Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp và tam thất hoang trên in vitro
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.4 MB, 58 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC
NGUYỄN THỊ TUYẾT TRINH
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG ĐÔNG MÁU
CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
TRÊN IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC
Hà Nội - 2017
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC
Ngƣời thực hiện: NGUYỄN THỊ TUYẾT TRINH
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG ĐÔNG MÁU
CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
TRÊN IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC
Khóa: QH.2012.Y
Ngƣời hƣớng dẫn:
1. PGS.TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng
2. TS. Vũ Thị Thơm
Hà Nội - 2017
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa YDƣợc, Đại học Quốc Gia Hà Nội, bộ môn Dƣợc lý - Dƣợc lâm sàng, Bộ môn
Y - Dƣợc học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em
hoàn thành chƣơng trình học tập trong suốt 5 năm qua.
Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Dƣơng
Thị Ly Hƣơng, TS. Vũ Thị Thơm, những ngƣời đã luôn tận tình hƣớng dẫn,
tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các
thầy cô bộ môn Dƣợc lý - Dƣợc lâm sàng, thầy cô bộ môn Y - Dƣợc học cơ
sở đã giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin cảm ơn chƣơng trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải
pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm
từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất
hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã
số KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện đƣợc nội dung
nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Khoa Xét nghiệm Huyết Học, Bệnh
viện 19.8 - Bộ Công An đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và ngƣời
thân đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhƣng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu
sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận thêm
hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 6 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Tuyết Trinh
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Giải nghĩa
APTT
Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa
(Activated Partial Thromboplastin Time)
DIC
Đông máu nội mạc rải rác
(Disseminated Intravascular Coagulation)
DMSO
Dimethyl sulfoxide
HP
Heparin
IC50
Liều ức chế 50% đối tƣợng thử
(Inhibitory Concentration 50%)
INR
Chỉ số bình thƣờng hóa quốc tế
(International Nomalized Ratio)
LD50
Liều gây chết 50% đối tƣợng thử
(Lethal Dose 50%)
PBBt
Cao chiết bằng dung môi n - butanol Sâm vũ diệp
PBEA
Cao chiết bằng dung môi ethyl acetat Sâm vũ diệp
PBEt
Cao chiết bằng dung môi ete Sâm vũ diệp
PBT
Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% Sâm vũ diệp
PSBt
Cao chiết bằng dung môi n - butanol Tam thất hoang
PSnH
Cao chiết bằng dung môi n - hexan Tam tất hoang
PST
Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% Tam thất hoang
PSW
Cao chiết bằng dung môi nƣớc Tam thất hoang
PT
Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time)
SVD
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
TTH
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M.Feng)
v/v
Thể tích/Thể tích
DANH MỤC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
Hình 1.1 Sơ đồ đông máu
3
Hình 1.2 Mạng lƣới fibrin giam giữ hồng cầu
6
Hình 1.3 Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian PT
13
Hình 1.4
Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian
APPT
15
Hình 1.5
Nguyên lý của quy trình xét nghiệm định lƣợng
fibrinogen
17
Hình 1.6 Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)
18
Hình 1.7 Hợp chất saponin khung oleanan từ rễ của cây SVD
19
Hình 1.8
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T Tsai et K.
M. Feng)
21
Hình 1.9 Thành phần hóa học của cây TTH
22
Hình 2.1 Sơ đồ chiết thu các phân đoạn SVD
25
Hình 2.2 Sơ đồ chiết thu các phân đoạn TTH
26
Hình 2.3 Ống đông máu chứa sodium citrat 3,8%
28
Hình 2.4 Pipet
28
Hình 2.5
Máy ACL TOP500 và nguyên lý đo quang của máy
ACL TOP500
29
Hình 3.1
Ảnh hƣởng của các phân đoạn dịch chiết SVD lên chỉ
số đông máu nội sinh APTT(s)
34
Hình 3.2
Ảnh hƣởng của các phân đoạn dịch chiết TTH lên chỉ
số đông máu nội sinh APTT(s)
37
DANH MỤC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
Bảng 3.1 Ảnh hƣởng của PBT trên thời gian đông máu in vitro
31
Bảng 3.2 Ảnh hƣởng của PBBt trên thời gian đông máu in vitro
32
Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của PBEA trên thời gian đông máu in vitro
33
Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của PBEt trên thời gian đông máu in vitro
33
Bảng 3.5 Ảnh hƣởng của PST trên thời gian đông máu in vitro
35
Bảng 3.6 Ảnh hƣởng của PSBt trên thời gian đông máu in vitro
35
Bảng 3.7 Ảnh hƣởng của PSnH trên thời gian đông máu in vitro
36
Bảng 3.8 Ảnh hƣởng của PSW trên thời gian đông máu in vitro
37
MỤC LỤC
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ........................................................................... 2
1.1. Sinh lý quá trình đông máu .................................................................. 2
1.1.1. Định nghĩa ...................................................................................... 2
1.1.2. Cơ chế đông máu............................................................................ 2
1.2. Điều hòa đông máu trong sinh lý ......................................................... 6
1.3. Rối loạn đông máu ................................................................................ 7
1.3.1. Rối loạn bẩm sinh ........................................................................... 7
1.3.2. Rối loạn mắc phải .......................................................................... 9
1.4. Các xét nghiệm đông máu cơ bản ...................................................... 13
1.4.1. Thời gian Prothrombin................................................................. 13
1.4.2. Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa ............................ 15
1.4.3. Định lượng fibrinogen .................................................................. 16
1.5. Tổng quan về Sâm vũ diệp và Tam thất hoang .................................... 18
1.5.1. Sâm vũ diệp……………………………………………………….18
1.5.2. Tam thất hoang ............................................................................... 20
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 24
2.1. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu ................................................. 24
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................ 25
2.3. Phƣơng pháp ......................................................................................... 27
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ...................... 31
3.1. Kết quả thực nghiệm ............................................................................. 31
3.1.1. Sâm vũ diệp ..................................................................................... 31
3.1.2. Tam thất hoang ............................................................................... 34
3.2. Bàn luận ................................................................................................ 38
CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................... 43
4.1. Kết luận ................................................................................................. 43
4.2. Đề xuất .................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc sử dụng các thuốc chống đông máu trong dự phòng và
điều trị các bệnh do nguyên nhân huyết khối đóng vai trò rất quan trọng. Các
thuốc chống đông máu nhƣ heparin, wafarin, ... đều cho thấy hiệu quả điều trị
tốt. Tuy nhiên mặt hạn chế của các thuốc này là có thể gây nhiều tác dụng phụ
nhƣ: giảm tiểu cầu, dị ứng… [16]. Y- dƣợc học thế giới và trong nƣớc đang
có xu hƣớng sử dụng các thuốc có nguồn gốc thực vật để nhằm hạn chế các
tác dụng không mong muốn này.
Việt Nam có hai loài sâm mọc tự nhiên ở vùng núi cao phía Tây Bắc là
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) thuộc họ Ngũ gia bì - Araliace theo
kinh nghiệm dân gian là có tác dụng giảm đau, hoạt huyết, bổ máu [13]. Tuy
nhiên cho đến nay các nghiên cứu về tác dụng sinh học này còn rất hạn chế.
Cả 2 loài đều là những cây thuốc đặc biệt quý hiếm và đang có nguy cơ tuyệt
chủng ở nƣớc ta. Các nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học của Sâm vũ
diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) cho thấy trong rễ và lá loài cây này có
chứa saponin khung dammaran và oleanan với hàm lƣợng cao [50,57]. Đặc
biệt, saponin trong một số cây thuộc chi Panax L. đã đƣợc chứng minh là có
tác dụng trên chức năng đông máu [40,44].
Để làm rõ cơ sở khoa học và giá trị sử dụng của loài SVD và TTH, góp
phần sử dụng hợp lý hóa tài nguyên thiên nhiên và áp dụng các giải pháp
khoa học công nghệ nhằm phát triển dƣợc liệu của vùng, đặc biệt là nghiên
cứu tác dụng trên quá trình đông máu, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác
dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp và Tam
thất hoang trên in vitro”. Mục tiêu của đề tài là:
-
Xây dựng mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu trên in vitro
-
Nghiên cứu tác dụng chống đông máu trên in vitro của các phân đoạn
dịch chiết SVD và TTH thông qua các chỉ số PT và APTT
1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1.
Sinh lý quá trình đông máu
Đông máu là trạng thái tự bảo vệ của cơ thể, là chuỗi các phản ứng hóa
học của các yếu tố đông máu có trong huyết tƣơng, các mô tổn thƣơng và tiểu
cầu [25,36,39]. Sau khi ra khỏi lòng mạch 2 - 4 phút, máu đông lại. Trong
máu và trong các mô có khoảng hơn 50 chất có ảnh hƣởng tới quá trình đông
máu. Các chất kích thích quá trình gây đông máu gọi là các chất gây đông
máu. Các chất ức chế quá trình gây đông máu gọi là các chất chống đông.
Máu có đông hay không là phụ thuộc vào sự cân bằng giữa các chất gây đông
máu và các chất chống đông máu. Bình thƣờng, các chất chống đông máu
chiếm ƣu thế, các chất gây đông ở dạng tiền chất không có hoạt tính, vì vậy
máu không đông trong quá trình lƣu thông trong mạch máu. Khi máu, mạch
máu bị tổn thƣơng, khi máu lấy ra ngoài cơ thể, các chất gây đông máu đƣợc
hoạt hóa và trở nên ƣu thế, đông máu đƣợc thực hiện [11,15,25,36].
1.1.1. Định nghĩa
Đông máu là quá trình chuyển máu ở thể lỏng sang thể đặc, mà thực
chất là chuyển fibrinogen ở dạng hòa tan trong huyết tƣơng thành fibrin ở
dạng không hòa tan dƣới xúc tác của thrombin [20,25].
1.1.2. Cơ chế đông máu
Lý thuyết dòng thác đông máu từ năm 1979 [15] là sự hoạt hoá theo
chuỗi từ các tiền yếu tố zymogen thành dạng enzym hoạt hoá.Quá trình đông
máu diễn ra qua 3 giai đoạn (Hình 1.1) [20,25,36]:
-
Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase.
-
Giai đoạn II: Hình thành thrombin.
-
Giai đoạn III: Hình thành fibrin.
1.1.2.1. Sự hình thành phức hợp prothrombinase
Khởi động cho cơ chế đông máu là sự hình thành phức hợp
prothrombinase. Đây là một cơ chế rất phức tạp và kéo dài nhất của quá trình
đông máu. Quá trình đƣợc xảy ra khi có chấn thƣơng thành mạch và mô, khi
2
có chấn thƣơng máu, khi có sự tiếp xúc của máu với tế bào nội mạc tổn
thƣơng hoặc với sợi collagen của mạch máu, với các mô khác ngoài nội mạc
hoặc với bất kỳ vật lạ nào [39,47,51]. Phức hợp prothrombinase có tác dụng
chuyển đổi prothrombin thành thrombin bằng sự phân cắt liên tục và đặc hiệu
[25,51]. Cơ chế lắp ráp và chuyển đổi prothrombin thành thrombin có tầm
quan trọng đối với sức khoẻ con ngƣời, bởi vì sự phát triển thrombin không
đủ là nguyên nhân gây bệnh Hemophilia và kết quả sản xuất thrombin quá
mức gây nên huyết khối [11,51,54].
Hình 1.1. Sơ đồ quá trình đông máu [15]
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo hai cơ chế ngoại sinh và
nội sinh. Cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu có chấn thƣơng thành mạch hoặc
các mô kế cận. Cơ chế nội sinh xuất hiện nếu có chấn thƣơng máu hoặc máu
lấy ra ngoài cơ thể từ lòng mạch. Các yếu tố tham gia đƣờng đông máu nội
sinh có trong lòng mạch, còn một số yếu tố tham gia đƣờng đông máu ngoại
sinh không tồn tại trong máu lƣu hành trong điều kiện sinh lý bình thƣờng. Cả
2 con đƣờng đều có sự tham gia của yếu tố X hoạt hóa (Xh), yếu tố V hoạt hóa
3
(Vh), phospholipid mô, các phospholipid tiểu cầu và Ca2+ để tạo thành phức
hợp prothrombinase. Các yếu tố tham gia vào quá trình đông máu hầu hết
đƣợc tổng hợp tại gan và giải phóng vào huyết tƣơng dƣới dạng tiền chất
không hoạt động. Có các yếu tố đông máu sau [25,51,54]:
-
Yếu tố I: Fibrinogen
-
Yếu tố II: Prothrombin
-
Yếu tố III: Thromboplastin của mô
-
Yếu tố IV: Ion Ca2+
-
Yếu tố V: Proaccelerin
-
Yếu tố VII: Proconvertin
-
Yếu tố VIII: Globulin A chống ƣa chảy máu (antihemophilic globin AHG).
-
Yếu tố IX: Globulin B chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin
component - PTC).
-
Yếu tố X: Stuart - Prower
-
Yếu tố XI: Globulin C chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin
antecedent - PTA).
-
Yếu tố XII: Hageman
-
Yếu tố XIII: Yếu tố ổn định fibrin (fibrin stabilizing factor - FSF)
Trƣớc đây các tác giả thấy rằng có 12 yếu tố đông máu đƣợc đặt tên
bằng số Lamã. Sau này có sự thay đổi: một số yếu tố III, IV, VI không tƣơng
ứng với một protein riêng biệt nào, đồng thời lại có một số yếu tố khác đƣợc
phát hiện thêm nhƣ: prekellicrein, kininogen có trọng lƣợng phân tử cao [21].
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế ngoại sinh
Mô bị tổn thƣơng giải phóng thromboplastin (yếu tố III) và
phospholipid từ màng tế bào mô. Yếu tố X đƣợc hoạt hoá (Xh) nhờ yếu tố
III, yếu tố VIIh (yếu tố VII đƣợc hoạt hoá nhờ yếu tố III), ion Ca2+ và
phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự
4
tham gia của yếu tố Vh (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin), ion Ca2+ và
phospholipid. Yếu tố Vh làm tăng hoạt tính của yếu tố Xh. Phospholipid
đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố (Hình 1.1)
[20,47,51].
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh
Máu bị chấn thƣơng, máu tiếp xúc với collagen hoặc bề mặt vật lạ thì
làm hoạt hoá yếu tố XII và giải phóng phospholipid tiểu cầu. Yếu tố XIIh
chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIh (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và
Fitzgerald). Yếu tố XIh hoạt hóa yếu tố IX thành yếu tố IXh (có sự tham gia
của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X đƣợc hoạt hoá có sự tham gia của yếu tố VIIIh
(yếu tố VIII đƣợc hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXh, ion Ca2+ và
phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự
tham gia của phospholipid, yếu tố Vh (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin)
và ion Ca2+. Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh
chậm hơn rất nhiều (1 - 6 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây) (Hình 1.1)
[20,47,51].
1.1.2.2. Sự hình thành thrombin
Prothrombin là α2 - globulin có trong huyết tƣơng, do gan sản xuất,
trọng lƣợng phân tử 68700, nồng độ trong máu bình thƣờng là 15mg/100ml
máu [28,36,47]. Khi phức hợp prothrombinase hình thành nó sẽ chuyển
prothrombin (yếu tố II), một zymogen không hoạt động thành thrombin (yếu
tố IIh) [28,37]. Giai đoạn này cũng cần sự có mặt của ion Ca2+. Sự hình thành
thrombin từ prothrombin xảy ra trên bề mặt tiểu cầu và diễn ra rất nhanh,
đƣợc tính bằng vài giây [11,28,37]. Thrombin là enzym trung tâm trong quá
trình đông máu [28,37]. Số lƣợng thrombin đƣợc hình thành phải đủ lớn để
đảm bảo cho quá trình đông máu nhƣng lại không đƣợc gây huyết khối
[11,37].
Ngoài vai trò kích hoạt sự hình thành cục máu đông, thrombin đóng
một vai trò điều chỉnh quan trọng trong quá trình đông máu. Thrombin kết
hợp với thrombomodulin hiện diện trên bề mặt tế bào nội bào tạo thành một
phức hợp chuyển đổi protein C thành protein Ch (protein C hoạt hóa). Protein
5
đồng phân protein S và protein Ch làm suy giảm các yếu tố Vh và VIIIh, do đó
hạn chế hoạt động của 2 yếu tố này trong chuỗi đông máu [28,37].
1.1.2.3. Sự hình thành fibrin
Fibrinogen là một protein hòa tan trong huyết tƣơng do gan sản xuất,
trọng lƣợng phân tử 340000, nồng độ trong máu bình thƣờng là 100 700mg/100ml máu [36]. Bình thƣờng do kích thƣớc phân tử lớn, fibrinogen
rất khó vào dịch kẽ. Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì
fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào
dịch kẽ [25,47,54].
Thrombin sau khi đƣợc hình thành đã chuyển fibrinogen thành fibrin
đơn phân. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi. Một
mạng lƣới fibrin đã hình thành và đƣợc ổn định nhờ yếu tố XIII (yếu tố XIII
tạo liên kết cộng hóa trị giữa các sợi fibrin) [25,36,47]. Giai đoạn này cũng có
sự tham gia của ion Ca2+. Khi mạng lƣới fibrin phát triển, các tế bào máu
đƣợc giữ lại trên lƣới fibrin và tạo nên cục máu đông. Chính mạng lƣới này
dính vào vị trí tổn thƣơng của thành mạch để ngăn cản sự chảy máu
[11,25,36].
Hình 1.2. Mạng lƣới fibrin giam giữ hồng cầu [37].
1.2.
Điều hòa đông máu trong sinh lý
Quá trình đông máu đƣợc điều hoà hết sức nghiêm ngặt và chính xác
sao cho chỉ cho một lƣợng rất nhỏ những zymogen - tiền yếu tố đông máu
chƣa hoạt động đƣợc chuyển thành dạng hoạt động làm cho nút cầm máu
không thể hình thành ở bên ngoài chỗ tổn thƣơng. Sự điều hoà này rất quan
6
trọng, vì mỗi 1ml máu có đủ khả năng làm đông toàn bộ fibrinogen trong cơ
thể trong vòng 10 đến 15 giây [11].
Tính chất lỏng của máu đƣợc duy trì bởi chính dòng máu chảy, bởi sự
hấp thu các yếu tố đông máu lên các bề mặt và do sự có mặt của hàng loạt các
chất ức chế đông máu trong huyết tƣơng. Antithrombin, protein C, protein S
và chất ức chế yếu tố tổ chức TFPI (Tissue factor pathway inhibitor) là những
chất ức chế quan trọng nhất. Ngoài ra ngƣời ta còn nói đến vai trò của serpin
trong điều hoà đông máu. Một khi thiếu các chất chống đông máu dù chỉ là ở
mức độ vừa phải, hoặc do một sự đột biến nào đó đều có thể làm tăng nguy cơ
huyết khối tĩnh mạch [11,37].
1.3.
Rối loạn đông máu
Rối loạn đông máu là sự gián đoạn trong khả năng của cơ thể để kiểm
soát đông máu. Các rối loạn đông máu có thể dẫn đến xuất huyết (quá ít cục
máu đông làm tăng nguy cơ chảy máu) hoặc huyết khối (đông máu quá nhiều
gây tắc nghẽn máu dẫn đến cản trở lƣu thông máu). Các rối loạn đông máu
này phát triển tùy từng điều kiện [24,26,48].
1.3.1. Rối loạn bẩm sinh
1.3.1.1. Rối loạn do thiếu yếu tố đông máu bẩm sinh (Hemophilia)
Rối loạn đông máu (Hemophilia) là rối loạn gây ra bởi sự thiếu hụt các
yếu tố đông máu. Nguyên nhân trực tiếp gây bệnh là do đột biến ở gen của
các yếu tố đông máu di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X. Hầu hết
thƣờng gặp ở nam, nhƣng có cả ở nữ [24,26,48].
Bệnh đƣợc phân loại dựa trên yếu tố bị thiếu hụt.
-
Hemophilia A: Là thể bệnh hay gặp nhất, do thiếu yếu tố VIII.
-
Hemophilia B: Là thể bệnh hay gặp thứ hai do thiếu yếu tố IX.
-
Hemophilia C: Là thể bệnh do thiếu yếu tố XI, triệu chứng nói chung
thƣờng nhẹ hơn. Chỉ xuất hiện ở 1% dân số.
Triệu chứng
Đặc điểm lâm sàng là chảy máu khó cầm ở nhiều bộ phận của cơ thể:
7
-
Máu chảy khó cầm ở vết thƣơng: đứt tay, chân, nhổ răng, bầm tụ máu
khi bị ngã.
-
Khối máu tụ ở khớp, cơ: thƣờng xuất hiện nhiều lần có tính lặp lại ở
một cơ, một khớp.
-
Chảy máu ở niêm mạc: đái máu, đi ngoài ra máu, chảy máu chân răng,
chảy máu mũi.
Mức độ, độ tuổi bắt đầu xuất hiện chảy máu tùy theo mức độ bệnh gọi
là thể nặng nhẹ. Căn bệnh này thực sự để lại nhiều hậu quả nặng nề nếu
không đƣợc chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời. Khi bệnh nhân bị chảy máu,
đặc biệt trong khớp, trong cơ, hoặc trong các nội tạng thì nhẹ nhất có thể tàn
phế, nặng có thể tử vong [24,26]. Ngoài ra có thể gặp thiếu yếu tố XII,
prekellicrein, kininogen trọng lƣợng phân tử cao nhƣng trƣờng hợp này hiếm
gặp và ít biểu hiện lâm sàng [24,26].
1.3.1.2. Bệnh Von Willebrand
Bệnh này đƣợc lấy tên từ một yếu tố đông máu có trong máu gọi là yếu
tố von Willebrand. Rối loạn này thƣờng là di truyền và gây chảy máu quá
nhiều khi hệ số von Willebrand thấp. Von Willebrand là một glycoprotein
đƣợc tổng hợp chủ yếu ở các tế bào nội mô. Chức năng của glycoprotein này
là [24,26,48]:
-
Làm trung gian dính tiểu cầu vào lớp collagen của nội mạc.
-
Kích thích ngƣng tập tiểu cầu.
-
Là protein mang của yếu tố VIII, làm yếu tố VIII bền vững.
Triệu chứng
Lâm sàng thấy chảy máu kéo dài thƣờng là chảy máu niêm mạc ít khi
chảy máu trong cơ, khớp. Nặng có thể có xuất huyết dƣới da [24,26,49].
1.3.1.3. Rối loạn do thiếu yếu tố chống đông máu bẩm sinh
Là bệnh do bất thƣờng về số lƣợng và chất lƣợng các yếu tố tham gia
vào quá trình ức chế đông máu nhƣ protein C, protein S, antithrombin III. Hầu
hết là do đột biến gen gây nên [26,48,49].
8
Lâm sàng thƣờng biểu hiện có các huyết khối và các ổ nhồi máu. Định
lƣợng các yếu tố này thấy giảm. Đối với những ngƣời này, nguy cơ tắc mạch
theo họ suốt cuộc đời và thƣờng gặp huyết khối ở tĩnh mạch [26,48,49].
1.3.2. Rối loạn mắc phải
1.3.2.1. Có kháng đông lưu hành
Có thể là kháng đông nội sinh và ngoại sinh. Kháng đông lƣu hành
đƣờng ngoại sinh: Kháng prothrombinase hoặc kháng đặc hiệu yếu tố đông
máu. Kháng đông lƣu hành đƣờng nội sinh: Kháng đặc hiệu yếu tố đông máu
hay kháng đông loại lupus [26].
Chất kháng đông lupus là một kháng thể antiphospholipid. Các chất
kháng đông lupus thƣờng liên quan đến việc làm gia tăng nguy cơ huyết khối
và chất kháng đông lƣu hành đặc hiệu liên quan đến nguy cơ xuất huyết
[24,26].
Xét nghiệm thấy có các bất thƣờng trên các chỉ số PT hoặc APTT. Cần
tiến hành định lƣợng các yếu tố đông máu và tìm kháng đông lƣu hành.
1.3.2.2. Giảm tổng hợp yếu tố đông máu
Hay gặp trong bệnh lý suy giảm chức năng gan, thiếu vitamin K gây
giảm tổng hợp các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin K [24,26].
Có 4 loại vitamin K:
-
Vitamin K1 (phytonadion, phulloquinon) có nguồn gốc thực vật.
-
Vitamin K2 (menaquinon) do vi khuẩn gram âm đƣờng ruột tổng hợp.
-
Vitamin K3 (menadion) và vitamin K4 có nguồn gốc tổng hợp.
Vitamin K tan trong lipid, nhƣng riêng vitamin K3 ở dạng muối tan
trong nƣớc vào cơ thể bị chuyển hóa thành vitamin K2. Vitamin K giúp cho
gan tổng hợp các yếu tố đông máu nhƣ prothrombin (II), VII, IX, X [20].
Ở những bệnh nhân có chế độ dinh dƣỡng kém, bị bệnh mạn tính, ứ
mật hoặc bệnh lý đƣờng ruột gây giảm hấp thu mỡ, uống kháng sinh kéo dài
làm mất cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột cũng làm rối loạn hấp thu vitamin
K. Ở một số trẻ sơ sinh, khi hệ vi khuẩn chí đƣờng ruột chƣa phát triển đầy đủ
9
có thể bị xuất huyết nặng, ngƣời ta có thể tiêm vitamin K dự phòng tránh xuất
huyết giai đoạn sơ sinh.
1.3.2.3. Đông máu nội mạc rải rác
Còn gọi là đông máu nội mạch lan tỏa (Disseminated Intravascular
Coagulation - DIC).
DIC đƣợc đặc trƣng bởi sự kích hoạt hệ thống đông máu, hậu quả tạo
và lắng đọng fibrin, thành lập huyết khối vi mạch ở nhiều cơ quan trong cơ
thể dẫn tới tình trạng nghẽn tắc mạch và xuất huyết do giảm trầm trọng các
yếu tố đông máu [24,26,49].
Nguyên nhân khởi phát là tăng quá mức hoạt tính thromboplastin trong
máu làm hoạt hóa đông máu, hình thành thrombin, biến đổi fibrinogen thành
các fibrin trong các tiểu động mạch. Hậu quả là có sự tiệu thụ quá mức
fibrinogen, prothrombin, các yếu tố V, VIII, tiểu cầu đồng thời có sự hoạt hóa
yếu tố VII, IX, X, XII hơn nữa thƣờng dễ xảy ra tiêu fibrin thứ phát do hệ
thống tiêu fibrin bị hoạt hóa, tăng sản sinh fibrinogen và các sản phẩm giáng
hóa của fibrin [24,26,49].
Nguyên nhân
Nguyên nhân sản khoa: viêm bể thận do thai nghén, nhiễm khuẩn khi
phá thai, thai chết lƣu, sản giật, nhiễm độc thai nghén, vỡ tử cung,…
Nguyên nhân ngoại khoa: sốc do chảy máu, sốc chấn thƣơng, bỏng
nặng, cấy ghép cơ quan, mổ cắt khối ung thƣ lớn, nạo vét hạch,…
Nguyên nhân nội khoa: nhiễm khuẩn nặng, nhiễm khuẩn máu: nhƣ tụ
cầu, mô não cầu, nhất là trực khuẩn gram âm, vi khuẩn yếm khí, nhiễm virus
nặng nhất là khi có sốc do nhiễm khuẩn, lao kê, dịch hạch, viêm tụy, xơ gan,
suy gan cấp, suy thận cấp,…
Hậu quả
DIC sẽ dẫn tới: Đông máu nội mạc → tắc vi mạch → mất nuôi dƣỡng
mô → rối loạn chuyển hóa mô → suy tạng → sinh ra cytokin và TF (Tissue
factor) → hoạt hóa đông máu. Tạo vòng xoắn của sốc, tổn thƣơng vi mạch và
10
đông máu. Gây tiêu thụ các yếu tố đông máu, chảy máu thứ phát do cạn kiệt
các yếu tố đông máu.
Biểu hiện trên xét nghiệm rất đa dạng tùy theo từng giai đoạn bệnh. Tất
cả các thành phần tham gia đông cầm máu đều có thể bị ảnh hƣởng
[24,26,49].
1.3.2.4. Rối loạn đông máu do dùng thuốc chống đông
Các thuốc chống đông máu bao gồm 3 nhóm chính là: các thuốc chống
đông kháng vitamin K, heparin và các thuốc chống kết tập tiểu cầu [20].
Các thuốc chống đông kháng vitamin K và heparin đều là các thuốc đã
đƣợc phát hiện và sử dụng từ rất lâu trong phòng và điều trị bệnh lý về huyết
khối [38]. Mới đây các nhà nghiên cứu đã tìm cách phát triển những thuốc
chống đông đƣờng uống mới. 2 nhóm thuốc đã đƣợc đƣa vào dùng trong lâm
sàng là nhóm ức chế trực tiếp thrombin [29] và nhóm ức chế trực tiếp yếu tố
X hoạt hóa (Xh) [31]. Sử dụng các thuốc chống đông máu kéo dài và liều cao
có thể gây rối loạn quá trình đông máu của cơ thể kèm theo đó là các tác dụng
phụ nguy hiểm [20,38].
Các thuốc chống đông kháng vitamin K
Các thuốc chống đông kháng vitamin K bao gồm dẫn chất coumarin
đƣợc tìm thấy năm 1948 và sau đó là dẫn chất indandion, các thuốc này có tác
dụng chống đông thông qua ức chế tổng hợp các yếu tố đông máu phụ thuộc
vitamin K [38]. Các thuốc chống đông nhóm này bao gồm:
-
Các dẫn xuất 4 – hydroxyl coumarin: Dicumarol, warfarin, ethyl
bicoumacetate, phenprocoumon.
-
Các dẫn xuất indandion: Phenyl – indandion, fluorophenyl – indandion,
clophenindion
Từ khi đƣợc phát hiện và đƣa vào sử dụng cho đến nay, các thuốc
chống đông kháng vitamin K đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhằm mục
đích dự phòng và điều trị bệnh lý huyết khối gây tắc mạch. Bệnh nhân đƣợc
chỉ định dùng thuốc kháng vitamin K bao gồm: ngừa đột quỵ và thuyên tắc
mạch hệ thống trong bệnh van 2 lá hậu thấp, bệnh nhân rung nhĩ, ngừa huyết
11
khối van tim nhân tạo và phòng ngừa thứ phát thuyên tắc huyết khối tĩnh
mạch (huyết khối tĩnh mạch sâu và thuyên tắc động mạch phổi). Hiệu quả
trong phòng và điều trị huyết khối là rõ ràng, tuy nhiên các thuốc chống đông
kháng vitamin K có tính ổn định thấp, tỷ lệ biến chứng là khá cao. Các thuốc
kháng vitamin K có thể gây chảy máu khi quá liều hoặc khi có tổn thƣơng từ
trƣớc, khi mang thai có thể sảy thai, thai lƣu, chảy máu ở trẻ sơ sinh. Dùng
lâu và liều cao có thể gây rối loạn thẩm thấu mao mạch, có thể hoại tử da
vùng ngực, chi dƣới … Hơn nữa thuốc có khoảng điều trị hẹp, tác dụng của
thuốc bị ảnh hƣởng bởi chế độ ăn uống và một số thuốc khác [20,52].
Heparin
Có 2 loại heparin là [20].
-
Heparin tiêu chuẩn: Còn gọi là heparin tự nhiên hay heparin chƣa phân
đoạn, có nguồn gốc từ tế bào mast của tổ chức liên kết. Trọng lƣợng
phân tử lớn, 10000 – 30000 dalton.
Heprain trọng lƣợng phân tử thấp: Là loại heparin có trọng lƣợng phân
tử từ 1000 - 10000 dalton.
Hiện nay, heparin đã đƣợc sử dụng phổ biến trong thực hành lâm sàng
với nhiều chỉ định từ phòng ngừa huyết khối, lọc máu đến điều trị các bệnh do
thuyên tắc huyết khối. Khoảng 1/3 bệnh nhân nhập viện có sử dụng heparin
hàng năm. Tuy nhiên, heparin có thể dẫn đến các tác dụng phụ nghiêm trọng
nhƣ chảy máu, chảy máu các khớp, chảy máu đƣờng tiêu hóa, dị ứng, rụng
tóc… Một trong những tác dụng phụ nguy hiểm của heparin là giảm tiểu cầu.
Khi bệnh nhận có dấu hiệu giảm tiểu cầu do heparin cần ngƣng heparin và sử
dụng các thuốc chống đông thay thế [20,35].
-
Các thuốc chống kết tập tiểu cầu
Điển hình trong nhóm này là asprin ngoài ra còn có các thuốc khác nhƣ
clopidogrel, ticlopidin… Các thuốc chống kết tập tiểu cầu có tác dụng chống
đông máu thông qua cơ chế chống kết tập tiểu cầu [20]. Do cơ chế tác dụng
của thuốc là tác dụng lên tiểu cầu và quá trình hình thành nút tiểu cầu nên
trong nhiều trƣờng hợp ngƣời ta tách và xét riêng nhóm thuốc này.
12
Khi dùng kết hợp các thuốc chống kết tập tiểu cầu với các thuốc chống
đông có cơ chế khác có thể gây chảy máu nguy hiểm [20]. Sử dụng kéo dài
các thuốc chống kết tập tiểu cầu gây kéo dài thời gian chảy máu, giảm tiểu
cầu, giảm prothrombin. Hậu quả làm kéo dài thời gian đông máu, mất máu
không nhìn thấy qua phân, tăng nguy cơ chảy máu. Ngoài ra thuốc còn gây
kích ứng đƣờng tiêu hóa, dị ứng,… [20].
1.4.
Các xét nghiệm đông máu cơ bản
1.4.1. Thời gian Prothrombin
Còn đƣợc gọi là thời gian Quick (Prothrombin Time - PT)
Nguyên lý
Máu đƣợc chống đông bằng natri citrat sẽ đƣợc phát động quá trình
đông máu theo con đƣờng ngoại sinh khi phục hồi calci và có mặt
thromboplastin. Dựa vào đặc tính này ngƣời ta khảo sát thời gian đông máu
huyết tƣơng sau khi cho thừa thromboplastin calci để đánh giá yếu tố đông
máu đƣờng ngoại sinh (phức hệ prothrombin: II, V, VII, X) [1,5,16].
Quy trình phân tích
-
50μL huyết tƣơng đƣợc ủ 3 phút trong cuvet ở 37 .
-
Thêm 100μL hóa chất PT vào mỗi ống. Đo thời gian PT ở bƣớc sóng
660nm.
-
Thời gian PT đƣợc xác định bằng khoảng thời gian từ khi cho hóa chất
PT vào hỗn hợp huyết tƣơng tới khi hình thành cục máu đông và đƣợc
đo bằng máy đông máu (Hình 1.3).
Hình 1.3. Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian PT [1]
Kết quả
13
-
PT tính theo giây (PTs): Thời gian Qick bình thƣờng khi sử dụng
thromboplastin có hoạt tính đầy đủ thƣờng từ 11-13 giây.
-
PT tính theo phần trăm (PT%): Việc tính tỷ lệ % dựa vào biểu đồ do
nhà sản xuất cung cấp hoặc biểu đồ đƣợc lập từ nhiều độ pha loãng
khác nhau của huyết tƣơng ngƣời bình thƣờng (dung dịch pha loãng:
Michaelis Citrat). Giá trị bình thƣờng trong khoảng 70 - 100%.
-
Hệ thống ISI/INR: (International Sentivity Index/International
Nomalized Ratio) đƣợc tính theo PT bệnh/PT chứng. SI là một chỉ số
liên quan đến loại hoá chất sử dụng. Tỷ số INR không phụ thuộc vào
hoá chất sử dụng do đó khách quan hơn [33].
Ý nghĩa
Thời gian prothrombin đƣợc gọi là kéo dài khi dài hơn thời gian chứng
ít nhất là 2 giây hoặc % tiêu thụ prothrombin giảm dƣới 70% hoặc INR > 1.3
với điều kiện là lƣợng fibrinogen không giảm và huyết tƣơng không chứa
heparin.
Thời gian Quick kéo dài trong các trƣờng hợp rối loạn đƣờng đông máu
ngoại sinh (giảm nồng độ các yếu tố phức hệ prothrombin do: suy chức năng
gan hoặc thiếu vitamin K, điều trị chống đông bằng dẫn xuất coumarin).
Xét nghiệm này nhạy nhất với sự thiếu hụt prothrombin.
Nguyên nhân sai số
-
Do mẫu huyết tƣơng kiểm tra: đông dây, sai tỷ lệ chống đông (máu lấy
quá ít hoặc quá nhiều).
-
Do kỹ thuật: tiến hành kỹ thuật sau 4 giờ kể từ khi lấy máu với mẫu
máu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng.
-
Do chất lƣợng hóa chất không đảm bảo hoặc hóa chất đã bảo quản quá
lâu sau khi chuẩn bị và mang ra sử dụng.
14
1.4.2. Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa
Còn gọi là thời gian cephalin - kaolin (Activated partical thrombopastin
time - APTT)
Nguyên lý
Thời gian phục hồi calci của huyết tƣơng citrat hóa sau khi ủ với một
lƣợng thừa kaolin (hoạt hóa yếu tố tiếp xúc) và cephalin (thay thế yếu tố 3
tiểu cầu) giúp đánh giá chính xác yếu tố khác của đƣờng đông máu nội sinh.
Với xét nghiệm này điều kiện hoạt hóa yếu tố tiếp xúc cũng nhƣ số lƣợng,
chất lƣợng tiểu cầu trong mẫu kiểm tra không ảnh hƣởng đến kết quả xét
nghiệm [2,5,16].
Quy trình phân tích
-
50μL huyết tƣơng đƣợc ủ 1 phút trong cuvet ở 37 .
-
Thêm 50μL hóa chất APTT vào mỗi ống.
-
Sau 3 phút, thêm 50μL CaCl2 25 mM vào mỗi ống. Đo thời gian APTT
ở bƣớc sóng 660nm.
-
Thời gian APTT đƣợc xác định bằng khoảng thời gian từ khi cho CaCl2
vào hỗn hợp huyết tƣơng và hóa chất APTT tới khi hình thành cục máu
đông và đƣợc đo bằng máy đông máu (Hình 1.4)
Hình 1.4. Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian APTT [2]
Kết quả
-
Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa của huyết tƣơng bình
thƣờng thay đổi từ 30-35 giây tùy loại cephalin - kaolin, tùy kỹ thuật,
tùy điều kiện kỹ thuật mà từng phòng xét nghiệm sử dụng.
-
So sánh ATTP bệnh nhân và nhóm chứng ta có tỷ lệ ATTP (rATTP)
15
Ý nghĩa
Nếu rATTP > 1.2 hoặc APTT kéo dài hơn chứng trên 8 giây là biểu
hiện giảm đông (giảm yếu tố đông máu nội sinh). Tình trạng này do thiếu hụt
yếu tố có thể bẩm sinh (Hemophilia) hay do yếu tố đông máu đã bị tiêu thụ
(DIC) hoặc do suy gan nặng không tổng hợp đƣợc yếu tố, cũng có thể do
trong máu có chất ức chế đông máu nội sinh, APTT kéo dài khi điều trị bằng
heparin.
Nếu rAPTT < 0.8 là biểu hiện tăng đông: Gặp trong DIC giai đoạn đầu
do có hiện tƣợng tăng đông.
Nguyên nhân sai số
-
Do mẫu huyết tƣơng kiểm tra: đông dây, sai tỷ lệ chống đông (máu lấy
quá ít hoặc quá nhiều).
-
Do kỹ thuật: tiến hành kỹ thuật sau 4 giờ kể từ khi lấy máu với mẫu
máu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng.
-
Do chất lƣợng hóa chất không đảm bảo hoặc hóa chất đã bảo quản quá
lâu sau khi chuẩn bị và mang ra sử dụng.
1.4.3. Định lượng fibrinogen
Nguyên lý
Cho thrombin vào huyết tƣơng, huyết tƣơng sẽ đông và thời gian đông
tuỳ thuộc vào lƣợng fibrinogen. Dựa trên cơ sở đó ngƣời ta pha dung dịch
fibrinogen chuẩn ở các nồng độ khác nhau rồi cho thêm thrombin. Kết quả lần
xét nghiệm này sẽ tạo đƣợc một đƣờng cong nồng độ fibrinogen - thời gian.
Huyết tƣơng bệnh nhân đƣợc pha loãng và xét nghiệm thời gian đông với
thrombin rồi đối chiếu đƣờng cong chuẩn sẽ biết nồng độ fibrinogen [3,5,16].
Quy trình phân tích:
-
Pha loãng huyết tƣơng: 10µL huyết tƣơng đƣợc cho thêm 90µL dung
dịch đệm Owren – Koller. Ủ ở 37oC trong 3 phút.
16
-
Thêm 50µL hóa chất Thrombin, sau đó đo thời gian hình thành fibrin ở
bƣớc sóng 660nm.
-
Thời gian hình thành fibrin đƣợc xác định bằng khoảng thời gian từ khi
cho hóa chất Thrombin đến khi xuất hiện những sợi fibrin đầu tiên và
đƣợc đo bằng máy đông máu.
Khi thời gian đông quá ngắn hay quá dài phải làm lại xét nghiệm và
huyết tƣơng đƣợc pha loãng 1/20 hoặc 1/5. Tính nồng độ fibrinogen dựa vào
biểu đồ mẫu tự làm với huyết tƣơng bình thƣờng hoặc dựa vào biểu đồ chuẩn
đƣợc cung cấp kèm theo lô thuốc thử (Hình 1.5).
Hình 1.5. Nguyên lý của quy trình định lƣợng fibrinogen [3]
Kết quả
Kết quả bình thƣờng từ 2 - 4g/l.
Ý nghĩa
Fibrinogen tăng trong: Các bệnh nhiễm trùng cấp, các bệnh viêm mạn,
các bệnh lý khối u, nhồi máu cơ tim cấp,…
Fibrinogen giảm trong: Bệnh lý gan nặng, DIC, tình trạng tiêu fibrin
tiên phát hay thứ phát do các bệnh lý huyết khối hay các thuốc tiêu fibrin,
không có fibrinogen bẩm sinh,…
Nguyên nhân sai số
-
Do mẫu huyết tƣơng kiểm tra: đông dây, sai tỷ lệ chống đông.
-
Do kỹ thuật: tiến hành kỹ thuật sau 4 giờ kể từ khi lấy máu với mẫu
máu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng.
-
Do chất lƣợng hóa chất không đảm bảo hoặc hóa chất đã bảo quản quá
lâu sau khi chuẩn bị và mang ra sử dụng.
17
