Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN NGỌC TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH
NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ MIỄN DỊCH
Chuyên ngành: Dị ứng và miễn dịch
Mã số: 62 72 01 09

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2017


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Đặng Dũng
2. TS. Trịnh Thanh Hùng

Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Thị Dụ
Bệnh viện Bạch Mai
Phản biện 2: GS. TS. Phạm Văn Thức
Trường Đại học Y Dược Hải Phòng
Phản biện 3: PGS. TS. Trịnh Xuân Kiếm
Bệnh viện Bạch Mai

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng luận án cấp trường
vào hồi:

giờ

ngày

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc gia
2. Thư viện Học viện Quân y

tháng

năm


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo số liệu thống kê của Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai
năm 2015, số bệnh nhân nhập viện do bị rắn hổ cắn chiếm 7,12% tổng
số trường hợp ngộ độc nói chung, trong đó có 29% được chẩn đoán xác
định do rắn hổ mang cắn [3]. Một trong những loài rắn hổ mang thường
gặp và hay gây ra tai nạn rắn cắn ở Miền bắc là rắn hổ mang Naja atra,
hay còn được gọi là rắn hổ mang bành. Tai nạn do rắn hổ mang Naja
atra cắn có thể dẫn tới nhiễm độc nọc rắn, nếu không được điều trị kịp
thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng nề [4]. Theo Tổ
chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm
độc nọc rắn là Huyết thanh kháng nọc rắn [124]. Thế nhưng, điều kiện
tiên quyết cho sử dụng Huyết thanh kháng nọc rắn là phải xác định loài
rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn. Tuy nhiên cho đến nay, ở nước ta việc

chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết
thanh kháng nọc rắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, do đó
thường bị hạn chế. Bên cạnh kỹ thuật ELISA đã được nhiều tác giả
trong nước và trên thế giới lựa chọn để phát triển các xét nghiệm phát
hiện nọc rắn [5], [29], [86], [107]. Ở Đài loan, Hung D.Z và cộng sự
cũng đã áp dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch để phát triển bộ xét
nghiệm nhanh phát hiện nọc rắn hổ mang và đã có những thành công
nhất định [59].
Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja
atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch” nhằm hai mục tiêu:
1. Chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo
nguyên lý sắc ký miễn dịch.
2. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn Naja atra của bộ xét nghiệm
trên thực nghiệm và lâm sàng.


2
Tóm tắt những đóng góp mới của luận án:
Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên ở Việt nam phát triển thành công
bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang bằng kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch.
Bộ kít có khả năng phát hiện được nọc rắn chuẩn pha trong dung
dịch đệm là 5 ng/ml, trong huyết thanh và nước tiểu là 10 ng/ml. Có thể
thấy, độ nhạy của bộ kít tương đương với các phương pháp xét nghiệm
khác. Bộ kít không có phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh và
chàm quạp. Tuy nhiên, bộ kít vẫn có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất
ở nồng độ 20 ng/ml.
Kết quả thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thập từ
các bệnh nhân được chẩn đoán rắn hổ mang cắn: tỷ lệ xét nghiệm
dương tính đối với mẫu huyết thanh là 69,9%; dịch vết cắn là 89,2% và

nước tiểu là 60%.
Sử dụng bộ kít này có thể giúp các bác sỹ chẩn đoán nhanh rắn hổ
mang cắn, từ đó sớm đưa ra chỉ định dùng huyết thanh kháng nọc rắn
đặc hiệu, một phương pháp điều trị hiệu quả nhất đối với bệnh nhân bị
rắn độc cắn cho đến thời điểm này
Bố cục của luận án:
Luận án gồm 110 trang, bao gồm:
- Đặt vấn đề và mục tiêu nghiên cứu: 2 trang
- Tổng quan: 30 trang
- Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 24 trang
- Kết quả: 28 trang
- Bàn luận: 24 trang
- Kết luận và kiến nghị: 2 trang
Luận án có 16 bảng, 11 biểu đồ, 2 sơ đồ, 31 hình vẽ, 125 tài liệu
tham khảo (cụ thể 18 tài liệu Tiếng Việt, 107 tài liệu Tiếng Anh).


3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tai nạn rắn cắn và chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt nam
1.1.1. Tai nạn rắn cắn ở Việt nam
Cho đến nay, chưa có số liệu nào thống kê chính xác nào về số ca
nhiễm độc và tử vong do rắn cắn. Mặc dù vây, bằng nhiều cách tiếp cận
khác nhau, các chuyên gia ước tính mỗi năm nước ta có đến 30.000
trường hợp bị rắn cắn, thủ phạm chủ yếu do hai họ rắn hổ (Elapidae) và
họ rắn lục (Viperidae) gây ra [12], [13], [17], [71]. Tại Trung tâm chống
độc Bệnh viện Bạch mai, năm 2015, chỉ tính số trường hợp bị rắn hổ cắn
đã là 216 trường hợp (chiếm 7,12% so với tổng số bệnh nhân ngộ độc nói
chung), trong đó có 29% được chẩn đoán xác định do rắn hổ mang cắn

[3].
1.1.2. Chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam
Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn
rắn cắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng và nhận biết loài rắn [4],
[13]. Chẩn đoán lâm sàng thường dựa vào:
• Mô tả của bệnh nhân hoặc người đi cùng về tình huống bị cắn và
đặc điểm con rắn gây tai nạn do họ nhìn thấy hoặc bắt được
mang theo đến bệnh viện;
• Dấu vết móc độc để lại tại vết thương rắn cắn;
• Biểu hiện nhiễm độc tại chỗ quanh vết cắn như chảy máu, đau
buốt, phù nề, hoại tử;
• Biểu hiện nhiễm độc toàn thân như nhiễm độc thần kinh hay rối
loạn đông cầm máu.
Tuy nhiên, chẩn đoán dựa vào lâm sàng có một số hạn chế do rắn
cắn là một tai nạn thường gây hoảng loạn cho bệnh nhân dẫn đến những


4
mô tả sai lệch về con rắn gây tai nạn. Rất ít trường hợp bệnh nhân có
thể mang theo con rắn gây tai nạn do không phải lúc nào cũng bắt được
rắn. Hơn nữa, những nghiên cứu về đặc điểm nhiễm độc của các loài
rắn độc gây tai nạn cho đến nay chưa có nhiều. Một trong những nhược
điểm khác nữa là phải dựa trên các biểu hiện và mức độ nhiễm độc của
bệnh nhân, những biểu hiện này chỉ có khi nọc rắn đã gây hại cho cơ thể
bệnh nhân một cách rõ ràng, tức là ở giai đoạn muộn của bệnh.
1.2. Rắn hổ mang Naja atra
1.2.1. Đặc điểm sinh học và nọc độc
Rắn hổ mang Naja atra hay còn gọi là Taiwan cobra, Chinese
cobra, là loài thuộc họ Elapidae [4], [13], [65], [116]. Rắn hổ mang
N.atra được mô tả lần đầu tiên bởi một bác sỹ, nhà động vật học người

Đan mạch là Theodore Edward Cantor vào năm 1842 [105]. Nọc của
rắn có độc tính cao, thành phần chính là các neurotoxin, cardiotoxin,
haematoxin và Phospholipase A2… [1], [2], [16], [28], [117]. Giá trị
LD50 trên chuột 0,62 mg/kg khi tiêm dưới da [78].
1.2.2. Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn
Ở Việt nam, trong nghiên cứu của Nguyễn Kim Sơn (2008), có đến
163/384 bệnh nhân bị rắn hổ mang cắn nhập viện được xác định là do
rắn hổ mang N.atra (chiếm 42%) [13]. Khi bị rắn hổ mang cắn ngoài
dấu vết của răng độc, đau đớn thường xảy ra trong vòng 10 phút tại vị
trí vết cắn. Các triệu chứng đau, đỏ da, sưng nề, chảy máu thậm chí có
bọng nước dần nặng lên. Các vết thương tổ chức tại chỗ tương đối rõ
ràng, nguyên nhân chính là do tác dụng của cardiotoxin và
phospholipase A2 [97], [122]. Theo Nguyễn Kim Sơn, dấu hiệu phù nề
+ hoại tử sớm gặp ở 100% trường hợp [13]. Hội chứng nhiễm độc thần
kinh do tác dụng của các độc tố thần kinh có trong nọc rắn hổ mang gây
liệt các dây thần kinh sọ não, liệt cơ hô hấp [13], [28], [122].


5
1.3. Một số kỹ thuật miễn dịch phát hiện nọc rắn và kháng thể
kháng nọc rắn
Do thành phần chính của nọc rắn độc đa phần là các độc tố có bản
chất là protein [1], [2], [14], [16]. Trong đó đa số đều có tính kháng
nguyên cao [42], [49] nên các xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc thường
dùng là xét nghiệm miễn dịch [95]. Dưới đây là một số kỹ thuật miễn
dịch đã và đang được ứng dụng phát hiện nọc rắn:
 Điện di miễn dịch
 Ngưng kết hồng cầu
 Ngưng kết miễn dịch
 Miễn dịch phóng xạ

 Miễn dịch huỳnh quang
 Miễn dịch quang
 Miễn dịch gắn enzym (ELISA)
 Kít phát hiện nhanh: dựa trên nguyên lý ELISA, sắc ký miễn dịch
1.4. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch
1.4.1. Lịch sử hình thành và phát triển
Các nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch được nghiên cứu
và khẳng định vào những năm 1980 và những năm cuối của thập kỷ đó
[123]. Trong 20 năm gần đây, với việc sử dụng các thế hệ KT, đặc biệt
là ứng dụng công nghệ KT đơn dòng và cải tiến nguyên liệu thành phần
trong đó có việc sử dụng hạt nano kim loại thay thế các hạt latex làm
thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng-Au)..., kỹ thuật sắc ký miễn dịch
đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực.
1.4.2. Nguyên lý hoạt động
1.4.3. Chế tạo và tối ưu que thử
- Thiết kế định dạng que thử: phụ thuộc vào mục đích phát hiện
kháng nguyên hay kháng thể, nguyên vật liệu sẵn có và chất lượng của


6
các nguyên vật liệu đó. Que thử có thể theo định dạng theo cơ chế
sandwich hoặc cạnh tranh [92], [123].
- Lựa chọn vật liệu:
+ Chỉ thị màu (nhãn): có nhiều loại hạt nano như hạt nano vàng,
nano bạc, hạt từ, latex, phân tử huỳnh quang, enzym… được sử dụng để
làm chỉ thị màu trong nguyên lý sắc ký miễn dịch [19], [36], [70], [85],
[113].
+ Màng: lựa chọn màng màng mao dẫn và các loại màng khác. Các
thông số lựa chọn bao gồm: kích thước lỗ, bản chất, độ dày, khả năng
thấm, gắn không đặc hiệu, độ bền… [18], [84], [123].

- Xử lý các màng: việc lựa chọn hệ đệm thích hợp để xử lý các màng
cũng tùy thuộc vào mục đích phát triển que thử. Mỗi hệ đệm thích hợp
cho các mẫu bệnh phẩm khác nhau [18], [84].
- Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp: cần có các bước tối ưu về pH dung
dịch đệm, nồng độ kháng thể thích hợp [8], [18], [84], [123].
- Tối ưu hóa nồng độ kháng thể trên que thử: trong từng trường hợp
cụ thể cần tối ưu nồng độ kháng thể để phản ứng xảy ra tốt nhất nhưng
lại tiết kiệm được nguồn nguyên liệu [18], [123].
1.5. Kháng thể kháng nọc rắn
Kháng thể kháng nọc rắn (KTKNR) có trong máu của động vật
miễn dịch như ngựa, thỏ và trong trứng gia cầm… được tinh chế qua
nhiều công đoạn [5], [10], [29], [39], [40]. Các KTKNR này dễ dàng
gắn vào các phân tử khác như các enzyme, các chất đánh dấu như
biotin, các chất huỳnh quang, các hạt nano… mà hoạt tính không bị
thay đổi sau khi gắn đồng thời vẫn giữ được sau thời gian dài bảo quản.
Do những đặc điểm trên KTKNR được ứng dụng nhiều trong chế tạo
các kít chẩn đoán và điều trị bệnh nhân rắn cắn [5], [29], [39], [60],
[74], [120].


7
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.1. Nghiên cứu chế tạo và tách chiết kháng thể kháng nọc rắn hổ
mang Naja atra
Thỏ đực 12 con cân nặng từ 2-2,5 kg chia làm 4 lô; gà mái
chuẩn bị đẻ trứng 12 con cân nặng từ 1,5-2 kg chia làm 4 lô; chuột nhắt
trắng 56 con cân nặng 20 ± 02 g/con tất cả đều khỏe mạnh.

Huyết thanh ngựa trước và sau khi gây miễn dịch với kháng
nguyên nọc rắn hổ mang N.atra do Đài loan cung cấp theo Đề tài Nghị
định thư giữa Việt nam và Đài loan.
2.1.1.2. Nghiên cứu đánh giá hiệu quả phát hiện nọc rắn hổ mang Naja
atra trên lâm sàng
Mẫu bệnh phẩm được thu thập ngay sau khi bệnh nhân nhập
viện và sau khi được điều trị bằng HTKNR đặc hiệu.
Thời gian thu thập: từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2014 tại Trung
tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai.
Trong số các mẫu bệnh phẩm thu thập được, tiến hành lựa chọn
các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán do rắn hổ mang
cắn.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Nọc tổng số của rắn hổ mang N.atra; Nọc tổng số của 4 loài rắn
độc khác (Hổ đất, Lục xanh, Chàm quạp và Hổ chúa).
- Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund không hoàn chỉnh; kháng thể
kháng IgG thỏ, kháng thể kháng IgY gà và kháng thể kháng IgG ngựa
gắn enzyme peroxidase; cơ chất OPD của các hãng Sigma, Thermo.


8
- Các loại màng sử dụng trên bộ kít: Màng hút mẫu (Sample pad);
Màng chứa kháng thể cộng hợp (Conjugate pad); Màng mao dẫn
(Nitrocellulose membrance); Màng hút trên (Absorbent pad) của các
hãng Ahlstrom, Whatman.
- Bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra do Bộ môn
Miễn dịch, Học viện Quân y nghiên cứu và chế tạo.
- Các hoá chất và vật tư tiêu hao khác dùng cho gây miễn dịch, phản
ứng ELISA và tối ưu hóa xét nghiệm nhanh.
- Hệ thống sắc ký, điện di, đo mật độ quang, hệ thống đo quang phổ

khả kiến và hệ thống sản xuất que thử nhanh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập và kiểm định chất lượng nọc rắn
2.2.2. Chuẩn bị kháng nguyên và gây miễn dịch
2.2.3. Phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh
2.2.4. Tách chiết và tinh sạch kháng thể
2.2.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của các kháng thể với các kháng nguyên nọc
rắn
2.2.6. Hấp phụ miễn dịch
2.2.7. Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể
2.2.8. Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp
2.2.9. Tối ưu hóa bộ xét nghiệm nhanh
2.2.10. Xác định thông số kỹ thuật của xét nghiệm
2.2.11. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu
bệnh phẩm
- Để kiểm tra giới hạn phát hiện của bộ kít trên lâm sàng chúng tôi
tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên và định lượng nọc rắn trong huyết thanh
của 35 bệnh nhân lúc nhập viện và sau khi được điều trị bằng HTKNR
bằng Bộ kít ELISA định lượng.


9
- So sánh độ phù hợp chẩn đoán của bộ kít với kết quả xét nghiệm
ELISA, xét nghiệm VDK của Đài loan và chỉ định sử dụng HTKNR
bằng hệ số KAPPA.
2.3. Xử lý số liệu
Sử dụng các thuật toán để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, tỷ lệ
phần trăm, các tứ phân vị (Q1, Q2, Q3), hệ số kappa dựa trên các phần
mềm Microsoft Office Excel và SPSS 22.0.
2.4. Đạo đức nghiên cứu

Đây là công trình nghiên cứu nhằm giải quyết khó khăn của các nhà
lâm sàng trong điều trị nhiễm độc do rắn hổ mang N.atra cắn, góp phần
nâng cao chất lượng điều trị, giảm chi phí và thời gian nằm điều trị cho
bệnh nhân. Thiết kế nghiên cứu là các thử nghiệm trong phòng thí
nghiệm và trên động vật, không can thiệp trên người. Vì vậy không
mang lại bất kỳ tác hại nào cho người bệnh. Các kết quả xét nghiệm chỉ
phục vụ cho mục tiêu nghiên cứu của đề tài.


10
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang
Naja atra từ thỏ và gà
3.1.1. Kết quả kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra
- Kết quả LD50 được tính theo phương pháp Karber-Behrens trên
chuột là 512,5µg/kg.
- Kết quả điện di: nọc độc của rắn hổ mang N.atra có chứa nhiều
protein có trọng lượng phân tử khác nhau, dao động từ (< 6 kDa) đến (>
188 kDa).
3.1.2. Biến động hiệu giá kháng thể trong quá trình gây miễn dịch
- Các lô thỏ, gà được gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn hổ
mang N.atra đều tạo ra kháng thể kháng nọc rắn, trước khi gây miễn
dịch không có cá thể thỏ và gà nào có kháng thể tự nhiên kháng nọc
rắn.
- Kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N.atra bắt đầu xuất hiện
sau mũi đầu tiên và tăng dần trong quá trình gây miễn dịch, đạt cao
nhất sau 4-5 lần tiêm.
3.1.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của các huyết thanh kháng nọc

rắn
- Kết quả xác định hiệu giá cho thấy, hiệu giá kháng thể đối với kháng
nguyên nọc rắn hổ mang N.atra có trong huyết thanh của các lô thỏ (T2,
T3) và lô gà (G3) sau 5 lần gây miễn dịch đều đạt từ 128.000 đến 256.000.
Trong huyết thanh ngựa của Đài loan là 256.000 đến 512.000.


11
3.1.4. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn với kháng
nguyên nọc rắn của các loài khác
- Có phản ứng chéo giữa kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn với nọc
rắn của các loài khác. Mức độc phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc
rắn với nọc rắn của các loài rắn cùng họ cao hơn so với các loài rắn khác
họ.
3.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY từ huyết
thanh và trứng gà
3.2.1. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể
- Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgG thỏ và IgG ngựa: có 2 đỉnh
protein, đỉnh 1 là các protein không bám vào cột, đỉnh 2 là IgG có trong
huyết thanh thỏ và ngựa. Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgY: có 2 đỉnh
protein, đỉnh 1 là các protein không bám vào cột, đỉnh 2 là IgY có trong
trứng gà.
3.2.2. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh
sạch
- Kết quả điện di cho thấy, các kháng thể sau tách chiết và tinh sạch
đều có độ tinh sạch cao.
3.2.3. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch
0,8

KT ngựa

0,7

KT thỏ

KT gà

OD 450 nm

0,6

KT ngựa thường
0,5

KT thỏ thường

0,4

KT gà thường

0,3
0,2
0,1
0
8

16

32

64

128

256

512

Blank

Độ pha loãng KT x 1000

Biểu đồ 3.6. Hoạt tính kháng thể sau khi tinh sạch


12
- Sau khi tinh sạch hoạt tính của các kháng thể vẫn có hoạt tính khá
mạnh với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra.
3.3. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể với các
kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất và hổ chúa
3.3.1. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể
bằng kỹ thuật Western blot
kDa

M

N. atra

N. k.

O. h. (100 mg)

188
98

kDa

M

N. atra

N. k.

O. h. (100 mg)

62

N. atra

N. k.

O. h. (100 mg)

49

49

38

38

28

M

62

62

49
38

kDa
188
98

188
98

28

28

17

17

17
14

14

14
6
3

6

1

6
3

2

3

3

(M: thang protein chuẩn, 1: kháng thể IgG thỏ, 2: kháng thể IgG ngựa, 3: kháng thể IgY gà)

Hình 3.3. Kiểm tra phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của các kháng thể
bằng kỹ thuật Western blot
- Kháng thể IgG thỏ phản ứng mạnh với các kháng nguyên < 6 kDa,
kháng thể IgY gà phản ứng mạnh với kháng nguyên > 188 kDa và < 6 kDa.
Trong khi đó, kháng thể IgG ngựa phản ứng với hầu hết các kháng nguyên
nọc rắn. Có phản ứng chéo của các kháng thể với nọc rắn hổ đất và hổ
chúa.
3.3.2. Hoạt tính và phản ứng đặc hiệu của các kháng thể với kháng
nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch

- Sau khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn hổ đất, hoạt tính của các
kháng thể bị giảm mạnh. Trong khi đó, sau khi hấp phụ với kháng
nguyên nọc rắn hổ chúa, hoạt tính của các kháng thể vẫn còn cao.


13
- Hầu hết các kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N.atra đã bị hấp
phụ bởi nọc rắn hổ đất. Trong khi đó, sau khi hấp phụ với nọc rắn hổ chúa,
các kháng thể còn lại vẫn phản ứng mạnh với các kháng nguyên đặc biệt là
những kháng nguyên < 6 kD, > 188 kDa, 14 và 49 – 62 kDa.
3.4. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể
3.4.1. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp ELISA
- Kết quả thử nghiệm trên ELISA cho thấy, sau khi được hấp phụ
với nọc rắn hổ chúa, cặp kháng thể IgG thỏ – IgG ngựa vẫn có khả năng
phát hiện được hầu hết các nồng độ nọc rắn hổ mang N.atra được thử
nghiệm, có ngưỡng phát hiện là 1 ng/ml. Cặp kháng thể IgG ngựa – IgG
thỏ và cặp kháng thể IgY gà – IgG ngựa có ngưỡng phát hiện là 3
ng/ml.
3.4.2. Kết quả lựa chọn cặp kháng thể bằng phương pháp nhúng trực
tiếp
- Kết quả thử nghiệm bằng phương pháp nhúng trực tiếp cho thấy,
khi sử dụng kháng thể IgG từ thỏ gắn hạt nano vàng và kháng thể IgG
từ ngựa nhỏ lên vạch test cho tín hiệu dương tính rõ nhất.
3.5. Kết quả cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng
3.5.1. Tối ưu hóa nồng độ kháng thể và pH dung dịch hạt nano vàng
- Khi thay đổi nồng độ kháng thể sử dụng cộng hợp từ 0,5 đến
4µg/250µl hạt nano vàng, nồng độ kháng thể tối ưu là 1,5 – 2µg (6 –
8µg cho 1 ml hạt nano vàng).
- Ở pH = 9 phản ứng cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ổn
định nhất, ở pH thấp 7 – 8 các hạt vàng có xu hướng vón vào nhau tạo

14
thành nhiều hạt có kích thước lớn (dung dịch có màu xanh tím). Khi cho
BSA vào dung dịch cộng hợp, phức hợp có độ ổn định cao hơn.
3.5.2. Kết quả cộng hợp và hoạt tính của kháng thể sau khi cộng
hợp với hạt nano vàng
- Biểu đồ phổ hấp phụ cho thấy, dung dịch vàng độc lập có đỉnh hấp
phụ tại bước sóng 540nm. Cũng ở bước sóng này, phức hợp kháng thể hạt nano vàng có đỉnh hấp phụ thấp hơn hơn và rộng hơn so với dung
dịch vàng độc lập.
- Kết quả dot-blot cho thấy, kháng thể sau khi cộng hợp với hạt nano
vàng vẫn còn hoạt tính đối với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra.
3.6. Kết quả tối ưu xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja
atra
3.6.1. Hệ đệm
- Màng được xử lý bằng đệm tris cho thời gian giải phóng nhanh
nhất, màng được xử lý bằng đệm tetraborat với PVP cho thời gian giải
phóng chậm nhất.

(1: đệm tris, 2: đệm phosphate; 3: đệm tetraborat với PVP)

Hình 3.10. Kết quả thử nghiệm lựa chọn hệ đệm
- Cả 3 hệ đệm đều cho kết quả dương tính. Tuy nhiên, hệ đệm 3 cho
kết quả tốt nhất, tín hiệu màu sắc tại vạch phát hiện rõ hơn khi so với
hai trường hợp còn lại.


15
3.6.2. Nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện

Hình 3.11. Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch phát hiện
- Ở nồng độ kháng thể là 1,5 mg/ml tín hiệu màu sắc tại vạch phát
hiện rõ hơn khi so với nồng độ 1 mg/ml. Khi tăng nồng độ kháng thể lên
2 mg/ml, tín hiệu màu sắc không có sự thay đổi rõ rệt.
3.6.3. Nồng độ kháng thể ở vạch chứng

Hình 3.12. Lựa chọn nồng độ kháng thể ở vạch chứng
- Ở nồng độ kháng thể là 1mg/ml tín hiệu màu sắc tại vạch chứng rõ
hơn so với nồng độ 0,5 mg/ml. Khi tăng nồng độ kháng thể lên 1,5
mg/ml, tín hiệu màu sắc không có sự thay đổi rõ rệt.
3.6.4. Nồng độ kháng thể cộng hợp

Hình 3.13. Lựa chọn nồng độ kháng thể cộng hợp vàng tối ưu
- Tín hiệu màu sắc ở cả hai vạch (chứng, phát hiện) tỷ lệ thuận với
nồng độ kháng thể cộng hợp trên quy thử. Ở độ pha loãng 5 lần dung


16
dịch cộng hợp (tương đương OD =10) tín hiệu màu sắc ở cả hai vạch là
rõ nhất, trong khi đó ở độ pha loãng 20 lần tín hiệu màu sắc ở khá mờ
nhạt và khó quan sát.
3.7. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện
nhanh
3.7.1. Giới hạn phát hiện

Hình 3.14. Thử nghiệm khả năng phát hiện nọc rắn ở các nồng độ khác nhau
của bộ kít xét nghiệm
- Với các mẫu nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch đệm bộ kít xét
nghiệm có giới hạn phát hiện là 5 ng/ml.
- Bộ xét nghiệm không có hiện tượng dương tính giả. Có 2 mẫu âm

tính giả (nồng độ 5 ng/ml pha trong huyết thanh và nước tiểu).
3.7.2. Phản ứng chéo
- Bộ xét nghiệm có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất ở nồng độ 20
ng/ml, không có phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh và chàm
quạp ở nồng độ được thử nghiệm.
3.8. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang của bộ kít trên lâm
sàng
3.8.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
- Có đến 50% số bệnh nhân có thời gian nhập viện từ 2 đến 13,75
giờ, số giờ nhập viện sau khi bị rắn cắn trung bình là 9.8 giờ. Nhập viện
nhất là 1 giờ và muộn nhất là 120 giờ (5 ngày).
- Trong số 113 bệnh nhân lựa chọn lấy mẫu nghiên cứu, có 40 bệnh
nhân được chẩn đoán do rắn hổ mang N.atra cắn, 5 bệnh nhân được


17
chẩn đoán do rắn hổ mang N.kaouthia cắn. Còn lại 68 bệnh nhân được
chẩn đoán do rắn hổ mang cắn nhưng không rõ loài.
3.8.2. Kết quả định lượng và phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng
- Kết quả định lượng nọc rắn trong huyết thanh của 35 bệnh nhân lúc
nhập viện cho thấy nồng độ nọc rắn có dải nồng độ từ 2,81 – 159,12
ng/ml; trong đó 50% số trường hợp có nồng độ nọc rắn nằm trong
khoảng từ 8,21 – 58,28 ng/ml.
- Tỷ lệ xét nghiệm dương tính đối với mẫu huyết thanh là 69,3%;
dịch vết cắn là 89,2% và nước tiểu là 60%. Trong đó, tỷ lệ xét nghiệm
dương tính đối với các mẫu huyết thanh, dịch vết cắn và nước tiểu trong
3 giờ đầu lần lượt là 67,85%; 95,83% và 53,33%.
- Khi so sánh với kết quả xét nghiệm của bộ kít với kết quả xét
nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm huyết thanh, hai xét
nghiệm cho kết quả với độ phù hợp khá (KAPPA = 0,78).

- Khi so sánh với kết quả xét nghiệm của bộ kít với kết quả xét
nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm dịch vết cắn, hai xét
nghiệm cho kết quả với độ phù hợp cao (KAPPA = 0,84).
- Khi so sánh với kết quả xét nghiệm của bộ kít với kết quả xét
nghiệm VDK của Đài loan trên mẫu bệnh phẩm huyết thanh, hai xét
nghiệm cho kết quả với độ phù hợp vừa (KAPPA = 0,41).
- Số trường hợp dương tính có chỉ định sử dụng HTKNR là 75/79
(94,93%), số trường hợp âm tính có chỉ định HTKNR là 15/34
(44,12%). Kết quả xét nghiệm của bộ kít với chỉ định sử dụng HTKNR
có độ phù hợp vừa (KAPPA = 0,56)
- Khi so sánh với kết quả xét nghiệm ELISA trên 70 mẫu huyết
thanh trước và sau khi điều trị, bộ kít có khả năng phát hiện nọc rắn hổ
mang khá tốt với độ phù hợp khá (KAPPA = 0,71).


18
CHƯƠNG 4
BÀN LUẬN
4.1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra
từ thỏ và gà
Kết quả lựa chọn liều kháng nguyên, cách thức gây miễn dịch cho
thấy các lô thỏ và gà được gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn ở
các liều khác nhau đều tạo ra được kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn
với hiệu giá cao. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, có hiện tượng phản
ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn với nọc của các loài rắn
thường gặp khác. Cụ thể là phản ứng chéo giữa kháng thể với nọc rắn
hổ đất và hổ chúa mạnh hơn so với nọc rắn chàm quạp và lục xanh. Kết
quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Đỗ Khắc Đại (2013) và
Lê Văn Đông (2003) [5], [42].
Để tinh sạch kháng thể IgG và IgY kháng nọc rắn, chúng tôi sử dụng

phối hợp nhiều kỹ thuật tinh sạch như: kỹ thuật tủa, kỹ thuật sắc ký lọc
gel, kỹ thuật sắc ký ái lực, kỹ thuật sắc ký miễn dịch [5], [6], [20], [22],
[61]. Kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di, kết quả cho thấy, với các
phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng thể (IgG, IgY) mà chúng tôi
áp dụng có hiệu suất tốt, thu được kháng thể có độ tinh sạch và hoạt tính
cao với kháng nguyên nọc rắn. Với hoạt tính như vậy, các kháng thể
này đủ điều kiện để thử nghiệm và chế tạo bộ kít.
4.2. Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu bộ kít phát hiện nhanh
nọc rắn hổ mang Naja atra
Kết quả western blot cho thấy, độ đặc hiệu với kháng nguyên nọc
rắn hổ mang N.atra có sự khác nhau giữa các kháng thể, sự khác nhau
này có thể do sự khác biệt giữa các loài về khả năng tạo đáp ứng miễn
dịch. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Brunda và cộng sự


19
(2006) [29]. Sự khác biệt này có ý nghĩa rất quan trọng khi giúp lựa
chọn cặp kháng thể để chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn, do bộ kít
dựa trên cơ chế sandwich.
Khi tiến hành hấp phụ miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn hổ đất,
do có nhiều thành phần giống nhau trong nọc độc nên hầu hết các kháng
thể đã bị hấp phụ, kiểm tra hoạt tính kháng thể kiểm tra trên ELISA là
rất thấp. Trong khi đó, khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn hổ chúa,
hoạt tính của các kháng thể với nọc rắn hổ mang N.atra vẫn còn khá
cao. Dựa vào những kết quả trên có thể thấy, để chế tạo que thử nhanh
phát hiện nọc rắn hổ mang N.atra có độ nhạy cao, chỉ nên hấp phụ miễn
dịch đối với nọc rắn hổ chúa. Sau khi hấp phụ với nọc rắn hổ chúa, thử
nghiệm trên ELISA và trực tiếp trên que thử cho thấy, phản ứng cho tín
hiệu tốt nhất khi ghép cặp hai kháng thể từ thỏ và ngựa.
4.3. Tối ưu hóa bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra

Công đoạn đầu tiên của tối ưu hóa bộ kít phát hiện nhanh dựa trên
nguyên lý sắc ký miễn dịch là lựa chọn nguyên vật liệu. Việc lựa chọn
này tùy thuộc vào tính sẵn có, mục đích của xét nghiệm. Đối với màng
hút mẫu, với yêu cầu có thể chứa được lượng mẫu thử từ 80 – 90 µl và
tốc độ dẫn mẫu chậm nên chúng tôi lựa chọn màng Ahlstrom prefilter
142. Đối với màng chứa kháng thể cộng hợp, chúng tôi đưa ra yêu cầu
lựa chọn một loại màng có thể chứa được thể tích kháng thể cộng hợp
tối đa từ 2 – 3 µl/cm2. Chúng tôi thấy màng Ahlstrom 6613 đáp ứng
được yêu cầu này. Cuối cùng là lựa chọn màng mao dẫn, để tạo thuận
lợi cho dòng chảy của chất lỏng màng cần có kích thước lỗ > 3 µm,
chúng tôi lựa chọn màng Whatman AE98.
Trong các công đoạn của quy trình tối ưu que thử nhanh, gắn kháng
thể với hạt nano vàng là quan trọng nhất. Việc tối ưu hóa nồng độ kháng
thể cộng hợp hạt nano vàng sẽ giúp cho lượng kháng thể còn dư trong


20
dung dịch ở mức tối thiểu. Ngoài ra, pH của dung dịch hạt nano vàng
cũng quyết định đến phản ứng cộng hợp. Ở thí nghiệm này, chúng tôi lựa
chọn gắn ở pH = 9 kết hợp với ủ lắc đã cho kết quả gắn khá tốt. Kết quả
cộng hợp được kiểm tra bằng máy đo quang phổ khả kiến, phức hợp
kháng thể - hạt nano vàng có độ hấp phụ thấp hơn so với hạt vàng độc lập
tuy nhiên đỉnh hấp phụ lại không có sự thay đổi, điều đó đồng nghĩa với
việc kháng thể đã gắn lên bề mặt các hạt nano vàng và các hạt nano vàng
không bị kết tập với nhau. Cuối cùng, để kiểm tra hoạt tính của kháng thể
sau khi cộng hợp với hạt nano vàng, chúng tôi sử dụng kỹ thuật dot-blot,
kết quả thử nghiệm cho thấy sau khi liên kết với hạt nano vàng kháng thể
vẫn có hoạt tính với nọc rắn hổ mang N.atra, điều đó khẳng định phức
hợp kháng thể hạt nano vàng có thể được sử dụng để tối ưu các công
đoạn kế tiếp.

Ở các công đoạn tiếp theo, sau khi đã lựa chọn được màng chứa
kháng thể cộng hợp, để màng có thể giải phóng gần như hoàn toàn
lượng kháng thể chứa ở trên một cách từ từ thì màng cần được ngâm
vào một dung dịch đệm phù hợp. Qua thử nghiệm chúng tôi lựa chọn hệ
đệm tetraborat với PVP cho thời gian giải phóng kháng thể cộng hợp là
115 giây, hệ đệm này cho tín hiệu màu sắc rõ nhất ở cả hai vạch (T và
C). Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu [8], [18], [59].
Để lựa chọn nồng độ kháng thể, chúng tôi áp dụng nguyên tắc “sử
dụng hàm lượng tối thiểu các kháng thể để tạo được bộ kít có tính năng
tối ưu”. Kết quả tối ưu cho thấy, đối với kháng thể ở vạch phát hiện
nồng độ kháng thể thấp nhất cho tín hiệu tốt nhất là 1,5 mg/ml. Đối với
kháng thể ở vạch chứng nồng độ kháng thể thấp nhất cho tín hiệu tốt
nhất là 1mg/ml. Với dung dịch cộng hợp, chúng tôi điều chỉnh về OD =
10, đây là OD thấp nhất cho tín hiệu màu sắc tốt nhất và không xảy ra
các phản ứng không đặc hiệu.


21
4.4. Thử nghiệm bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra
trên in vitro
Đối với các thông số kỹ thuật của bộ kít sau khi tối ưu, thử nghiệm cho
thấy bộ kít có giới hạn phát hiện là 5 ng/ml (pha trong đệm), đối với các
mẫu nọc rắn pha trong huyết thanh và nước tiểu bộ kít có giới hạn phát
hiện là 10 ng/ml. Bộ kít có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất ở nồng độ 20
ng/ml. Phản ứng chéo xảy ra do có sự giống nhau về thành phần nọc độc
giữa hai loài, sự giống nhau này cũng đã được thực tế lâm sàng chứng
minh, những bệnh nhân bị rắn hổ mang N.atra và rắn hổ đất N.kaouthia
cắn đều có những triệu chứng tương tự [4], [13]. Nghiên cứu về các chất
độc có trong nọc rắn của hai loài cũng cho những nhận xét tương tự [1],
[2], [14], [17].

4.5. Đánh giá khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang trên lâm sàng
Trong số các bệnh nhân được lựa chọn lấy mẫu, có đến 50% số bệnh
nhân có thời gian nhập viện từ 2 đến 13,75 giờ, số giờ nhập viện sau khi
bị rắn cắn trung bình là 9,8 giờ. Trong 45 trường hợp bắt được rắn, có
đến 40 bệnh nhân mang rắn hổ mang N.atra (chiếm 89%) và có 5 bệnh
nhân mang rắn hổ mang N.kaouthia. Với tỷ lệ 89%, rắn hổ mang N.atra
vẫn là thủ phạm gây ra phần lớn các vết cắn. Kết quả này hoàn toàn phù
hợp với các nghiên cứu cũng như số liệu thống kê trước đó [3], [13],
[14]. Cũng trong số những bệnh nhân này, có rất nhiều bệnh nhân nhập
viện trong 24 giờ đầu, điều đó có nghĩa các mẫu xét nghiệm được thu
thập rất sớm, rất có ý nghĩa trong thử nghiệm bộ xét nghiệm, phù hợp
với khuyến cáo của tác giả Hung D.Z đó là tỷ lệ xét nghiệm dương tính
với nọc rắn cao nhất trong 24 giờ đầu [59]. Kết quả định lượng cho thấy
nồng độ nọc rắn có dải nồng độ từ 2,81 – 159,12 ng/ml. Với dải nồng
độ trên, các mẫu bệnh phẩm rất phù hợp để đánh giá khả năng phát hiện
nọc rắn của bộ kít phát hiện nhanh.
Khi chúng tôi sử dụng bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn trên các mẫu
bệnh phẩm lâm sàng, bộ kít cho kết quả xét nghiệm dương tính đối với


22
mẫu huyết thanh là 69,9%, dịch vết cắn là 89,2% và nước tiểu là 60%.
Trong đó, tỷ lệ xét nghiệm dương tính đặc biệt cao trong 3 giờ đầu. Đối
với dịch vết cắn, tỷ lệ dương tính cao là điều dễ hiểu do nồng độ nọc
độc ở đây cao hơn ở trong máu, nhiều trường hợp vết cắn không sâu
hoặc chỉ là những vết xước nhẹ và đa số bệnh nhân thường garô trước khi
đến viện.
Theo Đỗ Khắc Đại (2013), chẩn đoán xác định loài rắn trên lâm sàng
hầu hết không có tiêu chuẩn vàng. Do đó không thể xác định được độ
nhạy và độ đặc hiệu của một bộ kít xét nghiệm [5]. Sử dụng hệ số

KAPPA để đánh giá độ phù hợp chẩn đoán trong giữa các phương pháp
chẩn đoán, với chỉ định sử dụng HTKNR là phương pháp khoa học nhất
để đánh giá hiệu quả phát hiện nọc rắn của bộ kít do chúng tôi chế tạo.
So sánh kết quả thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm với kết quả xét
nghiệm sử dụng bộ kít VDK của Đài loan cho thấy bộ kít có độ phù hợp
cao nhất khi thử với dịch vết cắn (KAPPA = 0,84). Khi thử với huyết
thanh và nước tiểu, kết quả có độ phù hợp khá và vừa với hệ số KAPPA
lần lượt là 0,78 và 0,41. Kết quả so sánh có sự khác biệt có thể do cặp
kháng thể sử dụng khác nhau, có hay không việc sử dụng phương pháp
hấp phụ miễn dịch và thời điểm thử nghiệm giữa hai xét nghiệm. Với
những trường hợp có chỉ định sử dụng HTKNR, chúng tôi nhận thấy kết
quả xét nghiệm dương tính chiếm 94,93% (75/79 trường hợp), số
trường hợp âm tính có chỉ định sử dụng HTKNR là 15/34 (44,12%).
Giải thích cho những trường hợp có chỉ định sử dụng HTKNR nhưng
kết quả xét nghiệm âm tính chỉ có thể do những trường hợp này nhập
viện muộn nên nồng độ nọc rắn trong huyết thanh đã giảm xuống ở mức
thấp và rất khó phát hiện. Độ phù hợp khi so với kết quả xét nghiệm
ELISA chưa cao chủ yếu là do xét nghiệm ELISA mà chúng tôi sử dụng
là xét nghiệm định lượng có giới hạn phát hiện là 0,1ng/ml.


23
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu thu được và những phân tích nêu trên. Đề
tài rút ra các kết luận sau:
1. Đã chế tạo được bộ kít xét nghiệm phát hiện nhanh nọc rắn hổ
mang N.atra với các thông số kỹ thuật sau:
- Bộ kít xét nghiệm có khả năng phát hiện được nọc rắn chuẩn pha
trong dung dịch đệm là 5 ng/ml, trong huyết thanh và nước tiểu là 10
ng/ml.

- Bộ kít không có phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh và
chàm quạp. Có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất ở nồng độ 20 ng/ml.
2. Qua phân tích 148 mẫu huyết thanh, 20 mẫu nước tiểu, 37 mẫu
dịch vết cắn của 113 bệnh nhân được chẩn đoán do rắn hổ mang
cắn điều trị tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai cho thấy,
hiệu quả phát hiện nọc rắn hổ mang trong các bệnh phẩm lâm sàng
như sau:
- Tỷ lệ xét nghiệm dương tính đối với mẫu huyết thanh là 69,9%;
dịch vết cắn là 89,2% và nước tiểu là 60%.
- Khi so sánh với kết quả xét nghiệm VDK của Đài loan trên các
mẫu bệnh phẩm là dịch vết cắn, huyết thanh và nước tiểu bộ kít có độ
phù hợp chẩn đoán với hệ số KAPPA lần lượt là 0,84; 0,78 và 0,41. Kết
quả xét nghiệm của bộ kít với chỉ định sử dụng HTKNR có độ phù hợp
vừa (KAPPA = 0,56), so với kết quả xét nghiệm ELISA bộ kít cũng có
khả năng phát hiện nọc rắn hổ mang khá tốt với độ phù hợp khá
(KAPPA = 0,71).