Nghiên cứu tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy chủng sinhchitinase cho thu nhận n acetyl d glucosamin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

ĐINH VĂN BÔN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU
KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG SINH CHITINASE CHO THU
NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN : PGS.TS. Lê Thanh Hà

Hà Nội – Năm 2015


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Đinh Văn Bôn xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài:
“Nghiên cứu tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy chủng sinhchitinase cho thu
nhận N-acetyl-D-glucosamin” là công trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tôi
thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Lê Thanh Hà. Các số liệu, kết quả trình
bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa công bố trong bất cứ công trình
khoa học nào khác.

2


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đƣợc luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận đƣợc sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thanh Hà - Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận
tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh
học & Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tậ
p và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

3


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... 3
MỤC LỤC .............................................................................................................. 4
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ 7
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 10
PHẦN I . TỔNG QUAN ...................................................................................... 12
1.1. Chitinase ..................................................................................................... 12
1.1.1. Cấu trúc ............................................................................................... 12
1.1.2. Cơ chế hoạt động của chitinase ............................................................ 13
1.1.3. Các đặc tính cơ bản của hệ chitinase [4] ............................................... 14

1.1.3.1. Trọng lƣợng phân tử ...................................................................... 14
1.1.3.2. Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis ................................................... 14
1.1.3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ................................................................ 14
1.1.3.4. Ảnh hƣởng của pH ........................................................................ 15
1.1.3.5. Các ion kim loại ............................................................................ 15
1.1.3.6. Sự ổn định ..................................................................................... 15
1.1.4. Các nguồn thu nhận chitinase [4],[15] .................................................. 16
1.1.4.1. Vi khuẩn ....................................................................................... 16
1.1.4.2. Chitinase nấm................................................................................ 16
1.1.5. Sơ lƣợc các nghiên cứu về chitinase từ vi sinh vật................................ 16
1.1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 16
1.1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .................................................. 19
1.2. Đặc điểm sinh học của chi nấm mốc Penicillium ........................................ 20
1.2.1. Vị trí phân loại Penicillium trong các hệ thống phân loại nấm [1],[14] . 20
1.2.2. Chitinase sinh tổng hợp bởi chi Penicillium [1] ................................... 20
1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase ................ 20
1.2.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng ........................................ 21
1.2.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men ................................................ 22
1.3. Chitin.......................................................................................................... 23

4


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

1.3.1. Nguồn gốc của Chitin........................................................................... 23
1.3.2. Cấu tạo của chitin................................................................................. 24
1.3.3. Các tính chất của chitin [15],[21] ......................................................... 25
1.4. N-Acetyl-D- glucosamin (GlcNAc) ............................................................ 26
1.4.1. Cấu tạo của N-Acetyl-D- glucosamin ................................................... 26

1.4.2. Tính chất của N-Acetyl-D- glucosamin ................................................ 26
1.4. 3. Ứng dụng của N-Acetyl-D- glucosamin [12] ....................................... 27
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP......................................................... 28
2.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 28
2.1.1. Giống vi sinh vật .................................................................................. 28
2.1.2. Hóa chất. .............................................................................................. 28
2.1.3. Dụng cụ. .............................................................................................. 28
2.1.4. Các thiết bị. .......................................................................................... 28
2.1.5. Môi trƣờng. .......................................................................................... 29
2.1.5.1. Môi trƣờng nhân giữ giống. ........................................................... 29
2.1.5.2. Môi trƣờng czapeck (môi trƣờng hoạt hóa). .................................. 29
2.1.5.3. Môi trƣờng MS chitin cơ bản (môi trƣờng lên men). ..................... 30
2.2. Các phƣơng pháp ........................................................................................ 30
2.2.1. Phƣơng pháp giữ giống ........................................................................ 30
2.2.2. Phƣơng pháp hoạt hóa giống. ............................................................... 30
2.2.3. Phƣơng pháp chuẩn bị chitin huyền phù [20]. ...................................... 31
2.2.4. Phƣơng pháp lên men chủng Penicillium oxalicum 20B ....................... 31
2.2.5. Xác định hàm lƣợng N-acetyl glucosamin ............................................ 31
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt độ của chitinase [33] ................................. 32
2.2.7. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh
tổng hợp chitinase của chủng Penicillium oxalicum 20B. ............................... 33
2.2.7.1. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc tới hoạt tính chitinase. .......................... 33
2.2.7.2. Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon tới hoạt tính chitinase. .............. 33
2.2.7.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng chitin tới hoạt tính chitinase. ............... 33

5


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

2.2.7.4. Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ tới hoạt tính chitinase.................... 33
2.2.7.5 . Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cao nấm men tới hoạt tính chitinase ... 34
2.2.7.6. Ảnh hƣởng của thời gian lên men tới hoạt tính của chitinase. ....... 34
2.2.8. Phƣơng pháp xác định sinh khối........................................................... 34
2.2.9. Phƣơng pháp xác định hoạt tính hexosaminidase [45] .......................... 34
2.2.10. Xác định hoạt độ endochitinase [55] .................................................. 35
2.2.11. Phƣơng pháp TLC xác định phổ sản phẩm của quá trình thủy phân .... 35
2.2.12. Phƣơng pháp phân lập bào tử đơn. [19] .............................................. 35
2.2.12.1. Nguyên lý phƣơng pháp .............................................................. 35
2.2.12.2. Các bƣớc thực hiện..................................................................... 35
2.2.12.3. Chú ý ......................................................................................... 36
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 37
3.1. Kết quả tuyển chọn chủng. .......................................................................... 37
3.2. Kết quả tuyển chọn bào tử đơn có khả năng sinh tổng hợp chitinase có hoạt
tính cao. ............................................................................................................. 39
3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ bào tử và thời gian hoạt hóa .................................. 41
3.4. Ảnh hƣởng của các dạng nguyên liệu chitin tới hoạt tính chitinase.............. 42
3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ chitin thô tới hoạt tính chitinase. ........................... 43
3.7. Ảnh hƣởng của các nguồn nito .................................................................... 46
3.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng cao nấm men. ................................................... 47
3.9.Kết quả động thái sinh trƣởng Penicillium oxalicum 20B............................. 48
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 52
4.1. Kết luận. ..................................................................................................... 52
4.2. Kiến nghị. ................................................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 53
PHỤ LỤC.............................................................................................................. 60

6

Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
KÝ HIỆU

TÊN ĐẦY ĐỦ

GlcNAc, NAG

N-acetyl-D-glucosamin

(GlcNAc)2

Diacetyl chitobiose

(GlcNAc)3

Chitooligomer

VP1

Vibrio parahemolyticus

DMAc

N,N-dimetyl axetamindo

LD50

Lethal Dose

TP

Thủy phân

CMN

Cao nấm men

DNS

3,5-dinitrosalicylic axit

OD

Mật độ quang

7


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tỷ lệ chitin trong các loài khác nhau ..................................................... 23
Bảng 3.1. Hoạt tính chitinase của các chủng tuyển chọn ....................................... 37
Bảng 3.2. Điều kiện lên men chủng Penicillium oxalicum 20B trước và sau khảo sát51

8

Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của chitinase ............................................................. 13
Hình 1.2.Công thức cấu tạo của chitin .................................................................. 24
Hình 1.3. Các kiểu sắp xếp trong mạch đại phân tử của chitin .............................. 25
Hình 1.4. Cấu tạo của N-Acetyl-D- glucosamin ..................................................... 26
Hình 2.1. Bào tử nấm mốc Penicillium oxalicum nảy mầm…………………………36
Hình 2.2. Các bào tử đơn phát triển thành những khuẩn lạc riêng rẽ .................... 36
Hình 3.1. Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân của các chủng nghiên cứu. ..................... 38
Hình 3.2. Hoạt tính NAHase của 4 chủng nghiên cứu. ........................................... 39
Hình 3.3. Hoạt độ chitinase và khả năng thủy phân của chitinase từ các bào tử
đơnTB1-TB8 .......................................................................................................... 39
Hình 3.4. Hoạt độ chitinase và khả năng thủy phân của các bào tử đơnTB1, TB2,
TB6........................................................................................................................ 40
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ cấp giống tới hoạt tính chitinase và khă năng
thủy phân 24h ........................................................................................................ 41
Hình 3.6. Ảnh hưởng của dạng chitin tới hoạt tính và khả năng thủy phân của
chitinase ................................................................................................................ 43
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ chitin thô tới hoạt tính và khả năng thủy phân
của chitinase ......................................................................................................... 44
Hình 3.8. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới hoạt tính và khả năng thủy phân của
chitinase ................................................................................................................ 45
Hình 3.9. Ảnh hưởng của các nguồn nito tới hoạt tính chitinase và khả năng thủy
phân của chitinase ................................................................................................. 46
Hình 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng CNM tới hoạt tính chitinase và khả năng thủy
phân của chitinase ................................................................................................. 48
Hình 3.11. Sự thay đổi pH của dịch lên men .......................................................... 49
Hình 3.12. Sự thay đổi hoạt tính chittinase, hoạt độ endochittinase, hoạt độ Nacetyl-D-hexominidase. ......................................................................................... 50
Hình 3.13. Sắc ký đồ sản phẩm TP 24h của chitinase ở các thời điểm lấy mẫu. ..... 50

9


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của toàn xã hội, cuộc sống của con ngƣời ngày càng
đƣợc cải thiện, con ngƣời cũng có điều kiện để quan tâm chăm sóc sức khỏe của
mình hơn. Môi trƣờng bị ô nhiễm, các sản phẩm thực phẩm không hợp vệ sinh hay
còn tồn dƣ hóa chất độc hại lan tràn khắp nơi trên thị trƣờng. Chính những yếu tố
khách quan nhƣ vậy khiên sức khỏe của chúng ta bị suy yếu, một trong số đó là các
bệnh về khớp.
N-Acetyl-D-glucosamin (NAG) là một đƣờng đơn, tồn tại nhiều trong sụn
khớp, chất nhầy, não,...là thành phần liên kết tế bào với tế bào, truyền đạt thông tin
từ tế bào này sang tế bào khác. N-Acetyl-D-glucosamin là thành phần cấu tạo nên
axit hyaluronic và thúc đấy quá trình sinh sản chodroitin - đây là 2 thành phần chính
cấu tạo nên sụn khớp ở gối, tay, bả vai, xƣơng chậu… NAG đƣợc sử dụng nhiều
trong y học để phục hồi, điều trị tận gốc căn nguyên của bệnh về khớp. Ngoài ứng
dụng trong điều trị bệnh viêm khớp, NAG đã đƣợc ứng dụng để chữa các bệnh viêm
ruột, ứng dụng trong mỹ phẩm làm đẹp da, là cơ chất để sản xuất axit sialic (ứng
dụng trong chữa bệnh cúm) và đƣợc chứng minh có khả năng chữa nhiều bệnh (ung
thƣ và di căn, phản ứng miễn dịch…).
N-axetyl-D-glucosamin (NAG) hay còn gọi là 2-acetamino-2-deoxy-β-Dglucose, là đơn phân cấu tạo nên chitin có nhiều trong vỏ tôm, cua, mực…
Mặt khác, giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản
lƣợng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất
khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất
chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lƣợng phế liệu giáp xác
khá lớn khoảng 70.000tấn/năm. Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho
công nghiệp sản xuất chitin, chitosan, glucosamin và các sản phẩm khác. Do vậy

việc nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất cần thiết nhằm
nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trƣờng.
NAG sản xuất từ chitin bằng rất nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ: hóa học
và sinh học. Phƣơng pháp hóa học đƣợc thực hiện bằng thủy phân axit mạnh. Do đó

10


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

năng suất thấp, chất thải có tính axit và không thân thiện với môi trƣờng. Vì vậy
phƣơng pháp sinh học với việc sử dụng hệ enzyme chitinase từ các nguồn vi sinh
vật đã đƣợc quan tâm nhiều hơn, đã có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào
enzyme chitinase trong sản xuất glucosamin và N-acetyl glucosamine. Trên cơ sở
khoa học, để thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao và ổn định, khả năng thủy phân tốt
thì ta phải chọn đƣợc giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme và tạo
điều kiện tốt nhất trong quá trình lên men. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề
tài: “Nghiên cứu tuyển chọn và xác định điềukiện nuôi cấy chủng sinh
chitinasecho thu nhận N-acetyl-D-glucosamin”.
Mục tiêu của đề tài:
- Lựa chọn bào tử đơn có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ chủng
giống đã thoái hóa.
- Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp chitinase thu nhận N-acetyl-D-glucosamin.
Nhiệm vụ của đề tài:
-

Tuyển chọn chủng sinh chitinase ứng dụng cho thu nhận N-acetyl-D-

glucosamine
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng quá trình sinh tổng hợp chitinase của

chủngđã tuyển chọn để tìm ra điều kiện thích hợp nhất.

11


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

PHẦN I . TỔNG QUAN
1.1. Chitinase
1.1.1. Cấu trúc
Chitinase

[Poly-ß-1-4-(2-acetalmido-2deoxy)-

D-glucoside

glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân
chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,2
glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N–acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong
chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.
3: Hydrolase
2: Glycosylase
1: Glycosidase
14: Chitinase
Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ
Glycohydrolase 18 và Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20.
Họ glycohydrolase 18: Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy ở
hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là
chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác nhƣ chitodextrinase, chitobiase và Naxetyl glucosaminidase.
Họ Glycohydrolase 19: Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu ở thực

vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus
influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua
cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm
I,II,IV.
Họ

Glycohydrolase

20

bao

gồm

β-N-axetyl–D–Glucosamine

axetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và ngƣời.
Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của ezyme, điểm đẳng
điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành
5 nhóm:

12


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

- Nhóm 1: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein
nối với tâm xúc tác thông qua một đoạng giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl
(C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết
enzyme và cơ chất chitin nhƣng không cần cho hoạt động xúc tác.

- Nhóm 2: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác,
thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino axit
tƣơng tự chitinase ở nhóm 1. Chitinase nhóm 2 có ở thực vật, nấm và vi khuẩn .
- Nhóm 3: Trình tự amino axit hoàn toàn khác với chitinase nhóm 1 và 2.
- Nhóm 4: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 –
47% trình tự amino axit ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm 1,
phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so
với chitinase nhóm 1.
- Nhóm 5: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực
vật bậc cao.
1.1.2. Cơ chế hoạt động của chitinase
Enzyme phân giải chitin bao gồm: Endochitinase, chitin 1-4-β-chitobiosidase
và β-N-acetyl hexosaminidase.

Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của chitinase
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và
chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lƣợng phân
13


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

tử khác nhau, nhƣng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính
endochitinase không thể phân cắt thêm đƣợc nữa.
Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp
lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích
diacetylchitobiose (GlcNAc)2 .
β-N-acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer một cách liên tục từ
đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-axetyl glucosamine[4].

1.1.3. Các đặc tính cơ bản của hệ chitinase [4]
1.1.3.1. Trọng lượng phân tử
Chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng phân tử khoảng
30kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xƣơng (cá, lƣỡng
cƣ, thú), một số chitinase có trọng lƣợng phân tử khoảng 40-90kDa hoặc cao hơn cả
là khoảng 120kDa. Trọng lƣợng phân tử của chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn
có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120kDa.
1.1.3.2. Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
Chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3-10 ở thực vật bậc cao
và tảo; pI từ 4,7- 9,3 ở cồn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5- 8,8 ở vi sinh
vật.
Hệ số hấp thu E280 (mg/ml) =1,24; phổ hấp thu chỉ là bƣớc sóng đơn 280 µm.
Hằng số Michaelis: 0,010 - 0,011 (g/100ml)
1.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20-50oC
(Frandberg và Schnure, 1994; Huang vàcộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal,1998;
Wiwat và cộng sự, 1999;Bendt và cộng sự, 2001) [4].
Nhìn chung nhiệt độ tối ƣu cho hệ chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 40oC, ngoại
trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối
thích là 50oC (Jeuniaux, 1993). Tùy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các chitinase
có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các chitinase thực vật thuộc nhóm
III và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nƣớc nóng cho thấy khả năng

14


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

chịu đựng nhiệt độ cao đến 80oC. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân
chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp.Từ 30- 45oC và chịu nhiệt từ chủng Bacillus

sp. BG -11 hoạt tính cao nhất ở 40 -60oC [4],[26].
Theo Lee và cộng sự, chitinase từ Penicillium sp. LYG 0704 hoạt động tối
ƣu ở khoảng 40- 50oC và bền trong khoảng 20- 40oC [20]. Penicilium oxalicum 20B
cũng hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 40 -50oC và hoạt động kém ở 30 -35oC. Nhiệt độ
thủy phân chitin cho lƣợng GlcNAc cao nhất là 40oC [6].
1.1.3.4. Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH tối thích (pHop) của hệ chitinase từ 4- 9 đối với các chitinase ở thực vật
bậc cao và tảo; hệ chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5 – 8,0.
Theo các nhà khoa học, pHopt của chitinase có thể có sự phụ thuộc vào cơ
chất đƣợc sử dụng. Đa số các chitinase đã đƣợc nghiên cứu có pHopt khoảng 5,0 khi
cơ chất là glucol chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu.
Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động đƣợc trong khoảng pH
từ 4,0 -8,5. Chitinase của nấm hoạt tính cao nhất ở pH =5, trong khi ở vi khuẩn pH
tối thích là 8,0, hoạt tính của chitinase từ Bacillus sp. BG-11 cao nhất ở pH= 8,5 [4],
[26].
Chitinase từ Penicillium oxalicum 20B có pH thích hợp cho quá trình thủy
phân chitin tạo thành GlcNAc là pH =3,5 -5 và tối ƣu trong khoảng 4,5 -5 [6].
1.1.3.5. Các ion kim loại
Các ion kim loại Hg2+, Ag+ là những chất ức chế. Đối với ion Cu+, có 2 dạng
chitinase: một bị ức chế và một đƣợc tăng cƣờng nhờ Cu2+ đƣợc tìm thấy ở một số
loài cá và vi sinh vật nhƣ Pseudomonas aeruginosa.
1.1.3.6. Sự ổn định
Chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2 năm.
Sự ổn định của chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất là chitin. Chúng bị khử
hoạt tính nhanh chóng ở 37oC trong trƣờng hợp không có mặt chitin. Chu kỳ bán
hủy ở 37oC là 40 ngày và ở 5oC là 230 ngày. Chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số
bất hoạt ở 20oC là k = 0,145/h [6].

15

Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

1.1.4. Các nguồn thu nhận chitinase [4],[15]
Chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật.
1.1.4.1. Vi khuẩn
Vi khuẩn sản sinh chitinase nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng. Chúng
thƣờng tổng hợp nhiều loại chitinase để phân cắt đƣợc các loại chitin đa dạng trong
tự nhiên. Nhƣ vậy, chitinase vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu trình chitin
trong tựnhiên.
Chitinase đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn nhƣ Chromobacterium,
Pseudomonas, Bacillus…và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp
chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trƣờng nhằm sử dụng nguồn cacbon cho
sự sinh trƣởng và phát triển.
Chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy nhiên trong
các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật, ngƣời ta đều cho thêm chitin – cơ chất của
chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính
chitinase sau quá trình chiết tách.
1.1.4.2. Chitinase nấm
Chitinase cũng đƣợc tạo ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho
chitinase cao nhƣ: Trichoderma, Aspergillus… đặc biệt là ở các loài nấm lớn nhƣ
Lycoperdon, Coprinus…
Tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về
mặt dinh dƣỡng nhƣng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình
phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính
của vách tế bào nấm.
1.1.5. Sơ lƣợc các nghiên cứu về chitinase từ vi sinh vật
1.1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Takahashi (1993) và Stoyachenko (1994) đã tinh sạch và khảo sát một số
tính chất của chitinase từ Vibrio sp. và Streptomyces kurssanovii [23, 38, 47]. Wang

và Hang (2001) đã xử lí nƣớc thải chứa động vật có vỏ bằng cách sử dụng chitinase
từ vi khuẩn Bacillus cereus, B. alvei, và B. sphaericus phân lập từ nƣớc thải [52]. Vi

16


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

khuẩn C4 thuộc chi Sanguibacter đƣợc Tao (2005) phân lập từ đất, vi khuẩn này đã
cho ra nguồn chitinase ngoại bào có khối lƣợng phân tử từ 57-58,8kDa, pI= 4,2.
Tuy nhiên, enzyme có vùng pH hoạt động rộng từ 3,0- 8,0, hoạt động tối ƣu ở pH
4,6 và khả năng chịu nhiệt lên đến 60oC vẫn duy trì 50% hoạt tính và ứng dụng
chitinase trong phòng trừ côn trùng gây hại [54]. Dahiya và cộng sự (2006) nghiên
cứu chitinase từ Baccilus circulans và ứng dụng để phân giải thành tế bào nấm men
(Rhaffia Rhodozyme)[41]. Lee (2007) đã nuôi cấy, tinh sạch và khảo sát một số đặc
điểm của chitinase từ vi khuẩn Bacillus sp.[53]. De-hui Dai (2011) phát hiện đƣợc
nhóm vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus sp. HU1 từ đất ở suối nƣớc nóng Trung Quốc
cho nguồn chitinase mới có khả năng chịu nhiệt, khi ủ ở pH tối ƣu 6,5 vẫn giữ đƣợc
hoạt tính khi gia nhiệt ở 60oC trong thời gian là 100 phút.
Nấm sợi đƣợc xem là nguồn cung cấp enzyme cho hoạt tính cao và ổn định,
là đối tƣợng đƣợc chú ý để nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực enzyme. Pedraza-Reyes
và Lopez-Romero (1989) đã nghiên cứu về các đặc tính của hai loại enzyme ngoại
bào chitinase ở nấm mốc Mucor rouxii[37]. Abdel-Naby và cộng sự (1992) đã tinh
sạch và khảo sát tính chất của chitinase từ Aspergillus carneus[39]. Chitinase từ
dịch tự phân Penicillium oxalicum đã đƣợc Rodriguez, Copa Patino, Pesrez Leblic
(1995) tinh sạch bằng phƣơng pháp tủa muối amoni sunfat và tính chất của nó cũng
đã đƣợc khảo sát với pH và nhiệt độ tối ƣu là 5,0 và 35oC, enzyme này bền vững ở
nhiệt độ tối đa 45oC và pH dao động từ 4,0 đến 6,0 [25].
Escott, Hearn và Adams (1998) đã tủa và tinh sạch chitinase từ chủng
Aspergillus fumigatus, phát hiện chitnase có khối lƣợng 45kDa khác biệt rõ nét với

enzyme từ chủng Aspergillus carneus có khối lƣợng khoảng 25kDa. Bên cạnh đó,
qua phân tích thành phần axit amin trong chủng Aspergillus carneus đã cho thấy
enzyme chứa nhiều axit amin asparagine, serine, threonine hoạt động trong điều
kiện tối ƣu pH 5,2 ở 50oC [22]. Kawachi (2001) nghiên cứu phƣơng pháp tinh sạch
và các đặc tính của chitinase ngoại bào từ chủng nấm kí sinh Isaria japonica và tách
chiết đƣợc hai loại chitinase với khối lƣợng tƣơng ứng 43,2kDa và 31,1kDa hoạt
động tốt trong khoảng pH khá thấp từ 3,5 đến 4,5 ở nhiệt độ từ 40-50oC [24].

17


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

Những đặc điểm của chitinase và endo-β-1,3-glucanase từ Trichoderma harzianum
Rifai T24 có liên quan tới phòng trừ nấm bệnh Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia
solani đã đƣợc El-Katatny và cộng sự nghiên cứu (2001) [36]. Nghiên cứu đƣờng
hóa chitin sử dụng môi trƣờng nuôi cấy bán rắn với chủng nấm Aspergillus sp. S113 với cơ chất lấy từ chất thải trong thủy sản nhằm tận dụng nguồn phế thải để tạo
ra nguồn enzyme có giá trị kinh tế cao. Với phƣơng pháp tủa muối ammonisulfate
và sắc kí đã tách đƣợc một exochitinase có khối lƣợng phân tử khoảng 73kDa và hai
endochitinase có khối lƣợng lần lƣợt là 45kDa và 52kDa [43].
Gkargkas (2004) nghiên cứu về N-acetyl-D glucosamineidase đƣợc sinh ra
bởi Fusarium oxysporun F3 phát triển trên môi trƣờng bán rắn và ứng dụng trong
trừ muỗi, nấm và côn trùng gây bệnh [27]. Những nghiên cứu gần đây về điều kiện
tối ƣu trong nuôi cấy nhằm tạo nguồn enzyme hoạt tính cao và có sản lƣợng lớn từ
những vật liệu giá trị thấp cũng đƣợc quan tâm rất nhiều. 14 chủng Penicillium sp.
có hoạt tính chitinase đƣợc phân lập và khảo sát trên môi trƣờng lên men bán rắn
[46]. Rattanakit (2007) sử dụng chitinase phân lập từ Aspergillus sp. để xử lý môi
trƣờng nhiễm chitin [44]. Swiontek-Brzezinska và cộng sự (2007) dựa vào cơ chế
hoạt động của enzyme thủy phân chitin từ các chủng nấm phân lập từ vỏ tôm cho
thấy chitinase từ vi khuẩn cho hoạt tính mạnh nhất ở pH=8 khi đƣợc ủ ở 40oC khác

biệt so với chitinase từ nấm cho hoạt tính mạnh trong môi trƣờng axit pH=5 ở nhiệt
độ 50oC [32]. Chủng nấm nhƣ Pencilium sp. LYG 07 đƣợc Lee và cộng sự (2009)
phân lập từ đất cho hoạt tính chitinase từ ngày đầu tiên và tiếp tục tăng dần cho đến
khi đạt đƣợc hoạt tính tối ƣu sau 3 ngày nuôi cấy. Chitinase đƣợc tủa với
isopropanol và sắc kí cột MonoQ và Butyl-Sepharose. Khối lƣợng phân tử chitinase
sau khi điện di SDS-PAGE cho kết quả là 46 kDa. Enzyme có hoạt tính tối ƣu ở
pH=5,0 và nhiệt độ là 40oC [20].
Gần đây, Ghanem và cộng sự (2010) đã nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi
cấy nấm Aspergillus terreus trên cơ chất vảy cá nhằm tăng sản lƣợng chitinase sinh
ra [28]. Năm 2011 ông đã tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy cho chitinase cao từ

18


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

Alternaria alternata và ứng dụng cho sản xuất Chitooligosaccharides và N-acetyl-D
glucosamine [29].
1.1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Nhìn chung những nghiên cứu về chitinase trong nƣớc còn hạn chế cho dù
tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận.
Đặng Trung Thành (2008) nghiên cứu thu nhận nguồn chitinase từ khoai
lang (Ipomoea batatas) ở Khánh Hòa đã thu đƣợc những kết quả ban đầu khả quan
khi tận dụng nguồn phế phẩm từ lá khoai lang để sản xuất nguồn enzyme có giá trị
(hoạt độ đạt 192UI/ml) [2]. Nguyễn Đình Nga (2008) khảo sát khả năng tác động
lên nấm Candida albicans của chitinase thu nhận từ thực vật và nấm Trichoderma.
Nguyễn Quang Nhân (2009) nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất
của chitinase từ mủ cây cao su Hevea Brasiliensis, đề ra quy trình thu nhận
chitinase từ mủ cây cao su cũng nhƣ các đặc tính hóa lý của enzyme [8].
Vi sinh vật là một trong những đối tƣợng chính để trích li nguồn chitinase có

hoạt tính cao. Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp có công trình nghiên cứu đặc tính
của chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarlus và một số ứng dụng trong
lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dƣợc [7].
Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thƣơng, Đinh Minh Hiệp, Đồng
Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá
trình sinh tổng hợp hệ chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma sp. Năm
2004, tác giả Tô Duy Khƣơng thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở
Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh [13]. Quỳnh
Hƣơng (2006) nghiên cứu về chuyển gen kháng nấm chitinase gluconase vào cấy
sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và đã thu đƣợc một số kết quả
ban đầu. Lê Thị Huệ (2010) khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một số
chủng thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng [7]. Đinh Minh Hiệp
(2010) nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả
năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [5].

19


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

1.2. Đặc điểm sinh học của chi nấm mốc Penicillium
1.2.1. Vị trí phân loại Penicillium trong các hệ thống phân loại nấm [1],[14]
Robert K Noyd (2000) xếp Penicillium vào trật tự nhƣ sau:
Ngành (Division): Deuteromycota
Lớp (Class): Hyphomycetes
Bộ (Order): Moniliales
Họ (Family): Moniliaceae
Chi (Genus): Penicillium
1.2.2.Chitinase sinh tổng hợp bởi chi Penicillium[1]
Nhiều nghiên cứu chỉ ra một số loài thuộc chi Penicillium có khả năng sinh

tổng hợp chitinase nhƣ P. aculeatum, P. citrinum, P. oxalicum…. Chitinase sinh
tổng hợp từ Penicillium thƣờng hoạt động ổn định trong khoảng nhiệt độ khá cao
tới 450C với P. oxalicum[50], Penicillium sp. LYG 0704 [34], và Penicillium
aculeatum ở 500C[18]. Theo Y. G. Lee et al năm 2009 nghiên cứu enzyme chitinase
của nấm hoạt động tốt trong khoảng pH từ 4-7. So sánh với một số enzyme
chitinase từ các chủng Penicillium nhƣ Penicillium sp. LYG 0704 pH tối ƣu ở 5,0
[34]và Penicillium aculeatum ở pH 5,5[18], pH tối ƣu của enzyme chitinase từ
chủng nấm Penicillium oxalicum thích hợp để thủy phân là 4,5-6,5[50].
Một số các nghiên cứu đã công bố khả năng sinh tổng hợp chitinase của
chủng Penicillium nhƣ Pencillium citrinum [11], Pencillium janthinell [35],
Penincillium aculeatum [46], Pencillium chrysogenum [47]. Trong 70 chủng nấm
sợi phân lập từ đất ở thành phố Cần Thơ có 10 chủng thể hiện hoạt tính chitinase,
trong đó Penicillium oxalicum có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất [10].
1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
Thức ăn không chỉ cung cấp các nguyên liệu để cơ thể nấm sợi sản xuất
thƣờng xuyên chất nguyên sinh, sợi nấm, chất dự trữ mà còn cung cấp năng lƣợng
cho hoạt động của cơ thể sống, trong đó có thành tế bào. Vì vậy thành phần dinh
dƣỡng đóng một vai trò quan trọng đến khả năng tổng hợp chitin, chitosan của sợi
nấm. Nếu cacbon, nito có mặt hầu hết trong các thành phần cấu tạo của tế bào thì

20


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

chất khoáng, vitamin, nguyên tố vi lƣợng cũng là thành phần không thể thiếu, chúng
ảnh hƣởng lớn đến hoạt động trao đổi chất, đến hoạt tính của vi sinh vật, bằng cách
thay đổi tốc độ các phản ứng enzyme.
1.2.3.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
1.2.3.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Cacbon chiếm tỉ lệ trên 50% trọng lƣợng khô tế bào, nó tồn tại trong tế bào
chất, trong tất cả các phân tử của enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi
chất. Ngoài nhiệm vụ là nguồn cung cấp năng lƣợng, tạo thành những tiền chất, hợp
chất cacbon còn tạo ra các quá trình oxy hóa khử để biến đổi những tiền chất này
thành những sản phẩm trung gian hoặc những sản phẩm cuối cùng dùng để xây
dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trƣờng một vài sản phẩm sinh tổng hợp.
Nếu môi trƣờng chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ nhƣ glucose, tinh bột
tan... thì vi sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lƣợng sinh khối thu đƣợc
nhiều nhƣng lƣợng chitinase mà vi sinh vật tiết ra môi trƣờng là rất ít. Muốn thu
đƣợc enzyme thì cần phải có chất cảm ứng để vi sinh vật có thể tiết ra enzyme để
thủy phân nguồn cơ chất đó. Nguồn cacbon chitin đóng vai trò là chất cảm ứng cho
sinh tổng hợp chitinase là chitin[40].
Cơ chất dùng để cảm ứng sợi nấm sinh chitinase là chitin và các dẫn xuất của
chitin. Theo Anil Kumar Singh khi sử dụng các nguồn cacbon khác nhau nhƣ chitin
keo, chitin thô, chintin từ vỏ cua và chitin từ vỏ tôm cũng đều cho hoạt tính
chitinase cao[16].Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên
trong môi trƣờng nuôi cấy sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là
nguồn carbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase.
1.2.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ nito
Tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều chứa Nito (Protein, axit
nucleic, enzyme...). Nito chiếm 10- 15% trọng lƣợng khô của tế bào. Nito tham gia
cấu tạo protit nhƣ: Protein, axit amin, glycoprotein, lipitprotein, peptidoglucan.
Protit chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần chất khô, phổ biến từ 60-85% trong
lƣợng khô của tế bào. Protit giữ chức năng tham gia cấu trúc mọi bào quan trong tế

21


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

bào, đặc biệt là enzyme giữ vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở nấm
sợi. Trong đó cả enzyme deacetyl hóa chitin thành chitosan trên thành tế bào [27].
Việc chọn nguồn nito là rất cần thiết để đảm bảo đƣợc hiệu suất cao và có lợi
về mặt kinh tế trong lên men. Các loại hợp chất nito mà nấm sợi có thể đồng hóa
đƣợc thƣờng là cao nấm men, cao malt, cao ngô, và các nguồn nito vô cơ nhƣ
NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, urea…Trong đó nguồn cao nấm men, pepton là thành
phần mà các loài nấm tiếp hợp và ƣa sử dụng nhất [48][16].
1.2.3.1.3. Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng
Ngoài nguồn cacbon, nito thì các nguyên tố khoáng cũng có tác dụng nhất
định đối với quá trình phát triển của vi sinh vật, chúng cần thiết cho sự duy trì cân
bằng sinh lý tế bào. Các nguyên tố khoáng bao gồm các nguyên tố vi lƣợng nhƣ
Mn, Cu, Fe, Zn…đƣợc bổ sung dạng muối vô cơ nhƣ KH2PO4, MgSO4… Mỗi
nguyên tố khoáng có chức năng riêng đối với vi sinh vật nhƣ photpho tham gia
thành phần cấu tạo của axitnucleic, phophoprotein,photpholipit và nhiều coenzyme
quan trọng nhƣ ATP, NADP, ADP…
1.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện lên men
1.2.3.2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng
hợp enzyme của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ và OH– trong môi trƣờng tác động trực
tiếp lên màng nguyên sinh chất làm thay đổi sự vận chuyển của chất cảm ứng vào tế
bào và vận chuyển enzym ra ngoài môi trƣờng.
Mặt khác ion H+ và OH– cũng ảnh hƣởng đến hệ enzyme của vi sinh vật,
tham gia hoạt động sống, sinh tổng hợp của vi sinh vật.
Chitinase thƣờng hoạt động trong vùng axit yếu. Khoảng pH thích hợp là từ
4,0-6,5. Tùy vào nguồn gốc chủng mà pH tối thích của nó khác nhau.
1.2.3.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống
Thông thƣờng đối với nấm sợi, để cấp giống thực hiện quá trình lên men
ngƣời ta dùng cấp giống bằng bào tử hoặc cấp giống cấp 2 ngay sau khi bào tử đã
phát triển thành hệ sợi. Lƣợng giống khi cấp vào dịch lên men phải có mật độ phù

22


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

hợp đối với từng chủng. Nếu lƣợng giống cấp vào quá cao thì tốn nhiều giống và
chƣa chắc hiệu quả đã tốt, nếu lƣợng giống cấp vào quá thấp thì lãng phí môi trƣờng
lên men, lên men kéo dài dẫn đến hiệu suất tổng hợp chitinase không tốt [48].
1.2.3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hƣởng lớn đến tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh enzyme của
chủng. Nhiệt độ từ 28-32oC là tối ƣu cho sự sinh trƣởng của đa số chủng, nhiệt độ
tối đa dƣới 50oC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trƣởng,
thậm chí có thể giết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế.
1.3. Chitin
1.3.1. Nguồn gốc của Chitin
Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên. Lƣợng chitin đƣợc sản
xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau cellulose, chúng đƣợc tạo ra trung bình
20g trong 1 năm/m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin đƣợc tìm thấy ở hai nguồn
động vật và thực vật.
Chitin đƣợc tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lƣợng khác nhau [3].
Bảng 1.1. Tỷ lệ chitin trong các loài khác nhau
Nguồn

Hàm lƣợng chitin (%)

Bọ cánh cứng

37%

Nhện

38%

Bò cạp

30%

Sâu

20-38%

Nấm

5-20%

Tôm

33%

Cua

70%

Mực

3-20%

Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp
vỏ của một số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và
giun tròn.

23


Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

Trong giới thực vât, chitin có ở thành tế bào nấm và một số tảo
Chlorophiceae. Chitin không hiện diện một mình trong lớp vỏ ngoài của loài nấm
mà nó còn đƣợc liên kết với những thành phần khác. Lƣợng chitin đƣợc tinh chế từ
một số loài nấm thông thƣờng từ 3% -5%.
Trong giới động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực,
hàm lƣợng chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lƣợng khô. Vì vậy vỏ tôm,
cua, ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ
chúng.
Mặc dù chúng đƣợc phổ biến rộng rãi nhƣng cho đến nay nguồn thu nhận
chính của chitin là từ vỏ cua và tôm.
1.3.2. Cấu tạo của chitin
Chitin có cấu trúc là một polymer đƣợc tạo thành từ các đơn vị N- axetyl- βD- glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glucoside.
Chitin có công thức phân tử (C8H13O5)n , còn gọi là β-1,4-poly-N-axetyl-Dglucosamine. Trong đó có chứa 47,29 % C; 6,45% H; 39,37% O và 6,89% N.
Phân tử lƣợng: Mchitin= (203,09)n

Hình 1.2.Công thức cấu tạo của chitin
Trong tự nhiên cấu trúc bậc 1 chitin tồn tại dƣới 3 dạng là α-chitin,β-chitin
và γ- chitin, sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Trong thực tế chitin
tồn tại chủ yếu dƣới dạng α-chitin. α-chitin có cấu trúc mạng tinh thể rất chặt chẽ do
các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lƣợng,
nên ngoài liên kết hydro trong cùng một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro
giữa các lớp chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Đây cũng là dạng phổ biến
trong tự nhiên. Ở chuỗi β-chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở

24

Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn

chuỗi γ-chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều sole với một chuỗi ngƣợc chiều
trong cấu trúc. Ở cấu trúc β-chitin và γ-chitin giữa các lớp không có loại liên kết
hydro. Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl
hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn [31].
Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi
tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γchitin đƣợc mô tả nhƣ sau:

Hình 1.3. Các kiểu sắp xếp trong mạch đại phân tử của chitin
Các chuỗi bậc 1 liên kết với nhau thông qua các liên kết hydro tạo ra cấu trúc
bậc 2, các vi sợi liên kết với nhau hình thành sợi lớn hay các tấm tạo cấu trúc bậc 3.
Cấu trúc bậc 4 đƣợc tạo thành do các phân tử protein bao quanh các vi sợi gọi là
tấm chitin- protein.
1.3.3. Các tính chất của chitin [15],[21]
Chitin có màu trắng hoặc trắng ngà, vô định hình. Chitin ở thể rắn, xốp nhẹ,
không màu, không mùi, không vị.
Vì có liên kết với hydro chặt chẽ giữa các phân tử nên chitin thể hiện ái lực
hạn chế đối với phần lớn dung môi. Chitin thông thƣờng (α-chitin) không tan và hầu
nhƣ không trƣơng trong các dung môi thông dụng và chỉ tan trong một số dung môi
đặc biệt nhƣ N,N-dimetyl axetamido (DMAc) có chứa 5-10% LiCl hay một số dung
môi đã đƣợc Flo hóa nhƣ hexafloaxetic, axit tricloaxetic và đicloetan. β-chitin có ái
lực đối với nƣớc và dung môi hữu cơ bởi mạnh hơn α- chitin do nó có liên kết
hydro giữa các phân tử yếu hơn.

25