp nhiều loại phân tử đƣờng khác nhau. Các
polysaccharide có khả năng chống ung thƣ nhƣng không tấn công trực tiếp mà gián
tiếp bằng việc kích hoạt các hệ thống miễn dịch khác nhau (Wasser, 2002). Bên
cạnh đó, chúng còn có khả năng giảm lƣợng đƣờng trong máu (Kiho và cs, 2000).
Các sterol trong Cordyceps đƣợc tìm thấy gồm: ergosterol, delta-3 ergosterol,
ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol, campesterol... Ergosterol tìm thấy
trong hệ sợi và có ƣu thế trong nấm. Dạng glycosyl hoá của ergosterol peroxide có
tác dụng ức chế sự tăng sinh các dòng tế bào ung thƣ K562, Jurkat, WM-1341, HL60 và RPMI-8226 (Bok và cs, 1998). Các protein, peptide, polyamine, các amino
acid và một số các dipeptide vòng của Cordyceps cũng có hoạt tính chống ung thƣ
và tiềm năng miễn dịch. Đặc biệt, cyclosporine – một loại peptide vòng- phân lập từ
Tolypocladium inflatum (thể vô tính của C. subsessilis) đã đƣợc sử dụng phổ biến
với vai trò là một chất ức chế miễn dịch hiệu quả cho các trường hợp cấy ghép vật
liệu hay cơ quan.

Trang 7

2. GENE Nuclear ribosomal large subunits (nrLSU)
Trong nghiên cứu định danh về sinh học phân tử, nhóm nấm ký sinh côn trùng
hay ở nhiều loài sinh vật khác thì việc lựa chọn trình tự DNA là vô cùng quan trọng.
Đòi hỏi trình tự DNA phải có tính bảo tồn cao trong cùng một loài và biến động lớn
giữa các loài khác nhau. Các gene RNA ribosome khuếch đại bằng mồi phổ quát, có
tính bảo tồn cao cho phép phân loại vƣợt mức độ loài [47]. Ngoài ra, dựa vào các
vùng bảo tồn của gene rRNA có thể thiết kế các cặp mồi phổ quát (universal primer)
sử dụng khếch đại trình tự của vùng gene rDNA từ nhiều loài trong định danh sinh
học phân tử.
rDNA bao gồm nhiều đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp lại bao gồm vùng ITS
(intergenic transcribed spacer), vùng 18S, 5.8S, 25-28S, 5S RNA và vùng IGS
(intergenic spacer). Trong đó vùng 18S-28S là vùng phiên mã chính (Vilgalys,
2004), vùng 18S hình thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU), vùng 28S, 5.8S và 5S hình
thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome RNA.
Từ lâu các vùng gene mã hóa RNA của ribosome (nrSSU, nrLSU) từ lâu đã
đƣợc sử dụng làm vùng gene mục tiêu trong nghiên cứu. Trình tự nrLSU-rRNA là
vùng gene mã hóa 25S 28S RNA của ribosome (tiểu phần lớn của ribosome). Cấu
trúc của nrLSU-rRNA ngoài những vùng bảo tồn còn có những vùng biến động gọi
là domain D1/D2/D3 (D-divergence region, các số đƣợc đánh thứ tự 1, 2, 3.. bắt đầu
từ đầu 5’-3’) [47]. Các domain khác nhau của 25-28S rDNA (tiểu phần lớn LSU)
chứa nhiều thông tin cho phép so sánh các cấp phân loại từ cao xuống đến cấp độ
loài. Đặc biệt, vùng DNA D1/D2 mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome gần đây
đƣợc xem là rất hữu ích cho việc phân loại phần lớn các loài nấm có giá trị y dƣợc
[47].

Trang 8


Hình 1.2. Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự nrLSU [62]

3. PHẢ HỆ PHÂN TỬ
Phân tích phát sinh chủng loài là nghiên cứu, phân tích, dự đoán về các mối
quan hệ tiến hóa. Kết quả phân tích này thƣờng đƣợc mô tả bằng cây phát sinh loài
(Phylogenetic tree). Cây phát sinh loài tập hợp nhiều loài đƣợc dự đoán có cùng
một tổ tiên chung và đƣợc phân ra nhiều nhánh thƣờng đƣợc gọi là clade. Mỗi clade
đại diện cho một nhóm loài có những đặc điểm hình thái hay gene tƣơng đồng nhau.
Trong một cây phát sinh loài thƣờng phải đảm bảo đầy đủ các thành phần:
-

Nhánh (clade) là đơn vị phân loại đơn ngành, thƣờng nhóm các sinh vật hoặc
các gene bao gồm tổ tiên chung gần nhất.

-

Taxon – đơn vị phân loài bất cứ nhóm nào mà không cùng một nhánh, taxon
đại diện cho các đối tƣợng đang nghiên cứu, có thể là loài, trình tự gene,
trình tự protein…

-

Node (nút) là một điểm cho nhánh phân nhánh, đại diện cho tổ tiên chung.
Để xây dựng cây phát sinh loài, hiện nay với sự phát triển của khoa học công

nghệ kết hợp với thuật giải máy tính, đã có rất nhiều chƣơng trình máy tính thiết kế,
xây dựng dựa trên các thuật toán khác nhau để xây dựng cây phát sinh loài (Saitou,
Trang 9


1996; Li, 1997; Swofford và cs, 1996). Một số phần mềm sử dụng hiện nay nhƣ:

PAUP*, MEGA6, PHYLIP…
Marsimum Parsimony (MP) là cây tiến hóa tốt nhất để mô tả tiến trình tiến
hóa, cây mô tả đƣợc các loài ít thay đổi nhất (tức ít đột biến nhất), cây vì thế có
điểm thấp nhất (hà tiện) theo một tiêu chuẩn định s n [30]. Nguyên lý của phƣơng
pháp Maximum Parsimony là tìm kiếm một cây sao cho số lƣợng thay đổi tiến hóa
là thấp nhất để giải thích những sự khác nhau đƣợc nhìn thấy qua các đơn vị phân
loại hiện hữu OTUs (operational taxanomic unit). Cây sẽ tính điểm thấp nhất (điểm
hà tiện) nên thông thƣờng phƣơng pháp parsimony sẽ chọn cây có tổng chiều dài
nhỏ nhất [33].
Neighbour Joining (NJ) là một trong những phƣơng pháp xây dựng cây tiến
hóa với ít nhánh nhất. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là tìm ra thứ tự các nhóm
hàng xóm (neighbour) hợp lý nhất làm giảm tổng chiều dài của cây tiến hóa. Mô
hình tiến hóa là một hàm hiện nên một trong số mô hình tiến hóa đƣợc chọn để tính
toán khoảng cách di truyền giữa từng cặp taxa từ đó cho ra một ma trận khoảng
cách giữa tất cả các taxa. Do phƣơng pháp Neighbour Joining là một trong những
phƣơng pháp nhanh nhất để dò tìm cây tiến hóa nên nó thƣờng đƣợc sử dụng để
phân tích khối dữ liệu lớn với nhiều taxa. Cây Neighbour Joining là cây không có
gốc nên chỉ cho biết mối quan hệ giữa các nhánh [33].
Maximum Likelihood (ML) có mô hình tiến hóa là hàm hiện.Nhóm phƣơng
pháp này dựa trên một hàm toán học tính toán xác suất khả năng một cây tiến hóa
đƣợc tạo thành từ dữ liệu đã quan sát. Hàm này cho phép việc tích hợp các quá trình
tiến hóa của đặc tính thành mô hình xác suất. Phƣơng pháp hợp lý cực đại chọn lựa
cây tiến hóa tối đa mà khi quan sát các dữ liệu dƣới một mô hình nào đó có xác xuất
tối đa [30]. Ứng với mỗi mô hình, phƣơng pháp này sẽ tính toán khả năng xác suất
dƣới dạng lnL mà một cây tiến hóa có thể có từ chuỗi trình tự phân tích. Cây tiến
hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng đƣợc chọn [33].

Trang 10

Mô hình tiến hóa phức tạp nhất hiện nay là mô hình có khả năng hồi biến tổng
quát theo thời gian (General time reverible model). Mô hình này cho rằng có 6 kiểu
biến đổi và trong đó mỗi kiểu biến đổi có một tốc độ khác nhau. Một vài mô hình
tiến hóa ngẫu nhiên phổ biến gồm Jukes-Cantor, Kimura 2-parameter (K2P),
Tamura 3-parameter, Hasegawa-Kishino-Yano (HKY), Tamura Nei, General Time
Reversible (GTR)…
Hiện nay, một trong các phƣơng pháp đánh giá cây phả hệ phân tử là phân tích
chỉ số bootstrap. Chỉ số bootstrap là tần số xuất hiện của một nhóm (cluster) trên số
lần giản đồ đƣợc thiết lập, đơn vị tính là % (phần trăm). Theo Felsenstein năm
1985, bootstrap là một công cụ hỗ trợ cho việc xây dựng cây phát sinh loài [28]. Chỉ
số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự gần gũi các thành viên của nhóm của cây phả
hệ. Phân tính bootstrap là một phƣơng pháp thống kê để có đƣợc sự ƣớc tính về các
lỗi sai sót khi dựng cây. Phân tích bootstrap thƣờng dùng để kiểm tra độ tin cậy một
cây, cụ thể là đánh giá độ tin cậy của sự phân nhóm loài trên một cây. Phân tích này
thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra các taxa đƣợc nhóm thành cụm nhƣ thế nào dựa
vào các trình tự nucleotide hay acid amin làm mẫu phụ [60]. Ƣu điểm của phƣơng
pháp bootstrap là nó có thể áp dụng cho tất cả các phƣơng pháp dựng cây cơ bản.
Khi giá trị bootstrap ≥75% thì thể hiện tính tƣơng đồng của loài cao, và khi ≥95%
thể hiện mức độ tƣơng đồng và độ tin cậy càng cao.

4. CẤU TRÚC THỨ CẤP
Cấu trúc thứ cấp của một phân tử acid nucleic đề cập đến sự bắt cặp tƣơng tác
của một phân tử và các phân tử, có thể đƣợc biểu diễn nhƣ là một chuỗi phân tử
acid nucleic [9]. Cấu trúc thứ cấp của DNA và RNA khác nhau: DNA chủ yếu tồn
tại ở dạng bắt cặp hoàn toàn và kết hợp xoắn kép, trong khi RNA thƣờng có dạng
bắt cặp phức tạp do tăng khả năng của nó để tạo thành liên kết hydro bắt nguồn từ
các hydroxyl nhóm phụ trong đƣờng ribose.
Trong chuỗi DNA hoặc RNA, 2 mạch bổ sung đối diện nhau đƣợc kết nối
thông qua liên kết hydro đƣợc gọi là base pair (viết tắt bp). Theo Watson-Crick cơ
Trang 11

sở bắt cặp đƣợc nghiên cứu là: adenine (A) bắt cặp với thymine (T) và guanine (G)
bắt cặp với cytosine (C) trong DNA.
Ở RNA, thymine (T) đƣợc thay thế bởi uracil (U). Một số trình tự DNA- hoặc
enzyme RNA- có thể nhận ra mẫu cặp base cụ thể mà xác định vùng đặc biệt của
gen. Liên kết hidro là cơ chế hóa học cho các quy tắc cơ bản của sự bắt cặp mô tả ở
trên. DNA có %GC cao là ổn định hơn so với DNA có %GC thấp, và sự tƣơng tác
của các liên kết hydro càng cao thì thì chuỗi DNA càng ổn định [45]. Các chuỗi
xoắn kép có vai trò quan trọng trong cấu trúc bậc hai của các phân tử axit
nucleic. Một chuỗi xoắn kép đƣợc hình thành bởi các đoạn chứa nhiều cặp bazơ liên
tiếp. Các axit nucleic xoắn kép là một chuỗi polymer xoắn ốc, có chứa hai mạch bổ
sung nucleotide bắt cặp với nhau [4]. Hầu hết các phƣơng pháp dự đoán cấu trúc
thứ cấp dựa trên một mô hình năng lƣợng tƣơng đồng với nhau [39]. Đối với nhiều
phân tử RNA, cấu trúc thứ cấp rất quan trọng đối với chức năng chính xác của
RNA.
Cấu trúc thứ cấp thƣờng có thể dự đoán đƣợc và phân tích mà không cần sự
tƣơng đoán cấu trúc bậc 3. Có ba kỹ thuật dung để dự đoán cấu trúc thứ cấp:
-

Đầu tiên là dựa vào các chƣơng trình, phần mềm Tin- Sinh học để phân tích
khả năng bắt cặp.

-

Thứ hai là dựa vào mức năng lƣợng tự do (∆G) và nguyên lý của nhiệt động
học để dự đoán cấu trúc bậc hai.

-

Xây dựng cây phát sinh chủng loài là yếu tố thứ ba, dựa vào các trình tự có
chức năng phân tử tƣơng đồng và liên quan về mặt cấu trúc.
Trong quá trình phân tích phả hệ phân tử, sự khác biệt một hay một vài

nucleotide giữa các trình tự không cho phép xác định rõ ràng ranh giới về loài, trong
khi đó, sự khác biệt một vài nucleotide sẽ ảnh hƣởng đến mức năng lƣợng tạo thành
cấu trúc bậc hai (secondary structure) của trình tự đó và từ đó ảnh hƣởng đến kiểu
cấu trúc bậc hai [58]. Ở Việt Nam, Đinh Minh Hiệp và cs đã dựa trên bộ dữ liệu ITS
Trang 12


tốt nhất sau khi hiệu chỉnh tiến hành phân tích phát sinh chủng loài cũng nhƣ dự
đoán cấu trúc bậc hai vùng ITS. Kết quả định danh hình thái kết hợp với kết quả dự
đoán cấu trúc bậc hai đã xác định chính xác những mẫu nấm thuộc chi Cordyceps
trong bộ sƣu tập nấm [2].

5. PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ
Giải trình tự (sequencing – kỹ thuật xác định một phần hay toàn bộ trình tự
nucleic acid của phân tử DNA) đƣợc nghiên cứu từ thập niên 70 của thế kỉ XX.
Phƣơng pháp này đã những ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong dự đoán chức năng
gene, các nghiên cứu nhân dòng phân tử hay các mối liên hệ tiến hóa, đa dạng sinh
học cho công nghệ sinh học phân tử và công nghệ sinh học nói chung. Vào năm
1990, dự án Bộ gene ngƣời đƣợc triển khai và hoàn thành 13 năm sau đó, sớm hơn
dự tính 2 năm. Dự án này đem lại một lƣợng dữ liệu lớn cho bộ gene ngƣời nhờ
phƣơng pháp giải trình tự.
Trong lĩnh vực định danh phân tử, nghiên cứu phát sinh loài… thì chỉ cần
phân tích xác định trình tự một vùng biến động giữa các loài cần khảo sát mà không
cần thiết phải xác định toàn bộ trình tự bộ gene. Từ hai phƣơng pháp giải trình tự
chính là phƣơng pháp hóa học của Maxam-Gillbert và enzyme học của Sanger
(1977), các kỹ thuật giải trình tự dần đƣợc cải tiến cho đến ngày nay. Mặc dù có

nhiều sự khác biệt giữa các phƣơng pháp, nhƣng cơ bản vẫn là thực hiện các phản
ứng (dùng các tác nhân hóa học hay enzyme xúc tác…) tạo ra tập hợp các đoạn
oligonucleotide có chiều dài khác nhau mà nucleotide tận cùng các đoạn này có thể
xác định đƣợc,sau đó phân tách các đoạn oligonucleotide bằng điện di trên gel
polyacrylamide (PAGE) hay điện di mao quản (capillary electrophoresis) và xác
định trình tự dựa trên tín hiệu huỳnh quang hay đánh dấu phóng xạ [55].
Phƣơng pháp enzyme học (phƣơng pháp Sanger) tiến hành phản ứng tổng hợp
các phân tử DNA với một hàm lƣợng nhỏ dẫn xuất dideoxy của các nucleotide
(dideoxynucleotide triphosphate, ddNTP). Các nucleotide dẫn xuất này bị khử mất
thêm một nhóm OH nên phản ứng polymerase không tiếp tục mà kết thúc tại
Trang 13


nucleotide đó. Nhƣ vậy, tất cả các phân tử đƣợc tạo ra trong phản ứng đó đều mang
đuôi là A, nếu ddNTP trộn vào là ddATP, tƣơng tự nhƣ vậy là T,C hoặc G khi trộn
ddTTP, ddCTP hoặc ddGTP.

Trang 14


PHẦN 2. VẬT LIỆU
VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU


1.

CẶP MỒI SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu

phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây. Cặp mồi này đƣợc thiết kế để
khuếch đại vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300 bp [38]. Vùng
D1, D2 là những domain khác nhau nằm trên vùng gen nrLSU có khả năng giải
quyết việc định danh những loài có mối liên quan rất gần gũi với nhau bởi các
domain này chứa nhiều thông tin di truyền, có tính biến động.
Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Ký

Mồi

hiệu
LR0R

Mồi
xuôi
Mồi

LR5

ngƣợc

Trình tự

5’ – GTACCCGCTGAACTTAAGC – 3’

5’ – ATCCTGAGGGAAATTC – 3’

Nguồn tài liệu
Vilgalys and Sun
(1994)

Vilgalys and Sun
(1994)

2. DANH MỤC CÁC PHẦN MỀM SỬ DỤNG:
 Annhyb: phiên bản 4.946 (Olivier Friard, 2012) là phần mềm miễn phí giúp
làm việc và quản lý các trình tự nucleotide dƣới nhiều định dạng.
 Clustalw2: là một phần mềm miễn phí (giao diện window) dùng cho việc so
sánh sự tƣơng đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học.
 SeaView: phiên bản 4.2.12 (Manolo Gouy). Sea View là phần mềm miễn phí
có các tính năng hỗ trợ cho các phân tích tƣơng đồng, sắp gióng cột các trình
tự.
 Chromas Lite: phiên bản 2.1.1 chƣơng trình miễn phí dùng để hiệu chỉnh
trình tự.

Trang 15


 MEGA: phiên bản 6.06 (Kumar, 2013). Phần mềm miễn phí dùng để xây
dựng cây phát sinh loài theo các phƣơng pháp Maximum Parsimony,
Maximum Likelihood, Neighbor-Joining.
 Mfold: phiên bản 3.1 (Zuker, 2013). Phần mềm trực tuyến dùng để dự đoán
cấu trúc bậc hai:

Trang 16