SẮC KÝ LỌC GEL

SẮC KÝ LỌC GEL
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TRẦN THANH TUẤN


GIỚI THIỆU


Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của
các phân tử. Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành
phần của dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li
(resolution).
Sắc kí gel phù hợp với những phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion
kim loại, môi trường khắc nghiệt.



Quá trình phân tách bằng phương pháp sắc kí gel
(gel filtration)

Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed).
Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa
học và trơ.
Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). Dung dịch điền đầy vào mạng
lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt.
Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh và chất lỏng bên ngoài
được xem là pha động.


LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ
GEL

Đặc điểm của quá trình
Kết quả của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đổ giải li hay
phổ đồ sắc kí cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thụ
tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li
khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử.



Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của
chúng, Ve (elution volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí. Có 3 cách để xác
định Ve:



•

 

Sự giải li của mẫu được đặc trưng bởi hệ số phân bố Kd.
Kd = =


Biểu đồ thể hiện V0 và Vt


•

Do thay
Vi bằng Vt - Vo, do đó ta có giá trị Kav, nó không thực sự đúng với giá

 
trị hệ số phân bố Kd. Nhưng đối với mỗi loại gel riêng thì có tỉ lệ giữa Kav:Kd,
và tỉ lệ này không phụ thuộc bản chất và nồng độ của mẫu.
Kav =


Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp

Chọn lựa phương pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích
thước lỗ xốp và được mô tả bởi đường cong chọn lọc. Bằng cách vẽ đường cong
đi qua những điểm giá trị Kav ứng với log Mr của các protein chuẩn có thể xây
dựng được đường cong chọn lọc.



Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li
ở thể tích khoảng trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời gian là
tối thiểu. Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá
trị Vt (Kav = 1)
+ Nếu Kav > 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong mạng lưới gel do kích
thước quá nhỏ (Ve > Vt).
+ Nếu Kav < 0, có thể trong cột đã xuất hiện những kênh, rãnh mà các
phân tử có thể chảy tắt qua cột (Ve < Vo).
 


Độ giải li

•

 

Độ giải li được xác định bằng biểu thức:
Rs =
+ Vr1 và Vr2 là thể tích giải li của 2 mũi gần nhau.
+ W1 và W2 là độ rộng tương đối của mũi.


Các thông số để xác định độ giải li


Độ giải li là hàm của độ chọn lọc của phương pháp và hiệu quả của phương
pháp tạo ra những mũi hẹp.


Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra mũi hẹp đối xứng trong quá
trình giải li và được xác định dựa trên số đĩa lý thuyết trên đơn vị chiều dài (N):
N = 5.54(Ve/W1/2)2 . 1000/L
Trong đó:
+ Ve: thể tích mũi giải li.
+ W1/2: chiều rộng mũi tại một nửa chiều cao mũi.
+ L: chiều cao đệm.


Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi vì khi mẫu đi qua cột thì quá
trình khuếch tán xảy ra. Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu thì sử dụng
thể tích mẫu tối đa trong giới hạn khoảng cách có thể phân tách. Nếu không có
vùng giản rộng thì thể tích tối đa của mẫu có thể lớn bằng thể tích phân tách:
VSep = VeB - VeA

PHÂN LOẠI GEL


Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố:
+ Mục tiêu của thí nghiệm (phân tích độ phân giải cao hay tách thành từng
nhóm hợp chất)
+ Khối lượng phân tử của protein mục tiêu và chất bẩn
Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là Superdex,Sephacryl, Superose và
Sphadex và Sphadex LH-20


Superdex
Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp Superdex là loại gel được lựa
chọn đầu tiên cho độ giải li cao với thời gian ngắn và độ thu hồi tốt.
Superdex được sản xuất với hai loại kích thước hạt với 4 độ chọn lọc khác
nhau (Superdex Peptide , superdex 30, Superdex 75, Superdex 200).