Nghiên cứu làm sạch bệnh virus cho cây tỏi (allium sativum l) bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem

NGUYỄN THI THANH PHƯƠNG *

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THI THANH PHƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU LÀM SẠCH BỆNH VIRUS
CHO CÂY TỎI (ALLIUM SATIVUM. L) BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MERISTEM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*
KHOÁ 2009 - 2011

HÀ NỘI – NĂM 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------NGUYỄN THI THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU LÀM SẠCH BỆNH VIRUS
CHO CÂY TỎI (ALLIUM SATIVUM. L) BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MERISTEM

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

Hà Nội – Năm 2011

i


LI CAM OAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu
của riêng tôi. Kết quả nghiên cứu trong luận văn
là kết quả lao động của chính tác giả. Các số
liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực và ch-a từng đ-ợc ai công bố trong bất cứ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc
thực hiện luận văn này đã đ-ợc cảm ơn và các thông
tin trích dẫn trong luận văn đều đã đ-ợc chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh
Ph-ơng

ii


LI CM N
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự
cố gắng của bản thân tôi đã nhận đ-ợc rất nhiều sự
quan tâm giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và ng-ời thân.
Tr-ớc tiên, tôi xin đ-ợc bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới cô giáo, nhà giáo -u tú PGS.TS. Nguyễn Thị
Lý Anh Viện Tr-ởng Viện Sinh học Nông nghiệp
Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình h-ớng
dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin đ-ợc gửi lời chân thành cảm ơn tới tập
thể các thầy cô giáo trong Viện Sinh học Nông nghiệp
Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội và tập thể các
thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và thực
phẩm, Viện Đào tạo Sau đại học Tr-ờng Đại học Bách
Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và điều kiện thuận
lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
chồng tôi, anh Đinh Tr-ờng Sơn ng-ời đã luôn ở bên
và động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất.
Đông thời, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình,
bạn bè, đồng nghiệp và những ng-ời đã ủng hộ và giúp
đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn
này.
Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2011
Tác giả luận văn

iii


NguyÔn ThÞ Thanh
Ph-¬ng

MỤC LỤC
Trang phụ bìa ...............................................................................................................i
Lời cam đoan .............................................................................................................. ii
Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii
Mục lục.......................................................................................................................iv
Danh mục các chữ viết tắt ........................................................................................ vii
Danh mục các bảng ................................................................................................. viii
Danh mục các hình vẽ, đồ thị .....................................................................................ix
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2 Mục đích, yêu cầu .......................................................................................... 2
1.2.1 Mục đích .................................................................................................. 2
1.2.2 Yêu cầu .................................................................................................... 2
CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về cây tỏi (Allium sativum. L) ....................................................... 3
2.6. Những thiệt hại do virus gây ra trên cây tỏi ................................................ 4
2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh virus trên cây tỏi ở Việt Nam và thế giới .............. 7
2.2.1 Tình hình nghiên cứu về bênh virus của cây tỏi ở Việt Nam .................. 7
2.2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh virus của cây tỏi trên thế giới ................. 8
2.3 Truyền lan của virus họ hành tỏi ..................................................................10
2.4 Phòng trừ bệnh virus hại hành tỏi ................................................................11
2.4.1 Các biện pháp nhằm ngăn chặn khả năng lây lan của vectơ truyền bệnh ....11
2.4.2 Hạn chế sự truyền lan của các virus qua vectơ truyền bệnh ..................11

iv


2.4.3 Các biện pháp tạo giống sạch bệnh .......................................................12
2.5

Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus ...................................................16

2.5.1 Phương pháp lây nhiễm cơ giới: ............................................................16
2.5.2 Phương pháp ELISA (Enzym linked immunosorbent assay):..............16
2.5.3 Phương pháp RT – PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain): ......17
2.6. Những nghiên cứu về nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) trên cây tỏi
(Allium sativum. L.).....................................................................................18
CHƯƠNG III. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......21
3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................21
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................21
3.1.2 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................21
3.1.3 Địa điểm nghiên cứu ..............................................................................21
3.1.4 Thời gian nghiên cứu .............................................................................21
3.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................21
3.2.1 Các nghiên cứu tiền đề là cơ sở cho nghiên cứu làm sạch bệnh
virus trên cây tỏi (Allium sativum. L) ...................................................21
3.2.2 Thu thập mẫu bệnh và xác định mẫu bị nhiễm bệnh virus từ các
cây tỏi thu thập ngoài đồng ruộng. ........................................................23
3.2.3 Nghiên cứu làm sạch bệnh virus cho cây tỏi ta (Allium sativum. L) ........23
3.2.4 Nghiên cứu nhân nhanh cây tỏi sạch virus ............................................24
3.2.5 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh .............................................................25
3.3 Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................26
3.3.1 Phương pháp thu thập mẫu ....................................................................26
3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào..........................................................26

3.3.3 Quy trình tách đỉnh sinh trưởng ............................................................27
3.3.4 Phương pháp đánh giá độ sạch virus của cây tỏi bằng phương
pháp lây nhiễm cơ giới. .........................................................................28
3.3.5 Phương pháp đánh giá độ sạch virus của cây tỏi bằng phương pháp RTPCR (Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction)............................28
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................30

v


CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................31
4.1 Các nghiên cứu tiền đề là cơ sở cho nghiên cứu làm sạch bệnh virus
trên cây tỏi (Allium sativum. L)...................................................................31
4.1.1 Nghiên cứu chế độ khử trùng tạo vật liệu khởi đầu...............................31
4.1.2 Nghiên cứu xác định môi trường nuôi cấy tái sinh chồi từ meristem .......33
4.2 Thu thập mẫu bệnh và xác định mẫu bị nhiễm bệnh virus từ các cây tỏi
thu thập ngoài đồng ruộng............................................................................42
4.3 Nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta (Allium sativum. L) ...................46
4.4 Nghiên cứu nhân nhanh cây tỏi sạch virus...................................................52
4.3.1 Nhân nhanh cây tỏi sạch virus bằng chồi đơn .......................................53
4.3.2 Nhân nhanh cây tỏi sạch virus bằng tái sinh chồi từ callus ...................57
4.4 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh ....................................................................61
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................65
5.1 Kết luận ........................................................................................................65
5.2 Đề nghị .........................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................68
PHỤ LỤC ..................................................................................................................73

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐTST

Chất điều tiết sinh trưởng

BA

6-Benzyl adenin

Ki

Kinetin

α NAA

α naphthuy acetic acid

IBA

3 - indolebutyric acid

2,4D

Dichlorophenoxyacetic acid

THT

Than hoạt tính

MS

Murashige và Skoog, 1962

Đ/C

Đối chứng

CT

Công thức

CTAB

Cetyl trimetyl amonium bromid

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Reverse transcriptase-PCR

Taq

Taq Polymerase

EtBr

Ethyl bromid

TN

Thí nghiệm

CTPB

Cây chỉ thị có biểu hiện nhiễm virus

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến khả năng sống và sạch của mẫu
cấy meristem (sau 6 tuần) ............................................................................31
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của Sodium Dichloroisocyanurate (NaDCC) đến khả
năng sống và sạch của mẫu cấy meristem (sau 6 tuần) ...............................32
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của
meristem (sau 6 tuần) ..................................................................................36
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng phát sinh hình thái

của

meristem (sau 6 tuần) ..................................................................................38
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của tổ hợp BA + 2,4D đến khả năng tái sinh của
meristem (sau 6 tuần) ..................................................................................40
Bảng 4.7: Ảnh hưởng của tổ hợp BA αNAA đến sự phát sinh hình thái của
meristem (sau 6 tuần) ..................................................................................41
Bảng 4.8. Chuẩn đoán, phát hiện cây bị nhiễm bệnh virus của các mẫu tỏi thu thập
ngoài đồng ruộng bằng phương pháp sử dụng cây chỉ thị ................................43

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của kích thước đến khả năng tái sinh và làm sạch virus
của meristem (sau 6 tuần) ............................................................................46
Bảng 4.10: Kết quả kiểm tra độ sạch bệnh của cây tái sinh từ các kích thước
meristem khác nhau .....................................................................................47
Bảng 4.11: Ảnh hưởng của việc kết hợp tách meristem và xử lý ribavinin đến
khả năng tái sinh và sạch virus của meristem (sau 6 tuần)..........................50
Bảng 4.12: Ảnh hưởng của BA đến sự nhân nhanh chồi tỏi (sau 6 tuần) ................53
Bảng 4.13: Ảnh hưởng của αNAA đến sự nhân nhanh chồi tỏi (sau 6 tuần) ...........55
Bảng 4.14: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA và BA đến sự nhân nhanh chồi tỏi
(sau 6 tuần) ..................................................................................................56
Bảng 4.15: Nhân nhanh cây tỏi sạch virus bằng tái sinh chồi từ callus ....................58
Bảng 4.16. Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi tỏi sạch virus .......................61
Bảng 4.17. Ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) đến sự ra rễ của cây tỏi sạch
virus (sau 4 tuần nuôi cấy)...........................................................................62
Bảng 4.18. Ảnh hưởng của tổ hợp than hoạt tính (THT) với IBA hoặc αNAA
đến sự ra rễ của cây tỏi sạch virus (sau 4 tuần nuôi cấy) ............................63

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái meristem.....................35
Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của Ki đến sự phát sinh hỉnh thái meristem .....................37
Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của kích thước đến khả năng tái sinh và làm sạch virus ..........47
Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của việc kết hợp tách meristem và xử lý hóa chất
ribavinin đến khả năng tái sinh và sạch virus ..............................................51
Biểu đồ 4.5: Nhân nhanh cây tỏi sạch bệnh virus bằng tái sinh chồi từ callus .........59
Hình 4.1. Ảnh hưởng của BA khả năng phát sinh hình thái meristem .....................36
Hình 4.2. Ảnh hưởng của 2,4D và BA đến khả năng phát sinh hình thái meristem .......39
Hình 4.3: Ảnh hưởng của BA và 2,4D đến khả năng phát sinh hình thái của meristem .....41

Hình 4.4: Mẫu tỏi biểu hiện triệu chứng bệnh virus ngoài đồng ruộng ....................43
Hình 4.5: Biểu hiện bệnh sọc vàng trên cây chỉ thị rau muối ...................................44
Hình 4.6: Kết quả kiểm tra RT – PCR ......................................................................45
Hình 4.7: Kết quả kiểm tra RT – PCR độ sạch bệnh virus của các mẫu tái sinh
từ meristem ở các kích thước khác nhau......................................................49
Hình 4.8: Kết quả kiểm tra RT – PCR độ sạch bệnh virus của các mẫu tái sinh
từ meristem trong môi trường có bổ sung ribavirin .....................................52
Hình 4.9: Ảnh hưởng của BA đến sự nhân nhanh chồi tỏi .......................................54
Hình 4.10: Ảnh hưởng của αNAA đến sự nhân nhanh chồi .....................................56
Hình 4.11: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA đến sự nhân nhanh chồi.................57
Hình 4.12: Tái sinh tạo chồi tỏi sạch virus từ callus .................................................60
Hình 4.13 : Cây tỏi hoàn chỉnh .................................................................................64

ix


CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây tỏi (còn gọi là tỏi ta, đại toán, hom kía...) có tên khoa học là Allium
sativum. L. thuộc họ hành tỏi Alliaceae, là một trong những cây trồng cổ xưa nhất
còn tồn tại đến ngày nay (trên 5000 năm). Đây vừa là cây thuốc vừa là cây rau gia
vị quan trọng, được trồng rộng rãi trên 175 quốc gia (theo FAO, 2001), đem lại nguồn
thu nhập đáng kể cho người dân. Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Tây Ban Nha, Mỹ,
Argentina và Thái Lan là những nước sản xuất nhiều tỏi nhất trên thế giới [1].
Việt Nam có các điều kiện thuận lợi cho việc trồng tỏi và đã hình thành nhiều
vùng chuyên canh có tiếng như Tiên Sơn (Bắc Ninh), Mê Linh (Vĩnh Phúc), Hà
Nội, Hưng Yên, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Đà
Lạt... (Tạ Thu Cúc và cộng sự, 2000) [1].
Tỏi là cây vụ đông quan trọng của vùng đồng bằng sông Hồng, có hiệu quả
kinh tế hơn so với các cây trồng khác như lúa, bí xanh, dưa lê... Trong dân gian, tỏi

thường được giữ giống và nhân giống vô tính bằng các nhánh tỏi (ánh tỏi, tép tỏi,
căn tỏi) từ năm này qua năm khác. Mặc dù các phương pháp giữ giống truyền thống
có ưu điểm là giống có khả năng thích ứng rộng, dễ bảo quản và vận chuyển, nhưng
nhược điểm là các bệnh virus nguy hiểm trên tỏi thường gặp như vàng lùn hành tây
(Onion yellow dwarf virus-OYDV), sọc vàng tỏi tây (Leek yellow stripe virusLYSV), Tomato black ring virus (TBRV), Shallot latent virus (SLV)... thường lan
truyền từ vụ này qua vụ khác gây nhiều thiệt hại, có khi gây mất mùa cục bộ. Ở
nước ta, hai loại bệnh OYDV và LYSV gây thiệt hại mạnh nhất, tỉ lệ thiệt hại lên
tới 20 - 30% cây giống, có ruộng nhiễm nặng tới 80%, ngoài ra, số cây giống có thể
ẩn triệu chứng chiếm 10 - 20%, (Vũ Triệu Mân và cộng sự, 2001) [3].
Sự nhiễm do virus đã làm giảm đáng kể về năng suất cũng như chất lượng củ
tỏi, do vậy bên cạnh những biện pháp truyền thống như chọn lựa hạt giống và cây
con khoẻ khi đưa ra ngoài sản xuất thì việc xây dựng quy trình tạo giống tỏi sạch
bệnh là yêu cầu cấp bách đặt ra trong thực tiễn sản xuất.

1


Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
làm sạch bệnh virus cho cây tỏi (Allium sativum. L) bằng kỹ thuật nuôi cấy
meristem”.
1.2. Mục đích, yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Sử dụng kỹ thuật tách và nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng (meristem) nhằm
tạo ra cây tỏi sạch bệnh virus cung cấp nguồn nguyên liệu phục vụ cho sản xuất
giống tỏi sạch bệnh, chất lượng cao.
1.2.2. Yêu cầu
- Thu thập các mẫu cây tỏi bị bệnh virus làm nguyên liệu nghiên cứu.
- Xác định được chế độ khử trùng tạo vật liệu khởi đầu thích hợp.
- Xác định được môi trường thích hợp cho tái sinh đỉnh sinh trưởng.
- Xác định được kích thước meristem thích hợp cho nuôi cấy tái sinh cây và

làm sạch bệnh virus.
- Xác định được ảnh hưởng của ribavirin đến khả năng tái sinh và làm sạch
bệnh virus.
- Xác định được môi trường nhân nhanh thích hợp cho cây tỏi sạch bệnh
virus.
- Xác định được môi trường tạo cây hoàn chỉnh thích hợp cho cây tỏi sạch
bệnh virus.

2


CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây tỏi (Allium sativum. L)
Tỏi là loại cây trồng cổ xưa có nguồn gốc ở vùng Trung Á, hiện vẫn tìm thấy
loài tỏi đặc hữu mọc hoang dại ở Kyrgyzstan, Tajikistan, Turkmenistan và
Uzbekistan. Từ 3000 năm trước công nguyên, tỏi đã được biết đến ở Hy Lạp. Ở Ấn
Độ và Trung Quốc, tỏi cũng là cây trồng từ thời cổ đại. Người Tây Ban Nha, Bồ
Đào Nha và Pháp đã đưa cây tỏi từ châu Âu sang châu Mỹ. Ngày nay, có khoảng
300 giống cây tỏi được trồng rộng rãi trên khắp thế giới, từ vùng có khí hậu nhiệt
đới xích đạo đến vĩ tuyến ở cả hai bán cầu.
Trước đây, trong một thời gian dài, cây tỏi được xếp vào họ Liliaceae (họ
hoa Lily) do hoa của chúng thuộc loại bầu thượng. Nhưng sau đó một số nhà thực
vật học đã đổi thành họ Amarylliadaceae (họ thủy tiên) do hoa được sinh ra ở lá
bắc, hình tán, nằm trên ngọn của cán hoa. Gần đây để tránh sự xáo trộn, J.G.Agard
đã phân loại tỏi vào chi Allium thuộc họ Alliaceae (họ Hành tỏi). Đây là một họ
thực vật lớn có khoảng 30 chi với hơn 600 loài (Tạ Thu Cúc và cộng sự, 2000 [1]).
Các giống tỏi trồng phổ biến hiện nay đều có số nhiếm sắc thể 2n = 16. Ở vùng
Campania, Italia người ta đã tìm thấy dạng tỏi tứ bội có bộ nhiễm sắc thể 4n = 32.
Theo H. Stavělíková, 2008 [26] diện tích canh tác tỏi trên thế giới năm 2006
vào khoảng 1.166.000 ha cho sản lượng hơn 15 triệu tấn. Tỏi đã trở thành cây rau

gia vị quan trọng, được trồng nhiều ở các nước Trung Quốc, Hoa Kỳ, Ấn Độ và các
nước Châu Âu, Châu Á, Châu Phi. Trong đó, Châu Á là khu vực có diện tích trồng
tỏi lớn nhất khoảng 956.000 ha, đạt sản lượng 13.396.000 tấn, tiếp đó là Trung
Quốc, với diện tích 657.250 ha, sản lượng đạt 11.587.000 tấn.
Không chỉ được sử dụng làm nguồn thực phẩm, tỏi còn là một loại dược liệu
quý được biết đến từ lâu do khả năng diệt khuẩn, tỏi được cho là là “chất Penicillin
của thiên nhiên”. Tỏi có tác dụng làm tăng nhiệt cơ thể nhanh vì trong 100g tỏi ăn
được có tới 121 calo (khoai tây chỉ có 94 calo), làm giảm lượng cholesterol trong
máu, ngăn ngừa bệnh tim mạch. Theo nhiều tài liệu phân tích thức ăn của Việt

3


Nam, cứ trong 100g tỏi tươi có 62,8% là nước; 6,3% protein; 29% hydratcacbon;
0,1% chất béo; 24mg Ca; 31mg P; 1,3mg Fe; 0,24mg Vitamin B1; 0,03mg Vitamin
B2; 0,9mg Vitamin PP; 3mg Vitamin C.
Ở nước ta, hiện nay hành tỏi là cây trồng vụ đông quan trọng của nhiều vùng
như Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú
Yên... và là một trong 3 loại sản phẩm giữ vai trò chính trong mặt hàng gia vị xuất
khẩu của Việt Nam với sản lượng lên tới 2.000 tấn/năm. Năm 2010, Hải Dương là
vùng trồng hành, tỏi lớn nhất vùng đồng bằng sông Hồng, với diện tích hơn 5.100
ha, tổng sản lượng hơn 51.000 tấn/năm. Ngoài ra, phải kể đến vùng trồng tỏi nổi
tiếng Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi, toàn huyện hiện có 310ha trồng tỏi. Vụ đông xuân
2009 - 2010, Lý Sơn được mùa tỏi với sản lượng trên 2.200 tấn, đã thu về khoảng
150 tỉ đồng cho người nông dân [49], [50].
Những giống tỏi chủ yếu đang trồng phổ biến ở nước ta có hai nhóm là: tỏi
trắng và tỏi tía. Nhóm tỏi trắng (Allium sativum sativum) có củ to (4 - 4.5cm), lá
lớn, cổ tỏi và vỏ củ có màu trắng sữa đến trắng, thời gian sinh trưởng dài, năng suất
cao, đều là các giống nhập nội. Nhóm tỏi tía (Allium sativum ophioscorodon) có kích
thước củ nhỏ (3 – 4cm); lá xanh đậm, thơm, nhiều tinh dầu, củ non có màu tím tía.

Hệ rễ tỏi thuộc rễ chùm, phát triển kém, rễ tập trung ở lớp đất mặt, khả năng
chống chịu khô hạn, ngập úng kém. Vì thế đất trồng thích hợp là dạng cát pha, thịt
nhẹ, khi trồng phải lên luống để tránh úng ngập nhưng cũng cần tưới ẩm thường
xuyên. Là cây sống hàng năm, tỏi là dạng cây thảo nhỏ, cao khoảng 30 – 40cm, thân
hành ngắn, hình tháp gồm nhiều hành con gọi là nhánh tỏi (ánh tỏi, tép tỏi, căn tỏi).
Khác với dạng ống của là hành, lá tỏi là một bản hẹp, dài, mềm, có lớp sáp rất mỏng
che phủ để chống mất nước và bảo vệ lá.
Ở nước ta, tỏi trồng bằng các nhánh tách từ củ, thời vụ thích hợp từ 25/9 tới
5/10 hàng năm. Củ tỏi thương phẩm được thu hoạch sau khi trồng 125 – 130 ngày.
Mỗi ha trung bình đạt 5-8 tấn củ khô.
2.6. Những thiệt hại do virus gây ra trên cây tỏi
Các cây họ hành tỏi bị tấn công bởi khoảng 50 bệnh trong đó 34 bệnh gây ra
bởi nấm, 7 bệnh vi khuẩn và nấm men, 5 bệnh tuyến trùng, 3 bệnh virus và một bởi

4


Mycoplasma (Schwartz và Mohan, 1995 [35]). Các bệnh do nấm, vi khuẩn, tuyến
trùng như: thối ướt, thối khô, mốc đen, khô, xanh, mốc lớn… hầu hết đều có thể
phòng trừ được thông qua các biện pháp phun thuốc hóa học, kỹ thuật canh tác,
phơi khô củ bảo quản… Với các bệnh do virus gây ra rất khó phòng tránh do virus
ký sinh hoàn toàn trong tế bào ký chủ sử dụng chính quá trình trao đổi chất của tế
bào ký chủ để nhân lên. Do được nhân giống vô tính nên tỷ lệ cây giống nhiễm
bệnh ngày càng tăng sau mỗi vụ. Ngoài ra, virus dễ dàng lây lan qua các vết thương
cơ giới và các vectơ truyền bệnh như rệp, nhện,… do đó không thể sử dụng biện
pháp thông thường để phòng tránh bệnh và ngăn chặn sự phát triển bệnh. Vì vậy
bệnh virus dễ phát triển trên diện tích rộng, từ năm này qua năm khác, bệnh không
chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất mà còn tới chất lượng sản phẩm.
Tại Mỹ tháng 6 năm 2005, S.L.Gieek đã công bố có tới 50% diện tích trồng
tỏi bị nhiễm các virus gây khảm và vàng cây như OYDV, LYSV, GCLV.

Klukackova, M. Navratil và M. Duchoslav, 2007 [27] nghiên cứu trên tỏi đã
phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm trung bình ở Cộng hòa Séc khoảng 75,4% OYDV; 31,2%
LYSV; 99,6% GarCLV và 81,1% SLV.
Lot H., Chovelen V., Souche S. và Delecolle, 1998 [29] đã điều tra nghiên
cứu về ảnh hưởng của OYDV và LYSV trên 3 giống tỏi trồng phổ biến ở Pháp là
Gernidowr, Printanor, Messidrome. Kết quả OYDV làm giảm tới 39% trọng lượng
củ ở giống thứ nhất và nên tới 60% ở hai giống còn lại. Trong khi đó, LYSV làm
giảm trọng lượng củ tương ứng ở 3 giống 26%, 54% và 17%. Củ thường bị móp,
các nhánh tép teo không đều.
Ở Australia, các giống tỏi được trồng bị giảm năng suất là do virus và tác
nhân gây bệnh được tìm thấy là LYSV và OYDV, trong đó LYSV có thể làm giảm
tới 15 - 50% năng suất tỏi (Gisele Irvine và Samantha Sterling, 2002 [24]). Ở
Argentina, LYSV được tìm thấy trên tỏi chiếm tới 80 - 98%, virus này làm giảm
44% trọng lượng và 13% đường kính củ, có khi giảm tới 60% năng suất nếu dùng
củ làm giống trong 5 năm liên tục (Vilma, Conci, Ana Canavelli, P Lunello, Di
Rienco, 2003).

5


Tháng 6 năm 2005, S. L. Gieck đã cống bố có tới 50% diện tích trồng tỏi bị
nhiễm các virus gây khảm và vàng cây như OYDV, LYSV, GCLV ở vùng Oregon, Mỹ.
Tiềm năng năng suất mất đi của tỏi (Allium sativum) do nhiễm OYDV dao
động từ 39% đến 60% phụ thuộc vào từng giống (Lot. H và cộng sự, 1998 [29]).
Tây Âu là vùng sản xuất tỏi tây (Allium porrum) lớn nhất thế giới. Các vụ tỏi thu và
đông đều xuất hiện LYSV, đây là virus gây hại nặng ở tất cả các giống trên các
vùng trồng tỏi thương mại. LYSV gây giảm năng suất tới 50% (Diekmann M.,
FAO/IPGRI, 1995 [23]).
Trung Quốc là nước trồng tỏi lớn nhất, chiếm 1/2 diện tích châu Á và 1/3
diện tích của thế giới, cũng bị tổn thất nặng nề bởi bệnh virus trên tỏi. Tỏi thương

phẩm có chứa ít nhất hai loài virus; các virus này làm lá cây bị bệnh có màu vàng,
cây không cho hoa, chất lượng củ xấu (Xu và cộng sự, 2000 [45]; Zhao và Xue
2002 [46]). Tại Trung Quốc, nhiễm virus OYDV đã làm giảm năng suất 47,60%
trong đó, chiều dài thân giả giảm 27,75%, số lượng lá giảm 14%, trọng lượng cây
giảm 56,24%, số lượng củ giảm 58,78%, số lượng nhánh giảm 47,37% và trọng
lượng nhánh giảm 71,92%. Sự giảm ở các chỉ tiêu trên cũng sảy ra với giống tỏi địa
phương Baladi- Ai Cập lần lượt là 16,79%, 20,10%, 47,12%, 46,56% 20,02%, và
44,90% (S. Elnagar, MAK El - Sheikh và AS Abdel Wahab, 2009 [36]). Các kết
quả trong nghiên cứu này đã chứng minh rõ ràng tác động của virus OYDV đối với
sản lượng của hành tây và tỏi so với những cây không bị bệnh.
Theo báo cáo của hội nghị về công nghệ trong nông nghiệp tổ chức ở Ai Cập
2009 thì cây hành bị bệnh OYDV bị giảm 27,42% chiều dài thân giả, 29,14% số
lượng lá ( 8,75 lá/cây khỏe mạnh giảm xuống còn 6,2 lá/cây bị nhiễm bệnh), 31.9%
trọng lượng cây (trọng lượng trung bình của cây khỏe là 118,1g so với cây bị bệnh
là 80,36 g) và 41,8% trọng lượng củ (trọng lượng trung bình của củ bị nhiễm bệnh
62,61 g/củ bị giảm nhiều so củ không bị bệnh 107,5 g).
Cây hành tỏi bị nhiễm virus còn bị giảm số lượng hoa, số lượng hạt giống và
chất lượng hạt giống (Bos L., 1982 [14]). OYDV có thể làm giảm quá trình sản xuất
hạt giống của cây hành tây giống lên đến 50% tuy nhiên không ảnh hưởng tới sức
sống hạt giống. Tổng thiệt hại do bệnh OYDV thay đổi theo tuổi cây tại thời điểm

6


nhiễm bệnh (Darin, 1997 [22]), bệnh nhiễm khi cây còn non thì năng suất thiệt hại
càng lớn ( S. Elnagar, MAK El - Sheikh và AS Abdel Wahab, 2009 [36]), Canavelli
và cộng sự, 1998 [17]) báo cáo rằng củ từ cây bị bệnh giữ kém trong kho dự trữ.
2.2. Tình hình nghiên cứu về bệnh virus trên cây tỏi ở Việt Nam và thế giới
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về bênh virus của cây tỏi ở Việt Nam
Bệnh virus trên cây hành tỏi ở nước ta được phát hiện lần đầu tiên năm 1993

[2]. Theo Vũ Triệu Mân và Bùi Trọng Thuỷ, có hai loài là virus gây bệnh vàng lùn
(OYDV) và virus gây bệnh sọc vàng (LYSV) gây hại trên cây hành tây. Các tác giả
đã mô tả được triệu chứng, bước đầu điều tra đánh giá mức độ gây hại từ giai đoạn
vườn ươm đến khi thu hoạch.
+ Bệnh vàng lùn hành tây (Onion yellow dwarf virus): Lá cây bị nhiễm bệnh
có hiện tượng biến thành mầu vàng và rất còi cọc. Nếu bệnh nhiễm sớm, cây không
phát triển được, lá màu vàng nhạt uốn cong, cây dần tàn lụi. Cây con sau 15 ngày lá
có màu sẫm ống lá to và mập hơn và chớm có sắc vàng. Nếu nhiễm muộn cây sinh
trưởng nhiều nhánh nhỏ, lá mọc thành chùm rũ cong xuống cây khô chết dần củ
không hình thành mà kéo dài thành thành một đoạn thân.
Theo các tác giả trên thiệt hại của bệnh vàng lùn là làm giảm số lượng và
chất lượng cây giống ở giai đoạn vườn ươm và củ trong sản xuất. Vùng Võ Cường Bắc Ninh, Tiền Phong - Mê Linh - Vĩnh Phúc tỷ lệ bệnh lên tới 20 - 30% số cây
giống, 10 - 20% số cây giống có thể ẩn triệu chứng, có ruộng giống nhiễm nặng tới
80% số cây giống. Ngoài hai vùng trồng hành tuyền thống trên, các vùng trồng mới
như Nam Sách - Hải Dương, Thuỷ Nguyên - Hải phòng cũng thấy xuất hiện bệnh.
Các giống hành Mỹ (Sunseed) nhiễm nặng hơn giống hành Nhật (Tokila) và
các giống Pháp, Bungari. Giai đoạn 20 - 25 ngày sau khi gieo hạt là giai đoạn mẫn
cảm nhất của bệnh.
+ Bệnh sọc vàng hành tây (Leek yellow stripe virus): Về triệu chứng, cây
bệnh lúc đầu có lá xanh đậm, dày và thô hơn cây bình thường sau đó lá xuất hiện các
sọc màu trắng nhạt theo chiều dài lá hành, sọc có viền vàng nhạt. Trên một lá có thể
có một hay nhiều sọc. Khi bệnh đã phát triển các sọc vàng, lá thô cứng, cây còi cọc.

7


Trên hành tây bệnh xuất hiện nhiều nhất ở giai đoạn cây bắt đầu có củ
khoảng 40 ngày sau trồng. Cây hành nhiễm bệnh có 2 - 3 thân giả hầu như không
cho thu hoạch.
Ngoài ra, một số tác giả khác như Nguyễn Hữu Thủy, 2007 [7] đã tiến hành

điều tra bệnh virus cây họ hành tỏi tại 5 điểm Gia Lâm, Từ Liêm – Hà Nội, Văn
Lâm – Hưng Yên, Đại Phúc – Bắc Ninh và Mê Linh – Vĩnh Phúc thu được kết
quả như sau: Tỷ lệ tỏi ta bị nhiễm bệnh sọc vàng LYSV 110 ngày sau trồng ở Đặng
Xá là 4,3 %, Đại Phúc là 14 %. Đối với tỏi tây 105 ngày sau trồng tỷ lệ nhiễm
LYSV ở 3 vùng Tây Tựu, Văn Lâm – Hưng Yên, và Mê Linh lần lượt là 14%,
10,9%, 10,5%. Tình hình nhiễm bệnh virus trên cây hành đẻ Bắc Ninh cũng khá
trầm trọng ở Đại phúc Bắc Ninh tỷ lệ bệnh là 15,6%, còn ở Tây Tựu tỷ lệ bệnh là
9,2% (Phạm Thị Thu Trang, 2007 [8]).
Tóm lại nghiên cứu về bệnh virus ở nước ta trên cây họ hành tỏi còn rất ít và
chỉ dừng ở mức độ điều tra, mô tả triệu chứng. Từ năm 1993 đến nay chưa có thêm
một nghiên cứu nào thêm về các loại virus gây hại trên hành tỏi ở Việt Nam trừ một
nghiên cứu mới đây nhất của Cuong Viet Ha, 2007 [21], bằng phương pháp RT PCR tác giả đã xác định có 3 loài virus là OYDV (Onion yellow dwarf virus), LYSV
(Leek Yellow Stripe Virus), SYLV (Shallot yellow stripe virus) gây hại ở Việt Nam.
2.2.2. Tình hình nghiên cứu về bệnh virus của cây tỏi trên thế giới
Van Regenmortel và cộng sự, 2000 [40] đã định danh được 23 loài virus
thuộc 5 họ virus gây bệnh trên các cây họ hành tỏi: Flexiviridae, Potyviridae
Reoviridae, Tombusviridae, Bunyaviridae trong đó có 3 loài virus gây bệnh phổ
biên nhất là: Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek Yellow Stripe Virus
(LYSV), Shallot yellow stripe virus (SYSV).
+ OYDV (Onion yellow dwarf virus) lần đầu tiên mô tả bởi Melhus và cộng
sự, 1929 [33], Bos L., 1976 [13], OYDV có dạng sợi mềm dài không có vỏ bọc bên
ngoài, kích thước 722 - 823 nm x 16 nm thuộc nhóm potyvirus. Thể vùi của virus
trong tế bào lá hành thường giống như 2 mảng hình bầu dục xếp sít hay hơi chồng
lên nhau có màu đậm nhạt khác nhau kích thước 20 micromet.

8


Theo Bos L., 1976 [13] và những nghiên cứu mới nhất của A.S. Abdel
Wahab, S. Elnagar và M.A.K. El-Sheikh, 2009 [36] đều mô tả triệu chứng điển hình

do potyvirus OYDV gây ra trên hành tây là khảm, sọc vàng, cây còi cọc, lùn tịt, lá
quăn, biến dạng cành mang hoa, không có củ hoặc củ nhỏ
+ LYSV (Leek yellow stripe virus) và SYSV (Shallot yellow stripe virus) có
dạng sợi mềm dài, không có vỏ bọc chiều dài xác định lần lượt là 820 nm và 750nm.
Trên cây tỏi tây (Allium porrum) bị nhiễm LYSV trên lá xuất hiện các sọc
vàng đứt đoạn theo chiều dọc của lá.
Một số loài virus gây hại cây họ hành tỏi đã được xác định
(Theo Van Regenmortel và cộng sự, 2000 [40].)
Họ

Nhóm

Carlavirus

Loài

Tác giả

Garlic common latent virus (GCLV)

VanDijjk et al, 1993

Garlic latent virus (GLV)

Lee, 1979

Shallot latent virus (SLV)

Bos et al, 1978

Garlic mosaic virus (GarMV)

Van Dijk,1993

Garlic

mite-borne

filamentous

virus Barg et al, 1994

(GMbFV)
Flexiviridae
Allexivirus

Garlic virus A (GarV-A)

Sumi et al, 1993

Garlic virus A (GarV-B

Sumi et al, 1993

Garlic virus A (GarV-C)

Sumi et al, 1993

Garlic virus A (GarV-D)

Sumi et al, 1993

Garlic virus A (GarV-X)

Song et al, 1998

Shallot virus X (ShV-X)

Vishnichenko,1991

Garlic mite-borne latent virus (GMbLV)

Barg et al, 1997

Onion mite-borne latent virus (OMbLV)

VanDijk, 1991

Shallot mite-borne latent virus (ShMbLV) VanDijk, 1991

Potyviridae

Potyvirus

Onion yellow dwarf virus (OYDV)

Methus et al, 1929

Leek Yellow Stripe Virus (LYSV)

Bos et al , 1978

Shallot yellow stripe virus (SYSV)

VanDijk et al, 1993

Wakegi yellow dwarf virus (WYDV)

Tsuneyshi et al, 1997

Welsh
Reoviridae

onion

yellow

stripe

virus VanDijk et al, 1991

Fijivirus

Garlic dwarf virus (GDV)

Los et al, 1998

Tombusviridae

Necrovirus

Leek White Stripe Virus (LWSV)

Van

Bunyaviridae

Tospovirus

Tomato spotted wilt virus (TSWV)

Brittlebank, 1919

9

Regenmortel,


Bos L. và cộng sự, 1978 [15] đã mô tả triệu chứng điển hình do virus OYDV
gây ra trên cây tỏi là toàn cây bệnh bị vàng lá, uốn cong, cây còi cọc, lá dày, không
lớn, tạo nhiều nhánh nhỏ, không có củ hay củ nhỏ. Các cây tỏi bị nhiễm virus
LYSV đều xuất hiện các sọc vàng đứt đoạn chạy dọc theo chiều lá, cây có 2 - 3 thân
giả và không cho thu hoạch. Theo Barg E. và cộng sự, 1994 [10], virus SYSV đã
được ghi nhận gây bệnh trên cây tỏi giai đoạn còn non. Cây non bị bệnh có các sọc
màu trắng sữa dọc lá, lá cong uốn, thô cứng. Đến giai đoạn thu hoạch, xuất hiện các
sọc vàng rõ rệt trên lá già, cây còi cọc, thấp lùn hơn so với các cây xung quanh.
2.3. Truyền lan của virus họ hành tỏi
Theo Conci và cộng sự, 2002 [18], rệp là tác nhân truyền bệnh của nhiều loại
virus như Potyvirus (OYDV, LYSV), Calarvirus (GLCV, SLV), trong khi nhện là
tác nhân truyền bệnh cho các vi rirus thuộc nhóm Allexivirus (Garlic virus A, B, C

và D). Đây là những nhóm gây hại chính có mặt ở hầu hết các vùng trồng tỏi lớn
trên thế giới như Mỹ, Canada, Nhật Bản, Australia, Hà Lan…
Có hơn 50 loài rệp có thể truyền được virus OYDV (Bos, 1976 [13]). Rệp
đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii) không chỉ truyền bệnh ngoài đồng
mà còn có thể truyền cả trong kho bảo quản từ củ hành hay mầm của cây nhiễm
bệnh qua cây khoẻ khác. M. ascalonicus cũng là loài rệp truyền được trong kho bảo
quản. Các loài khác như M. certus, M. humuli, A. fabae, Macro sifohum,
Rhopalosiphum insertum, R. maydis… cũng có khả năng truyền cả ba loài virus trên.
Khi nghiên cứu về sự truyền lan của OYDV, Hardtl, 1962, 1972 cho rằng virus này
có thể nhiễm qua hạt giống hành tây với tỷ lệ từ 6 - 29%. Bos và cộng sự, 1978 [15]
thì cho rằng trong tự nhiên OYDV không truyền từ cây tỏi (Allium sativum) xang tỏi
tây (Allium porum) và ngược lại. Virus cũng không truyền qua hạt giống và qua hạt
phấn (Bos, 1976 [13]; Loui và Lorbeer, 1966 [30]). Cũng theo các tác giả trên và Van
dijk, 1993 [38] thì các virus đều truyền qua xây xát cơ giới. Không có tài liệu nào
thông báo về các loài virus này có khả năng truyền qua tuyến trùng hay nấm.
Cách thức và nguồn bệnh lây truyền virus chủ yếu là qua củ giống và các cây
qua đông. Theo Walkey, Atil, Ballooned và Millar, 1987, 1989 [43], [44], các virus
tồn tại trong củ qua các năm và lây nhiễm cho cây con khi người dân dùng củ làm

10


giống. Báo cáo khác của Miyuki Takaichi, Takayuchi Nagakubo, Kenji Oeda, Nhật
Bản, 2001 [33] tỷ lệ cây nhiễm triệu chứng tăng theo số năm liên tục để củ giống tỏi.
2.4. Phòng trừ bệnh virus hại hành tỏi
Virus là tác nhân gây bệnh kí sinh hoàn toàn bên trong tế bào ký chủ vì vậy
việc phòng trừ bệnh virus hại cây trồng rất khó khăn đặc biệt với nhóm non persistant như OYDV, LYSV, SYLV lại càng khó khăn hơn vì nhóm virus này có
thời gian truyền bệnh rất ngắn, có khi chỉ cần 10 - 60 giây là vectơ truyền virus đã
thực hiện xong việc truyền virus của nó. Chính vì thế mà mọi nỗ lực nhằm ngăn
chặn hoặc kìm hãm sự lan truyền của các virus trên trên đồng ruộng bằng phương

pháp sử dụng thuốc học là không hiệu quả. Để phòng trừ các virus này cần phải
phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.
2.4.1. Các biện pháp nhằm ngăn chặn khả năng lây lan của vectơ truyền bệnh
+ Vệ sinh đồng ruộng, trừ bỏ các cây ký chủ dại trong ruộng (cả đường đi và
trong luống) và xung quang cánh đồng trồng hành hoặc phun thuốc trừ rệp muội
Aphididae vào các cây dại trước mỗi vụ trồng hành tỏi để loại bỏ nguồn bệnh và nơi
cư trú môi giới.
+ Trồng hành tỏi vào thời kì không có rệp hoặc có nhưng với mật độ thấp.
+ Nhổ bỏ sớm các cây có biểu hiện triệu chứng để hạn chế nguồn bệnh ban đầu
là một biện pháp có hiệu quả cao trong việc ngăn chặn sự lan truyền gây hại của bệnh.
+ Sản suất cây con sạch bệnh trong nhà lưới hoặc che chắn vườn ươm bằng
các vật liệu khác để hạn chế môi giới xâm nhập vào vườn ươm. Cần có biện pháp áp
dụng kết hợp cả trong vườn ươm và ngoài đồng ruộng.
2.4.2. Hạn chế sự truyền lan của các virus qua vectơ truyền bệnh
Sử dụng thuốc hoá học để trừ rệp muội nhằm ngăn chặn sự lan truyền của
OYDV, LYSV, SYLV trên đồng ruộng là không có hiệu quả khi rệp mang virus đã
xuất hiện, do vậy, việc phun định kỳ thuốc trừ sâu trong suốt thời kì vườn ươm và
đồng ruộng có vai trò quan trọng nhằm hạn chế sự truyền lan của virus thông qua
các vectơ truyền bệnh.

11


2.4.3. Các biện pháp tạo giống sạch bệnh
Nguồn virus chủ yếu là từ củ giống đã nhiễm bệnh từ vụ trước vì vậy cần
loại bỏ những củ bị nhiễm bệnh, lựa chọn những củ sạch bệnh để giống, không để
giống củ liên tục trong nhiều năm.
Bên cạnh những biện pháp truyền thống như chọn lựa hạt giống và cây con
khoẻ khi đưa ra ngoài sản xuất, dùng thuốc hoá học phòng trừ môi giới truyền bệnh
thì các quốc gia như Nhật Bản (Walkey, D. G. A., Ebb, M. J. W., Ballooned, 1987

[44]), Myanmar, Philippin, Braxin, Nertherland (Conci, V. C., và Nome, S. F., 1992
[19]; Verbeek, M., P. Van Dijk và P.M.A. Van Well, 1995 [41] đã tạo cây con sạch
bệnh thành công trên tỏi ta (Allium sativum), trên

hành (Allium cepa var.

ascalonicum) bằng phương pháp nuôi cấy mô.
Có một số phương pháp làm sạch virus trong nuôi cấy in vitro như sau:
2.4.3.1. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh:
Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh là tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích
thước nhỏ hơn 0,3mm, nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái
sinh bằng các phương pháp khác nhau nhằm thu được cây sạch bệnh virus.
Cơ sở và nguyên lý:
Bệnh virus hại thực vật là một loại bệnh nguy hiểm dễ lan truyền qua nhân
giống vô tính (do tồn tại trong các bộ phận sống). Khác với các bệnh gây ra do nấm
và vi khuẩn, virus là loại bệnh không thể chữa được trong khi gây tổn thất rất lớn về
năng suất, phẩm chất và lan truyền qua các thế hệ khi nhân giống vô tính gây ra
hiện tượng thoái hóa giống. Chính vì thế, việc tạo ra các giống cây sạch virus là
biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất cả các cây nhân giống vô tính và cũng là
một biện pháp phục tráng giống hiệu quả cho các giống đã bị thoái hóa do virus
(Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004 [6]). Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một
công cụ hữu hiệu để thực hiện mục tiêu trên.
Đỉnh sinh trưởng (meristem) có đường kính khoảng 0,1mm, dài 0,25 – 0,3mm
nằm trên cùng của mô phân sinh đỉnh. Nếu nuôi cấy trong môi trường thích hợp, mỗi
đỉnh sinh trưởng sẽ phân hóa tạo thành một hoặc nhiều cây con hoàn chỉnh.

12


Theo những nghiên cứu của White, 1934, Limasset và Cornuet, 1950 virus

không tồn tại ở mô phân sinh đỉnh và lớp lá bao thứ nhất, lượng virus sẽ tăng dần
lên ở các lớp lá nằm phía dưới. Dựa vào kết quả trên, White, Limasset và Cornuet
đã đề xuất kỹ thuật nuôi cấy meristem (đỉnh sinh trưởng thuộc mô phân sinh đỉnh)
để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh. Morel và Martin, 1952 là
những người đầu tiên tạo ra các cây thược dược khỏe từ cây bệnh thông qua kĩ thuật
này. Từ đó đến nay, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã được áp dụng rộng rãi để nhân vô
tính sạch virus ở rất nhiều loại cây trồng.
Các giả thuyết giải thích hiện tượng mô phân sinh đỉnh không có virus do:
+ Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có ở mô
phân sinh đỉnh.
+ Trong khi phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao
chép các thông tin di truyền của virus.
+ Sự phân chia rất nhanh của các tế bào mô phân sinh dẫn tới virus không
thể lan truyền qua plasmodesmata.
+ Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác
trong cây.
+ Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép
virus (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004 [6]).
Hiệu quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được đánh giá bằng tỉ lệ hình thành cây
con và độ sạch virus. Điều này tùy thuộc rất lớn vào loại cây trồng, loại virus và
kich thước đỉnh sinh trưởng khi nuôi cấy. Một số virus có thể bị loại trừ dễ dàng, số
khác thì khó hơn. Nhìn chung mẫu đỉnh sinh trưởng lấy càng to thì tỉ lệ tái sinh càng
cao, nhưng số cây sạch bệnh virus lại càng giảm. Số mầm ở đỉnh sinh trưởng có vai
trò quan trọng trong việc làm sạch virus, nếu đỉnh sinh trưởng có 1 – 2 mầm sẽ loại
trừ virus tốt hơn (Phan Hữu Tôn, 2005 [5]).
Sau khi tái sinh được cây sạch virus từ các cây bị nhiễm bệnh thì việc nhân
nhanh và duy trì độ sạch bệnh của chúng có ý nghĩa quan trọng quyết định. Các cây,
củ sạch bệnh tạo ra từ cây, củ cấy mô phải được trồng trong điều kiện cách ly với

13

các nguồn gây bệnh và vectơ truyền bệnh. Sau giai đoạn nhà màn, nhà lưới là giai
đoạn nhân nhanh giống ở vùng cách ly (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004 [6]).
Cho đến nay, kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã được ứng dụng rất hiệu
quả trong việc làm sạch virus cho nhiều loại cây trồng, tạo ngân hàng cây giống
sạch bệnh, phục vụ cho sản xuất. Tại trung tâm nghiên cứu Nông Nghiệp Cent –
Nhật Bản, 20 loại virus đã được loại bỏ nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và 12 chi với
khoảng 50 giống cây trồng đã trở nên sạch bệnh virus. Người ta đã dùng phương
pháp này để làm sạch virus khảm cây sắn, mía, súp lơ, tỏi; virus khảm dưa chuột,
chuối; virus X, Y, S, A, M... Hiện nay, trên 10% diện tích khoai tây ở Trung Quốc
đang trồng giống sạch virus thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Các trung tâm
nghiên cứu quốc tế như CIAT ở Colombia, IITA ở Nigeria đang phổ biến nuôi cấy
sinh trưởng làm sạch virus trên đối tượng cây sắn, khoai tây và khoai lang cung cấp
cho nhiều quốc gia (Phan Hữu Tôn, 2005 [5]).
Theo Mai Thị Tân, 1998 [4]), phương pháp làm sạch virus này đã được áp
dụng trên nhiều đối tượng như cây lương thực (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ,
khoai sọ, củ từ, ngô, sắn...), cây ăn quả (nho, táo tây, mâm xôi, dâu tây...), hoa cây
cảnh (cúc, loa kèn, lay ơn, phong lan...), cây rau gia vị (hành lá, tỏi ta, ớt ngọt, củ
cải, cà chua...), cây dược liệu (địa hoàng...).
Như vậy, bằng việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, chúng ta có
thể chủ động tạo ra những cây, củ giống sạch bệnh làm trẻ hóa cây trồng, cải thiện
chất lượng cây giống, nâng cao năng suất hoặc dùng làm vật liệu ban đầu sạch bệnh
cung cấp cho việc lai tạo giống mới.
2.4.3.2. Vi ghép:
Vi ghép là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng
bệnh trong điều kiện invitro để sản xuất cây sạch bệnh virus. Kỹ thuật này thường
sử dụng cây thân gỗ đặc biệt họ cam chanh.
2.4.3.3. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao:
Ở nhiệt độ 36 - 37oC thì một số loài virus không có khả năng nhân bản hoặc

khả năng nhân bản giảm đi. Cơ chế ảnh hưởng của nhiệt độ lên virus thực vật vẫn
chưa được làm sáng tỏ. Tuy nhiên, nghiên cứu của Mink và cộng sự năm 1998 cho

14


thấy: quá trình sinh tổng hợp protein di chuyển và protein vỏ của virus khá mẫn cảm
với nhiệt độ. Hai protein trên liên quan đến sự lây lan của virus giữa các tế bào (cellto-cell movement) cũng như sự vận chuyển của virus trong hệ thống mạch dẫn.
Lợi dụng đặc tính trên có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh với xử lý nhiệt độ để tẩy sạch virus khỏi mẫu cấy. Biện pháp này cho phép có
thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5 - 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh
cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở các kích thước 0,1 - 0,2mm
Có thể xử lý nhiệt 36 - 37oC một thời gian cho cây mẹ trước khi tách mô
phân sinh đỉnh. Chúng ta có thể xử lý mẫu sau khi nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39 40oC trong 1 - 2 tuần. Ở nhiệt độ này, các RNA thông tin của virus sẽ bị phân giải
và cây tái sinh có độ sạch bệnh virus cao.
2.4.3.4. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp với xử lý hóa chất kháng virus:
Bên cạnh việc xử lý nhiệt độ cao, còn có thể nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với
kích thước lớn 0,5 - 1mm kết hợp với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất
kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Một số các chất có tác dụng chống virus được sử
dụng trên thực vật là các chất tổng hợp có cấu trúc tương tự các nucleotide như 2thiouracil, ribavirin, vidarabin. Các chất này có tác dụng ức chế sự nhân bản của virus.
Trong các kỹ thuật làm sạch virus thông qua nuôi cấy in vitro thì kỹ thuật
nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp với xử lý hóa chất có tính khả thi hơn vì có thể
xác định được chính xác nồng độ của chất ức chế bổ sung vào trong môi trường
nuôi cấy. Hóa chất thường được sử
dụng là ribavirin.
Ribavirin có công thức hóa học
là C8H12N4O5 với tên hóa học là 1-βD-ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3carboxamide, dạng bột màu trắng, hòa
tan tự do trong nước và hòa tan ít
trong rượu khan.
Cơ chế hoạt động của ribavirin:

Công thức hóa học của Ribavirin

15