Phát triển kỹ thuật MSP nhằm phát hiện methyl hóa bất thường gen rassf1a hướng đến hỗ trợ chẩn đoán ung thư vòm họng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MSP NHẰM PHÁT
HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN
RASSF1A HƯỚNG ĐẾN HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN
SỚM UNG THƯ VÒM HỌNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS. LAO ĐỨC THUẬN
SVTH: NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT
MSSV: 1153010962
Khóa: 2011-2015
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành đối với PGS. TS. Lê Huyền Ái
Thúy, người luôn đầy nhiệt huyết với khoa học đã truyền cho em ngọn lửa đam mê
trong nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Lao Đức Thuận, người thầy đã luôn tận tình hướng
dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em chân thành cảm ơn ThS.Trương Kim Phượng cũng đã truyền đạt cho em nhiều
kinh nghiệm đáng quý trong suốt thời gian vừa qua.

Tôi cũng xin cảm ơn các thành viên trong phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử Trường ĐH Mở TP.HCM đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã luôn yêu thương, chăm
sóc, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 5, năm 2015

Nguyễn Thị Yến Tuyết

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang ii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế epigenetics bao gồm hiện tượng methyl hóa DNA, biến đổi
histone và micro-RNA
Hình 1.2. Cơ chế biến đổi epgenetics gây im lặng gen
Hình 1.3. Cơ chế methyl hóa DNA
Hình 1.4. Sự methyl hóa DNA trong ung thư
Hình 1.5. Mô hình methyl hóa DNA
Hình 1.6. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong của các loại ung thư tại Việt Nam
Hình 1.7. Giải phẫu vùng hầu họng-cổ
Hình 1.8. Vị trí của gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3
Hình 1.9. Bản đồ của gen RASSF1A (A) và protein RASSF1A (B )
Hình 1.10. Tóm tắt vai trò sinh học của protein RASSF1A
Hình 1.11. APC-Cdc20 bị ức chế suốt quá trình nguyên phân
Hình 1.12. Protein RASSF1A điều hòa chu trình chết thông qua Bax
Hình 1.13. Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil
Hình 1.14. Nguyên tắc của kỹ thuật MSP
Hình 2.1. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Hình 3.1. Tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng và tế
bào bình thường
Hình 3.2. Tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng theo
loại mẫu sử dụng
Hình 3.3. Tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng và tế
bào bình thường
Hình 3.3. Định vị gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3
Hình 3.4. Hình A. Sơ đồ hình ảnh các vùng đảo CpG trên trình gen khảo sát; Hình
B. Vùng promoter mồi unmethyl và mồi methyl bắt cặp và các nhấn tố phiên mã
Hình 3.5. Mồi methyl bắt cặp với trình tự RASSF1A đã biến đổi bisulfite
Hình 3.6. Mồi unmethyl bắt cặp với trình tự RASSF1A đã biến đổi bisulfite
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm MSP
Hình 3.8. Kết quả sản phẩm PCR giải trình tự

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang iii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Bảng mồi gen RASSF1A tham khảo
Bảng 2.2. Các bước tách chiết DNA
Bảng 2.3. Chuẩn bị ME Wash buffer 1X
Bảng 2.4. Chuẩn bị mẫu
Bảng 2.5. Các bước thực hiện biến đổi bisulfite
Tiến hành đặt phản ứng PCR với hai cặp mồi sau
Bảng 2.6. Mồi methyl và unmethyl cho gen RASSF1A
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR
Bảng 3.1. Phương pháp được sử dụng trong 10 công trình nghiên cứu

Bảng 3.2. Loại mẫu được sử dụng trong 10 nghiên cứu
Bảng 3.3. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của một số gen RASSF1A,
DAPK, p16 trên bệnh ung thư vòm họng
Bảng 3.4. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A ở bệnh
ung thư vòm họng phân theo loại mẫu
Bảng 3.5. Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A trong tế
bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường
Bảng 3.6. Trình tự mồi và các thông số vật lý được đánh giá bằng phần mềm trực
tuyến IDT
Bảng 3.7. Bảng nồng độ và chất lượng DNA tách chiết từ mẫu giữ trong PBS và
formallin
Bảng 3.8. Bảng kết quả sơ bộ phương pháp MSP

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang iv


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
5mC

5-methylcytosine

APC

Anaphase-promoting complex

BSP

Bisulftte sequencing

C

Cytosine

CDK1

Cyclin-depentdent kinase 1

CpG

Cystosine phosphate Guanine

ddH2O

Double-distilled H2O

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

DNMT

DNA methyltransferase

EBV

Epstein-barr virus

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

G

Guanidine

JNK

Jun-NH2-Kinase

Kb

Kilo base pair

MDB

methyl-binding protein

MMSP

Multiplex Methylation Specific PCR

MOAP1

Modulator of apoptosis 1

MSP

Methylation-Specific Polymerase chain reaction

NST

Nhiễm sắc thể

OD

Optical Density

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang v


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PCR

Polymerase Chain Reaction

Pha G

Pha GAP

Pha S

Pha Synthesis

RASSF1A

RAS association domain family member 1

RT-PCR

Real time PCR

SAM

S-adenosyl-L-methionine

SDS

Sodium dodecyl sulfat

Ta

Nhiệt độ bắt cặp

TBBT

Tế bào bình thường

TBE

Tris-Borate-EDTA

TBTS

Trung bình có trọng số

TBUT

Tế bào ung thư

Tm

Nhiệt độ nóng chảy

UTVH

Ung thư vòm họng

WHO

World Health Organization

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang vi


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.TỔNG QUAN ..........................................................................................................1
1.1

Tổng quan về ung thư và sinh học phân tử của ung thư ................................1

1.1.1

Tổng quan về ung thư .............................................................................1

1.1.2

Sinh học phân tử ung thư ........................................................................2

1.1.3

Epigenetics ..............................................................................................5

1.2

Tổng quan về ung thư vòm họng .................................................................10

1.2.1

Tình trạng ung thư vòm họng trên thới giới và tại Việt Nam ...............10

1.2.2

Khái quát về ung thư vòm họng............................................................11

1.2.3

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...........................................14

1.2.4 Tìm hiểu về gen RASSF1A và sự methyl hóa gen RASSF1A dẫn đến
ung thư vòm họng. ............................................................................................15
1.2.5

Phương pháp phát hiện sự methyl hóa ..................................................22

1.2.6

Phương pháp cố định mô ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi DNA ........24

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................................................27
2.1

Vật liệu ........................................................................................................27

2.1.1

Mẫu mô sinh thiết vòm họng ................................................................27

2.1.2

Dung cụ – thiết bị – hóa chất ................................................................27

2.1.3

Danh mục các phần mềm sử dụng ........................................................28

2.2

Phương pháp tiến hành ................................................................................29

2.2.1

Khai khác dữ liệu ..................................................................................29

2.2.2

Khảo sát in silico...................................................................................29

2.2.3

Khảo sát thực nghiệm ...........................................................................31

3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................................36
3.1

Khai thác dữ liệu ..........................................................................................36

3.2

Kết quả khảo sát in silico.............................................................................41

3.2.1

Khảo sát in silico gen RASSF1A ...........................................................41

3.2.2

Khảo sát vị trí và cấu trúc đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A
...............................................................................................................41

3.2.3

Đánh giá mồi .........................................................................................44

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang vii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
3.3

Kết quả thực nghiệm....................................................................................47

3.3.1

Kết quả tách chiết DNA ........................................................................47

3.3.2

Kết quả phản ứng MSP trên các mẫu mô ung thư vòm họng. ..............48

4.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................51
4.1

Kết luận........................................................................................................51

4.2

Đề nghị ........................................................................................................51

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................53

PHU LỤC ..................................................................................................................59

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang viii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo tổ chức thế giới (WHO), ung thư là một trong những nguyên nhân dẫn đến tử
vong trên toàn thới giới, ước tính có khoảng 8,2 triệu ca tử vong vào năm 2012.
Ung thư là thuật ngữ chỉ một nhóm các dạng bệnh lý khác nhau, đến nay đã có trên
200 dạng bệnh ung thư được mô tả ví dụ như ung thư vú, ung thứ tuyến tiền liệt,
ung thư vòm họng, ung thư phổi…. Trong đó, ung thư vòm họng được biết là một
trong những ung thư phổ biến , tập trung chủ yếu ở Trung Quốc, Đông Nam Á và
Bắc Phi. Theo thống kê của Globocan 2012 thì ung thư vòm họng có khoảng 60.896
triệu ca mắc bệnh và tỷ lệ tử vong là 35.756 triệu ca mỗi năm trên toàn thế giới,
theo ước tính đến 2017 thì tỷ lệ số nhiễm ung thư vòm họng sẽ tăng 161.899 ca trên
toàn thế giới. Tại Việt Nam ung thư vòm họng chiếm 4,7% trên tổng số các ung thư.
Đồng thời, số lượng tử vong cũng khá cao chiếm 3,3% (theo Globocan 2012).
Trong những năm gần đây, bệnh ung thư vòm họng bắt nguồn từ hiện tượng biến đổi
di truyền cụ thể là epigenetics ngày càng được các nhà khoa học quan tâm. Một trong
những biến đổi di truyền liên quan đến epigenetics chính là sự methyl hóa vượt mức
(hypermethylation) trên các đảo CpG trên vùng promoter thuộc gen ức chế khối u, sự
biến đổi bất thường này làm bất hoạt chức năng của gen ức chế khối u, kết quả dẫn
đến sự tăng sinh vượt mức của tế bào và dẫn đến sinh u.
Sự methyl hóa ở vùng promoter của gen RASSF1A được biết chiếm tỷ lệ khá cao
trong bệnh ung thư vòm họng nó dao động từ 66,7%-83% trong tổ hợp các gen
methyl liên quan đến ung thư này. Gen RASSF1A nằm ở vị trí 3p21.3 của NST, bình
thường đóng vai trò là những gen ức chế ung thư nhưng khi bị methyl hóa một cách

bất thường thì sẽ dẫn đến hình thành khối u. Trên thế giới đã có những công trình
nghiên cứu của Lo K. W. và cộng sự (2001), Kwong J. và cộng sự (2002), Wang T.
và cộng sự (2009),… cho thấy rằng sự mất hay giảm biểu hiện gen RASSF1A do sự
methyl hóa vượt mức vùng promoter của gen này sẽ tạo u và dẫn đến ung thư vòm
họng. Gen RASSF1A là gen ức chế khối u, có khả năng giảm thiểu số lượng và ức
chế sự phát triển các protein sinh u trong tế bào . Đồng thời, gen RASSF1A mã hóa
cho protein RASSF1A thuộc thành viên trong họ protein RASSF có chức năng ức

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang ix


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
chế khối u. RASSF1A có thể ức chế chu trình phát triển của tế bào bằng cách ngăn
cản sự tích lũy cyclin D1 kìm hãm sự tăng sinh tế bào vượt mức, chết theo chu trình
chết, liên kết với Cdc20 và Cdc20 sẽ không kích hoạt APC và chu trình tế bào sẽ bị
chặn lại tại thời điểm trước kì giữa nguyên phân. Một khi gen RASSF1A bị methyl
hóa sẽ dẫn đến sự im lặng của gen, các tế bào tăng sinh không thể kiểm soát và dẫn
đến hình thành u.
Chính sự methyl hóa trên của gen RASSF1A đã được ứng dụng như một dấu ấn
phân tử trong việc chuẩn đoán và tiên lượng phát hiện sớm ung thư. Các phương
pháp sinh học phân tử được ứng dụng để phát hiện sự methyl hóa của gen RASSF1A
đã được ứng dụng trong một số công trình nghiên cứu trên thế giới như RT-PCR
của Zhou L và cộng sự (2005), Multiplex MMSP của Zang Z. và cộng sự (2012),
MSP của Lo K.W. và cộng sự (2001),…Trong đó phương pháp MSP được sử dụng
phổ biến đồng thời phân tích nhanh tình trạng methyl hóa của các đảo CpG, nó
được ứng dụng trong nhiều nghiên của các nhóm nghiên cứu trên thới giới như
Tong J. H. và cộng sự (2002), Kwong J. và cộng sự (2002), Chang H và cộng sự
(2003), Zhou L. và cộng sự (2005),…

Tứ những cơ sở trên, tối thấy rằng sự phát triển dấu chứng sinh học phân tử
(Biomarker), là cần thiết trong việc phát hiện sớm tiền ung thư rất cần thiết cho việc
hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng.Từ đó, tôi tiến hành hường đề tài ‘PHÁT TRIỂN KỸ
THUẬT MSP NHẰM PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN
RASSF1A HƯỚNG ĐẾN HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ VÒM
HỌNG.’ với mong muốn xây dựng cơ sở lý thuyết khoa học nhằm khẳng định sự
methyl hóa ở RASSF1A được xem là một dấu chứng sinh học hỗ trợ cho việc chẩn
đoán sớm bệnh ung thư vòm họng.

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang x


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về ung thư và sinh học phân tử của ung thư
1.1.1 Tổng quan về ung thư
1.1.1.1 Định nghĩa
Ung thư là một bệnh lý ác tính của tế bào, khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh
ung thư, tế bào sẽ tăng sinh vô hạn và không tuân theo các cơ chế kiểm soát về phát
triển của cơ thể [2].
Các tế bào phân chia và phát triển không kiểm soát được, hình thành các khối u ác
tính và xâm nhập vào các bộ phận ở gần hoặc xa cơ thể thông qua hệ thống bạch
huyết hoặc máu của cơ thể gọi là di căn [2].
1.1.1.2 Đặc tính của ung thư
Đa số bệnh ung thư sẽ hình thành khối u, các khối u lành tính chỉ phát triển tại chỗ,
thường rất chậm, có vỏ bọc xung quanh, các khối u ác tính (ung thư) xâm lấn vào
các tố chức lành khác rồi bám vào các tổ chức này và lan rộng ra. Các tế bào khối u

ác tính có khả năng di căn tới hạch bạch huyết hoặc các cơ quan xa hình thành các
khối u mới và cuối cùng dẫn tới tử vong [2].
Ung thư không phải là một bệnh duy nhất mà thuật ngữ này phản ảnh một nhóm các
dạng bệnh lý khác nhau (đến nay đã có trên 200 dạng ung thư đã được mô tả).
Những loại ung thư này tuy có những đặc điểm giống nhau về bản chất nhưng
chúng có nhiều đểm khác nhau như sau: khác nhau về nguyên nhân gây bệnh, tiến
triển của bệnh và về phương pháp trị liệu [1, 2].
1.1.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới
Theo số liệu thống kê năm 2012 của WHO, ung thư là nguyên nhân hàng đầu dẫn
đến tử vong và chiếm 8,2 triệu ca tử vong hàng năm [55]. Bên cạnh đó khoảng 60%
tổng các ca ung thư xảy ra ở các nước nghèo và đang phát triển, gồm Châu Phi,
Châu Á và khu vực Nam Mỹ. Đặc biệt tỷ lệ tử vong ở các khu vực trên chiếm
NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
khoảng 70% trên tổng số ca tử vong do ung thư trên toàn thế giới. WHO cũng dự
đoán rằng số trường hợp mắc ung thư sẽ đạt 22 triệu trường hợp vào năm 2032 [55].
1.1.2 Sinh học phân tử ung thư
Các nhà khoa học cho rằng ung thư thường phát sinh khi một tế bào đã tích lũy một
loạt các tác nhân gây sai hỏng DNA, thông thường là từ 4-6 tổn thương cấu trúc
DNA. Một vài sai hỏng có được là do di truyền, số còn lại được tích lũy trong suốt
quá trình sống của cơ thể [1].
Các sai hỏng di truyền chủ yếu xảy ra ở hai nhóm gen lớn là gen tiền ung thư
(proto-oncogenes) và các gene ức chế ung thư (tumor suppressor genes) [1]. Các gen
này mã hóa cho hàng loạt các protein có vai trò kiểm soát sự tăng trưởng và phát
triển của tế bào; những đột biến xảy ra trên các gen này có thể sẽ dẫn đến ung thư
[1]

.

Các nhà ung thư học đã phân loại các nhóm gen chính liên quan đến sự phát sinh
các tế bào ung thư bao gồm các nhóm sau: Các gen tiền ung thư (proto-oncogenes);
Các gen ức chế khối u (tumor suppressor genes); Các gen kiểm soát chu trình tế
bào; Các gen sửa chữa DNA [1].
1.1.2.1 Các gen tiền ung thư (proto-oncogenes)
Gen gây ung thư (oncogene) được định nghĩa như là những gen mã hóa cho một
protein có khả năng làm chuyển dạng tế bào nuôi cấy hoặc có khả năng gây ung thư
ở động vật [1]. Trong số rất nhiều các oncogene được biết đến, một số có nguồn gốc
từ các gen nội bào là những gen mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình kiểm
soát tăng trưởng và thụ thể (receptor) của chúng, các protein truyền tín hiệu, các
nhân tố phiên mã và các protein kiểm soát chu trình tế bào [1].
Sự chuyển đổi hoặc hoạt hóa một pro-oncogene thành oncogene thường bao gồm
một đột biến về chức năng [1].
Một oncogene được hình thành theo hai cơ chế đầu tiên mã hóa một oncoprotein
khác với protein bình thường được mã hóa bởi pro-oncogene tương ứng

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

[1]

. Ngược

Trang 2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
lại, hai oncogene phát sinh từ hai cơ chế sau lại sản xuất protein giống hệt protein

bình thường, chúng có tác dụng gây ung thư vì được sản xuất ở mức độ cao hơn
bình thường hoặc bình thường trong tế bào chúng không được sản xuất

[1]

. Tuy

nhiên, sự đột biến chức năng chuyển pro-oncogene thành oncogene thường mang
tính trội, tức là sự đột biến chỉ cần xảy ra trên một trong hai alen là đủ để kích thích
ung thư [1].
1.1.2.2 Các gen ức chế khối u (tumor suppressor genes)
Gen Rb
Gen làm phát triển u nguyên bào võng mạc ở người được gọi tên là Rb
(retinoblastoma). Đột biến ở gen Rb làm phát triển dạng ung thư khác ở người như
sacôm xương (osteosarrcom)

[1]

. Khác với bệnh retioblastoma do di truyền, những

đột biến của Rb thường xuất hiện ở tế bào sinh dưỡng hơn là do di truyền từ bố mẹ.
Retioblastoma tạo ra do đột biến hai lần ở phạm vi gen Rb của thể nhiễm sắc 13 [1].
Thông qua các nghiên cứu người ta biết sản phẩm protein của gen Rb tham gia
trong điều hòa tăng trưởng tế bào [1] .
Gen p53
Gen p53 nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 17 [1]. Protein p53 có vai trò ngăn
cản sự lan rộng của các tế bào bị hư hại về di truyền

[1]

. Protein p53 khu trú trong

nhân tế bào và khi tác động, nó có chức năng đầu tiên là kiểm soát sự phiên mã của
các gen khác. Sự biến đổi p53 xảy ra ở gần một nửa số ung thư ở người

[1]

. P53

được huy động để làm ngừng sự hư hại DNA và hỗ trợ cho việc sửa chữa DNA
bằng cách gây dừng ở G1 và kích thích các gen được sửa chữa. Một tế bào có DNA
bị hư hại nếu không được sửa chữa sẽ được p53 điều khiển đi vào chu trình chết tế
bào [1].
Nếu mất đồng hợp tử của gen p53, tổn hại p53 không được sửa chữa, đột biến trở
thành cố định trong các tế bào đang phân chia và các tế bào sẽ chuyển sang dạng ác
tính, đặc biệt là ở mô liên kết [1].

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Gen p53 đã được phát hiện gần 20 năm nay và được xem là gen duy nhất giữ vai trò
trung tâm trong cơ chế gây bệnh ung thư [1].
Gen p73
Đến cuối năm 1977, các nhà nghiên cứu phát hiện ra gen p73, gen này mã hóa một
protein mang nhiều đặc điểm tương tự như gen p53

[1]

. Gen p73 có một vùng gắn

DNA giống một vùng tương ứng của gen p53, nó có thể gây dừng chu kì tế bào và
gây chết tế bào theo chương trình trong những điều kiện thích hợp [1].
Nhiều nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào gen họ hàng của p73 này. Gen p73
phổ biến trong nhiều loại u như u nguyên bào thần kinh, ung thư đại tràng,... [1].
1.1.2.3 Các gen kiểm soát chu trình tế bào
Các tế bào của sinh vật Eukaryotae trải qua nhiều giai đoạn nối tiếp nhau và kết
thúc bằng sự phân chia tạo nên tế bào mới. Toàn bộ quá trình từ tế bào đến tế bào
thế hệ tiếp theo được gọi là chu trình tế bào gồm 4 giai đoạn: M, G1, S và G2 [1].
G1: là gap phase thứ nhất, ở phase này tế bào chuẩn bị cho sự sao chép DNA
[1]

.

S: là giai đoạn tổng hợp DNA. Cuối giai đoạn này lượng DNA tăng lên gấp
đôi và chuyển sang G2 [1].
G2: là phase gap thứ hai, tế bào chuẩn bị cho sự phân chia [1] .
M (mitosis): là giai đoạn nguyên phân của tế bào. Cuối phase M, có hai tế
bào con giống hệt tế bào ban đầu được tạo thành [1].
Các tế bào khởi đầu cho chu trình khi chúng nhận được tín hiệu của nhân tố tăng
trưởng (growth factor). Sự thiếu đi nhân tố này sẽ làm cho tế bào mất khả năng
phân chia và đi vào phase G0, tuy nhiên nếu lại nhận được tín hiệu của nhân tố tăng
trưởng tế bào sẽ lại được hoạt hóa trở lại chu trình. Tế bào có thể đi ra khỏi chu
trình bình thường để trải qua quá trình biệt hóa hoặc đi vào chương trình chết
(apoptosis) [1].

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.1.2.4 Các gen sửa chữa DNA
Những tác nhân tác động khác nhau (như chuyển hóa tế bào, tia UV, tia phóng xạ,
hóa chất, hay lỗi sao chép,...) sẽ làm sai hỏng DNA trong tế bào [1]. Khi DNA bị sai
hỏng tế bào sẽ hoạt hóa các kiểm soát chu trình tế bào, hoặc hoạt hóa những cơ chế
sửa chữa, hoặc hoạt hóa chương trình apoptosis

[1]

. Khi những chương trình hay cơ

chế này bị lỗi làm cho những sai hỏng không được nhận biết, sửa chữa kịp thời, và
tích lũy ngày càng nhiều thì sẽ tạo cơ hội cho ung thư diễn ra [1].
1.1.3 Epigenetics
Epigenetics là sự thay đổi thông tin di truyền trong quá trình biểu hiện gen nhưng
không làm thay đổi trình tự DNA và được di truyền một cách ổn định từ thế hệ này
sang thế hệ khác

. Epigenetics bao gồm các hiện tượng sau : sự methyl hóa

[4, 15]

DNA, các biến đổi histone, và microRNAs (hình 1.1) [4, 15].

Hình 1.1. Cơ chế epigenetics bao gồm hiện tượng methyl hóa DNA, biến đổi
histone và micro-RNA [33].
Khởi đầu trong quá trình sinh ung thư do sự tích lũy sai khác thông tin di truyền hay

DNA bị đột biến đó là sự bất thường về mặt di truyền hoặc bị biến đổi về tình trạng
điển đổi epigenetics [4, 15]. Trong một số nghiên cứu gần đây, sự bất thường về hiện
tượng epigenetics là một trong những cơ chế chính liên quan đến quá trình hình

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
thành tế bào ung thư. Một ví dụ về hiện tượng methyl hóa của epigenetics

[4, 15]

ở

hình 1.2. :

Hình 1.2. Cơ chế biến đổi epgenetics gây im lặng gen.
1.1.3.1 Methyl hóa DNA
Hiện tượng methyl hóa là hiện tượng gắn thêm nhóm methyl (CH3) vào vị trí
carbon số 5 của các phân tử cystosine (5’C) của đứng trước guanine trong cặp
dinucleotide CpG (cystosine-phosphate-guanine ) hình thành 5-methylcytosine
(5mC) [4, 15, 19, 36].
Khi nói đến methyl hóa DNA thì vùng đảo CpG luôn được đề cập, thực tế đảo CpG
là vùng giàu dinucleotide CpG (cystosine phosphate guanine) có kích thước khoảng
0,5- 4,0 kb, bao gồm các đơn vị cystosine và đơn vị guanine nằm kề nhau được liên
kết với nhau bằng liên kết phosphodiester, đảo này có thành phần phần trăm GC cao
hơn so với các vùng khác (> 50%) thuộc bộ gen người

[15, 27, 36]

. Các đảo CpG

thường kéo dài từ vùng đầu 5’ đến exon 1 thuộc vùng promoter của gen, ở các tế
bào bình thường phần lớn các đảo CpG không bị methyl hóa, chỉ những phân nhóm
riêng biệt bắt đầu từ vùng promoter đến vùng exon đầu tiên của gen thì bị methyl
hóa [26, 38, 43].

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 1.3. Cơ chế methyl hóa DNA [19].
Chú thích: dưới xúc tác của enzym DNMT và co-factor S-adenosyl-L-methionine
(SAM) thì nhóm methyl sẽ gắn vào vị trí carbon số 5 của cytosine [48].
Hiện tượng methyl hóa DNA xảy ra sau quá trình tổng hợp DNA, quá trình này
được thực hiện bởi các enzyme DNA methyltranfarase (DNMTs) bằng cách hình
thành liên kết cộng hóa trị chuyển nhóm methyl từ S-adenosyl-L-methionine (SAM)
đến trình tự đầu 5’-CG-3’ cystosine (hình 1.3. ) [4, 19, 33] .
DNA methyltransferase (DNMTs) là một hệ enzyme phổ biến, được thực hiện chủ
yếu bởi 3 enzyme DNA methyltransferase 1, 3A, 3B (DNMT1, DNMT3A và
DNMT3B). Nhóm enzyme methyltranferase (DNMTs) gồm hai nhóm de novo
methyltranfarase (các chuỗi DNA bị methyl hóa tại các dinucleotide CpG) và nhóm
methyltranferase duy trì (một mạch DNA bị methyl hóa tại các dinucleotide CpG).
Trong đó DNMT1 thuộc nhóm methyl transferase duy trì, DNMT3a và DNMT3b
thuộc nhóm de novo transferase tham gia trực tiếp trong quá trình methyl hóa DNA

[15, 19, 36]

. Nhóm enzyme de novo methyltranferase gắn bổ sung nhóm methyl (CH3)

vào 5-Cystosine hình thành 5-methylcytosine (5mC) tạo vị trí methyl hóa mới,
enzyme de novo biểu hiện ở mức cao trong quá trình phát triển phôi thai và biểu
hiện mức thấp trong quá trình chuyên biệt hóa tế bào sinh dưỡng (tế bào soma).
NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
DNMT3a và DNMT3b thuộc nhóm enzyme de novo methyltransferase có khả năng
hoạt động không phụ thuộc vào quá trình sao chép và hoạt động thể hiện khả năng
methyl hóa cả hai mạch và methyl hóa một nửa đoạn DNA. Nhóm enzyme
methyltranferase duy trì DNA (maintenance DNA methyltransferase) trong đó
DNMT1 là enzyme phổ biến nhất trong tế bào, đóng vai trò chủ chốt trong quá trình
sao chép có khả năng hoạt động xuyên suốt pha S trong chu kỳ tế bào nhằm duy trì
ổn định sự methyl hóa của các tế bào soma khác nhau. DNMT1 có khả năng tăng
cường quá trình sinh tổng hợp DNA vì DNMT1 tương tác nhân tố DNA polymerase
trong quá trình tăng trưởng tế bào

[19, 36, 46]

. Ngoài ra enzyme DNMT1 còn tăng

cường hỗ trợ hoạt động nhóm enzyme de novo transferase.
1.1.3.2 Methyl hóa trong tế bào bình thường
Sự methyl hóa DNA có nhiều chức năng trong quá trình phát triển của tế bào bình

thường chẳng hạn như: Methyl hóa DNA là một hiện tượng bình thường xảy ra
trong quá trình phát triển của tế bào, chúng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa
biểu hiện gen cho nhiều loại tế bào gồm sự phát phát triển phôi thai, quá trình phiên
mã, cấu trúc NST, bất hoạt NST số X và đánh dấu bộ gen [19, 27]. Sự methyl hóa
DNA bắt đầu từ trước và sau khi sinh ở những tế bào bình thường. Bình thường,
những gen dấu ấn sẽ được bảo vệ từ sự demethylation trên toàn bộ gen, tuy nhiên
trong quá trình phát triển của cơ thể có những giai đoạn cần được thể hiện thì các
gen này sẽ được mở ra và biểu hiện chức năng, tuy nhiên sự methyl hóa này sẽ giảm
theo độ tuổi. Bên cạnh đó nếu sự methyl hóa bất thường này tăng theo thời gian có
thể là nguyên dẫn đến hiện tượng methyl hóa vượt mức và hình thành u [19, 36].
1.1.3.3 Methyl hóa DNA trong tế bào ung thư
Sự methyl hóa ở tế báo ung thư được chia làm hai loại là: methyl hóa mức thấp
(hypomethylation) và methyl hóa vượt mức (hypermethylation) ở vùng đảo CpG
(hình 1.3.). Sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) tại một số vị trí ở các đảo
CpG thuộc vùng promoter hay sự methyl hóa ở mức thấp (hypomethylation) được
diễn ra trên toàn bộ bộ gen [15, 19].

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Methyl hóa ở mức thấp (hypomethylation) là nguyên nhân dẫn đầu làm giảm biểu
hiện gen ức chế khối u, thông qua một số cơ chế gắn kết nhóm protein MBD
(methyl - binding domain) vào các đảo CpG có khả năng làm cạnh tranh vị trí gắn
của các nhóm methyl (CH3) trên các đảo CpG bị methyl MBD hay gắn một số chất
kìm hãm như 5 -glycosylate vào các yếu tố phiên mã làm bất hoạt quá trình phiên
mã gen bằng cách cạnh tranh khả năng bám của các yếu tố phiên mã vào vùng
promoter của gen ức chế khối u

[19, 35]

. Methyl hóa DNA ở mức thấp

(hypomethylation) là tín hiệu di truyền hình thành khối u và xảy ra tại các vùng
trình tự bộ gen bao gồm các yếu tố vùng trình tự lặp lại, vùng promoter nghèo
dinucleotide CpG, điều này dẫn đến sự gia tăng kích thích xây dựng NST tiền sắp
xếp bộ gen, ngoài ra là do gen bị tổn thương và tái hoạt động của trình tự
endoparasitic vì vậy gây ra sự hoạt động bất thường của gen góp phần vào sự phát
triển và hình thành ung thư (hình 1.4) [19, 35, 40].

Hình 1.4. Sự methyl hóa DNA trong ung thư [19].
Chú thích: Hình A. Trong tế bào bình thường, toàn bộ CpG và nhân tố tăng cường
thì bị methyl hóa tự do, trong khi các CpG nằm trong vùng trình tự lặp lại thì
methyl hóa mạnh. Hình B. Trong tế bào ung thư vùng đảo CpG bị methyl hóa quá
mức cùng một số vùng điều hòa khác.
Methyl hóa vượt mức tại một số vị trí đặc biệt trên bộ gen cụ thể là các đảo CpG
dẫn đến im lặng gen ức chế khối u góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát
triển tế bào làm tăng sinh tế bào không chọn lọc hậu quả sinh u có mối liên quan
đến một số bệnh ung thư [13, 19, 35]. Nguyên nhân chủ yếu của hiện tượng methyl hóa
NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
vượt mức do sự hoạt động quá mức của enzyme DNMTs gồm DNMT1 và DNMT3,
việc biểu hiện quá mức của nhóm họ enzyme DNMTs ở các tế bào bình thường có
thể gây ra các hiện tượng methyl hóa bất thường của DNA quan trọng nhất là sự bất

thường này làm gia tăng quá trình methyl hóa DNA [ 13, 35 ]. Những gen ức chế khối
u này tham gia vào nhiều con đường điều hòa tế bào quan trọng như: chu trình tế
bào, chu trình chết apoptosis, sửa lỗi DNA, đường tín hiệu Ras,…Sự methyl hóa
quá mức ở vùng prometer của gen được sử dụng để phân loại, chẩn đoán và tiên
lượng ung thư [19].

Hình 1.5. Mô hình methyl hóa DNA.
1.2 Tổng quan về ung thư vòm họng
1.2.1 Tình trạng ung thư vòm họng trên thới giới và tại Việt Nam
Theo thống kê của Globocan 2012 ung thư vòm họng có khoảng 60.896 triệu ca
mắc bệnh và tỷ lệ tử vong là 35.756 triệu ca mỗi năm trên toàn thế giới, theo ước
tính đến 2.017 thì tỷ lệ số nhiễm ung thư vòm họng sẽ tăng 161.899 ca trên toàn thế
giới [52].

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 1.6. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong của các loại ung thư tại Việt Nam [49].
Theo thống kê Globocan 2012, tại Việt Nam ung thư vòm họng chiếm 4,7% trên
tổng số các ung thư. Đồng thời, số lượng tử vong cũng khá cao, chiếm 1.931 trường
hợp tương đương với 3,3% [52].
1.2.2 Khái quát về ung thư vòm họng.
1.2.2.1 Giải phẫu vùng vòm họng
Họng là ngã ba của đường tiêu hóa và đường hô hấp. Họng được chia làm ba phần
gồm phần vùng mũi họng, hầu họng và hạ hầu. Phần họng mũi hay còn gọi là vùng
vòm họng (phần cao nhất của họng), cũng là một bộ phận quan trọng của họng và

nằm sau khoang mũi (hình 1.7) [29].

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 1.7. Giải phẫu vùng hầu họng-cổ.
1.2.2.2 Khái niệm và triệu chứng ung thư vòm họng
Ung thư vòm họng (UTVH) là một khối u biểu mô ác tính xuất phát từ niêm mạc
của khoang mũi họng

[11, 29]

. Tuy nhiên, trong vùng mũi họng thì khối u lại b

ắt

nguồn từ hố yên (hay còn gọi là Rosenmuller ) và lan rộng ra các vùng lân cận và
các vùng khác như xương, phổi, gan thông qua đường máu

[29]

. Những bệnh nhân

trong giai đoạn sớm UTVH thường không có triệu chứng hoặc có những triệu
chứng rất là bình thường như sưng cổ, tắc nghẽn mũi, và chảy máu cam

[12]

. Sưng

cổ cũng là một trong những triệu chứng phổ biến nhất của bệnh UTVH, giống như
sự di căn của hạch bạch huyết, đồng thời cũng là dấu hiệu nói đến sự lan rộng của
ung thư [29].
Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO) chia UTVH thành 3 loại: loại I ung thư bi ểu
mô vảy (Squamous Cell Carcinoma

), loại II là ung thư không có v

(Nonkeratinizing Carcinoma ), loại III ung thư không bi

ảy

ệt hóa (Undifferrentisted

Carcinoma) [7, 12]. Theo một thống kê cho thấy phía bắc nước Mỹ, UTVH theo từng
loại chiếm tỷ lệ như sau loại I chiếm 2%, loại II chiếm 12% và loại III chiếm 63%,
bên cạnh đó khi thống kê với bệnh nhân UTVH ở Trung Quốc thấy rằng tỷ lệ trên

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
được phân bố như sau loại I 2%, loại II 3% và loại III là 95%, từ đó cho thấy UTVH
phổ biến nhất là loại III [19].

1.2.2.3 Tác nhân gây bệnh ung thư vòm họng
Những yếu tố gây ra ung thư vòm họng bao gồm yếu tố môi trường, di truyền và
Epstein-barr virus [3, 19, 21, 33].
Yếu tố môi trường: việc sử dụng cá muối và thức ăn có chất bảo quản có chứa các
thành phần hóa học biến đổi nitrosamine là hai yếu tố chính yếu dẫn đến ung thư
vòm họng. Theo một thử nghiệm trên chuột đã cho thấy những chú chuột sau khi sử
dụng cá muối thì những khối u ác tính đã xuất hiện ở vòm họng [19, 21]. Bên cạnh đó
việc tiếp xúc với các hóa chất độc hại trong nghề nghiệp, hút thuốc lá, uống rượu và
chất thải độc hại cũng là một trong những yếu tố dẫn đến việc hình thành và phát
triển ung thư vòm họng [19, 21, 33].
Yếu tố di truyền: sự hình thành các khối u ác tính và hiện tượng di căn thường phụ
thuộc vào sự tích lũy đồng thời của nhiều đột biến liên quan đến các tiền gen gây
khối u và các gen ức chế khối u [1]. Dường như để một tế bào chuyển sang trạng thái
ung thư, cần phải có ít nhất 6 hoặc 7 đột biến xảy ra và được tich lũy độc lập qua
vài chục năm. Các đột biến này hoặc liên quan đến sự bất hoạt của các gen ức chế
khối u, dẫn đến hàng loạt các sai hỏng trong sự đều hòa sinh trưởng, phát triển và
sửa chữa DNA trong tế bào [1, 19, 33]. Theo nghiên cứu của Fangyun T. lượng lớn các
gen ức chế khối u bị methyl hóa được tìm thấy phổ biến ở NST 9p21 (CDKN2A,
p15 và p14 ARFI) và 3p21.3 (RASSF1A, BLU/ZMYND10 và CACNA2D2)

[19, 21, 33]

.

Những gen ức chế khối u bị methyl hóa quá mức ở vùng promoter sẽ dẫn đến giảm
chức năng hay mất biếu hiện hoặc đột biến cũng gây nên bất hoạt hoạt động của gen
[19, 21, 33]

. Sự methyl hóa bất thường của các gen ức chế khối u hoặc đột biến sẽ dẫn

đến hình thành UTVH thông qua việc phá vỡ cơ chế điều hòa chu trình tế bào như
chu trình chết (apoptosis), tăng sinh tế bào và bám dính tế bào [19, 21].
Đồng thời yếu tố di truyền và môi truyền cũng liên quan đến trong việc hình thành
UTVH chẳng hạn như bệnh ung thư vòm họng hiếm ở người da trắng nhưng nó rất

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
phổ biến ở thành phố Guangdong phía nam Trung Quốc, người Et-xki-mô ở Alaska
và ngươi thổ dân Greenland

[11, 21, 24]

; Bên cạnh đó những người Trung Quốc di cư

sang miền Bắc nước Mĩ thì tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn hẳn những người sinh ra tại
Trung Quốc [11, 21, 24]. Điều này chứng tỏ rằng yếu tố môi trường và yếu tố di truyền
đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh ung thư vòm họng [11, 21, 24].
Epstein-barr virus (EBV) được biết là một trong những nguyên nhân gây UTVH
ngoài các nguyên nh ân do di truyền và môi trường

[3, 21, 24, 33]

. Epstein-barr virus

xuất hiện hơn 90% ở những người trưởng thành trên thế giới, phân bố khắp cơ thể
thường không gây hại vì có sự cân bằng giữa ký chủ và virus, tuy nhiên, khi gặp

điều kiện cần và đủ, EBV cũng giống như một số loại virus tàng nhiễm khác, sẽ gây
biến đổi mô/tế bào của cơ thể thành khối u ác tính [3]. Sự nhiễm EBV nếu không có
sự kết hợp cùng các yếu tố như cơ địa người bệnh, môi trường, chế độ ăn uống và
tiêu thụ cá muối thì sẽ không dẫn đến sự phát triển ung thư vòm họng [3, 21, 24, 33].
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tôi tập trung chủ yếu nguyên nhân chính gây
UTVH do yếu tố di truyền cụ thể là hiện tượng methyl hóa bất thường dẫn đến việc
tạo u, và gen methyl hóa mà tôi quan tâm ở đây là gen RASSF1A.
1.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Hiện tượng methyl hóa vượt mức (hypermethylation) gen ức chế khối u (tumor
suppressor genes) RASSF1A trong ung thư vòm họng đã trở thành một dấu chứng
sinh học (Biomarker) chuyên biệt góp phần chẩn đoán sớm và tiên lượng ung thư,
đồng thời, trên thế giới đã có một số công trình nghiên tiêu biểu về hiện tượng
methyl hóa bất thường của gen này:
Lo K. W và cộng sự (2001), đã nghiên cứu về tần số methyl hóa quá mức của gen
RASSF1A trên bệnh ung thư vòm họng và thu được kết quả là 66,7% gen RASSF1A
bị methyl hóa trên 26 mẫu mô sinh thiết từ các bệnh nhân ung thư vòm họng. Năm
2005, Zhou L. và cộng sự cũng đã nghiên cứu về tần số methyl hóa cùa gen
RASSF1A và TSLC1 cùng sự hiện diện của Epstein-barr virus trong ung thư vòm
họng, kết quả thu được được phân chia theo vị trí lấy mẫu như sau: tại vị trí ung thư

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
vòm họng methyl hóa RASSF1A chiếm 82%, vị trí xung quanh cách khối u 0,5 cm
75%, cách vị trí khối u 1,0 cm là 46%. Wang T. và cộng sự (2009), cũng nghiên cứu
về sự methyl hóa của gen RASSF1A và hoạt động của nhóm K-Ras trong thư vòm
họng và thấy được rằng tần số methyl hóa của gen RASSF1A chiếm 71,05% trong

tổng số 38 mẫu mô ung thư vòm họng. Bên cạnh đó, Zang Z cùng cộng sự cũng đã
nghiên cứu về tần số methyl hóa của gen RSSF1A và DAPK thấy rằng tần số methyl
hóa chiếm 79,6% và 67,3% đối với 49 mẫu mô sinh thiết và chiếm 57,2% và 55,1
đối với 49 mẩu phết hầu họng. Đồng thời còn các công trình khác trên thế giới của
Fangyun T (2012), Hutajulu S. H và cộng sự (2011), Fendri A. (2009),…cũng
nghiên cứu về tần số methyl hóa gen RASSF1A trên những bệnh nhân ung thư vòm
họng.
Ở Việt Nam, tôi chưa tìm thấy công trình tiêu biểu nào liên quan đến việc nghiên
cứu sự vượt mức methyl hóa ở gen RASSF1A được xem như là một dấu chứng sinh
học cho việc phát hiện, chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng.
1.2.4 Tìm hiểu về gen RASSF1A và sự methyl hóa gen RASSF1A dẫn đến ung thư
vòm họng.
1.2.4.1 Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen RASS1A trên NST
RASSF1A (Ras association domain family 1 isoform A ) là m ột gen ức chế khối u
nằm trong vùng 3p21.3 trên nhiễm sắc thể số 3 của bộ gen người (hình 1.8) [16, 23].

Hình 1.8. Vị trí của gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3.
RASSF1 dài kho ảng 11000 bp, bao gồm 8 exon tạo thành 8 vùng phiên mã khá c
nhau từ RASSF1A tới RASSF1H

[16]

. Trong đó , RASSF1A bao gồm các exon 1α,

2αβ, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho một chuỗi polypeptide ngắn với 340 amino acid có trọng

NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT

Trang 15