Sàng lọc và phân tích đặc tính của enzyme thủy phân cellulose bền nhiệt và hoạt động trên môi trường axit từ nấm mốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

---------------------------

ĐÀM QUANG HIẾU

SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH CỦA
ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE BỀN NHIỆT
VÀ HOẠT ĐỘNG TRÊN MÔI TRƢỜNG AXIT
TỪ NẤM MỐC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Vũ Nguyên Thành
2. PGS.TS. Tô Kim Anh

Hà Nội - Năm 2015


MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................v
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................2
1.1. Cấu trúc cellulose.........................................................................................2
1.2. Cellulase và hoạt động thủy phân cellulose ...............................................4
1.2.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose ......................................................................... 4
1.2.2. Phân loại cellulase............................................................................................. 6
1.2.3. Các yếu tố điều hòa hoạt động cellulase .......................................................... 8
1.2.4. Cellulosome ....................................................................................................... 9
1.3. Một số ứng dụng của cellulase ..................................................................11
1.3.1. Trong thức ăn chăn nuôi .................................................................................11
1.3.2. Trong công nghiệp giấy ..................................................................................12
1.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm ........................................................................12
1.3.4. Trong kỹ thuật di truyền..................................................................................13
1.3.5. Trong công nghiệp dệt ....................................................................................13
1.3.6. Trong xử lý môi trường ..................................................................................13
1.4. Tình hình nghiên cứu cellulase bền nhiệt, hoạt động ở pH thấp trong
nƣớc và trên thế giới ...........................................................................................14
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................................14
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam..................................................................16
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................18
2.1. Vật liệu ..........................................................................................................18
2.1.1. Nguồn mẫu phân lập .......................................................................................18

i


2.1.2. Hoá chất và thiết bị ..........................................................................................18
2.1.3. Máy móc thiết bị ..............................................................................................20
2.1.4. Môi trường phân lập, nuôi cấy và chiết enzyme ...........................................21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.............................................................................22
2.2.1. Phân lập mẫu ở môi trường Czapek pH 2.0 trên giấy lọc ............................22

2.2.2. Nuôi cấy và chiết enzyme ..............................................................................22
2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme cellulase .............................................................23
2.2.3.1. Phương pháp đục lỗ thạch .............................................................23
2.2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng DNS tại các pH khác nhau ........23
2.2.4. Xác định khả năng bền nhiệt của enzyme trên cơ chất CMC ......................26
2.2.5. Xác định hàm lượng protein (Lowry) ............................................................26
2.2.6. Điện di protein SDS-PAGE ...........................................................................27
2.2.7. Điện di Zymogram .........................................................................................28
2.2.8. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................29
2.2.9. PCR fingerprinting .........................................................................................29
2.2.10. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA ..30
2.2.11. Tách chiết và tinh chế enzyme cellulase ......................................................31
2.2.12. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme. ..................32
2.2.13. Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme............................33
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................34
3.1. Phân lập chủng nấm mốc sinh enzyme thủy phân cellulose ....................34
3.2. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR finger-printing .......................................37
3.3. Định tên của các chủng nấm mốc dựa vào phƣơng pháp đọc trình tự rDNA ... 38
3.4. Xác định hàm lƣợng protein, đƣờng kính vòng thủy phân, hoạt tính
cellulase, hoạt tính CMCase của các chủng định tên .......................................41
3.4.1. Hàm lượng protein ..........................................................................................41
3.4.2. Hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0 và pH 7.0...42
3.4.3. Hoạt tính CMCase của các chủng nấm mốc .................................................43
3.5. Khả năng bền nhiệt của enzyme từ các chủng phân lập ..........................43

ii


3.6. Tinh chế enzyme cellulase ...........................................................................47
3.6.1. Chọn chủng tinh chế .......................................................................................47

3.6.2. Nuôi chiết và cô đặc enzyme .........................................................................48
3.6.3. Kết tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate ............................................49
3.6.4. Sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE Sepharose FF, thể tích cột 7 ml ...........51
3.6.5. Sắc ký tương tác kỵ nước trên cột Butyl Sepharose High Performance .....54
3.7. Xác định nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt của enzyme tinh sạch đƣợc ....58
3.8. Xác định pH tối ƣu và độ bền pH của enzyme tinh sạch đƣợc ................61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................63
KẾT LUẬN ..........................................................................................................63
KIẾN NGHỊ .........................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................64
Tài liệu tiếng Việt ................................................................................................64
Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................64
PHỤ LỤC .................................................................................................................69
I.

Trình tự vùng ITS, mã trình tự so sánh và độ tƣơng đồng của 18 chủng

nấm mốc đã đọc trình tự ....................................................................................69
II. Tổng hợp kết quả sàng lọc ..........................................................................78
III. Kết quả phần tinh chế..................................................................................82

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Sàng lọc và phân tích đặc tính của enzyme thủy
phân cellulose bền nhiệt và hoạt động ở môi trường axit từ nấm mốc” do
PGS.TS. Vũ Nguyên Thành và PGS. TS Tô Kim Anh hướng dẫn là do tôi thực hiện
và một số kết quả cộng tác với các học viên khác, không phải là sao chép của bất cứ
tác giả hay tổ chức nào trong và ngoài nước. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về

nội dung đã trình bày trong luận văn.
Hà Nội, ngày 30 tháng 9 năm 2015
Học viên

Đàm Quang Hiếu

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Vũ Nguyên Thành và PGS.TS. Tô Kim
Anh đã dành thời gian công sức tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các anh, chị và các bạn ở Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tạo điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo tôi
trong suốt thời gian làm thí nghiệm tại Trung tâm.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô Viện Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã dạy bảo tôi, cho tôi kiến
thức và kinh nghiệm bổ ích trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè
luôn ở bên tôi, cho tôi nguồn động lực, chia sẻ và giúp tôi hoàn thành tốt quá trình
học tập và nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày 30 tháng 9 năm 2015
Học viên

Đàm Quang Hiếu

ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
APS

Ammonium persulfate

BSA

brovine serum albumin

CBD

Cellulose binding domain

CBM

Cellulose binding module

CMC

Carboxylmethyl cellulose

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNS

3,5 Dinitrosalicylic acid

DP

degree of polymerization

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA

ethylene diamine tetra acetic acid

FPU

Fiter paper unit

GH

Glycoside hydrolase

ITS

Internal transcribed spacer

IU

International unit

kDa

KiloDalton

MDa

MegaDalton

OD

opical desity

PCR

polymerase chain reaction

PDA

potato dextrose agar

rDNA

ribosomal deoxyribonucleic acid

SDS-PAGE

sodium dodecyl sulphate - Polyacrylamide
gel electrophorosis

iii


DANH MỤC BẢNG

STT

Bảng

Trang

1

Bảng 1.2.3. Một số chất điều hòa hoạt động cellulase.

9

2

Bảng 2.1.1. Tổng hợp danh sách các chủng nấm mốc chịu nhiệt
và pH đã phân lập được.

78

3

Bảng 2.3.1. Bảng tổng hợp đường kính vòng thủy phân và hoạt
tính enzyme ở pH 3.0, pH 5.0 và pH 7.0 của 58 chủng nấm mốc
phân lập được.

80

4

Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc chịu nhiệt và pH phân

lập được.

34

5

Bảng 3.1.1. Hoạt tính CMCase của các mẫu thu từ cột DEAE
Sepharose FF của mẫu 50 % (NH4)2SO4.

82

6

Bảng 3.2.1. Hoạt tính CMCase của mẫu thu từ cột DEAE
Sepharose FF mẫu kết tủa 60 % (NH4)2SO4.

84

7

Bảng 3.3. Kết quả định tên loài của 20 chủng đại diện dựa vào
phương pháp đọc trình tự rDNA.

38

8

Bảng 3.3.1. Hoạt tính CMCase của các phân đoạn sau khi chạy
qua cột Sepharose High Performance (HIC).

86

9

Bảng 3.4.3. Bảng tổng hợp đường kính vòng thủy phân và hoạt
tính enzyme ở pH 3.0, pH 5.0 và pH 7.0 của các chủng phân lập
được.

45

10

Bảng 3.6.1. Hoạt tính enzyme trước và sau khi cô đặc.

49

11

Bảng 3.6.3.1. Khối lượng (NH4)2SO4 cần bổ sung ở các phân
đoạn.

49

12

Bảng 3.6.3.2. Hoạt tính CMCase của các phân đoạn tủa muối
(NH4)2SO4.

50

13

Bảng 3.6.5.1. Hoạt tính riêng của enzyme trước và sau tinh chế.

58

iv


DANH MỤC HÌNH
STT

Hình

Trang

1

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose.

3

2

Hình 1.2. Hoạt động xúc tác của các cellulase trên cơ chất cellulose.

7

3

Hình 2.2.1. Đường kính vòng thủy phân của 58 chủng nấm mốc
phân lập được.

80

4

Hình 2.2.3.2. Đường chuẩn glucose ở pH 3.0, pH 5.0 và pH 7.0.

24

5

Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc, hình thái tế bào của một số chủng
nấm mốc phân lập.

36

6

Hình 3.2. Phổ finger-printing của 20 chủng nấm mốc đã chọn.

37

7

Hình 3.3. Cây phả hệ xây dựng dựa trên trình tự ITS của các chủng
LPH 134, LPH 137, LPH 172, LPH 182 và các loài liên quan.

40

8

Hình 3.4.1. Hàm lượng protein của một số chủng nấm mốc phân
lập được.

41

9

Hình 3.4.2. Hoạt tính cellulase ở pH 3.0, pH 5.0 và pH 7.0 của
một số chủng nấm mốc phân lập.

42

10

Hình 3.4.3. Hoạt tính CMCase ở pH 3.0, pH 5.0 và pH 7.0 của các
chủng phân lập.

44

11

Hình 3.5. Khả năng bền nhiệt của các enzyme từ các chủng phân
lập được.

47

12

Hình 3.6.1. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 9.3.

48

13

Hình 3.6.3. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của các phân đoạn tủa
muối (NH4)2SO4.

50

14

Hình 3.6.4.1. Sắc ký đồ và ảnh điện di SDS-PAGE mẫu tủa 50 %
(NH4)2SO4 sau khi chạy qua cột DEAE Sepharose FF.

52

15

Hình 3.6.4.2. Sắc ký đồ và ảnh điện di SDS-PAGE mẫu tủa 60 %
(NH4)2SO4 sau khi chạy qua cột DEAE Sepharose FF.

53

16

Hình 3.6.5.1. Sắc ký đồ và ảnh điện di SDS-PAGE các đỉnh peak
sau khi chạy qua cột HIC.

55

v


STT

Hình

Trang

17

Hình 3.6.5.2. Ảnh điện di SDS-PAGE các faction E104÷E124 sau
khi chạy HIC.

56

18

Hình 3.6.5.3. Ảnh điện di SDS-PAGE và Zymogram các bước của quá
trình tinh chế.

57

19

Hình 3.7.1. Nhiệt độ tối ưu của phản ứng enzyme-cơ chất ở pH5.0.

59

20

Hình 3.7.2. Độ bền nhiệt của enzyme ở pH 5.0.

60

21

Hình 3.7.3. Thời gian bán hủy của enzyme ở 70 °C, pH 5.0.

60

22

Hình 3.8.1. Ảnh hưởng của pH lên phản ứng enzyme cơ chất ở 50 °C.

61

23

Hình 3.8.2. Khảo sát độ bền pH của enzyme tinh chế được ở 50 °C.

62

vi


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới tạo điều kiện thuận
lợi cho việc phát triển các cây công - nông nghiệp. Sự gia tăng sản lượng các mặt
hàng nông sản phục vụ đời sống và nhu cầu xuất khẩu kéo theo nhiều phế phụ phẩm
nông nghiệp thải ra trong quá trình sản xuất và chế biến. Tuy nhiên, nguồn nguyên
liệu này có thể sử dụng một cách hữu ích trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất
thức ăn chăn nuôi, chế biến giấy, cồn nhiên liệu... Để thủy phân sinh khối thực vật
cho những ứng dụng kể trên, enzyme cellulase thường được sử dụng. Với mỗi ứng
dụng, enzyme thủy phân cần đáp ứng các tiêu chí kỹ thuật nhất định, ví dụ về điều
kiện pH hoạt động, nhiệt độ làm việc, tính bền với các tác nhân hóa học, sinh học,
khả năng thu hồi…
Cellulase thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm phá vỡ cấu trúc tế
bào thực vật, tăng khả năng tiêu hóa của vật nuôi. Trong sản xuất công nghiệp, thức
ăn chăn nuôi thường được nén thành viên ở nhiệt độ cao (70÷80 C) nhằm hồ hóa
thức ăn và diệt Salmonella. Do vậy enzyme ứng dụng trong chăn nuôi cần đảm bảo
khả năng chịu nhiệt. Ngoài ra, để đảm bảo khả năng hoạt động trong môi trường
dịch dạ dày động vật enzyme cần thể hiện hoạt tính ở môi trường axit.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn cấp thiết trên chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Sàng lọc và phân tích đặc tính của enzyme thủy phân cellulose bền
nhiệt và hoạt động ở môi trường axit từ nấm mốc” nhằm tìm kiếm các enzyme
mới có khả năng ứng dụng trong chăn nuôi. Đề tài bao gồm các nội dung sau:
-

Phân lập, tuyển chọn nấm mốc chịu nhiệt và pH thấp

-

Phân nhóm và định tên các chủng lựa chọn

-

Xác định hoạt tính, khả năng chịu nhiệt, pH hoạt động của cellulase sinh ra
bởi các chủng lựa chọn

-

Tinh chế và xác định đặc tính của cellulase từ một chủng tiềm năng

Đàm Quang Hiếu

1

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cấu trúc cellulose
Cellulose là một polysaccharide quan trọng và hợp chất hữu cơ phong phú
nhất trên trái đất. Cellulose là thành phần chính của thành tế bào thực vật, tạo hình
thù cho thân cây, lá, cành và giúp chúng cứng cáp hơn. Ngoài ra người ta còn thấy
chúng có nhiều trong thành tế bào ở một số loài vi sinh vật. Cellulose chiếm 50 %
lượng sinh khối thực vật, chiếm khoảng 90 % trong bông, 40÷50 % trong cây gỗ và
khoảng 45 % trong các cây dầu. Cellulose được phát hiện vào năm 1837 bởi nhà

hóa học người Pháp Anselme Payen khi ông phân lập nó từ nguồn thực vật và xác
định công thức hóa học của nó [14]. Hàng năm, lượng cellulose trong sinh quyển
được sản xuất là 4x1010 tấn (Coughlan. 1985) và tổng khối lượng cellulose trên trái
đất ước tính khoảng 7x1011 tấn. Thời gian bán hủy của cellulose là 4.7x106 năm ở
điều kiện nhiệt độ thường (Wolfenden et al. 1998). Khi đun sôi với H2SO4 nồng độ
cao, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân ở điều kiện nhẹ nhàng sẽ
tạo nên disaccharide cellobiose [6].
Cellulose là một hợp chất hữu cơ với công thức (C6H10O5)n, là polysaccharide
đồng thể mạch thẳng cấu tạo bởi các đơn phân glucose liên kết với nhau bởi các liên
kết β-1,4-glycoside. Cấu trúc của cellulose được mô tả như trong hình 1.1 [10].
Trong phân tử cellulose, các gốc -D-glucose có cấu tạo hình ghế và quay một góc
180 với nhau, do đó các nhóm hydroxyl (-OH) đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang.
Đơn vị lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose bao gồm hai đơn vị đường
glucose. Trong tự nhiên, chuỗi cellulose có mức độ trùng hợp (DP) từ vài nghìn đến
hàng chục nghìn đơn vị glucose, ở trong gỗ xấp xỉ 10000 DP và trong bông là
15000 DP [14]. Tùy theo từng loại thực vật mà các phân tử cellulose có khối lượng
phân tử rất khác nhau (từ 50.000 đến 2.500.000) [5]. Các nhóm OH ở hai đầu mạch
có tính chất hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử, trong khi
đó OH tại C4 có tính chất rượu [1].

Đàm Quang Hiếu

2

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose.
Bằng tia Rơnghen người ta xác định được cellulose có cấu tạo sợi, các chuỗi
cellulose có đường kính khoảng 3 nm kết hợp với nhau tạo thành vi sợi có đường
kính 10÷40 nm. Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và
liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là vùng kết tinh và vùng
vô định hình. Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, cấu trúc sợi đậm đặc và chặt
chẽ như tinh thể, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược
lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết lỏng lẻo với nhau nên dễ bị tấn công
[11]. Tỷ lệ vùng kết tinh và vùng vô định hình tùy thuộc vào nguồn gốc, xuất xứ
của nguyên liệu. Sự kết tinh của cellulose một phần là nhờ các liên kết hydro giữa
các mạch cellulose. Tất cả các nhóm hydroxyl (-OH) trong pha vô định hình đều
hấp thụ nước và trương nở giúp cho cellulose bị tấn công dễ dàng. Trong khi chỉ
một số ít nhóm hydroxyl trong vùng kết tinh có tương tác với nước, ở điều kiện
thường cellulase chỉ có thể tác động lên bề mặt sợi cellulose.
Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (một loại
heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như galactose, manose, glucose,
xylose, arabinose…), với pectin (hợp chất polymer của axit D-galacturonic), với
lignin điều này làm cho cellulose khá bền vững với tác động của enzyme cũng như
hóa chất. Việc thủy phân cellulose chỉ có thể diễn ra khi cellulose đã tách khỏi các
thành phần cùng cấu tạo nên thành tế bào thực vật. Chính vì vậy, để có thể phân giải
được cellulose tự nhiên cần phải có sự kết hợp giữa các enzyme.

Đàm Quang Hiếu

3

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật

Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

1.1. Cellulase và hoạt động thủy phân cellulose
1.1.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose
Năm 1890 hai nhà khoa học Brown và Morris đã đưa ra bằng chứng kết luận
khả năng thủy phân cellulose trong dịch chiết đại mạch là do một loại enzyme đặc
biệt, nhưng trước đó trong ấn phẩm de Bary xuất bản năm 1886 các nhà khoa học
đã tiến hành thí nghiệm trộn dịch chiết nấm mốc với tế bào thực vật và quan sát. Họ
thấy rằng chúng có khả năng phân hủy thành phần polysaccharide trên thành tế bào.
Tiếp đó, năm 1899 Newcombe cũng đã chứng minh rằng, bản chất enzyme thủy
phân cellulose trong đại mạch hoàn toàn khác với enzyme thủy phân cellulose là
cellulase, và một thập niên sau người ta mới làm sáng tỏ bản chất các cellulase là
các protein.
Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose vô cùng phong
phú và đa dạng. Bản chất của quá trình này là do các vi sinh vật sinh tổng hợp nên
các enzyme cellulase, chúng xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose, glucose
và sử dụng các hợp chất sinh ra làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng [16].
Vi khuẩn
Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất vào
việc phân giải cellulose. Chúng có khả năng tiết ra enzyme phân giải cellulose khá
mạnh, mỗi loại vi khuẩn chỉ sinh một loại enzyme nhất định. Nhưng lượng enzyme
mà vi khuẩn tiết ra lại ít, việc chỉ tiết một loại enzyme điều này làm hạn chế khả
năng phân hủy cellulose trong tự nhiên.
Cả vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí đều có khả năng phân giải cellulose. Trong
điều kiện kỵ khí cả vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt đều phân giải cellulose khá tốt. Đại
diện điển hình cho các vi khuẩn ưa ấm phân giải cellulose ở nhiệt độ 30÷40 C là
loài Clostridium omelanskii, vi khuẩn ưa nhiệt là loài Clostridium thermocellum và
Bacillus dellulosae, nhiệt độ tốt nhất cho sự hoạt động của chúng là 60÷65 C. Các

loại vi khuẩn trên phân giải cellulose thành glucose và cellobiose, chúng sử dụng
các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon, kèm theo việc tạo thành
các axit hữu cơ, CO2 và H2O [34; 35].
Đàm Quang Hiếu

4

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

Nấm mốc
Nấm mốc (nấm sợi) là nhóm vi sinh vật có khả năng tiết hệ enzyme cellulase
ngoại bào khá mạnh và đầy đủ, điều này làm cho khả năng phân hủy cellulose trong
tự nhiên của chúng trở nên rất tốt và triệt để. Sau chiến tranh thế giới thứ II, một dự
án lớn được triển nhằm tìm kiếm và sàng lọc các chủng nấm mốc có khả năng sinh
tổng hợp cellulase, một trong những chủng được tìm thấy là Trichoderma viride
(hay còn gọi là Trichoderma reesei). Chúng được phân lập ở quần đảo Solomon.
Năm 1979, bằng cách tạo đột biến các nhà khoa học đã thu được chủng
Trichoderma reesei có khả năng tổng hợp enzyme với hiệu suất tăng gấp 20 lần so
với chủng gốc. Từ đó cellulase bắt đầu được nghiên cứu sâu hơn và áp dụng sản
xuất với mục đích thương mại, phục vụ rất nhiều ngành công nghiệp khác [13]. Vào
những năm cuối của thập kỷ 80 thế kỷ 20, Abuja và các cộng sự đã tìm ra cấu trúc
bậc bốn của cellulase của Trichoderma reesei nhờ kỹ thuật quét tia X [38]. Đây
được coi là một bước ngoặt quan trọng trong nghiên cứu cellulase. Nấm mốc
Trichoderma reesei là một đại diện tiêu biểu cho khả năng phân hủy lignocellulose
thành đường và các thành phần khác [36].

Ngoài ra các loài nấm khác như: Penicillium pinophinum, Aspergillus niger,
Aspergillus wentii, Sporotrichum pulverulentum, Fusarium lini, Penicillium
fumiculosum… cũng có khả năng phân hủy cellulose trong tự nhiên khá cao. Một số
nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng các loài nấm ưa nhiệt có khả năng sinh tổng
hợp cả exo-glucanase, endo-glucanase và -glucosidase, chúng là những enzyme
bền nhiệt, có thể giữ được hoạt tính ở nhiệt độ cao trong thời gian khá lâu [9].
Một số loài nấm chịu nhiệt phân hủy cellulose mạnh nhưng cellulase tách chiết
từ canh trường lại có hoạt tính rất thấp do sự phân hủy cellulose liên quan mật thiết
tới hệ sợi [26]. Cellulase của nấm mốc chịu nhiệt tác động ưu tiên lên cellulose tinh
thể hơn là cellulose vô định hình. Trừ một số trường hợp ngoại lệ như Thermoascus
aurantiacus [25], Humicola insolens [22], và H. grisea var. thermoidea [41], các
chủng nấm mốc này sản sinh cellulase mạnh ngay cả trên cơ chất hemicellulose
không chứa cellulose. Với một số chủng Spothermophile rotrichum, các
Đàm Quang Hiếu

5

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

disaccharide, cellobiose và lactose cũng cảm ứng quá trình sinh tổng hợp cellulase,
mặc dù hiệu quả thấp [20].
Xạ khuẩn
Ngoài vi khuẩn và nấm mốc thì có một nhóm vi sinh vật đặc biệt cũng có khả
năng phân hủy cellulose đó là xạ khuẩn. Xạ khuẩn có cấu tạo nhân đơn giản giống
như vi khuẩn. Tuy vậy, đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh

phức tạp và có nhiều màu sắc giống như nấm mốc. Chúng sinh trưởng và phát triển
cả trong môi trường hiếu khí, vi hiếu khí và cũng có một số loài phát triển trên cả
môi trường kỵ khí. Xạ khuẩn sinh enzyme cellulase ngoại bào. Một số loài xạ khuẩn
có khả năng phân hủy cellulose: Streptosproagium, Streptomyces, Actinomyces,
Micromonospora,…
1.1.2. Phân loại cellulase
Cellulase là hệ enzym xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản
phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn vị glucose.
Có thể phân loại cellulase theo nhiều cách khác nhau.
Theo phân loại thông thường (hệ thống phân loại EC).
Dựa vào vị trí xúc tác của enzyme, cellulase được chia thành 3 loại chính:
Endo-1,4-β-glucanase (1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) (EG)
enzyme này tác động ngẫu nhiên lên cơ chất tại vị trí liên kết 1,4-β-glucan ở cả hai
dạng cellulose hòa tan và không hòa tan. Sản phẩm của quá trình phân cắt là
cellodextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này còn có một số các tên khác như:
endoglucanase, C-cellulase.
Exo-1,4-β-D-glucanase (EC 3.2.1.91)(CBH) thủy phân 1,4-β-D-glucan thành
D-cellobiose. Enzyme này tấn công chuỗi cellulose từ đầu không khử và giải phóng
ra các cellobiose. Enzyme này còn có một số tên gọi khác như: cellobiohydrolase,
cellobiosidase và avicellase.

Đàm Quang Hiếu

6

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

β-D-glucosidase (cellobiase, EC 3.2.1.21), enzyme này chỉ thủy phân
cellobiose và dạng hòa tan của cellodextrin tạo thành D-glucose. Chúng không có
khả năng thủy phân cellulose tự nhiên.
Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của cả 3 enzyme trên [7].
Trước tiên enzyme EG tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các
đầu cuối của chuỗi polysaccharide. Sau đó enzyme CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản
phẩm cuối cùng là cellobiose. Cuối cùng enzyme β-D-glucosidase sẽ phân cắt
cellobiose thành glucose.

Hình 1.2. Hoạt động xúc tác của các cellulase trên cơ chất cellulose [12].
Mặc dù hệ thống phân loại EC đã cho ta biết khá đầy đủ và chính xác sự khác
biệt giữa hoạt động của cellylotic enzyme, tuy nhiên vẫn không thể tránh được
những hạn chế. Thứ nhất, ranh giới giữa hoạt động của endocellulolytic (EC
3.2.1.4) và exocellulolytic (EC 3.2.1.91) không rõ ràng khi mà có một vài enzyme
thể hiện cả hai kiểu hoạt động. Thứ hai, nhóm EC bao gồm họ protein với sự khác
nhau hoàn toàn về cấu trúc có thể khác biệt về nguồn gốc của sự tiến hóa.

Đàm Quang Hiếu

7

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

Hệ thống phân loại GH (Glycoside Hydrolase):
Dựa vào đặc điểm trình tự Glycoside hydrolase (EC 3.2.1.-). Đây là một nhóm
chứa nhiều enzyme thủy phân liên kết glycosid giữa hai hoặc nhiều carbonhydrate
hoặc giữa một carbohydrate và một không phải là carbohydrate. Hiện nay có rất
nhiều enzyme cellulase được tìm thấy dựa vào trình tự DNA nhưng chưa được mô
tả về sinh lý, sinh hóa. Một hệ thống phân loại chứa đựng tất cả các thông tin bao
gồm thông tin về cấu trúc, chức năng và phát sinh loài, các mối quan hệ tiến hóa
liên quan trong một họ đã được xây dựng. (CAZy. for carbohydrate-active enzyme
database; ) [42]. Tại thời điểm bài viết (2012), Cazy hiện chia
nhỏ các trình tự glycoside hydrolase vào 122 họ riêng biệt từ GH1÷GH122 (và thêm
956 trình tự chưa được phân loại). Cho đến nay số họ đã lên tới 133 và cellulase
được xếp vào một nhóm họ mới là GH124.
Phân nhóm cellulase dựa vào cấu trúc protein:
Cellulase được chia thành 4 dạng khác nhau: cấu trúc α, cấu trúc β, cấu trúc
hỗn hợp α+β, cấu trúc α/β. Về mặt hóa học, cellulase xúc tác phản ứng thủy phân
liên kết β-1,4-glycoside nằm trong các chuỗi polymer của cellulose. Một số
cellulase chỉ tác động lên cellulose không tan còn được gọi là “true cellulase”.
1.2.3. Các yếu tố điều hòa hoạt động cellulase
Các chất hoạt hóa là những chất có thể làm tăng hoạt độ của enzyme một cách
trực tiếp hay gián tiếp. Đối với các chất kìm hãm, chúng kết hợp với enzyme ở vị trí
ngoài trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme theo
hướng không có lợi cho hoạt tính xúc tác, làm giảm hoạt lực enzyme. Tuy nhiên,
enzyme vẫn có thể hoạt động và mức độ hoạt lực bị giảm tùy thuộc vào nồng độ các
chất ức chế. Ví dụ đối với cellulase từ Trichoderma reesei thì δ-gluconolactone có
thể hoạt động như chất kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh, chất này có khả
năng bám vào trung tâm hoạt động của cellulase.
Trên thế giới việc tìm hiểu về các yếu tố điều hòa hoạt động của cellulase đã
được nghiên cứu khá nhiều. Dưới đây là bảng tổng hợp một số chất điều hòa hoạt
động cellulase.

Đàm Quang Hiếu

8

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

Bảng 1.2.3. Một số chất điều hòa hoạt động cellulase [16; 17; 18; 19; 20; 32].
Enzyme/ Chất
thử

Cellulase
(C. thermocellum)

Cellulase
(T. reesei)

Glucose

x

- (c, 73 mM)

Cellobiose

x

- (c, 29 mM)

δ-gluconolactone

- (c, 10 mM)

Ethanol

- (c)

Buthanol

- (c)

Acetone

+

EDTA

Cellulase
(Khoai tây)

-

EGTA

- (10 mM)

- (10 mM)

HgCl2

- (20 mM)

x

Ag+

- (20 mM)

x

-

Mn2+

x

- (10 mM)

Ca2+

x

- (10 mM)

+

Mg2+

x

- (10 mM)

+

Na+

+

K+

+

Cu2+

- (20 mM)

- (20 mM)

Zn2+

- (1 mM)

- (1 mM)

Chú thích: (+): Hoạt hóa, (-): Ức chế, (c): Ức chế cạnh tranh, (x): Không ảnh hưởng
1.2.4. Cellulosome

Năm 1980 Raphael Lamed và Ed Bayer là những người đầu tiên xác định và
đưa ra khái niệm về cellulosome. Nhưng cho đến nay nhờ những tiến bộ về khoa
học kĩ thuật thì cellulosome đã được nghiên cứu khá kĩ về cả cấu trúc và chức năng.
Cellulosome là phức hệ enzyme có cấu trúc đa vùng, mỗi vùng có cấu tạo và chức
năng riêng, nhưng chúng tương tác chặt chẽ với nhau tạo thành một thể thống nhất
Đàm Quang Hiếu

9

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

[34]. Cellulosome có khả năng thủy phân chọn lọc và cố định cellulose tinh thể.
Kích thước của một phân tử cellulosome rất lớn có thể lên đến vài MDa.
Cellulosome là phức hợp enzyme nhiều thành phần, liên kết với bề mặt tế bào và
làm trung gian gắn cơ chất không tan lên tế bào, chuyển cơ chất này thành dạng tan
để tế bào hấp thụ. Cấu trúc của cellulosome gồm có các thành phần chính sau:
- Vùng không xúc tác gọi là scaffoldin (vùng cấu trúc).
- Vùng xúc tác.
- Vùng liên kết với cellulose.
Vùng cấu trúc (scaffoldin):
Một phân tử cellulosome bao gồm nhiều scaffoldin, một scaffoldin có vai trò
liên kết với vùng xúc tác và chứa vị trí liên kết carbohydrate (CBM), một scaffoldin
thứ hai giữ vai trò liên kết bề mặt tế bào (SLH), còn scaffoldin thứ ba chứa các
cohensive và dockerin. Các scaffoldin thường chứa nhiều cohensin vào khoảng 140
axit amin và trình tự axit amin này thường rất bảo thủ. Trong khi đó, kích thước của

dockerin khoảng 70 axit amin gồm 2 trình tự kép dài 22 axit amin, cả hai trình tự
đều có vị trí liên kết với ion Ca2+.
Vùng xúc tác:
Đây là vùng quan trọng nhất trong cấu trúc cellulase, là vùng chứa các gốc axit
amin tham gia trực tiếp vào quá trình phản ứng enzyme - cơ chất. Các gốc axit amin
quan trọng là Asp và Glu, chúng tham gia phản ứng xúc tác theo hai cơ chế duy trì và
chuyển hóa. Cho đến nay, việc nghiên cứu cấu trúc vùng xúc tác được mở rộng trên cả
lĩnh vực gene, có nhiều gene mã hóa cho các cellulase đã được nhân dòng và giải trình
tự DNA. Theo thống kê tính đến năm 2010 có 112 gene đã được công bố trên “Swiss
protein data base”. Thêm vào đó, một số gene mã hóa cho các cellulase nhưng có trình
tự khác biệt với các gene đã biết, chứng tỏ sự đa dạng của cellulase trong tự nhiên và
hiểu biết về enzyme này vẫn còn hạn chế. Trong số các trình tự gen đã được công bố,
hầu hết chúng thuộc một vài họ cellulase chính, ví dụ khi xác định cấu trúc của nhiều
cellulase thuộc 8 họ khác nhau, kết quả cho thấy các enzyme trong một họ đều có

Đàm Quang Hiếu

10

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

chung một vùng cấu trúc cơ bản. Các họ khác nhau điển hình ở vùng xúc tác, chính vì
thế mà cơ chế phản ứng của chúng cũng khác nhau.
Vùng liên kết cellulose (CBD):
CBD là vùng đặc biệt trên cellulase, nó có chức năng liên kết với cơ chất

cellulose giúp cho enzyme xúc tác dễ dàng hơn. CBD gắn vào vùng xúc tác phản
ứng thông qua một liên kết glycoside, đặc tính của liên kết này là rất linh hoạt, giúp
cho nó có thể gắn hay nhả ra một cách dễ dàng. Về cấu trúc protein thì CBD có thể
nằm ở đầu C hay đầu N của chuỗi polypeptide. Dựa vào trình tự các axit amin, các
nhà nghiên cứu đã đã chia chúng thành 13 họ khác nhau [37]. Trong số 13 họ thì có
7 CBD đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp khác nhau: Cấu trúc CBD
của Trichoderma reesei thuộc họ số 1 được xác định bằng phương pháp NMR [23].
Cấu trúc CBD của Clostridium fimi thuộc họ số 2 được xác định bằng phương pháp
chiếu xạ tia X [28; 39]. Cấu trúc CBD của Trichoderma fusca thuộc họ số 3 được
xác định bằng phương pháp tinh thể hóa [31]. Tuy cấu trúc không gian của các
CBD thuộc các họ 1, 2 và 3 là khác nhau nhưng thành phần protein của chúng đều
được cấu tạo từ các chuỗi β-sheet.
1.3. Một số ứng dụng của cellulase
1.3.1. Trong thức ăn chăn nuôi
Cellulase hiện nay đã và đang rất được quan tâm vì khả năng thủy phân các hợp
chất chứa cellulose rẻ tiền, đa dạng và sẵn có trong tự nhiên như rơm, rạ, bã mía… để
làm nguyên liệu cho việc sản xuất thức ăn chăn nuôi. Việc sử dụng cellulase để thủy
phân vừa giúp vật nuôi cải thiện tiêu hóa và hấp thu dễ dàng dinh dưỡng từ nguyên liệu
thức ăn vừa góp phần bảo vệ môi trường. Cellulase ngoài khả năng giúp vật nuôi dễ
hấp thu chất dinh dưỡng có trong thức ăn hơn nó còn tác động tích cực lên quá trình lên
men ở manh tràng bằng cách tăng sản xuất axit propionic, chất này hoạt động như một
chất kháng khuẩn và do đó có thể làm giảm số lượng của vi khuẩn gây bệnh [24]. Sử
dụng cellulase vào thức ăn chăn nuôi đem lại những tác dụng rất tốt như vậy nhưng
muốn giữ lại được khả năng xúc tác của enzyme thì enzyme cần bền nhiệt và chịu được
pH thấp để sau quá trình ép viên và trong dạ dày của vật nuôi chúng vẫn thể hiện hoạt
Đàm Quang Hiếu

11

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật

Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

tính. Chính vì vậy ngay từ bước đầu ta nên tìm những chủng sinh cellulase có hoạt tính
cao và bền nhiệt cũng như chịu pH.
1.3.2. Trong công nghiệp giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, các nguyên liệu đầu vào chứa
một hàm lượng lớn các chất chứa lignin và hemicellulose là những chất rất khó hòa
tan bởi quá trình nghiền cơ học thông thường. Việc bổ sung endoglucanase trước
quá trình nghiền cơ học sẽ làm thay đổi nhẹ cấu trúc của cellulose giúp tăng hiệu
quả và tiết kiệm khoảng 20 % năng lượng trong quá trình nghiền cơ học. Ngoài
endoglucansase thì hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase cũng được bổ
sung vào nguyên liệu đầu vào trước khi tiến hành xử lý hóa học và cơ học. Chúng
giúp phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào trong
gỗ nhằm tăng hiệu quả khử lignin.
Trong công nghiệp tái chế giấy: Trước đây, người ta thường sử dụng axit HCl
để tẩy trắng giấy. Tuy nhiên việc dùng HCl dẫn đến nước thải ra trong quá trình sản
xuất làm ô nhiễm môi trường và gây hại đối với sức khỏe con người. Ngày nay,
người ta thường sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn tẩy trắng giấy cũng như
trong quá trình tái chế giấy. Enzyme cellulase sẽ thủy phân một lớp rất nhỏ các chất
bẩn bám trên bề mặt giúp giấy sạch và trắng hơn. Ưu điểm của phương pháp này là
giữ cho sợi giấy không bị ăn mòn nhiều và không ảnh hưởng đến môi trường.
1.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm
Cellulase ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng vào trong thực phẩm và đồ
uống. Trong công nghiệp sản xuất bia, cellulase được sử dụng để ngăn chặn sự tạo
thành các diacetyl, rút ngắn thời gian để ủ bia. Hơn nữa cellulase làm giảm đáng kể
lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia. Trong sản

xuất các loại nước hoa quả, cellulase được thêm vào ở giai đoạn dịch hóa, làm cho
độ đồng hóa của nước quả có thịt tốt hơn. Cellulase góp phần làm giảm độ nhớt của
dịch quả thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong nước quả. Trong quá trình
sản xuất cà phê, cellulase và pectinase được dùng để xử lý bóc vỏ cà phê và làm
tăng khả năng trích ly dịch quả.

Đàm Quang Hiếu

12

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

Trong sản xuất cồn nhiên liệu, cellulase có vai trò quan trọng trong việc sản
xuất ethanol thế hệ hai từ nguồn nguyên liệu có bản chất lignocellulose. Việc sử
dụng các enzyme thủy phân lignocellulse trong giai đoạn tiền xử lý góp phần đáng
kể vào hiệu quả quá trình lên men, giảm chi phí tiêu tốn năng lượng và thân thiện
hơn so với các phương pháp tiền xử lý bằng vật lý hay hóa học khác. Trong sản
xuất bột giặt và chất tẩy rửa, bổ sung cellulase chủ yếu nhằm mục đích làm mềm sợi
vải cotton. Khi bổ sung cellulase kết hợp với một số enzyme khác như protease,
lipase,… sẽ làm cho các sản phẩm tẩy rửa có thể tẩy sạch một số vết bẩn khó giặt
như vết mực, dầu mỡ…
1.3.4. Trong kỹ thuật di truyền
Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng để phá vỡ tế bào thực vật mà
không làm tổn thương các cơ quan bên trong, đảm bảo nguyên vẹn nhân tố di
truyền. Đó là phương pháp ưu việt hơn so với phương pháp hóa học và cơ học.

1.3.5. Trong công nghiệp dệt
Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyem cellulase để giữ sáng vải,
bền và không sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và
tạo ra các vệ “stone washed”. Trước đâu các vệt “stone washed” được làm thủ công
bằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra
những sợi chỉ trắng. Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn
giặt vải jean thay cho việc sử dụng đá bọt. Enzyme cellulase chỉ thủy phân theo các
vết kieemd trên vải jean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed”. Các vệt
“stone washed” được tạo ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt.
Ngoài ra người ta có thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm
lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt.
1.3.6. Trong xử lý môi trường
Chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thải được
thải ra. Trong chất thải hữu cơ có nguồn gốc thực vật thì cellulose chiếm khoảng 50
%. Trong điều kiện tự nhiên các chất thải này thường có thời gian phân hủy rất lâu
(khoảng 8 tháng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới); tuy nhiên thời gian phân hủy sẽ

Đàm Quang Hiếu

13

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

được giảm xuống còn khoảng 1 tháng nếu như bổ sung sinh vật giàu cellulase. Việc
thúc đẩy nhanh quá trình thủy phân nguồn chất thải chứa cellulose này không chỉ

giúp bảo vệ môi trường mà nó còn làm tăng quá trình chuyển hóa của vật chất trong
tự nhiên.
Ngoài việc bổ sung trực tiếp nguồn vi sinh vật vào các bể ủ để xử lý rác thải
thì các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật có khả năng thủy phân cellulase đã
và đang được nghiên cứu. Phức hệ cellulase thường được sử dụng để bổ sung vào
nguồn nước thải của các nhà máy giấy nhằm phân hủy nhanh các hợp chất chứa
cellulose giúp cho việc xử lý các nguồn nước thải của các nhà máy dễ dàng và đơn
giản hơn, tiết kiệm chi phí.
1.4. Tình hình nghiên cứu cellulase bền nhiệt, hoạt động ở pH thấp trong nƣớc
và trên thế giới
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nấm mốc chịu nhiệt có mặt trong các loại đất và bên trong khối thực vật đang
phân hủy. Nấm mốc chịu nhiệt có thể tìm thấy trong phân ủ, đống cỏ khô, ngũ cốc
được lưu trữ, vật liệu làm tổ của các loài chim và động vật, rác thải thành phố. Các
chất hữu cơ khi được tích lũy trong môi trường ấm áp, ẩm ướt và hiếu khí cung cấp
điều kiện sinh lý cơ bản cho phát triển của nấm mốc chịu nhiệt. Trong hơn 40 năm
qua, nhiều loài nấm chịu nhiệt đã được phát hiện và nghiên cứu [29].
Cellulase bền nhiệt và hoạt động ở pH thấp là nhóm enzyme có tiềm năng ứng
dụng không chỉ trong chăn nuôi mà còn rất nhiều lĩnh vực trong cuộc sống.
Cellulase được bổ sung vào trong thức ăn chăn nuôi hay sử dụng chúng vào các
ngành công nghiệp khác đòi hỏi điều kiện đặc biệt về nhiệt độ cao, hay môi trường
axit. Đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu và công bố về việc tìm ra
cellulase bền nhiệt, bền pH. Tiêu biểu là các công trình nghiên cứu sau:
Năm 1996, ở hai phòng thí nghiệm thuộc Iceland và Thụy Điển, một enzyme
cellulase endo-β-1,4-glucanase được tinh sạch từ Rhodothermus marinus có hoạt
tính trên carboxylmethyl cellulose nhưng không có hoạt tính trên avicel. Khối lượng
phân tử của enzyme khoảng 49 kDa, pH tối ưu là 7.0. Đây là một siêu enzyme chịu
Đàm Quang Hiếu

14

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật


Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Viện CN Sinh học và CN Thực phẩm

nhiệt nhất được biết đến tại thời điểm công bố, enzyme giữ được 50 % hoạt tính khi
ủ ở 100 °C trong 3.5 giờ và 80 % hoạt tính khi ủ ở 90 °C trong 16 giờ. Siêu enzyme
này có khả năng ứng dụng rất lớn trong các ngành công nghiệp cần bổ sung enzyme
trong những công đoạn cần gia nhiệt cao [21].
Năm 2000 Bingze Xu và cộng sự đã tinh chế thành công một endo-β-1,4-Dglucanase. Endoglucanase được tinh sạch có kích thước 19.7 kDA, pI=7.0. Enzyme
có thể hoạt động trên vùng vô định hình của cellulose và CMC nhưng không thể
hiện hoạt tính trên cellulose tinh thể. Enzyme có thể chịu được nhiệt độ 100 °C
trong 10 phút mà không bị mất hoạt tính. Trình tự amino acid của enzyme này cho
phép các nhà nghiên cứu sắp xếp enzyme tinh sạch thuộc GH45 [8].
Năm 2005, các nhà nghiên cứu ở Pháp và ở Đức đã tách dòng và biểu hiện
thành công gene SSO 1949 mã hóa 334 amino acid chứa protein SSO 1949, là một
endo-β-glucanase thuộc họ GH12. Gen được tách dòng từ cổ khuẩn Sulfolobus
solfataricus, là vi sinh vật sống ở vùng suối nước nóng với nhiệt độ tối ưu 80 °C và
pH thích hợp cho sự phát triển là pH từ 2 đến 4. Enzyme tái tổ hợp được tinh sạch
và xác định các đặc tính sinh hóa cho thấy rằng đây là một enzyme rất ưa nhiệt và
ưa axit. Enzyme có nhiệt độ tối ưu khoảng 80 °C. Đây là enzyme chịu nhiệt có thời
gian bán hủy là 8 giờ và pH 1.8. Enzyme chịu nhiệt này phụ thuộc rất lớn vào pH: ở
pH trung tính tỷ lệ bất hoạt với nhiệt cao gấp 2 lần so với ở pH 1.8 [40].
Năm 2007, tại Ấn Độ các nhà nghiên cứu đã tìm ra một endoglucanase mới từ
Aspergillus aculeatus. Enzyme mới này có kích thước 45 kDa, pH tối ưu của
enzyme là 5.0, nhiệt độ tối ưu là 40 °C, pI=4.3. Enzyme có khả năng giữ được 50 %
hoạt tính khi gia nhiệt ở 90 °C trong 5 giờ [27].

Tại Nga năm 2010, các nhà khoa học đã tinh chế được 9 cellulase từ
Penicillium verruculosum. Các enzyme có pH tối ưu 3.5÷5.0. Hầu hết các enzyme
đều có thể chịu được nhiệt độ 50 °C trong ít nhất 3 giờ. Ở 60 °C, các enzyme tinh
sạch vẫn giữ được hoạt tính 31 %÷80 % hoạt tính sau 3 giờ. Ở 65 °C, enzyme
EGIIb vẫn giữ được 46 % hoạt tính sau 3 giờ [30].

Đàm Quang Hiếu

15

Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật