Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) từ dịch thủy phân pectin và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

------------------***-------------------

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PECTIC OLIGOSACCHARIDE (POS) TỪ DỊCH THỦY
PHÂN PECTIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------------------***-------------------

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PECTIC OLIGOSACCHARIDE (POS) TỪ DỊCH THỦY
PHÂN PECTIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã
nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và
bạn bè.
Trước hết, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. NGUYỄN THỊ
XUÂN SÂM – Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh
học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã định hướng
nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học – Đại
học Lâm nghiệp cùng các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng
thí nghiệm Vi sinh- Hóa sinh - Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn các thầy cô và bạn bè thân thiết đã động viên, giúp đỡ em trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Những lời cảm ơn chân thành nhất của em xin được gửi đến các thành viên trong
gia đình, những người đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho
em trong cuộc sống.
Chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 09 năm 2016
Học viên
Nguyễn Thị Kim Dung


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi. Các

kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán là hoàn
toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào.
Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều
được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.

Hà Nội, ngày 21 tháng 09 năm 2016


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1. Prebiotic và Pectic oligosaccharide (POS)....................................................... 3
1.1.1. Prebiotic .................................................................................................... 3
1.1.2. Pectic oligosaccharide (POS) ................................................................... 4
1.2. Cơ chất pectin ................................................................................................... 5
1.3. Thu nhận Pectic oligosaccharide (POS)........................................................... 7
1.3.1. Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme thu POS trong hệ thống có
tích hợp màng lọc.............................................................................................. 10
1.3.2. Cô đặc, tách, tinh sạch POS .................................................................... 13

1.3.3. Sấy tạo sản phẩm .................................................................................... 17
1.3.4. Bao gói và điều kiện bảo quản sản phẩm ............................................... 19
1.4. Đánh giá pectic oligosaccharide (POS) ......................................................... 20
1.4.1. Phân tích định tính .................................................................................. 20
1.4.2. Phân tích định lượng ............................................................................... 21
1.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học .................................................................... 23
1.5. Ứng dụng POS sản xuất nước bí đao chức năng............................................ 25
1.5.1. Tiềm năng ứng dụng của POS ................................................................ 25
1.5.2. Ứng dụng sản xuất nước bí đao bổ sung POS ........................................ 26
CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 28
2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị........................................................................... 28

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

2.1.1. Vật liệu .................................................................................................... 28
2.1.2. Môi trường và các dung dịch sử dụng .................................................... 28
2.1.3. Hoá chất chính ........................................................................................ 29
2.1.4. Thiết bị .................................................................................................... 30
2.1.5. Màng lọc ................................................................................................. 31
2.2. Phương pháp phân tích ................................................................................... 33
2.2.1. Phương pháp vi sinh ............................................................................... 33
2.2.2. Phương pháp hoá lý - hoá sinh ............................................................... 34
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 36
2.3.1. Thu nhận dịch thủy phân ........................................................................ 36
2.3.2. Cô đặc dịch thủy phân ............................................................................ 37

2.3.3. Loại muối khỏi dịch thủy phân bằng kết tủa ethanol.............................. 37
2.3.4. Sấy phun ................................................................................................. 37
2.3.5. Tính toán hiệu suất thu hồi POS ............................................................. 37
2.3.6. Lựa chọn bao bì và điều kiện bảo quản chế phẩm POS ......................... 38
2.3.7. Nghiên cứu sản xuất nước bí đao bổ sung POS...................................... 38
2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan ................................................................... 38
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 42
3.1. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm POS................................................. 42
3.1.1. Cô đặc dịch thủy phân ............................................................................ 42
3.1.2. Loại muối đệm khỏi sản phẩm POS ....................................................... 44
3.1.3. Sấy phun thu chế phẩm POS .................................................................. 47
3.2. Nghiên cứu bảo quản chế phẩm POS ............................................................. 52
3.3. Đánh giá chế phẩm POS bột .......................................................................... 57
3.3.1. Đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS 57
3.3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm POS ..................................... 61
3.4. Nghiên cứu ứng dụng POS để sản xuất nước bí đao chức năng .................... 64
3.4.1. Nghiên cứu sản xuất nước bí đao bổ sung POS...................................... 64
3.4.2. Phân tích thành phần nước bí đao có bổ sung POS ................................ 68

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

3.4.3. Xây dựng quy trình sản xuất nước bí đao bổ sung POS ......................... 70
3.4.4. Đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm nước bí
đao bổ sung POS ............................................................................................... 72
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 74

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 76
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 87

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Chú thích

AX

Arabinoxylan

AXOS

Arabinoxylooligosaccharides

CFF

Cross flow filtration (Lọc dòng ngang)

Da

Dalton

DE

Degree of esterification (Mức độ ester hóa)

DP

Degree of polymerization (Mức độ trùng hợp)

FOS

Fructo oligosaccharide

G1

Monomonogalacturonic

G2

Dimonogalacturonic

G3

Trimonogalacturonic

GalA

D-monogalacturonic

GalOS

Galacto oligosaccharide

GOS

Galacto oligosaccharide

HGA

Homogalacturonan

HM

High methyl ester (Pectin có mức độ methyl hóa cao)

HPAEC-PAD

High performance anion exchange chromatography
(HPAEC) with pulsed amperometric detection (PAD) (Sắc kí
trao đổi anion hiệu năng cao với detector điện hóa)

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

HPLC

Công nghệ sinh học

High performance liqiquid chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao)

kDa

kilo Dalton

LD50

Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm

LM

Low methyl este (Pectin có mức độ methyl hóa thấp)

MOS

Mannooligosaccharide

MPa

Mega Pascal

MWCO

Molecular weight cutoff

NMWL

Nominal molecular weight limit (Giới hạn khối lượng phân
tử đại diện)

PE

Polyethylene

POS

Pectic Oligosaccharide

RG I, II

Rhamnogalacturonan I, II

TLC

Thin layer chromatography (Sắc ký bản mỏng)

v/v

volume/volume (Thể tích/thể tích)

v/v/v

volume/volume/volume (Thể tích/thể tích/thể tích)

w/v

weight/volume (Khối lượng/thể tích)

XOS

Xylo – oligosaccharide

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thông số kỹ thuật của màng 50 kDa (GE Healthcare, Mỹ) .......................... 31
Bảng 2.2. Thông số kỹ thuật của màng 1 kDa (GE Healthcare, Mỹ) ............................ 31
Bảng 2.3. Thông số kĩ thuật màng nano spiral wound 0.3 kDa (Model: DL2540F1072)
........................................................................................................................................ 32
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp ................................................................. 34
Bảng 2.5. Phép thử tam giác .......................................................................................... 40
Bảng 3.1. Xác định hiệu suất thu hồi của bước cô đặc bằng lọc nano ........................... 43
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol : dịch đến hiệu quả kết tủa và khả năng loại
muối (kết tủa ở 4˚C trong 4 giờ). ................................................................................... 45
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện kết tủa đến hiệu suất thu hồi POS .................. 46
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô dịch POS trước khi sấy phun .............. 49
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của chế độ sấy đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm ............... 51
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của loại bao bì đến các thông số của bột POS ............................ 53
Bảng 3.7. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong POS thành phẩm.... 58
Bảng 3.8. Bảng theo dõi trọng lượng chuột khi cho ăn POS ......................................... 60
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại ........... 62
Bảng 3.10. Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS bột ...................................... 63

Bảng 3.11. Xác định công thức nước bí đao bổ sung POS ............................................ 65
Bảng 3.12. Hàm lượng POS trong nước bí đao bổ sung POS ....................................... 66
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan bằng phép thử tam giác ................................... 67
Bảng 3.14. Thành phần dinh dưỡng trong nước bí đao (tính trên 100 mL) ................... 69
Bảng 3.15. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong nước bí đao bổ sung
POS................................................................................................................................. 73
DANH MỤC CÁC HÌNH

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

Hình 1.1. Cấu tạo của D - Monogalacturonic và một pectic oligosaccharide [21] .......... 4
Hình 1.2. Cấu trúc pectin [11] .......................................................................................... 6
Hình 1.3. Sơ đồ sản xuất POS theo phương pháp thủy phân pectin bằng enzym............ 9
Hình 1.4. Sơ đồ mô hình phản ứng thủy phân có tích hợp bộ phận lọc dòng ngang ..... 10
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn monogalacturonic .......................................................... 35
Hình 3.1. Sắc ký của các dung dịch thử nghiệm với màng 0.3kDa ............................... 43
Hình 3.2. Kết tủa POS (A) sau kết tủa cồn và Phổ sản phẩm POS (B) trong kết tủa. .. 47
Hình 3.3. Chế phẩm POS bột sau sấy phun ................................................................... 52
Hình 3.4. Chế phẩm POS bảo quản trong túi PE và túi thiếc ........................................ 54
Hình 3.5. Quy trình thu nhận chế phẩm POS dạng bột .................................................. 55
Hình 3.6. Một số hình ảnh của quá trình thu nhận POS trên quy mô pilot .................... 57
Hình 3.7. Kiểm tra độ bền của POS sau thanh trùng ..................................................... 65
Hình 3.8. Sản phẩm nước bí đao bổ sung POS .............................................................. 69
Hình 3.9. Quy trình thu nhận nước bí đao bổ sung POS ............................................... 71
Hình 3.10. Sản phẩm nước bí đao chứa POS 2% .......................................................... 72

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Cuộc sống hiện đại mang lại cho chúng ta nhiều tiện nghi, thoải mái nhưng hệ
lụy của nó mang lại cũng không hề nhỏ. Với sự bận rộn của cuộc sống ngày nay,
những bữa ăn nhanh đang dần thay thế những bữa ăn với đầy đủ chất dinh dưỡng làm
cho số lượng người mắc các căn bệnh như: béo phì, tiểu đường, bệnh tim mạch, ung
thư… đang dần tăng lên. Nhận thức được những nguy cơ này, con người ngày càng
quan tâm hơn đến sức khỏe của mình, đặc biệt là trong việc phòng chống bệnh tật. Xu
hướng và nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng để bổ sung dưỡng chất cho cơ thể
đồng thời giúp phòng chống bệnh ngày càng phổ biến. Điều này đã thúc đẩy mạnh nhu
cầu sử dụng prebiotic và nghiên cứu sản xuất các thế hệ prebiotic mới.
Pectic oligosaccharide (POS) là một trong những prebiotic thế hệ mới được
nghiên cứu trong thời gian gần đây. POS là một hợp chất carbohydrate, bao gồm từ 2 –
10 đơn phân D - monogalacturonic nối với nhau bằng liên kết α (1 – 4) glucoside và có
nhiều đặc tính quý.
Là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên POS có tính acid tương tự
như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây
bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại
oligosaccharide trung tính. Bên cạnh đó, POS được các vi sinh vật có trong đường ruột
sử dụng và sản phẩm của quá trình lên men này có những ảnh hưởng tích cực đối với
cơ thể vật chủ. POS được chứng minh là thúc đẩy quá trình tự chết apoptosis của các tế
bào ung thư ruột ở người, có khả năng bảo vệ tim mạch, làm giảm tổn thương của cơ
thể dưới tác dụng của các kim loại nặng, chống béo phì, chống nhiễm trùng, chống

nhiễm khuẩn và chống oxy hóa. Từ những lợi ích rất thiết thực trên, oligosaccharides
prebiotics nói chung và POS nói riêng có tiềm năng làm thực phẩm bổ sung trong công
nghệ chế biến các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

1
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

Hiện nay POS được sản xuất bởi một số phương pháp như tổng hợp hóa học,
phân cắt pectin bằng chiếu xạ và sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin. Trong đó,
hướng nghiên cứu sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin được quan tâm hơn cả do
cho hiệu quả tốt nhất với điều kiện phản ứng enzyme êm dịu, thân thiện với môi
trường, cường lực xúc tác của enzyme mạnh và đặc hiệu.
Trên thế giới hiện nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về quá trình thủy phân
giới hạn pectin thu POS bằng phương pháp thủy phân gián đoạn [17, 55, 56, 59] và
phương pháp thủy phân có tích hợp màng lọc [21, 36, 38, 40] cho hiệu quả cao. Tuy
nhiên, có rất ít công trình trên thế giới và trong nước nghiên cứu thu hồi POS từ hệ
thống thủy phân trong bình phản ứng thông thường cũng như vẫn chưa có công trình
nào công bố về quy trình sản xuất, thu hồi POS từ hệ thống thủy phân có tích hợp
màng lọc và ứng dụng POS vào sản xuất thực phẩm chức năng. Xuất phát từ những lí
do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu nhận Pectic Oligosaccharide (POS)
từ dịch thủy phân pectin và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”
Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng quy trình thu nhận POS có chất lượng và hiệu suất cao từ dịch thủy
phân pectin ứng dụng vào sản xuất nước bí đao chức năng.
Nội dung nghiên cứu



Xây dựng quy trình thu nhận và tinh sạch Pectic oligosaccharide (POS) từ dịch
thuỷ phân pectin thu từ hệ thống thủy phân có tích hợp màng lọc.



Hoàn thiện sản phẩm và đánh giá các chỉ tiêu chất lượng, vệ sinh an toàn thực
phẩm của chế phẩm POS.



Nghiên cứu ứng dụng POS vào sản xuất nước bí đao chức năng, đánh giá chất
lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm. Xây dựng quy trình sản xuất nước bí đao
bổ sung POS.
2

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN
1.1. Prebiotic và Pectic oligosaccharide (POS)
1.1.1. Prebiotic
Prebiotic là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm cacbonhydrate mà cơ thể vật chủ
không tiêu hóa được (oligosaccharides), kích thích sự phát triển và hoạt động của vi
khuẩn có lợi trong ruột [27]. Như vậy, nhờ có prebiotic mà vi sinh vật hữu ích có điều

kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do đó cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ. Tinh bột bền
(resistant starch), Xylo oligosaccharide (XOS), Fructo oligosaccharide (FOS), Inulin và
Pectic oligosaccharides (POS) là những ví dụ đại diện cho các dòng sản phẩm dạng
này.
Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có một số cơ sở trong nước nghiên cứu
và đưa vào sản xuất một số sản phẩm prebiotic. Tại Viện Công nghiệp thực phẩm,
Trịnh Thị Kim Vân, Nguyễn Hoàng Anh đã thực hiện các đề tài nghiên cứu sản xuất
Fructooligosaccharide (FOS) bằng enzyme để ứng dụng sản xuất một số thực phẩm
chức năng [6]. Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã sử dụng enzyme endo-1,4-β-mannosidase
từ Aspergillus niger BK01 để thủy phân bã cơm dừa, thu chế phẩm đường chức năng
Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng và dược
phẩm [2]. Với các đặc tính ưu việt của enzyme tái tổ hợp, cùng hiệu suất biểu hiện cao,
quá trình ứng dụng enzyme tái tổ hợp này trong sản xuất chế phẩm MOS cao độ đang
được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn nuôi tôm,…[3].

3
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

1.1.2. Pectic oligosaccharide (POS)
Pectic oligosaccharides là các oligosaccharide có nguồn gốc từ pectin, cấu tạo từ
2 - 10 đơn phân D - Monogalacturonic nối với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside
[21] (hình 1.1).

Hình 1.1. Cấu tạo của D - Monogalacturonic và một pectic oligosaccharide [21]

Pectic oligosaccharide có phân tử lượng không lớn lắm và chúng có một số tính
chất của một acid hữu cơ, mang điện tích âm, có độ nhớt thấp và ít ngọt hơn đường
sucrose [8].
Là một oligosaccharid dễ tan trong nước và khi thủy phân bằng acid hoặc enzyme
sẽ làm đứt các liên kết glucoside, giải phóng các đơn phân Monogalacturonic và các
oligosaccharide mạch ngắn hơn.
Các nghiên cứu về pectic oligosaccharide cho thấy POS có hoạt tính của một
prebiotic, POS được các vi sinh vật có trong đường ruột sử dụng và sản phẩm của quá
trình lên men này có những ảnh hưởng tích cực đối với cơ thể vật chủ. Một số ảnh
hưởng có lợi của POS cho sức khỏe của con người như:
- Bảo vệ các tế bào đường ruột chống lại tác dụng của của độc tố Shiga [63];
- Ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh đường tiết niệu [30];
- Thúc đẩy quá trình tự chết apoptosis của các tế bào ung thư ruột ở người [62];
4
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

- Có khả năng bảo vệ tim mạch [47], làm giảm tổn thương của cơ thể dưới tác
dụng của các kim loại nặng, chống béo phì, các bệnh về da, chống độc, chống nhiễm
trùng, chống nhiễm khuẩn và chống oxy hóa.
Hoạt tính prebiotic của POS phụ thuộc vào đặc điểm hóa học và hóa lý của
chúng. Mức độ methyl hóa của pectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong các thuộc
tính lên men của POS. Người ta đã chứng minh được rằng POS có mức methyl hóa
thấp được vi khuẩn lên men tốt hơn POS có mức methyl hóa cao [26].
Năm 2003, Olano-Martin, Rimbach và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu khả
năng thúc đẩy quá trình apoptosis của tế bào ung thư ruột ở người [62].

Một nghiên cứu khác về hoạt tính prebiotics của POS có nguồn gốc từ pectin
táo gai được Li và cộng sự công bố năm 2010 [47] cho thấy POS có khả năng làm giảm
nồng độ cholesterol và triglyceride tổng số giúp ức chế sự tích tụ chất béo của cơ thể.
Năm 2004 và 2007, Holchkiss và cộng sự cũng công bố nghiên cứu chứng tỏ
rằng POS có khả năng làm tăng số lượng các loài vi khuẩn có lợi trong đường ruột như
bifidobacteria, lactobacilli [32, 33].
Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu khác ở môi trường in vivo và in vitro
cho thấy POS có tính acid không độc hoặc gây đột biến, thích hợp bổ sung vào thực
phẩm dành cho trẻ em và trẻ sơ sinh [25].
1.2. Cơ chất pectin
Pectin là polysaccharide phân nhánh phức tạp có trục chính bao gồm các phân tử
D-monogalacturonic (GalA) liên kết với nhau theo liên kết α-1,4-glucoside, trong đó
một số gốc cacboxyl -COOH có thể bị acetyl hóa và/hoặc methyl hóa ngẫu nhiên.

5
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

Pectin được tìm thấy trong tế bào của tất cả các thực vật bậc cao và chiếm khoảng
22 - 35% khối lượng khô của tế bào [15]. Pectin giữ nhiều vai trò quan trọng của thành
tế bào và của thực vật [57].
Pectin có cấu trúc khá phức tạp và gồm ba phần chính:
Homogalacturonan (HGA) và Rhamnogalacturonan (RG) I và II [11]. Cấu trúc pectin
được biểu diễn trên hình 1.2

Hình 1.2. Cấu trúc pectin [11]

Trong 3 loại trên, HGA là thành phần chiếm tỷ lệ lớn và có mặt ở nhiều loại thực
vật nên được nghiên cứu sâu rộng hơn các thành phần khác.
Một vài nhóm carboxyl -COOH của phân tử monogalacturonic trong chuỗi pectin
bị este hóa bởi nhóm methyl và phần trăm các nhóm carboxyl bị este được gọi là mức
độ este hóa, ký hiệu là DE (Degree of esterification). Mức độ este hóa ảnh hưởng lớn
đến các tính chất của pectin, đặc biệt là tính hòa tan và khả năng tạo gel.
Dựa vào mức độ este hóa, pectin được chia thành 2 nhóm chính:
- Pectin este metyl hóa cao (High methyl este - HM) với số gốc acid của pectin được
metyl hóa lớn hơn 50%.
6
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

- Pectin este metyl hóa thấp (Low methyl este - LM) với số gốc acid của pectin được
methyl hóa nhỏ hơn 50% [69].
Khả năng este hóa cao nhất có thể đạt được ở các dịch chiết nguyên liệu thô
tự nhiên khoảng 75%.
1.3. Thu nhận Pectic oligosaccharide (POS)
Pectic oligosaccharide là một prebiotic có nguồn gốc từ pectin. Hiện nay, có một
số phương pháp sản xuất POS như: tách chiết từ thực vật [48], tổng hợp và phân cắt
pectin tạo POS [34].
Thu nhận POS từ nguồn cơ chất pectin đang được nghiên cứu nhiều với các
phương pháp khác nhau:
 Phương pháp hoá học:
- Tổng hợp hóa học: tiến hành glycosyl các mono và disaccharide thích hợp, sau
đó thực hiện phản ứng nối các trihexagalacturonate đã được methyl este hóa chọn lọc

[50].
- Xử lý hóa chất: sử dụng acid pha loãng hoặc acid cô đặc (đến 2M) như
hydrochloric acid, sulfuric acid, trifloacetic acid, formic acid hoặc nitric acid đun nóng
từ 50 - 90˚C để phân cắt pectin tạo POS [19].
 Phương pháp vật lý:
Một số tác nhân vật lý được sử dụng như nhiệt, vi sóng, bức xạ γ và sóng siêu
âm [31, 37]. Ví dụ, chiếu xạ pectin thu được các mảnh oligosaccharide với hiệu suất
cao. Tuy nhiên, khi chiếu xạ sẽ làm tăng nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng lên đến hơn
100˚C, điều này sẽ làm lượng protein hoặc peptide còn lại trong mẫu có thể gây ra
phản ứng Maillard, do đó có thể hình thành các phân tử không mong muốn và độc hại
[37].
7
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

 Phương pháp sinh học
Pectin có thể được phân cắt thành các pectic oligosaccharide nhờ endopolygalacturonase [21, 38]. Phương pháp thủy phân bằng enzyme có nhiều ưu điểm
như: phản ứng được thực hiện dưới các điều kiện êm dịu, môi trường thủy phân không
gây ăn mòn thiết bị, không có chất độc hoặc hóa chất tồn dư, quá trình thủy phân có
mức độ chọn lọc cao, enzyme chỉ xúc tác cho các liên kết hoặc đơn vị cơ chất đặc biệt
của riêng nó, sản phẩm thu được nhiều hơn so với phương pháp hóa học và tránh được
sự hình thành của các hợp chất không mong muốn. Từ những ưu điểm trên cho thấy
phương pháp thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme là phương pháp đơn giản, hiệu
quả và khắc phục được nhược điểm của phương pháp vật lý và hóa học.
Hình 1.3 là sơ đồ chung sản xuất POS theo phương pháp thuỷ phân pectin bằng
enzym. Sơ đồ gồm các bước chính sau:

-

Thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme ở các điều kiện thích hợp diễn ra trong
bình phản ứng thông thường hoặc trong bình phản ứng có tích hợp màng lọc.

-

Từ dịch thuỷ phân thu được, tiến hành cô đặc, tách, tinh sạch bằng các phương
pháp lọc nano, kết tủa ethanol, hoặc lọc gel để tách riêng các thành phần POS
phục vụ cho các mục đích nghiên cứu và phân tích khác.

-

Hoàn thiện sản phẩm: bao gồm công đoạn sấy phun thu chế phẩm dạng bột,
nghiên cứu các điều kiện bao gói và bảo quản sản phẩm.

-

Đánh giá, ứng dụng: tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về chất lượng, an toàn vệ
sinh thực phẩm và hoạt tính prebiotic. Ứng dụng POS vào sản xuất một số sản
phẩm thực phẩm chức năng.

8
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

Pectin
Enzyme

Thuỷ phân giới hạn pectin
(Nồng độ pectin, enzyme, pH, to...)
thời gian)

Cô đặc, tách, tinh sạch
(lọc nano, kết tủa, sắc ký, ...)

Hoàn thiện sản phẩm
(sấy, bao gói, bảo quản)

Sản phẩm POS
(đánh giá, ứng dụng)

Hình 1.3. Sơ đồ sản xuất POS theo phương pháp thủy phân pectin bằng enzym
9
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

1.3.1. Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme thu POS trong hệ thống có
tích hợp màng lọc
Một số nghiên cứu về động học phản ứng của quá trình thủy phân pectin bởi endo
polygalacturonase cho thấy tốc độ phản ứng bị kìm hãm bởi sản phẩm thủy phân của
chúng [38, 41]. Để tránh hiện tượng này, một số nhóm nghiên cứu đã áp dụng hệ thống

bình phản ứng dạng màng [9, 21]. Với hệ thống này, các sản phẩm thủy phân có kích
thước nhỏ hơn lỗ màng có thể qua màng dễ dàng và được loại ra khỏi hệ thống, trong
khi các phần tử có khối lượng và kích thước lớn (cơ chất và enzyme) được giữ lại. Tuy
nhiên hệ thống thủy phân này là hệ thống lọc màng truyền thống (dead-end filtration)
nên có thể gặp trở ngại trong quá trình vận hành do hiện tượng tắc màng bởi thành
phần phức tạp và độ nhớt của dịch phản ứng.
Một trong những cách tiếp cận có thể đồng thời giải quyết được các vấn đề này là
sử dụng hệ thống bình phản ứng tích hợp với bộ phận lọc dòng ngang.

Màng 1

Màng 2

Hình 1.4. Sơ đồ mô hình phản ứng thủy phân có tích hợp bộ phận lọc dòng ngang
Lọc dòng ngang (Cross flow filtration - CFF) là một kỹ thuật lọc trong đó
dung dịch ban đầu chuyển động tiếp tuyến dọc theo bề mặt màng lọc. Do có sự chênh
lệch áp suất qua màng nên các phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ màng sẽ đi qua, những
10
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

thành phần lớn hơn bị giữ lại, dịch chuyển dọc theo bề mặt màng và quay trở lại bình
chứa ban đầu.
Dung dịch chuyển động định hướng đến bề mặt màng gọi là dòng cấp (feed).
Dung dịch chuyển động dọc theo bề mặt màng và quay trở lại bình chứa ban đầu gọi là
dòng hồi lưu (retentate). Dòng hồi lưu thường được bơm trở lại bình chứa ban đầu và

được tuần hoàn. Dung dịch đi qua màng được gọi là dòng ra (permeate).
Kỹ thuật lọc dòng ngang khác với kỹ thuật lọc truyền thống ở chỗ:
- Màng lọc sử dụng cho CFF được thiết kế riêng trong khi lọc truyền thống sử dụng rất
nhiều loại màng khác nhau, giấy hoặc các vật liệu khác như bi thủy tinh để phân đoạn
các thành phần có dòng cấp.
- CFF là một hệ thống tuần hoàn khép kín của dòng hồi lưu. Đối với lọc truyền thống,
dòng cấp thường chỉ đi qua màng lọc một lần.
- Trong hệ thống CFF, dòng hồi lưu được giữ lại như một dung dịch và có thể được tái
sử dụng một cách trực tiếp [75].
Rất nhiều các công trình nghiên cứu đã thành công khi ứng dụng kỹ thuật màng
cho quá trình thủy phân pectin bằng enzyme [36, 38, 40]. Bình phản ứng có tích hợp hệ
thống lọc dòng ngang chủ yếu sử dụng màng siêu lọc (ultrafiltration) và màng lọc nano
(nanofiltration). Mô hình phản ứng này có nhiều ưu điểm: (1) enzyme có thể được giữ
lại cho quá trình thủy phân liên tục trong thời gian dài; (2) màng cho phép lọc tại chỗ
các sản phẩm có kích thước nhỏ hơn lỗ màng và (3) cho phép loại bỏ một cách liên tục
sản phẩm để hạn chế tối đa quá trình ức chế phản ứng bởi sản phẩm, từ đó giúp làm
tăng sản lượng và tỷ lệ chuyển hóa [60]. Bên cạnh đó, mô hình thủy phân dạng này còn
tiết kiệm năng lượng, dễ dàng theo dõi và điều chỉnh các thông số hoạt động như áp
suất, nhiệt độ, tốc độ dòng vào, tốc độ khuấy và dễ dàng nâng cấp lên các quy mô sản
xuất lớn hơn [54].
11
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

K. Be´lafi-Bakó (2007) đã thủy phân pectin bằng enzyme polygalacturonase
trong hệ thống bình phản ứng dạng màng siêu lọc cut off 30kDa. Hệ thống thủy phân

hoạt động ổn định trong hơn 50 giờ và giúp nâng hiệu suất chuyển hóa pectin lên
40.6% so với mô hình thủy phân mẻ truyền thống do các phân tử cơ chất có khối lượng
phân tử thấp như D-monogalacturonic được giải phóng ra từ quá trình phân cắt pectin
liên tục được loại bỏ khỏi hệ thống [38]. A. Lama-Munoz và cộng sự sử dụng nhiều
loại màng kích thước khác nhau: 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa và 1 kDa để thu nhận POS từ
LM – pectin oliu. Kết quả nghiên cứu cho thấy POS chủ yếu nằm ở phân đoạn 1 – 3
kDa và chiếm 23% đường tổng số [7]. Nhóm các nhà nghiên cứu José M. RodriguezNogales và cộng sự (2008) đã sử dụng mô hình bình phản ứng lọc màng với enzyme tự
do để thủy phân pectin táo bằng hỗn hợp enzyme thô polygalacturonase và pectin
lyase. Mô hình này vận hành tốt nhất dưới điều kiện tỷ lệ enzyme/cơ chất 23.3, nhiệt
độ 48˚C, tốc độ hồi lưu 36 l/h và áp suất qua màng 34.5 kPa với màng có khối lượng
phân tử giới hạn (NMWL) 10 000. Độ nhớt của dịch thủy phân giảm đến 88% chỉ sau
15 phút và tỷ lệ chuyển hóa đạt 68% sau 2.5 giờ tương đương với khoảng 1.6 mg
monogalacturonic/ mL [36]. Cũng với hệ thống thủy phân dạng màng K. Kiss (2009)
lắp đặt thêm một máy hút chân không sau màng 30 kDa nhằm làm tăng tốc độ phân
đoạn sản phẩm khỏi hệ thống phản ứng khi thử nghiệm thủy phân pectin từ nhiều
nguồn khác nhau để thu các sản phẩm POS. POS thu được nhiều hơn, 24.3; 21.5 và
19.4 g sản phẩm/h.g enzyme lần lượt với pectin bã nho đen, củ cải đường và pectin nho
đỏ so với 9.7g sản phẩm/h.g enzyme với pectin họ citrus [40].
Trong sản xuất và tinh sạch POS, phương pháp siêu lọc và lọc nano thường
được ứng dụng để thu nhận các oligo có mức độ trùng hợp DP < 30 (3.8 kDa). J. Holck
và cộng sự đã sử dụng màng cellulose 3 kDa cho mục đích này [35], trong khi K.
Iwasaki và Y. Matsubara tinh sạch POS (thủy phân từ pectin bột cam quýt) bằng màng

12
Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

50 kDa để giữ lại các hợp chất có khối lượng phân tử lớn và sau đó lọc tiếp tục qua
màng 15 kDa [39].
1.3.2. Cô đặc, tách, tinh sạch POS
Các nhà khoa học mô tả rằng các monome monogalacturonic không có tác dụng
ngăn chặn sự bám dính của các tác nhân gây bệnh lên các tế bào, đặc biệt là các tế bào
biểu mô đường tiêu hóa và đường sinh dục, trong khi tỷ lệ ngăn chặn lên đến 91.7%
hoặc 84.6% tương ứng với digalacturonic và trimonogalacturonic, và hiệu quả ngăn
chặn mong muốn giảm cùng với trọng lượng phân tử ngày càng tăng của các
galacturonic [14]. Như vậy, việc loại bỏ các thành phần không mong muốn như đường
monosaccharide, muối đệm là cần thiết để cải thiện hoạt tính prebiotic của chế phẩm
POS. Hơn nữa, việc tinh sạch giúp mở rộng khả năng ứng dụng của POS tinh khiết
trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Vì vậy, tùy theo mục đích sử
dụng mà POS được thu hồi từ dịch thủy phân dưới các dạng chế phẩm khác nhau nhờ
một số phương pháp khác nhau.
Quy trình thu nhận của đề tài nhằm thu được chế phẩm POS tinh sạch cho ứng
dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng. Các phương pháp chính được sử dụng trong
quy trình thu nhận này bao gồm: phương pháp lọc nano, phương pháp kết tủa và
phương pháp sắc ký. POS sau khi tách và tinh sạch được tạo chế phẩm dạng bột bằng
phương pháp sấy phun để bảo quản lâu dài và thương mại hóa.


Lọc nano
Các phương pháp lọc màng nói chung cho phép đồng thời thực hiện các quá

trình tinh sạch và cô đặc dung dịch. Trong đó lọc nano là một phương pháp có nhiều
tiềm năng trong tinh sạch và cô đặc POS ở quy mô công nghiệp. Màng kích thước nano
có giới hạn khối lượng phân tử (MWCO) trong khoảng 200 – 1000 Da. Đường kính lỗ
của hầu hết các màng kích thước nano trong khoảng 0.6 – 2.0 nm, trung bình 0.8 – 0.9
13

Nguyễn Thị Kim Dung


Luận văn thạc sĩ khoa học

Công nghệ sinh học

nm. Đường kính của monosaccharides là 0.6 – 0.8 nm. Bên cạnh đó, màng nano có thể
tách riêng ion đơn (monovalent ions) ra khỏi hỗn hợp chất đa ion (multivalent ions). Vì
vậy, màng kích thước nano có thể phân riêng monogalacturonic ra khỏi digalacturonic
và oligogalacturonic.
Có nhiều báo cáo về việc sử dụng phương pháp lọc nano trong tinh sạch các
oligosaccharide. Pruksasri và cộng sự sử dụng một màng NF (NP030) để tinh sạch
GOS cho độ tinh khiết của sản phẩm đạt 85% (dựa trên hàm lượng monosaccharide) và
hiệu suất thu hồi oligosaccharide đạt 82% [67].
Feng và cộng sự đánh giá ảnh hưởng của áp suất vận hành (0.2-0.8 MPa) và
nồng độ thấp (5-60 g/l) trong tách GOS sử dụng màng lọc nano cellulose acetate. Một
màng NF-3 với giới hạn trọng lượng phân tử 0.8-1 kDa đã được chọn để phân tách một
chế phẩm GOS thương mại có hàm lượng oligosaccharide thấp bằng phương pháp lọc
pha loãng (diafiltration) ở 50˚C và áp suất 6 bar. Theo đó, 90.5% monosaccharide và
52.5% lactose trong hỗn hợp đã được loại bỏ, năng suất thu hồi oligosaccharides đạt
70.0% [24].
Bốn loại màng NP010, NP030 (Microdyn Nadir, Germany), Desal-5 DL và
Desal-5 HL đã được Kuhn sử dụng trong thí nghiệm để lựa chọn loại màng thích hợp
trong tinh sạch fructooligosaccharide (FOS) từ hỗn hợp với glucose, fructose và
sucrose [42]. Kết quả cho thấy màng NP030 cho khả năng giữ các loại đường khác
nhau khác biệt nhất: FOS (0.66), glucose (0.18), fructose (0.15), và sucrose (0.24). Các
kết quả đã chứng minh tiềm năng của phương pháp lọc pha loãng (diafiltration) sử
dụng màng NP030 trong việc tinh sạch FOS từ hỗn hợp chứa mono và disaccharide.
Phương pháp lọc nano cũng đã được nghiên cứu trên quy mô pilot được thực

hiện bởi Zhang và cộng sự để nghiên cứu khả năng giữ disaccharide (lactulose và
lactose) và chất xúc tác (NaCl và H3BO3) trong chế phẩm xi-rô lactulose. Kết quả thu
được cho thấy khả năng được giữ lại trên màng khác biệt lớn và giảm dần theo thứ tự:
14
Nguyễn Thị Kim Dung