Đồ án kĩ thuật nuôi cấy và bảo quản nấm men công nghiệp

Đồ án nấm men công nghiệp

I)LỜI NÓI ĐẦU...............................................................................................................2
II)NỘI DUNG...................................................................................................................3
III)KĨ THUẬT NUÔI CẤY...........................................................................................16
III.2)MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MEN: còn rất nhiều môi trường
để nuôi cấy nấm men, đọc thêm tài liệu và bổ sung vào..................................17
III.3)CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN............24
III.3.1) chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy..................................................................24
III.3.2) Chuẩn bị môt trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm......................37
III.4)PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP GIỐNG NẤM MEN......................................41
III.4.1) KỸ THUẬT TẠO GIỐNG DÙNG TRONG SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP
.......................................................................................................................41
III.4.2) CHUẨN BỊ TĂNG SINH VÀ PHA LOÃNG MẪU.................................45
III.4.3)KĨ THUẬT CẤY MẪU VÀ Ủ MẪU.........................................................47
IV)NGHIÊN CỨU TẾ BÀO NẤM MEN DƯỚI KÍNH HIỂN VI..............................59
IV.1) Hình thái sinh sản.....................................................................................59
IV.3) Nghiên cứu hình thái bào tử của nấm men..............................................62
V.5). Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp: 71
V.5.1). Phương pháp đông khô:....................................................................71
V.5.2) Phương pháp bảo quản lạnh sâu:.......................................................72
Trước khi đưa ra phương pháp nâng cao chất lượng cần phải xét đến việc
thực hiện quá trình kiểm tra mức độ phân giải hợp chất hữu cơ không chứa
nito mà điển hình là quá trình lên men rượu của giống Saccaromyces............75
VI)THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HOÁ CÁC HỢP CHẤT
CACBON KHÁC............................................................................................................75
VI.1) Khả năng phân giải các chất không chứa nitơ.........................................76
VI.2 Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể:..78
VI.3) Sinh trưởng trên môi trường thạch...........................................................79
VI.4) Phương pháp dùng con dấu.....................................................................80
VIII)ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP..............................................................83

phần này viết cô đọng không trình bày quá dài dòng và quá chi tiết. PHải nói lên
khả năng ứng dụng của nó như thế nào? Và ít nhất phải nêu 3 ứng dụng.................83
IX)KẾT LUẬN.............................................................................................................104

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

1


Đồ án nấm men công nghiệp

I)LỜI NÓI ĐẦU
Ngày nay, với sự bùng nổ của cuộc cách mạng sinh học,và với sự
ứng dụng của nó,công nghệ sinh học đã làm thay đổi bộ mặt của thế giới
và tạo ra những điều mới lạ mà chúng ta không hề tưởng, đặc biệt một số
sản phẩm do nó tạo ra không những đáp ứng cho thời đại mà còn hứa
hẹn cho một ngành sản xuất năng lượng đầy tiềm năng trong tương lai
thay thế cho những năng lượng tự nhiên đang ngày càng bị cạn kiệt.
Nấm men- một vi sinh vật bé nhỏ, được mệnh danh là trái tim của ngành
công nghệ lên men đã tạo ra những sản phẩm đầy thú vị, mới lạ và đầy
tính ứng dụng cao không những trong ngành thực phẩm mà còn mở rộng
ra ở những ngành khác. Thực tế điển hình như sản xuất cồn: Brazil đã sử
dụng cồn-một loại sản phẩm được lên men từ nấm men sacharomyces
cerevisiae, được thay thế một phần xăng dầu cho sự tiêu thụ năng lượng
của nước mình. Do vậy, tôi chọn đề tài:kĩ thuật nuôi cấy và bảo quản
nấm men công nghiệp để làm đồ án riêng cho bản thân. Bước sang thế
kỉ XXI loài người đã hiểu biết về sự đa dạng nấm men đã được tích lũy
thông qua các phương pháp phát hiện và mô tả của nhiều nhà vi sinh vật
học. Kết quả là một số lượng lớn thông tin về hệ sinh thái nấm men đã

được tích lũy và số lượng lớn các loài nấm men được biết gia tăng nhanh
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

2


Đồ án nấm men công nghiệp

chóng nhờ vào các kỹ thuật sinh họ phân tử.
Nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong
thiên nhiên, đặc biệt chúng có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi
trồng hoa quả. Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu.

II)NỘI DUNG
II.1)PHÂN LOẠI NẤM MEN
Từ cổ xưa loài người đã biết nấu rượu. tác nhân chuyển hoá đường
là một loại nấm men thường gọi là men rượu. Theo hệ thống phân loại
nấm men thuộc vào giới nấm
(Kingdom Fungi theo

Whitaker , 1969,Takhtakjan,1970). Fungi bắt

nguồn từ chữ la tinh Fungus có nghĩa là nấm, đôi khi còn dùng Mycetes
bắt nguồn từ chữ Hy Lạp Mukes.
Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân
chuẩn, hiển vi. Nấm men có thể thuộc về hai lớp nấm: nấm túi
(Ascomycetes) và nấm bất toàn(Deutero-mecetes hoặc Fungi imperfect).
Tiêu chí phân loại nấm men
Đơn vị cơ bản phân loại nấm men trong sản xuất lên men là nòi

hoặc chủng. Đây là các tế bào thuần chủng của một loài xác định. Các
nòi (chủng) được hợp nhất thành loài (Specise), các loài hợp thành giống
(genus,genera), các giống hợp thành họ…
Nấm men và các loài giống nấm men thuộc về hai nhóm nấm:
nhóm nấm túi tạo thành bào tử được gộp chung vào lớp nấm túi

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

3


Đồ án nấm men công nghiệp

(Ascospor) và nhóm nấm không tạo thành bào tử-lớp nấm không hoàn
thiện (Fungi imperfect) hay còn gọi là lớp nấm bất toàn.
Qua sơ đồ phân loại nấm của W.Carol Frarier ta thấy:
Lớp nấm túi là những nấm sinh bào tử nang hay còn gọi là nấm thật.
Dưới lớp là bộ gồm các đơn bào (unicelloceteles). Đây là những nấm
men. Dưới bộ là họ Schizosaccharo-mycetaceae gồm các giống
sacharomycodes, Sackira,Hanseniaspora, Nasodia…
PHần lớn nấm men được sử dụng trong công nghiệp thuộc giống
sacharomyces trong lớp nấm túi và vài giống thuộc lớp nấm bất toàn.
Giống Endomyces vernalis là một loài nấm men dùng trong thế chiến thứ
nhất để tổng hợp chất béo.
Giống sacharomyces ,quan trọng nhất là loài sacharomyces cerevisiae
được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Một số chủng của nấm
men này dùng làm men nở bánh
mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất
glycerol hoặc enzim invertaza. Sacharomyces fragilis lên men đường

lactoza đón
Sơ đồ phân loại nấm men (theo W.Carol Frazier)
1- nấm men tạo màng
2-nấm men hình chuỳ
3 -nấm men tạo thành khuẩn ti thật hoặc khuẩn ti giả

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

4


Đồ án nấm men công nghiệp

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

5


Đồ án nấm men công nghiệp

EumycopHyta (nấm)

(Fungi imperfect)
Deuteromycetes

Ascomycetes

Moniliales

Endomycetes

Endomyceetceae

Endomyces
Schizosacchoomycess

X

Sacharomycetac
eae

Crytoccace
ae

Rhodotorulaceae

Sacharomyces
Zygosaccharomyces
Toruiaspora
Picha 1
Hasenula 1
Debaryomyces

Crytococus
Kloeskera 2
Mycoderma
Candida 1
Georichum 3

Trichosporum

Rhodotorula

X

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

X

X

6


Đồ án nấm men công nghiệp

Vai trò quan trọng quan trọng trong sản xuất sữa và các sản phẩm của
sữa. Có lẽ trong tương lai loài người trông cậy vào loại giống nấm men
này để thu nhận cồn tuyệt đối từ những nguyên liệu tái tạo được để thay
thế xăng khi dầu mỏ của trái đất bị cạn kiệt.
 Giống Zygosacharomyces. Một vài tác giả coi giống này là giống phụ
của giống sacharomyces. Cac loài của giống này có thể phát triển ở dịch
đường nồng độ cao và làm hỏng mật siro.Zygosacharomyces
nusbarumeri được tìm thấy trong mật. Các loài này tham gia vào lên
men rượu vang và đặc biệt là lên men đậu tương làm thành một thứ đồ
uống đặc biệt.
 Các giống Pichia, Hansenula, Debaryomyces… cũng như giống
Mycoderma, candida… là những nấm men không hình thành màng trên

mặt dịch nuôi cấy, phát triển trên bề mặt dịch ướp chua dưa chuột và các
loại rau quả. Chúng oxy hoá các chất hữu cơ làm giảm độ chua và làm
tăng ph của dịch ướp. Hansenula và Pechia có thể chịu đựng độ cồn cao
và oxy hoá rượu etylic. Debaryomyces có thể chịu được muối cao, đặc
biệt ở phosphat có muối tới 24% vẫn thấy men này phát triển. Nấm men
tạo màng không hoặc sản sinh ít rượu etylic từ đường. Giống
sacharomycodes và Hansenula sporacos hình quả chanh, cũng như các
men giả Kloeckera không sinh bào tử có thể hình thành chuỳ. Những
giống men này làm hỏng rượu, đặc biệt là mất mùi rượu vang.

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

7


Đồ án nấm men công nghiệp

 Lớp men giả còn gọi là lớp men không hoàn toàn thuộc lớp nấm bất
toàn (Fungiimperfect hay Deuteromycetes). Nấm trong lớp nấm này
không tạo thành bào tử. Thuộc lớp này có Moniales gồm hai họ là
Cryptococcaceae và Rhodorulaceae.
 Họ Cryptococcaceae hay Cryptococides gồm các giống Cryptoccocus,
Torulopsis,

Pityrosporum,

Brettanomyces,

Candida,

Trigonopsis,

Rhodotorulua.
II.3)CHỦNG NẤM MEN sacharomyces
khi đã nói đến chủng nấm men là phải nhắc đến có những giống nấm
men nào?, lí do chọn giống saccaromyces? Giống này gồm những
loài nào?
.II.3.Giống saccharomyces menyen ? (thực ra đây là giống
saccaromyces
giống này gồm các loài nấm men (câu này viết sai) có thể lên men đường
sinh ra rượu etylic .các loài của giống này phổ biến rất rộng rãi trong tự
nhiên đặc biệt một số nòi đã được chúng ta nghiên cứu và biết khá rõ.
Các men này có vai trò rất to lớn trong sản xuất các sản phẩm lên men có
chứa cồn.
đặc điểm chung của giống này là gì, môi trường lên men, điều kiện
len men?
Giống sacchromyces có hình dáng tế bào là hình cầu,hình ôvan hay
elip. Sinh sản vô tính bằng nẩy chồi. Thường có 1-4 bào tử tong một
nan,ít khi có 8 bào tử. Thế hệ sinh dưỡng của các giống này trong điều
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

8


Đồ án nấm men công nghiệp

kiên bình thường là các thể lưỡng bội.khi già chúng thường kết thành
vòng và mọc trên dịch men sợi giả,có thể kết thành màng nổi. Lên men

đường tốt,nhưng nồng độ đường không quá 30% (chính vì điều này
những nấm men này được gọi là “nấm đường”) và tạo thành 18% cồn
etylic. Chúng không đồng hoá được muối nitrat.
Theo Kudrêyxeva,giống này có 18 loài.Chúng không khác nhau về
hình thái,nhưng lại khác nhau nhiều về quan hệ với các loại đường (xem
bảng 1.1) không được viết như thế này. PHải viết: bảng số mấy: tên
bảng (tài liệu tham khảo, trang số?)
Bảng 1.1 Khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon của nấm men. (tài

S.vini

Quan hệ với các nguồn cabon dinh dưỡng
Các loại đường
Các loại rượu
cácloại axit hữu cơ
glucoza
galactoza
sacroza
rafinoza
lactoza
maltoza
dextrin
inulin
xyloza
Arabioz aa
etanol
glixeryl
mannit
dulxit
sorbit

axetic
lactic
xucsinic
malic
tartaric
xitric

sacchromyces

giống

liệu tham khảo “nấm men công nghiệp,trang số 19).

1

- + - - -

- + + - - - + + - - - -

3
s.cerevisia + + + 1 - + + - -

- + + - - - + + - - - -

e

+ + +

/

/

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

9


Đồ án nấm men công nghiệp

s.uvarum
s.carlsberg
ensis
s.chevalier
i
s.oviformi
s
s.chodati

3
+ + + + - + - - -

- + + - - - + + - - - -

+ + + + - + + - -

- + + - - - + + - - - -

1
+ - + / - + - - -- - + + - - - + + - - - 3

1
+ - + / - + - - -

- + + - - - + + - - - -

3
- - + - - -

- + + - - - + + - - - -

+ + -

Ghi chú: + đồng hoá

- không đồng hoá

Rafinoxa khi bị phân huỷ thành fructoza(1) và melbioza(2).Nấm men khi
chỉ đồng hoá được fructoza còn melbioza không đồng hoá được ,nên chỉ
ghi là 1/3
dưới đẩy sẽ giới thiệu 7 loài chính thộc giống sacchromyces .Các loài
này có nhiều ý nghĩa và đóng vai trò to lớn trong sản xuất lên men.
II.4)GIỚI THIỆU
các loài được giới thiệu theo mức độ quan trọng giảm dần. đồng thời cho
biết loài đó lên men được môi trường nào
II.4.1)sacchromyces cereviseae menyen
Loài nấm men này được dùng trong công nghiệp cồn etylic,men bánh
mì và bia. Hình dáng của chủng nó không khác lắm nhiều so với các
chủng cùng giống (hình 1.8). Khả năng tạo thành bào tử túi của
sacharomyces cerevissiea kém hơn sacharomyces vini,sacharomyces
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm

Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

10


Đồ án nấm men công nghiệp

uvarum. Loài này có đặc điểm lên men đường từ tinh bột sâu xa (không
được viết như thế này) hơn với các loài khác, vì rằng nó có thể lên men
được các dextrin đơn giản.
II.4.2)sacchromyces vini menyen
Đây là loài nấm men rất phát triển ở các loại quả ngọt ,ở dịch rau quả.
Chúng lên men dịch quả,đặc bệt là dịch quả nho tạo thành những loại
rượu nho và thường được gọi là rượu vang. Tên của loài này trước đây
gọi là sacchromyces ellípsoideus.bắt nguồn từ hình dáng tế bào của
chúng là hình ellip.
Hình 1.2(x2000)

Hình 1.3 (x2000)

Sacchromyces vini

sacchromy cescerevissiae

Trong dịch quả lên men ta thấy giống sacchromyces chiếm 80% số tế bào
vi sinh vật (không được viết tắt) có mặt. Dịch lên men được phủ một lớp
bọt trên bề mặt. Men này có hai dạng:dạng bụi dễ làm đục và dạng bông
dễ kết tủa, dễ lắng làm trong dịch men.

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm

Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

11


Đồ án nấm men công nghiệp

Nói chung các nòi thuộc loài này cần có nguồn dinh dưỡng là đường,
rượu axit hữu cơ. Các nguồn chất sinh trưởng của chúng là axit
panotenic (vtm B3), biotinvtm H hay B7, mezoinzoit, tiamin(B1) và
piridoxin(vtm B6)
II.4.3)sacchromyces uvarum Beiyrinck
Các chủng loài này được phân lập từ dịch quả phúc bồn tử,dịch nho lên
men và dịch bia. Một số chủng được dùng làm men bánh mì,chúng có độ
lắng tốt (loại men chìm) được dùng trong sản xuất bia.
Hình thái loài này có dáng chung của các loài sacchromyces. sự tạo
thành bào tử của loài này xảy ra mạnh mẽ khi nuôi trên môi trường thạch
–malt trong khoảng thời gian đầu sau khi tách được chúng từ điều kiện
tự nhiên. Có một số chủng loài này dễ tạo thành dạng bông trong lên
men.Vì vậy mà chúng được dùng trong sản xuất rượu vang và có thể tích
tụ trong dịch lên men được.
Hình1.4 (x2000)
Sacchromyces uvarum

Hình 1.5 (x2000)
sacchromyces carsbergenis

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

12


Đồ án nấm men công nghiệp

II.4.4)Sacchromyces carsbergenis Hansen
Các chủng của loài này được dùng nhiều trong sản xuất bia. Chúng là
loại nấm men chìm,hình thái tế bào cũng tương tự các loài men khác
cùng giống (hình 1.10). Khả năng sinh bào tử yếu và ít gặp.
Khả năng lên men đường không kém các loài sacchromyces khác,nhưng
loài men này có thể phát triển và lên men ở nhiệt độ thấp (5-10 0C). Vì lẽ
này Kudrreyxeva xếp chúng thành một loài riêng.
Trong dịch nho ít gặp loài này. Vì vậy trong sản xuất rượu nho các
chủng thuộc loài này khôg có vai trò gì thật đặc biệt,nhưng chúng là chủ
lực trong lên men bia.
II.4.5)Sacchromyces chevalieri guillermond
Các chủng thuộc loài này thường được phân lập từ dịch quả nho tự lên
men và từ van non của dịch quả cọ dừa. Hình thái men này xemhình
1.11. (không được viết như thế này).
Loài này thường phát triển trên dịch quả nho và có thể tích tụ tới
160 cồn,song không vượt được sacchromyces vini trong lên men rượu
vang
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

13


Đồ án nấm men công nghiệp

Hình 1.6 (x2000)

Hình 1.7 (x 2000)

Sacchromyces chevalieri

sacchromyces oviform

II.4.6)Sacchromyces oviformis Osterwadrrer
Các chủng thuộc loài men này đựơc phân lập từ dịch quả nho lên lên tự
nhiên thường dùng trong sản xuất rượu sâmpanh (champange)
Những giống oviforrmis thuần chuẩn có tế bào tương tự như các
loài khác (hình 1.12) phát triển tốt ở dịch nho,lên men gần như toàn bộ
đường trong dịch quả và có thể tíchtụ với 18 0 cồn (nếu dịch quả có hàm
lượng cao hoặc qúa trình lên men được bổ sung đường). Nhu cầu về chất
sinh trưởng của loài men này cũng giống như sacchromyces vini,nhưng
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

14


Đồ án nấm men công nghiệp

sức chịu đựng cồn lại cao hơn và như vậy ở giai đoạn cuối lại phát triển
tốt hơn. Do vây nó thường được dùng kết hợp với sacharomyces vini
trong lên men rượu vang có hàm lượng đường cao và để sản xuất vang
“khô” (lên men hết đường).
Các chủng sacharomyces oviformis khi kết thúc lên men thường tạo
thành một lớp màng trên bề mặt dịch. Chúng thường được dùng trong

sản xuất rượu vang từ dịch quả có hàm lượng đường cao,đặc biệt trong
sản xuất sâmpanh để sản xuất lên men có nồng độ cồn cao hơn tự nhiên.
*Sacchromyces oviformis cheresiensis (hình 1.13).
Loài này lên men đường mạnh,có thể tạo thành tới 16.5 0 cồn trong dịch
lên men. Khi kết thúc lên men cũng tạo thành lớp màng trên mặt dịch.
Trong quá trình rượu bị oxi hoá và kết quả sẽ tạo thành chất axetaldehyt
(tới 700mg/l) cùng với các este bay hơi làm cho vang có hương thơm
quả anh đào.
Điều kiện thích hợp cho sacharomyces oviformis cheres (không
được viết thế này) phát triển tốt là nhiệt độ 18-200C và phải đủ không
khí. Có thể dùng men này để chứa các loại vang có tích tụ axit axetic và
axit lactic (vang có hai loại axit này thường có mùi chuột).
II.4.7)Sacchromyces chodati Scheiner
Men này thường phân lập từ nước nho lên men tự nhiên ở Thuỵ Sĩ.
Không lên men được sacacroza,nhưng lên men tốt glucoza và fructoza.
(Bổ sung thông tin cho lại này)
Hình dáng tế bào và bào tử của sacharomyces chodati Scheiner
Hình 1.8 (x2000)
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

Hình 1.9
15


Đồ án nấm men công nghiệp

Sacchromyces oviformis var

sacchromyces chodati

Trong tất cả các loài kể trên thì loài sacharomyces cerevisiae được sqr
dụng nhiều nhất trong công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất bia
rượu và công nghệ sản xuất bánh như chúng ta đã biết từ trước đến nay.
III)KĨ THUẬT NUÔI CẤY
III.1) YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG GIỐNG NẤM MEN

DÙNG

TRONG SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP:
1.

Nấm men phải cho ta sản phẩm như chúng ta
mong muốn và năng suất cao, chất lượng tốt, có ý nghĩa kinh tế trong
sản xuất, không tạo thành những sản phẩm phụ mà ta không mong
muốn

2.

Sử dụng các nguồn nguyên liệu sẵn có rẻ tiền
của địa phương

3.

Có khả năng tách dễ dàng các tế bào hoặc các
sản phẩm tạo ra sau quá trình lên men

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

16


Đồ án nấm men công nghiệp

4.

Chủng nấm men phải rất thuần, không chứa vi
sinh vật gây nhiễm khác, đặc biệt là không có bacteriophage kí sinh…

5.

Chủng nấm men phải khoẻ, giống sau khi cấy
vào nồi nhân giống hoặc từ nồi nhân giống chuyển qua nồi lên men
phải phát triển rất nhanh để tránh sự tạp nhiễm.

6.

Chủng giống phải dễ dàng phát triển cho nhiều
tế bào sinh dưỡng, bào tử hoặc bằng các hình thức tái sinh khác

7.

Sản phẩm tạo ra trong thời gian lên men càng
ngắn, càng tốt, thường 1-3 ngày

8.

Có khả năng chống được sự tạp nhiễm của các
vi sinh vật lạ, tự bảo vệ bằng cách phát triển trong môi trường pH thấp,

nhiệt độ cao hoặc sinh ra các chất ức chế vi sinh vật khác.

9.

Chủng được bảo quản dễ dàng, tồn tại và ổn
định các đặc tính xuyên suốt trong thời gian sử dụng.

10.

Chủng có khả năng thay đổi được các đặc tính

bằng cách kiểm tra dột biến, kĩ thuật gen để không ngừng nâng cao
trong sản xuất.
11.
III.2)MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MEN: còn rất
nhiều môi trường để nuôi cấy nấm men, đọc thêm tài liệu và bổ sung
vào
*Môi trường nước malt:
Hoà bột malt với nước theo tỉ lệ 1:5,gia nhiệt đến 45-48 0C kết hợp với khuấy đảo.
Giữ nhiệt trong 30 phút,sau đó nâng lên 500C giữ 1h, rồi nâng tiếp lên 620C-630C,giữ

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

17


Đồ án nấm men công nghiệp
nhiệt cho đến khi đường hoá hoàn toàn. Dung dịch đường hoá được đun sôi 20-30
phút cần thêm nước khi đun tới thể tích ban đầu. Lọc bỏ bã

Dịch lọc làm nguội đến 300C có 8-10% chất khô, cho vào bình tam giác, hấp
thanh trùng với áp suất dư 0,5atm.
*Môi trường thạch-malt
Dịch đường malt mới lọc hoặc đã thanh trùng ở trong các bình tam giác có 8% chất
khô và bổ sung thạch (20g cho 1 lít). Thạch sơ bộ hoà nước, nấu nóng chảy có thể
phả lọc qua hai lớp vải màng xen vào giữa là lớp bông rồi cho vào dịch malt. Đun
dịch thạch-malt cho nóng chảy đều và chia vào các ống nghiệm hoặc các bình tam
giác. Thanh trùng ở 0,5-0,8atm.
*Môi trường nước thịt-pêpton (MP) – xem lại đây là môi trường chủ yếu
để nuôi cấy vi khuẩn.
*Nước chiết men
Có thể dùng men bia dạng sữa, men bánh mì dạng ép, dạng khô để chế ra nước chiết
men
80g men dạng ép hay 50g dạng khô cho vào 1l nước điều chỉnh ph đến 6,8,sau đó
đun sôi trong 30 phút, chiết lấy nước trong bỏ cặn, kiểm tra lại ph, lọc và thanh
trùng, từ nước chiết men ta pha thành môi trường thạch-nước chiết men.
Men tự phân và cao men: Nguyên liệu là men bánh mì dạng ép hoặc khô,.men bia
rửa sạch ở dạng men sữa
Men cũng được hoà với nước (men ép tỉ lệ 1:4,men khô tỉ lệ 1:6,men sữa tỉ lệ
1:1) giữ ở 500C trong vòng 24h. Chiết lấy phần nước trong, bỏ cặn trung hoà và đun
sôi. Từ dịch men ta phân ta có thể pha thành môi trường thạch-nước men-đường
(nước men được pha thêm 0,5% muối ăn,1-2% glicoza và 2% thạch), pH 6,8. Thanh
trùng ở 0,5 at trong 30 phút. Có thể thay glucoza bằng 0.5% sacaroza, pH 6-6,5
Dịch men tự phân có thể cô đặc thành cao men, đem dùng dần để pha môi
trường với tư cách là nguồn nitơ hữu cơ (pepton,peptit,axitamin,nucleotit…) và các
nguồn vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B.
*Môi trường Hansen

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

18


Đồ án nấm men công nghiệp
Glucoza

20g

(có thể thay bằng sacaroza 50g)
Pepton

10g

KH2P04

3g

MgS04

2,5g

nước cho đủ

1l

*Môi trường Genneberg
Sacaroza

150g

Apragin hoặc pepton

3g

KH2P04

5g

MgS04

2g

CaC03

5g

nước cất cho đủ

1l

*Môi trường Genneberg+ amôni
Sacaroza

150g

(NH4)2HP04

2g

MgS04.7H20

1g

CaC03

5g

Nước cất cho đủ

1l

*Môi trường Rider: thành phần môi trường có các loại muối sau,g/l
Amoni sulfat

3

Magie sulfat

0,7

Canxi nitrat

0,4

Natri clorua

0,5

KH2P04

1

K2HP04

0,1

Dùng môi trường nuôi nấm men cần loại bỏ caxi nitrat, vì nấm men không
đồng hoá được chất này, pH ban đầu của môi trường là 6,6
Để thử sinh trưởng của nấm men người ta thêm 2% đường vào môi trường.

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

19


Đồ án nấm men công nghiệp
Để thử lên men của nấm men người ta thêm 5% đường vào môi trường
Để môi trường tổng hợp được đầy đủ các chất dinh dưỡng và sinh trưởng ta cần
phải bổ sung các hợp phần vitamin như sau,µg/ml
Inozit

5

Biotin

0,0001

Axit pantotenic

0,25

Tiamin

1

Pyrodoxin

0,25

Axit nicotinic

0,5

Pha trong nước cất
Chú ý: Khi dùng môi trường chọn lại của nấm men, để cho nấm men có ưu thế và ức
chế vi khuẩn, ta cho vào môi trường chất kháng sinh neomixin với hàm lượng 20dv/1
ml môi trường, hoặc hỗn hợp penixilin với streptomixin cho đồng thời (50-100 dv
trong 1 ml môi trường)
Để ngăn chặn nấm mốc phát triển ở các môi trườg lỏng hoặc môi trường
thạch người ta cho thêm vào môi trường cồn để có 40 cồn hoặc 0,2% natri propionat
Khi phân lập từ nấm men tạo màng người ta cho vào môi trường axitiodua
axetic với số lượng 0,1-0,2%
*Môi trường Saburo
Pepton

10g

Glucoza

40g

Thạch

15g

Nước cho đủ

1l

pH

5,6

*Môi trường mầm lúa:
Ủ cho thóc nảy mầm, phơi khô mầm, xay thành bột. Cân 1kg bột cho vào đó 3 lít
nước, đun cách thuỷ ở nhiệt độ 600C để đường hoá tinh bột.. Thử bằng dung dịch
iodine.. Lọc lấy dịch thêm nước điều chỉnh cho nồng độ chất khử hoà tan đạt 10Bx,
phân vào các dụng cụ chứa, hấp tiệt trùng 1210C trong 1 phút.
*Môi trường khoai tây -đường- cám:
Khoai tây
300g
Sucrose
50g
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

20

Đồ án nấm men công nghiệp
Cám
100g
Khoai tây cắt nhỏ, rửa sạch, cân lấy 300g. Thêm 500ml nước, đun sôi trong 30 phút.
Lọc lấy nước trong, trộn 2 loại dịch lọc trên và thêm 50 glucoza đường, bổ sung cho
đủ 1 lít.
*Môi trường giá đậu- đường:
Cân 100 g giá đậu. Thêm 100 ml nước, đun sôi 30 phút, lọc để lấy dịch trong. Thêm
cho đủ 1lít nứơc và thêm 50g đường.
 Môi trường lai giống nấm men:
Glucoza
20g
MgSO4
19g
Biotin
3g
Thạch
20g
K2HPO4
2g
(NH4)2SO4
1g
Thiamin
200g
nước
100ml
Nếu sử dụng môi trường lỏng thì không cần thạch.
 Môi trường Acetate:
Acetate natri

10g
Thạch
20g
KCl
5g
Nước
1l
Em đã có bổ sung thêm các môi trường trên,sau đây em xin bổ sung các môi trường
mới, nhưng ở đây, em chọn tất cả các môi trường để nuôi cấy vi sinh vật, em rất xin
lỗi vì đây, em không thể phân biệt được các loại môi trường là đặc hiệu dành cho
nấm men, nên em đưa vào rất mong cô có thể phân biệt giúp em, em xin cảm ơn.
 Thạch thường (Meat Extr aga):
Pepton

10g

Cao thịt

3g

NACl

5g

Aga

12g

pH

7

Đun tan các hợp phần trên trong 1l nước, hấp ở 1210C trong 15 phút.
 Nước muối sinh lý vô trùng
Pha NACl trong nước cất với nồng độ 0,85%. Hấp ở 1210C trong 15 phút.
 BGBL (Brilliant Bile Lactose 2%)

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

21


Đồ án nấm men công nghiệp
Pepton

10g

Lactose

10g

Mật bò

20g

(Sodium desoxychocolate)
Brilliant Green

0,0133g

pH

7,4

Hoà tan pepton và lactose vào trong 500ml nước cất. Cho 20g mật bò vào 200ml
nước cất (pH của dung dịch khoảng 7-7,5). Trọn hai dung dịch, thêm nước cất đến
975 ml. Chỉnh pH đến 7,4. Cho thêm 13,3 ml dung dịch Brilliant Green 0,1% trong
nước cất. Thêm nước cất cho đủ 1l. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ 16mm có
chuông Durham (mỗi ống 15ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút.
 Nước pepton
Pepton

10g

NaCl

10g

pH

7,2

Đun tan các hợp phần trên trong 100 lit nước cất. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ
16mm (mỗi ống 5ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút.
 Môi trường MRVP
Pepton

5g

K2HPO3

5g

Dextroza (hoặc Glucose)

5g

pH

7,5

Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ
16mm( mỗi ống 5ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút.
 EMB(Eosine Methylene Blue Aga)
Pepton

10g

K2HPO3

10g

pH

7,2

Đun tan các hợp phần trên trong 1l nước cất. Hấp ở 1210C trong 15 phút.
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

22


Đồ án nấm men công nghiệp
 Endo Aga
Pepton

10g

Lactose

10g

Cao thịt

10g

NaCl

5g

Funchsine basic

0,04g

Na2SO3

2,5g

Aga

15

pH

7,4

Đun tan cáchợp phần trên trong 1 lít nước cất. Hấp ở 1210C trong 15 phút.
 Simmons Citrate Aga:
(NH4)2HPO4

1g

K2HPO4

1g

NaCl

5g

Natri citrate

2g

MgSO4

0,2g

Bromotymol xanh

0,08g

Aga

12,5g

pH

6,6

Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Hấp ở 1210C trong 15 phút.
 Matinol Salt Broth
NaCl

150g

Pepton

20g

Manitol

15g

Cao thịt

5g

Phnol đỏ

0,025g

Natri sulfamezathine

0,055g

pH

7,4

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

23


Đồ án nấm men công nghiệp
Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ
16mm (mỗi ống 10ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút.
 Wilson Blair Aga
NaCl

5G

Pepton

10g

Glucose

10g

Cao thịt

3g

Aga

10g

pH

7

Đun tan hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Hấp ở 121 0C trong 15 phút. Trước khi
sử dụng, đun chảy môi trường và cứ 18ml môi trường + 1ml Na 2SO3 (10g/100ml) +5
giọt FeSO4 (8g/100ml). Thêm 1ml Na2SO3 + 5 giọt FeSO4 vào ống thạch ngay trước
khi bắt đầu trình tự tiến hành thí nghiệm.
 Chapman Aga:
NaCl

75g

Pepton

10g

Matinol

10g

Cao thịt

3g

Phenol đỏ

0,025g

Aga

12g

pH

7,4

Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Phân phối vào các đĩa pectri cỡ
100mm (mỗi đĩa 15-20ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút.

III.3)CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
NẤM MEN
III.3.1) chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy
III.3.1.1) Xử lí dụng cụ
1- nguyên tắc chung
Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm
Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

24


Đồ án nấm men công nghiệp

Các loại dụng cụ để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính thật sạch
và trong ,không bị nứt mẻ
- phương pháp xử lí
-trung tính dụng cụ
-rửa dụng cụ
a) trung tính dụng cụ
-Đổ vào bên trong dụng cụ nước có ph=7 (để kiểm tra trung tính)
-Hấp khử trùng dụng cụ ở 1210C trong 15 phút bằng nồi hấp điện
-Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra ph của nước trong dụng cụ
-Nếu nước có ph kiềm thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào HCL 2% cho đến
khi kiểm tra lại và thấy nước có ph =7 thì mới thôi
-Rữa kĩ bằng nước nhiều lần thì dùng được
b)PHương pháp rửa dụng cụ
Nhìn chung các dụng cụ làm bằng thuỷ tinh có độ bền hoá học,chịu
được nhiệt độ cao rất khác về hình dạng và kích thước. Do đó các loại
dụng cụ khác nhau cần có các phương pháp rửa khác nhau
phiến kính
Với phiến kính cũ (đã dùng làm tiêu bản)
 Chùi sạch mỡ và vaselin trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen
hoặc ngâm tiêu bản vào dung dịch sulfubricomate trong 48h
 Ngâm tiêu bản vào nước xà phòng và đun sôi trong vòng 1h
 Rửa nước,để ráo
 Ngâm tiêu bản vào cồn 900 trong 2h

Giáo viên hướng dẫn: Trần Thị Hoài Tâm

Sinh viên: Dương Thị Thuỳ Dương

25