Thẩm định thử nghiệm nhận dạng vi rút sởi trong vắc xin sởi bằng phương pháp RT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

LÊ THỊ HẢI YẾN

THẨM ĐỊNH THỬ NGHIỆM NHẬN DẠNG VI RÚT SỞI
TRONG VẮC XIN SỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP RT-PCR
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM
2. PGS.TS NGUYỄN THỊ HỒNG LINH

HÀ NỘI, NĂM 2013


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn “Thẩm định thử nghiệm nhận dạng vi rút sởi
trong vắc xin sởi bằng phương pháp RT-PCR” là công trình nghiên cứu của cá nhân
tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Linh và PGS.TS.
Nguyễn Thị Xuân Sâm. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong
luận văn là trung thực và rõ ràng.
Học viên

Lê Thị Hải Yến

i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá tr nh nghi n
rất nhi u s gi p đ qu

u v ho n th nh uận v n n

áu

á th

t i đ nhận đư

giáo đ ng nghiệp

ng ạn

v gi

đ nh
Trư

h t t i in đư

t

ng nh tr ng v

i t ơn s u sắ t i

PGS.TS, Nguyễn Thị Hồng Linh, phó viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia

Vắc xin và Sinh phẩm Y t và PGS.TS, Nguyễn Thị Xuân Sâm giảng viên tại
trường Bách Khoa Hà Nội , những người cô kính m n đ tr
t nh tru n đạt i n th

u v ho n th nh uận v n

T i in h n th nh ảm ơn

qu

n Giám hiệu

h ng

o tạo S u đại h

giáo ộ m n Sinh h c phân tử - Trường đại h

tạo đi u iện thuận

n tận

inh nghiệm đ ng thời u n động vi n v tạo đi u kiện

ho t i trong quá tr nh nghi n
á th

ti p hư ng

i ho t i trong suốt quá tr nh h

á h ho H

tập

ho t i những

v
ội đ
i n

áu để ho n th nh uận v n n
ng thời t i

ng in đư

Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y t
khoa hóa lý, phòng Khoa h

gửi ời ảm ơn t i
á

nh hị m ho

iểm định vắc xin vi rút ,

v đ o tạo, phòng Quản lý chất ư ng c

định đ tạo đi u iện gi p đ t i trong quá tr nh
v nn

nh đạo Viện Kiểm định
iện iểm

m việ để t i ho n th nh uận

đ ng hạn
uối

ng nhưng h ng phải là ít nhất t i in

thương nhất t i gi đ nh những người đ
ả quá tr nh h

u n

nt i

nh những t nh ảm th n
ng hộ động vi n t i trong

tập v ho n th nh uận v n n

ột n nữ

in h n th nh ảm ơn tất ả những s gi p đ qu

Lê Thị Hải Yến

ii

áu đ


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính xác
(Association of official Analytical Chemists)

ASTM

Hiệp hội phép thử Mỹ
(Americal society for testing of material)

ARN

Acid ribonucleic

ATP

Acid adenosin triphosphat

bp

Base pair (cặp base nitơ)

CCID50

Cell culture infective dose 50%

dNTP

Deoxyribonucleotide

DNA

Acid Deoxyribo Nucleic

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtBr

Ethidium Bromide

ELISA

Thử nghiệm miễn dịch gắn men
(Enzyme-linked Immunosorbent assay)

EU

Dược điển châu âu

IU

Đơn vị quốc tế (Internationnal Unit

ISO

Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

KĐQG

Kiểm định quốc gia

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of dete)

GMP

Thực hành sản xuất tốt

(Europe volume)

(Good Manufacturing Practice)
HVHQ:

Hiển vi huỳnh quang

mRNA

Messeger RNA (ARN thông tin)

MC

Mẫu chuẩn

MCQT

Mẫu chuẩn quốc tế

NICVB

Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế
(National Institute for Control of Vaccine and Biologicals)

iii


NIBSC

Viện sinh phẩm chuẩn quốc gia anh
(National Institute for Biologycal Standards and Control)

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

RT-PCR

Reverse transcriptase PCR (kỹ thuậtPCR ngược)

TAE

Tris acetic acid- EDTA

TE

Tris EDTA

TRS

Hồ sơ kỹ thuật ((Technical Report Series)

TCYTTG

Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

USP

US. Pharmacopeia

SD

Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

SOP

Qui trình chuẩn ((Standard Operating Procedure)

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1: Các thông số cần xác định của thẩm định qui trình

7

Bảng 2: Bảng thống kê các giai đoạn sản xuất vắc xin tại Mỹ

12

Bảng 3:Bảng tiêu chuẩn xuất xưởng, đăng ký vắc xin sởi

19

Bảng 4: Các vắc xin ngừa bệnh sởi lưu hành tại Việt Nam

23

Bảng 5: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR vi rút sởi

31

Bảng 6: Thành phần phản ứng RT-PCT (Invitrogen)

40

Bảng 7: Thành phần phản ứng RT-PCT (Qiagen)

40

Bảng 8 : Qui trình nhiệt phản ứng RT-PCR nhận dạng vi rút sởi

41

Bảng 9: Kết quả nghiên cứu độ mạnh

44

Bảng 10: Kết quả nghiên cứu giới hạn phát hiện

45

Bảng 11: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu

47

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

Trang

Hình 1.1: Hình minh họa độ đúng và độ chính xác

8

Hình 1.2 :Hình ảnh vi rút sởi

10

Hình 1.3: Hình ảnh người mắc bệnh sởi

11

Hình 1.4: Hình ảnh phiến dùng kiểm tra vi rút sởi bằng phương pháp
trung hòa vi lượng
Hình 1.5: Hình ảnh tế bào Vero dùng trong nhận dạng vi rút sởi bằng
phương pháp trung hòa vi lượng

25

25

Hình1.6: Hình ảnh vi rút sởi làm hủy hoại tế bào Vero

26

Hình1.7: Hình ảnh minh hoạ phát hiện vi rút bằng kính huỳnh quang

29

Hình 1.8: Hình minh họa xác định kháng nguyên bằng phương pháp Elisa

30

Hình 1.9 Hình minh họa xác định kháng nguyên bằng phươn pháp DNA
probe

30

Hình 1.10 Hình minh họa phản ứng PCR

31

Hình 2.1 Hình ảnh thực hiện phản ứng RT-PCR

41

Hình 3.1 Hình đánh giá độ mạnh của thử nghiệm

43

Hình 3.2 Hình đánh giá giới hạn phát hiện của thử nghiệm

45

Hình 3.3 Hình đánh giá độ đặc hiệu của thử nghiệm

46

Hình 4.1 Hình ảnh mồi xuôi trên ngân hàng gen

48

Hình 4.2 Hình ảnh mồi ngược trên ngân hàng gen

49

vi


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1 Một số khái niệm về thẩm định phƣơng pháp ..................................................... 3
1.1.1Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình ............................................. 3
1.1.2Yêu cầu chung ................................................................................................. 4
1.1.3Các chỉ tiêu trong thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định ....................... 4
1.1.3.1 Độ đúng (Accuracy) .............................................................................. 5
1.1.3.2 Độ chính xác (Precision) ....................................................................... 5
1.1.3.3 Độ tuyến tính (Linearity): ..................................................................... 6
1.1.3.4 Vùng tuyến tính (Range): ...................................................................... 6
1.1.3.5 Độ đặc hiệu (Specificity): ..................................................................... 6
1.1.3.6 Độ mạnh (Ruggedness): ........................................................................ 7
1.1.3.7 Giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection): ................................... 7

1.1.3.8 Giới hạn định lượng (LOQ - Limit of Quantitation): ............................ 7
1.2.Vi rút sởi và vắc xin sởi .......................................................................................... 9
1.2.1 Vi rút sởi, bệnh sởi ......................................................................................... 9
1.2.1.1 Lịch sử phát hiện vi rút sởi .................................................................... 9
1.2.1.2 Hình thái và đặc tính sinh học ............................................................... 9
1.2.2 Vắc xin Sởi ................................................................................................... 12
1.2.2.1 Lịch sử vắc xin Sởi .............................................................................. 12
1.2.2.2 Các giai đoạn phát triển của vắc xin sởi ............................................. 12
1.2.2.3.Qui trình sản xuất vắc xin sởi. ............................................................. 13

vii


1.3 Kiểm định chất lƣợng vắc xin sởi ....................................................................... 18
1.3.1 Yêu cầu chung .............................................................................................. 18
1.3.2 Tiêu chuẩn đăng ký và xuất xưởng của vắc xin sởi sống giảm độc
lực .......................................................................................................................... 19
1.3.3Các vắc xin phòng ngừa bệnh sởi lưu hành ở Việt Nam............................... 23
1.3.4 Các phương pháp kiểm tra thử nghiệm nhận dạng vi rút sởi trong
vắc xin sởi [12] [38]. ............................................................................................. 24
2.3.4 Các Phương pháp miễn dịch học .................................................................. 24
2.3.4.1 Phương pháp trung hòa vi lượng ......................................................... 24
2.3.4.2 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang ................................................. 27
1.3.4.3 Phương pháp Elisa .............................................................................. 29
1.3.4.4 Phương pháp sinh học phân tử (RT-PCR.......................................... ) 30
Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 32
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 32
2.2 Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 32
2.2.1 Mẫu chuẩn .................................................................................................... 32
2.2.2 Mẫu thử nghiệm ........................................................................................... 32

2.2.3 Hóa chất:........................................................................................................ 33
2.2.4 Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................... 33
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 34
2.3.1 Thiết kế thử nghiệm và cách xác định độ mạnh, độ đặc hiệu và giới
hạn phát hiện ......................................................................................................... 34
2.3.1.1 Xác định độ mạnh ............................................................................... 34
2.3.1.2 Xác định giới hạn phát hiện ................................................................ 36
2.3.1.3 Xác định độ đặc hiệu ........................................................................... 37
2.3.2 Các bước tiến hành cho một lần thử nghiệm ................................................ 38
2.3.2.3 Điện di đánh giá kết quả...................................................................... 41
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 43
3.1 Độ mạnh ................................................................................................................ 43

viii


3.2 Giới hạn phát hiện ................................................................................................ 45
3.3 Độ đặc hiệu ............................................................................................................ 46
Chƣơng 4: BÀN LUẬN .............................................................................................. 48
4.1 Đánh giá mồi sử dụng .......................................................................................... 48
4.2 Độ mạnh ................................................................................................................. 51
4.3 Giới hạn phát hiện ................................................................................................. 52
4.4 Độ đặc hiệu của quy trình ................................................................................... 52
KẾT LUẬN ................................................................................................................. 53
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 55
PHỤ LỤC

ix

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong sinh vật, đấu tranh tồn tại là một trong những qui luật tự nhiên. Tất cả
các loài đều có ít nhiều khả năng tự bảo vệ chống lại sự xâm nhập của bất kỳ vật lạ
nào, dù có hại hay không để bảo toàn tính toàn vẹn của cơ thể chúng. Dựa trên
nguyên tắc đó khoa học về vắc xin đã ra đời. Vắc xin đầu tiên ra đời từ thế kỷ 18.
Sang thế kỷ 20, 21 công nghệ sản xuất vắc xin càng có những bước tiến bộ vượt bậc
đạt nhiều thành tích đáng kể. Song song với việc ra đời của vắc xin thì việc kiểm
soát chất lượng ở các cấp cũng yêu cầu rất chặc chẽ. Phương pháp “kiểm tra chất
lượng” là chất lượng của sản phẩm sinh học được xác định theo các phương pháp
hóa học, lý học hay sinh học. Ở nước ta cũng như trên thế giới, các loại chế phẩm
sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi rút v.v... đã được sử dụng rộng rãi cho người
nhằm mục đích phòng (vắc xin) và/hoặc chống (huyết thanh miễn dịch) nhiều bệnh
nhiễm vi sinh vật. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo tất cả các loạt sinh
phẩm trước khi cấp phép xuất xưởng phải được kiểm định nghiêm ngặt về các tính
chất an toàn, công hiệu, vô trùng, chất gây sốt, nhận dạng, gentamincin, BSA tồn
dư, AND tồn dư và các đặc tính về hoá lý...
Vắc xin Sởi ra đời từ năm 1957. Ở nước ta từ năm 1982 vắc xin sởi là một
trong 6 vắc xin đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng. Tuy vậy đến năm 2010
dịch sởi lại bùng phát tại Việt Nam. Vắc xin sởi có 2 dạng, một là dạng đơn vắc xin
sởi của 2 nhà sản xuất là Sanofi (Pháp) và Polyvac (Việt Nam) hoặc dạng phối hợp
sởi-quai bị- rubella có các nhà sản xuất MMR-II (nhà sản xuất MSD), MMR (Ấn
độ), R.O.R (Sanofi), Trivivac (Sec), Priorix (GSK)… Mỗi năm có khoảng 4-10 loạt
vắc xin sởi đơn giá và 3 loạt sởi (đa giá) cần được đánh giá chất lượng trước khi
đưa vào sử dụng. Một trong những thử nghiệm quan trọng thực hiện để kiểm soát
chất lượng vắc xin sởi là việc nhận dạng vi rút sởi. Để thực hiện tốt việc xác định vi
rút sởi cần có một qui trình đánh giá có độ tin cậy cao.
Hiện nay, trong khu vực và trên thế giới đang sử dụng phổ biến nhiều qui
trình nhận dạng vi rút sởi .Tại Viện Kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế
1

(NICVB) đang sử dụng qui trình nhận dạng vi rút Sởi bằng phương pháp RT-PCR.
Qui trình này được dược điểm Châu Âu khuyến cáo. Để góp phần tạo độ tin cậy
trong quá trình kiểm định vắc xin sởi chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Thẩm
định qui trình nhận dạng vi rút sởi trong vắc xin sởi bằng phương pháp RTPCR" với 3 mục sau:
1- Xác định độ mạnh của qui trình.
2- Xác định độ đặc hiệu của qui trình.
3- Xác định giới hạn phát hiện

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1 Một số khái niệm về thẩm định phƣơng pháp
Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra cung cấp bằng
chứng khách quan chứng minh phương pháp đó đáp ứng các yêu cầu đặt ra. Kết quả
của thẩm định phương pháp dùng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả
phân tích [13].
Theo ISO/IEC 17025: Thẩm định qui trình kỹ thuật là việc khẳng định bằng
kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan rằng các thông số cần xác định cho
việc sử dụng một qui trình cụ thể đã được thực hiện [2].
Theo WHO: Thẩm định qui trình kỹ thuật là quá trình thiết lập một hoặc nhiều
hơn các đặc tính: Độ đúng, độ chính xác, độ tuyến tính, vùng tuyến tính, độ đặc hiệu,
giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ mạnh ... phù hợp với từng qui trình 39], [40].
Theo USP: Thẩm định là quá trình phân tích qua đó xác định bằng các
phương pháp phòng thí nghiệm [33].
Phòng thử nghiệm có có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào nguồn gốc
có thể phân loại thành hai nhóm khác nhau.
- Các phương pháp tiêu chuẩn: Các phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia,

quốc tế, hiệp hội, khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO,
ASTM, AOAC.......
- Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ là phương pháp
do phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sản xuất
thiết bị, phương pháp theo tạp chí, tài liệu chuyên nghành [13]
1.1.1 Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình
Khái niệm về qui trình: Qui trình là các thao tác được mô tả chi tiết để thực
hiện một phép đo cụ thể theo một phương pháp đã chọn [3].
Thực hiện theo qui trình nhằm thực hiện một việc gì đó theo một trình tự
nhất quán. Để xây dựng qui trình, người ta cần liệt kê các bước thực hiện chi tiết,

3


theo trình tự nhất định, đặc biệt là các yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả cần được
qui định rõ ràng.
Việc thẩm định một qui trình kỹ thuật là nhằm chứng minh qui trình đó có
phù hợp với mục đích sử dụng không 25. Thẩm định qui trình thử nghiệm phải
được tiến hành khi 31 39 : Áp dụng một qui trình mới (thẩm định toàn phần), áp dụng
các qui trình có trong Dược điển hoặc chuyển giao kỹ thuật (thẩm định một phần) hoặc
nếu có thay đổi lớn về qui trình thử nghiệm (thay đổi dụng cụ, trang thiết bị, công thức
hoặc qui trình thực hiện) thì tiến hành tái thẩm định một phần 17 40.
Thẩm định qui trình kỹ thuật là một qui định bắt buộc, được tiến hành định
kỳ nhằm đảm bảo chất lượng của các kết quả thử nghiệm, vì kết quả thử nghiệm có
thể bị biến đổi bởi những yếu tố: Nhiệt độ, độ ẩm, điện áp, con người, thiết bị và
các phòng thí nghiệm khác nhau [40]
1.1.2 Yêu cầu chung
Điều quan trọng nhất trong quá trình thẩm định là: các qui trình đó được diễn
ra trong các điều kiện thực. Tức là mọi hoạt động diễn ra tương tự như các hoạt
động thường xuyên mà qui trình đó được thực hiện trong quá trình làm việc. Ví dụ:

Số người /nhân viên tham gia, các qui trình đi vào, đi ra; giám sát môi trường, thao
tác thực hiện giống như công việc thực hàng ngày khi áp dụng qui trình cần thẩm
định 40.
Tất cả các số liệu liên quan thu được trong quá trình thẩm định và các công
thức được sử dụng để tính toán các đại lượng đặc trưng của việc thẩm định cần
được đưa ra và thảo luận. Các chất đối chiếu được sử dụng trong quá trình thẩm
định cần phải được đánh giá rõ ràng và kèm theo tài liệu về độ tinh khiết. Mức độ
tinh khiết phụ thuộc vào mục đích sử dụng 25.
1.1.3 Các chỉ tiêu trong thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định
Thẩm định qui trình thử nghiệm là một quá trình xác định một hay nhiều chỉ số
phù hợp đối với thử nghiệm về 13 24 25 27 31.
- Độ đúng.
- Độ chính xác.
4


- Độ tuyến tính và vùng tuyến tính.
- Độ đặc hiệu.
- Độ mạnh.
- Giới hạn phát hiện.
- Giới hạn định lượng.
1 1 3 1 ộ đ ng (A ur

)

Độ đúng của một qui trình biểu diễn mức độ gần gũi giữa giá trị tìm thấy sau
thử nghiệm với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu đã biết 25 27 39 40.
Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm (%) của chất chuẩn (thu được sau thử
nghiệm) hoặc độ chệch (bias) giữa các chất thu được với giá trị thực hoặc sự khác biệt
giữa giá trị trung bình thu được và giá trị thực được chấp nhận cùng với khoảng tin cậy

cho phép. Giá trị % càng lớn thì độ đúng qui trình càng cao. Ngược lại, độ chệch càng bé
thì độ đúng của qui trình càng cao.
Độ đúng được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 9 lần thử nghiệm trong
khoảng nồng độ đã được xác định của qui trình (ví dụ: 3 nồng độ đã được xác định
giá trị, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần thử nghiệm ở nồng độ
thử 100% 27 40.
Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm thu được sau thử nghiệm của lượng
chất cần tìm đã được thêm vào mẫu hoặc sự khác biệt giữa giá trị trung bình đo được
và giá trị thực với cùng khoảng tin cậy 25 39 40.
1 1 3 2 ộ h nh á ( r ision)
Là giá trị gần nhất giữa nhiều lần đo thu được trong nhiều lần lấy mẫu, nó có
thể biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD), hoặc hệ số biến thiên (CV), độ chính xác
có thể được coi là 25 39 40.
- Độ lặp lại (Repeatability): Độ lặp lại diễn tả độ "chụm" của một qui trình,
trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại còn được
gọi là độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng.

5


- Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): Độ chính xác trung gian diễn tả
mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày
khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau.
- Tính tái lặp (Reproducibility): Tính tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các
phòng thí nghiệm (Các nghiên cứu phối hợp giữa các phòng thí nghiệm thường
được áp dụng để tiêu chuẩn hoá phương pháp).
Độ chính xác được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 9 lần thử nghiệm
trong khoảng nồng độ đã được xác định của qui trình (ví dụ: 3 nồng độ đã được xác
định, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần thử nghiệm ở nồng độ
thử 100% 27 40.

Độ chính xác của mỗi một qui trình cần phải đưa ra các dữ liệu sau: Độ lệch
chuẩn (standard deviation), độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)
hay hệ số biến thiên (coefficient of variation) và khoảng tin cậy 27 40.
1 1 3 3 ộ tu n t nh ( in rit ):
Là khả năng của một thử nghiệm thu được các kết quả thí nghiệm dựa vào
đường thẳng biểu diễn sự tương quan giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được và
nồng độ chất cần tìm trong mẫu 17 25 31 39 40.
Độ tuyến tính được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 5 nồng độ mẫu đã
được xác định giá trị, mỗi nồng độ được tiến hành tối thiểu 3 lần 17 24 27 [40.
1134

ng tu n t nh (R ng ):
Là vùng của phương pháp thể hiện bởi khoảng giữa mức độ/nồng độ thấp và

cao của các chất cần phân tích được xác định với mức độ chấp nhận về độ đúng, độ
chính xác vẫn còn tuyến tính 17 24 27 39 40.
1.1 3 5 ộ đặ hiệu (Sp ifi it ):
Là khả năng xác định được chất cần tìm có trong mẫu thử khi có mặt các
thành phần khác: tá dược, tạp chất... 24 27 39 40.

6


1 1 3 6 ộ mạnh (Rugg n ss):
Là mức độ tái lặp các kết quả thu được bằng cách phân tích các mẫu giống
nhau với nhiều thay đổi nhỏ so với điều kiện chuẩn (phòng thí nghiệm khác nhau,
kỹ thuật viên khác nhau, dụng cụ, trang thiết bị khác nhau, thuốc thử khác lô, khác
nhau về nhiệt độ, thời gian thử...) 26 27 31 40].
1 1 3 7 Gi i hạn phát hiện ( OD - Limit of Detection):
Là lượng nhỏ nhất chất cần tìm có thể xác định được nhưng không định

lượng được giá trị chính xác của nó 26 27 31 40].
1 1 3 8 Gi i hạn định ư ng ( OQ - Limit of Quantitation):
Là lượng nhỏ nhất chất cần tìm mà một qui trình kỹ thuật có thể định lượng
được với điều kiện thỏa mãn độ đúng, độ chính xác thích hợp. Xác định LOQ bằng
cách pha loãng đến nồng độ tối thiểu có thể phát hiện được chất thử với độ đúng và
độ chính xác theo yêu cầu 26 27 31 40].
Tùy thuộc vào từng loại qui trình như: Nhận dạng, định lượng, xác định giới
hạn, xác định công hiệu và xác định thành phần mà chúng ta có thể sử dụng các
thông số phù hợp như sau 26 27 31 40].
Bảng 1: Các thông số cần xác định trong thẩm định qui trình
Thử nghiệm
Thông số
Độ đúng
Độ chính xác
Độ mạnh
Đường/vùng tuyến tính
Độ đặc hiệu
LOD
LOQ

Nhận
dạng
+
+
+
-

Xác định độ tinh khiết
Định
Xác định

lượng
các giới hạn
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

(-): Các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá
(+): Các chỉ tiêu này cần phải đánh giá.

7

Xác định
công hiệu
+
+
+
+
+
-

Xác định
thành
phần

+
+
+
+
+
-


Độ chính xác
XXXÁCxác

Th
ấp

Ca
o

Th
ấp

B

Độ đúng
đúngđuđúng
Ca
o

A

D

C

Giá trị đ

i t trư c c a m u thử nghiệm

Giá trị c a các l n thử nghiệm
Giá trị trung bình c a các l n thử nghiệm
Hình 1.1 Minh họa độ đúng và độ chính xác của qui trình
Hình A giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm cao nhưng giá trị trung
bình của các lần thử nghiệm cách xa giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm
có độ chính xác cao, nhưng độ đúng thấp 2.
Hình B giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm thấp và giá trị trung bình
của các lần thử nghiệm cách xa giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm có độ
chính xác và độ đúng đều thấp 2.
Hình C giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm cao và giá trị trung bình
của các lần thử nghiệm gần với giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm có độ
chính xác và độ đúng đều cao 2.
8


Hình D giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm thấp nhưng giá trị trung
bình của các lần thử nghiệm gần với giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm
có độ chính xác thấp, nhưng độ đúng cao 2.
1.2.Vi rút sởi và vắc xin sởi
1.2.1 Vi rút sởi, bệnh sởi
1 2 1 1 ị h sử phát hiện vi r t sởi
Vi rút sởi được xuất hiện từ thế kỷ 7. Trên thực tế nó được nhà triết học, bác
sĩ Rhazes người Ba Tư mô tả ở thế kỷ thứ 10 như sau: “sợ hãi hơn so với bệnh đậu

mùa”. Trước những năm 1963 hầu như tất cả mọi người đều bị bệnh . Mỗi năm Hoa
Kỳ có 2-4.000.000 trường hợp mắc bệnh sởi và có khoảng 450 ca tử vong. Vào giữa
thế kỷ 18 dịch sởi bùng nổ ở thành phố Scôtlen với nhiều biến chứng nghiêm trọng.
Francis Home bác sĩ điều trị người Scôtlen đã cố gắng thử gây miễn dịch cho các cá
nhân bằng cách rạch nông da những người đã phát bệnh sởi trong thời gian ngắn.
Quy trình này thử nghiệm với 12 trẻ em, 10 trong số đó phát hiện thấy bệnh
sởi với thời gian ủ bệnh 8-10 ngày. Sự cố gắng đó đã đưa đến thành công, tiếp theo
ông có vài sự hoài nghi cho đến năm 1906 ông đã giải thích rõ ràng sởi lây nhiễm
bằng đường máu qua việc thử trên những người tình nguyện [22] [45].
Đến năm 1954, Enders và Peebles lần đầu tiên phân lập được vi rút sởi . Trên
cơ sở đó, 1 vắc xin sởi bất hoạt (vắc xin sởi chết) đã ra đời. Tuy nhiên do tính hiệu
quả thấp của nó mà đến năm 1963, một vắc xin sởi sống giảm độc lực đã được cấp
phép lưu hành tại Mỹ, thay thế cho vắc xin sởi bất hoạt. Hiện nay thế giới chỉ dùng
vắc xin sởi sống giảm độc vong, thậm chí đã thanh toán được sởi ở một số nước
Châu Mỹ [21] [28].
1 2 1 2 H nh thái v đặ t nh sinh h
Vi rút sởi, thuộc họ Paramyxonviridae, hình cầu đường kính 120-250 nm.
Lõi chứa ARN ( acid ribunucleic). Vi rút sởi có tính đề kháng yếu: Bị tiêu diệt ở
nhiệt độ 560C/30 phút; cồn, formalin, tia cực tím đều có thể diệt nhanh vi rút. pH

9


thích hợp với vi rút 5-10, tốt nhất: pH=7,0. Sức đề kháng của vi rút cao hơn nếu bảo
quản ở dạng đông khô, có them gelatin và đường (glucose) [1] [9].
Vi rút sởi chỉ có 1 type kháng huyết thanh duy nhất. Phần vỏ có kháng nguyên
ngưng kết hồng cầu, kết hợp bổ thể, trung hòa và đặc biệt có kháng nguyên tan
huyết [19].

Hình 1.2

Hình ảnh vi rút sởi

1.2.1.3 Bệnh sởi và dịch tễ h c bệnh sởi
Sởi là một loại bệnh do vi rút sởi gây ra qua đường hô hấp, nó thường mọc ở
mặt sau của cổ họng và phổi [46].
Vi rút sởi lây từ người sang người qua hô hấp. Mầm bệnh được thải ra khỏi
người bệnh (nguồn truyền nhiễm) thông qua nói, ho, hắt hơi, mớm cơm, hôn….Sau
khi khỏi nguồn truyền nhiễm, mầm bệnh tồn tại tạm thời trong môi trường không
khí, bề mặt dụng cụ, mặc đất.Vi rút có thể tồn tại tạm thời trong môi trường không
khí ít nhất 34 giờ (nhưng dễ diệt vong trong môi trường khô, nóng). Từ môi trường
không khí, bề mặt dụng cụ, vi rút xâm nhập vào cơ thể cảm nhiễm qua đường mũi

10


họng, cư trú và nhân lên ở các tế bào niêm mạc biểu mô đường hô hấp rồi xâm nhập
vào máu và gây bệnh cho cơ thể [10], [11].
Nguồn truyền nhiễm bệnh sởi là bệnh nhân chủ yếu là trẻ em nhỏ hoặc thanh
thiếu niên. Thường phát hiện bệnh sởi vào giai đoạn trước mọc ban và sau khi lặn 23 ngày. Phát hiện bệnh sởi trong nhầy họng và huyết thanh của bệnh nhân thời kỳ ủ
bệnh cho đến lúc mọc ban khoảng 2-3 ngày. Có thể thể tìm thấy trong nước tiểu
bệnh nhân [19].
Phòng bệnh:
Biện pháp phòng bệnh hữu hiệu nhất vừa kinh tế, vừa mang lại hiệu quả lâu
dài là tiêm vắc xin sởi.Trẻ cần được tiêm một mũi vắc xin sởi đầu tiên vào tháng
thứ 9 (chậm nhất là không quá tháng thứ 12).Sau đó có thể nhắc lại mũi thứ 2 ở độ
tuổi đi học.Với những trẻ mắc bệnh sởi cần được cách ly (tại nhà) trong suốt quá
trình bị bệnh cho đến khi ban bay hết ít nhất 4 ngày.Chú ý phòng bệnh cho trẻ suy
dinh dưỡng hoặc suy giảm miễn dịch [10] [11].

Hình 1.3

Hình ảnh người bị mắc bệnh sởi

11


1.2.2 Vắc xin Sởi
1.2.2.1 Lịch sử vắc xin Sởi
Vắc xin sởi đầu tiên ra đời là vắc xin sởi chết, tuy nhiên hiệu quả miễn dịch
của nó tương đối thấp. Giai đoạn sau là giai đoạn phát triển vắc xin sống, giảm độc
lực, vắc xin sống cho hiệu quả ngừa bệnh cao. Đến hiện nay vắc xin sống giảm độc
lực vẫn được sản xuất và sử dụng thông dụng trên toàn thế giới.
Các chủng được sản xuất vắc xin phổ biến là : Schwarz, CAM-70, AIK-C,
TD-97….
Hiện nay vắc xin Sởi có 2 loại vắc xin Sởi đơn và vắc xin Sởi phối hợp : Sởiquai bị-Rubella. Vắc xin phối hợp ra đời năm 1971 [32] [8] [7]
1.2.2 2 Cá gi i đoạn phát triển c a vắc xin sởi
+ Lịch sử vắc xin sởi tại Mỹ từ năm 1963 đến năm 2001.
Bảng 2
Dạng vắc
xin
Vắc xin bất
hoạt

Bảng thống kê các giai đoạn sản xuất vắc xin tại Mỹ
Chủng sản
Nhà sản
xuất
xuất
Edomonston B + Lilly

+ Pfizer

Vắc xin
sống giảm
độc lực

Edomonston B +Lederle
+Lilly
+Mecrk
+Parke
Davis
+Pfizer
+Philips
Roxane
Sống, giảm +Schwarz
+Pitman
độc
lực +Moraten
Moore-Dow
tương lai
+Merck

Tên sản phẩm

Năm sử
dụng
1963-1967

+Generic
+Pfizer Vax,

Measles-K
+M-vac
1963-1975
+Generic
+Rubeovax
+Generic
+Pfizer Vax,
Measles-L
+Generic
+Lirugen

Tổng số
liều
1,8 triệu
liều
18,9 triệu
liều

+1965-1976 Hơn 255
+1968-2001 triệu liều

+Attenuvax

Mặc dù có những thành tựu to lớn đối với bệnh sởi giảm tỷ lệ tử vong toàn
cầu và mục tiêu loại trừ bệnh sởi, trên toàn cầu, trong năm 2010, đã có 327.305
trường hợp mắc bệnh sởi và khoảng 139.300 bệnh sởi trường hợp tử vong (tức là
khoảng 380 trường hợp tử vong / ngày. Trong thời gian 2009-2010, bệnh sởi bùng
12

phát đã được báo cáo ở châu Âu, châu Phi và châu Á. Trong năm 2010-2011, Tây
Âu đã gia tăng người mắc bệnh sởi.Trong đó có ít nhất 33 quốc gia báo cáo hơn
68.743 trường hợp bị sởi. Ở những nước có bệnh sởi đã được loại bỏ, nhưng vẫn có
nguy cơ gây nhiễm bởi nguồn bệnh từ các quốc gia khác [20] [32].
+ Các giai đoạn phát triển vắc xin tại Nhật
Hiện nay có 4 loại vắc xin sởi sống, giảm độc lực được sử dụng tại Nhật. Sự
phát triển này đảm bảo bởi ủy ban hiệp hội vắc xin sởi vào năm 1968. Chiến dịch
tiêm chủng bắt đầu vào năm 1970. Sự tiêm chủng định kỳ từ năm 1978 và kéo dài
cho tới ngày nay. Có 4 chủng vi rút sởi được sử dụng là AIK-C, Chwarz FF8, CAM
70, TD97 [23].
+ Vắc xin Sởi tại Việt Nam
Từ năm 1985, vắc xin sởi được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng
làm thay đổi tình hình bệnh sởi tại Việt Nam. Tuy nhiên toàn bộ số vắc xin này đã
phải nhập khẩu và thực hiện mục tiêu thanh toán bệnh sởi vào năm 2010.
Năm 2008 nhà máy sản xuất vắc xin sởi Polyvac đã đi vào hoạt động và hằng
năm cung cấp số lượng vắc xin sởi phục vụ chương trình tiêm chủng quốc gia. Năm
2010 dịch sởi lại bùng phát tại Việt Nam trong lứa tuổi từ 18-40. Vì thế việc khuyến
cáo tiêm vắc xin Sởi cho người lớn cũng được lưu ý [7].
1.2.2.3.Qui trình sản xuất vắc xin sởi.
Quá trình M1: Ấp tr ng gà SPF và lấy phôi (1)
Quá trình nhận trứng gà SPF từ nhà cung cấp
1. Kiểm tra trứng gà trong hộp đóng gói 2)
2. Soi trứng (3)
3. Bảo quản trứng ở 12~160C trong 4 ngày
4. Ủ trứng gà ở 36,8±10C, độ ẩm 50-70% trong 9 ngày.
5. Soi trứng gà sau 9 ngày ấp 4)
6. Khử trùng vỏ trứng đã có phôi
7. Cắt vỏ trứng và lấy phôi
8. Cắt loại bỏ đầu của phôi

13


Quá trình và kiểm định chất ư ng
1)

Giám sát m i trường sau khi vận hành:
m hạt đ m vi sinh vật trong không khí, vi sinh vật b mặt và trên nhân

viên th c hiện.
(2)

Kiểm tr

i u kiện đ ng g i số tr ng, ngày và thời gi n đ n, ch ng chỉ

c a tr ng gà c a nhà cung cấp.
(3)

Kiểm tra: Kiểm tra tr ng: Số tr ng v phải ≤3%

(4)

Soi tr ng: Số tr ng không có phôi và tr ng bị ch t phải 15%

Quá trình M2: Nuôi cấy mẻ đơn (1)
1. Rửa trứng gà 5 lần bằng dung dịch Hanks không có Ca &Mg.
2. Nghiền phôi gà
3. Đặt phôi gà đã nghiền vào lọ trypsin hóa.
4. Tách tế bào phôi gà đã tách bằng dung dịch trypsin 0,25w/v% ủ 370C trong

số lần.
5. Hộn tế bào phôi gà đã tách bằng môi trường phát triển (M199 bổ sung 3%
serum bê mới sinh NBCS)
6. Ly tâm hỗn dịch tế bào đã tách trong 5 phút ở 10oC, 190g.
7. Thu hồi cặn tế bào và đánh tan trong môi trường phát triển.
8. Đếm tế bào
9. Pha hỗn dịch tế bào ở nồng độ 17~23x 104 tế bào/ml bằng môi trường phát
triển.
10. Chia 150 ml hỗn dịch tế bào vào các chai roux nuôi cấy.
11. Nuôi cấy tế bào phôi gà ở 37 ± 1oC trong 2 ngày.
12. Nuôi cấy các tế bào chứng không nhiễm với thể tích tương ứng với 25%
hoặc 500ml của mẻ nuôi cấy đơn.
13. Quan sát tế bào trứng trong suốt quá trình nuôi cấy ở cùng một điều kiện đã
sử dụng cho các chai tế bào gây nhiễm virus
14. Lấy mẫu môi trường nuôi cấy tế bào trứng ở cuối giai đoạn quan sát.

14


Quá trình và kiểm định chất ư ng
1)

Giám sát m i trường sau vận h nh

m hạt đ m vi sinh vật trong không

khí, vi sinh vật trên b mặt v tr n người th c hiện,
2)

Các thử nghiệm trên nuôi cấy t bào d

io ogi

th o “

inimum R quir m nts for

ro u ts” of J p n

Quá trình M3: Gây nhiễm ch ng virus 1)
1.Quan sát chai tế bào nuôi cấy bằng kính hiển vi để kiểm tra không có sự bất
thường hoặc hủy hoại tế bào trước khi gây nhiễm 2)
2. Kiểm tra điều kiện của tế bào nuôi 3)
3. Đếm tế bào trong 3 chai nuôi cấy.
4. Đông tan chủng virus <28oC
5. Pha loãng virus bằng môi trường duy trì 1 ( M-199 bổ sung 1% serum bê non)
6. Gây nhiễm 20ml chủng virus đã pha loãng vào mỗi chai nuôi cấy sau khi đã loại
bỏ môi trường nuôi;
7. Hấp phụ virus trong 2 giờ ở 32 ± 1oC, cứ 30 phút láng nhẹ một lần.
8. Bổ sung 130ml môi trường duy trì -1 vào các chai nuôi cấy sau khi hấp phụ.
9.Ủ các chai ở 32 ± 1oC trong 3 ngày.
Quá trình và kiểm định chất ư ng
1) Giám sát m i trường sau vận hành:
m hạt đ m vi sinh vật trong không khí, vi sinh vật trên b mặt và trên
người th c hiện,
2) Không có s th

đổi cytopathic và không nhiễm khuẩn.

3) T bào kín một l p đạt ≥75%

Quá trình M4: Thay môi trƣờng duy trì -1 1)
1. Quan sát chai nuôi cấy sau 3 ngày ủ 2)
2. Thay 150ml môi trường duy trì sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ
3. Ủ ở 32 ± 1oC trong 3 ngày.
Quá trình và kiểm định chất ư ng
1)

Giám sát môi trường sau vận hành:

15