PHÂN TÍCH một số CHỈ TIÊU VI SINH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG AN TOÀN vệ SINH THỰC PHẨM ở các mẫu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG

VŨ THỊ CHÂM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH ĐÁNH GIÁ CHẤT
LƯỢNG AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM Ở CÁC MẪU
TIẾT CANH TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI DƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM Y HỌC

HẢI DƯƠNG, NĂM 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG

VŨ THỊ CHÂM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH ĐÁNH GIÁ CHẤT
LƯỢNG AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM Ở CÁC MẪU
TIẾT CANH TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI DƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM Y HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.BS. TRẦN QUANG CẢNH

HẢI DƯƠNG, NĂM 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận văn này là đề tài nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi, được thực
hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trần Quang Cảnh.
Các số liệu, những kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận
này trung thực và chưa được công bố dưới bất cứ hình thức nào.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Hải Dương, ngày tháng
Sinh viên

Vũ Thị Châm

năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, sau một thời gian với sự nỗ
lực cố gắng của bản thân, tôi cũng đã nhận được không ít sự giúp đỡ, quan
tâm và động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết,tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Kỹ
thuật Y tế Hải Dương là môi trường giúp tôi học tập được nhiều kiến thức và
khoa Xét nghiệm đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bài khóa luận này cùng
với sự góp ý chân thành của thầy cô trong Hội đồng khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới thầy TS.Trần Quang

Cảnh đã hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận.
Tôi cũng chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Xét nghiệm đặc
biệt là Labo An toàn Vệ sinh Thực phẩm trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải
Dương đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi hết lòng cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người đã
giúp đỡ tôi về vật chất cũng như về tinh thần và là động lực rất lớn để tôi vượt
qua khó khăn trong thời gian làm khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hải Dương, ngày 3 tháng 7 năm 2015
Sinh viên

Vũ Thị Châm


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATTP

:

An toàn thực phẩm

ATVSTP

:

An toàn vệ sinh thục phẩm

E.coli

:

Escherichia coli

KL

:

Khuẩn lạc

S.aureus

:

Staphylococcus aureus

S.suis

:

Streptococcus suis

VSV

:

Vi sinh vật


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tình hình ngộ độc do tiết canh ............................................................... 3
1.1.1. Trong nước ........................................................................................... 3
1.1.2. Trên địa bàn Hải Dương ...................................................................... 3
1.2. Tầm quan trọng của an toàn vệ sinh thực phẩm ..................................... 3
1.3. Một số chỉ tiêu vi sinh có trong tiết canh................................................ 4
1.3.1. Coliform ............................................................................................... 4
1.3.2. Escherichia coli .................................................................................... 5
1.3.3. Salmonella ............................................................................................ 6
1.3.4. Staphylococcus aureus ......................................................................... 8
1.3.5.Streptococcus suis (liên cầu lợn) ......................................................... 9
1.4. Các con đường VSV nhiễm vào tiết canh và giới hạn cho phép các chỉ
tiêu vi sinh trong thực phẩm. ....................................................................... 11
1.4.1. Các con đường nhiễm VSV vào tiết canh .......................................... 11
1.4.2. Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm ............... 12
CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 13
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 13
2.1.1. Mẫu tiết canh...................................................................................... 13
2.1.2. Các chỉ tiêu xét nghiệm vi sinh .......................................................... 13
2.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 13
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 13
2.2.2. Môi trường, hóa chất .......................................................................... 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu. ..................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu .................................................... 15
2.3.2. Phương pháp định lượng Coliforms – kỹ thuật đếm khuẩn lạc ......... 15
2.3.3. Phương pháp định lượng E.coli dương tính β – glucuronidase ......... 18


2.3.4. Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch ............................ 21

2.3.5. Phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng coagulase dương
tính (S.aureus). ............................................................................................. 25
2.3.6. Quy trình phân lập, xác định S.suis. .................................................. 29
2.3.7. Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang và hồi cứu. ............................ 31
2.3.8. Cỡ mẫu và chọn mẫu. ........................................................................ 31
2.3.9. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu............................................... 32
2.3.10. Biện pháp hạn chế sai số. ................................................................. 32
2.3.11. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. ................................................... 33
2.3.12. Đạo đức nghiên cứu. ........................................................................ 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 34
3.1. Một số chỉ tiêu vi sinh trong các mẫu tiết canh .................................... 34
3.2. Mức độ ô nhiễm VSV của từng loại vi khuẩn trong các mẫu tiết canh
nghiên cứu .................................................................................................... 36
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................. 38
4.1. Thông tin chung .................................................................................... 38
4.2. Một số chỉ tiêu vi sinh trong tiết canh .................................................. 38
4.3. So sánh mức độ ô nhiễm giữa các loại tiết canh. .................................. 42
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 46
PHỤ LỤC ............................................................................................................


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Giới hạn cho phép các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm ................... 12
Bảng 2.1. Cỡ mẫu được chọn có chủ đích với số lượng như sau: .................. 31
Bảng 2.2. Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu VSV trong mẫu tiết canh........ 32
Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm Coliforms, E.coli, S.aureus trong tất cả các mẫu tiết
canh ................................................................................................................. 34
Bảng 3.2: Tỷ lệ nhiễm Salmonella và S.suis trong từng loại tiết canh ........... 34
Bảng 3.3: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Coliforms, E.coli, S.aureus trong từng loại

tiết canh ........................................................................................................... 35
Bảng 3.4: Tỷ lệ đồng thời vượt hai hoặc ba chỉ tiêu vi khuẩn Coliforms, E.coli
và S.aureus trong tất cả các mẫu tiết canh ...................................................... 35
Bảng 3.5: Mức độ ô nhiễm của Coliforms trong các mẫu tiết canh nghiên cứu.
......................................................................................................................... 36
Bảng 3.6: Mức độ ô nhiễm của E. coli trong các mẫu tiết canh nghiên cứu. . 36
Bảng 3.7: Mức độ ô nhiễm của S.aureus trong các mẫu tiết canh nghiên cứu.
......................................................................................................................... 37


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. KL Salmonella trên môi trường XLD ............................................. 22
Hình 2.2. KL Salmonella trên môi trường HE ................................................ 22
Hình 2.3. KL Salmonella trên môi trường BPLS ............................................ 23
Hình 2.4. Hình thể KL và vi khuẩn S. suis trên thạch máu ............................. 31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội thì
đời sống của con người cũng ngày càng được nâng cao. Do đó, ATVSTP
được coi là vấn đề quan trọng và được đặt lên hàng đầu. Một trong những yếu
tố dẫn đến ngộ độc thực phẩm là thói quen ăn uống không đảm bảo vệ sinh
của người dân như ăn tiết canh, gỏi,... Mặc dù đã được Bộ y tế khuyến cáo
nhưng nhiều thói quen của người dân vẫn chưa được thay đổi và dẫn đến
nhiều vụ ngộ độc thực phẩm [12].
Ở nước ta, mỗi năm có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với
7.000-10.000 người và 100-200 ca tử vong, trong đó nguyên nhân do VSV
chiếm 33-49% [11].
Tiết canh là một món ăn ưa thích của người dân Việt Nam từ đồng
bằng tới miền núi và đã có từ rất lâu. Hiện nay, tiết canh đang được bày bán

nhiều ở khắp nơi. Hầu hết người dân Việt Nam biết đến tiết canh như một
món ăn ngon. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của trung tâm dinh dưỡng thành
phố Hồ Chí Minh thì món tiết canh chứa nhiều sắt nhưng sắt trong tiết canh
cơ thể không hấp thụ được vì dễ bị oxy hóa thành Fe3+ khi chế biến. Ngoài ra,
trong tiết canh có chứa rất nhiều chất đạm, ít chất béo và đường, các loại
vitamin A, B2, Ca, P là môi trường thuận lợi cho nhiều mầm bệnh gây bệnh
phát triển như giun sán, các loại vi khuẩn thường gặp như: S.aureus, E.coli,
Salmonella, đặc biệt là liên cầu lợn [11]. Do đó, những người dân có thói
quen ăn tiết canh có nguy cơ bị ngộ độc rất cao và có thể dẫn đến tử vong.
Có rất nhiều vụ ngộ độc do ăn tiết canh như: ở Lào Cai với hơn 30
người bị ngộ độc tiết canh ngựa và ở huyện Đắk GLong cũng xảy ra vụ ngộ
độc tập thể do ăn tiết canh lợn với hơn 20 người bị nạn [13].
Để người dân ý thức hơn và loại bỏ thói quen ăn tiết canh thì việc tìm
hiểu về nguyên nhân dẫn đến ngộ độc do các VSV như: Coliforms, E.coli,
Salmonella, tụ cầu vàng, liên cầu lợn và mức độ nguy hiểm của chúng gây ra
1


là rất cần thiết. Tại thành phố Hải Dương, chưa có nghiên cứu nào thực hiện
phân tích các chỉ tiêu vi sinh liên quan đến ngộ độc thực phẩm do ăn tiết canh.
Trong đề tài này, nghiên cứu tập trung xác định: E.coli, S.aureus, Salmonella,
Coliforms và S.suis là một trong số các chỉ tiêu quy định trong kiểm tra VSV
đã được ghi danh trong mục tiêu chuẩn vi sinh thực phẩm theo Quyết định
867 của Bộ Y tế năm 1998 [8]. Chính vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Phân tích một số chỉ tiêu vi sinh đánh giá chất lượng an toàn vệ sinh
thực phẩm ở các mẫu tiết canh trên địa bàn thành phố Hải Dương” với
mục tiêu nghiên cứu như sau:
1. Xác định một số chỉ tiêu vi sinh đánh giá chất lượng an toàn vệ
sinh thực phẩm ở các mẫu tiết canh trên địa bàn thành phố Hải Dương.
2. So sánh mức độ ô nhiễm VSV giữa các loại tiết canh trên địa bàn

thành phố Hải Dương.

2


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ngộ độc do tiết canh
1.1.1. Trong nước
- Ngày 11-3-2013, ở xã Bản Lầu huyện Mường khương có 50 người bị
ngộ độc tiết canh lợn trong đó có 30 người bị ngộ độc nặng [12].
- Tháng 11 và tháng 12/2012 có hơn 10 người tại xã Gia Phú, huyện
Bảo Thắng và hơn 20 người là công nhân thi công công trình ở khu vực xã
Nam Cường, thành phố Lào Cai cũng bị ngộ độc do ăn tiết canh lợn nhiễm
khuẩn [13].
- Vụ ngộ độc thực phẩm tại bếp ăn tập thể của một gia đình tại Lào Cai
với tổng số 53 người ăn (có 22 người ngộ độc) được Chi cục An toàn vệ sinh
thực phẩm Lào Cai kết luận là do căn nguyên vi khuẩn tụ cầu vàng, E.coli
trong tiết canh lợn và canh rau ngót nấu tiết [12].
- Sáng 4/12, tại thôn 4, xã Đắk P’Lao, huyện Đắk GLong xảy ra vụ ngộ
độc tập thể do ăn tiết canh lợn với hơn 20 người bị nạn, hầu hết là thanh niên,
trong đó 10 người bị ngộ độc nặng phải đưa đi cấp cứu tại bệnh viện [13].
- Ngày 17/09/2012 Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương xác nhận chỉ trong
vòng 1 tháng có 3 bệnh nhân tử vong do ăn tiết canh lợn [14].
1.1.2. Trên địa bàn Hải Dương
- Ngày 29/10/2011 bệnh viện huyện Nam Sách đã tiếp nhận, điều trị 5
người bị ngộ độc do ăn tiết canh lòng lợn ở xã Nam Đồng [14].
- Ngày 27/1/2014 sau 1 tuần lấy ngẫu nhiên 10 mẫu tiết canh trên địa
bàn thành phố Hải Dương để xét nghiệm, Chi cục ATVSTP đưa ra kết quả tất
cả các mẫu tiết canh đều nhiễm vi khuẩn E.coli và S.aureus [14].

1.2. Tầm quan trọng của an toàn vệ sinh thực phẩm
Chất lượng ATVSTP là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện
nay. Thực phẩm là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng cho sự phát triển của cơ
3


thể, đảm bảo cho sức khỏe con người nhưng đồng thời cũng là nguồn gây bệnh
nếu không đảm bảo vệ sinh. Về lâu dài, thực phẩm không những tác động
thường xuyên tới sức khỏe con người mà còn ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống.
Sử dụng các thực phẩm không đảm bảo vệ sinh trước mắt có thể bị ngộ độc cấp
tính với các triệu chứng dễ nhận thấy, nhưng vấn đề nguy hiểm là sự tích lũy
dần các chất độc hại trong cơ thể và sau một thời gian mới biểu hiện bệnh.
Ngoài ra, ATVSTP cũng tác động không ít tới kinh tế. Đối với Việt
Nam và nhiều nước đang phát triển khác, lương thực, thực phẩm là loại sản
phẩm chiến lược, ngoài ý nghĩa kinh tế còn có ý nghĩa chính trị, xã hội rất
quan trọng. Chất lượng ATVSTP không đảm bảo gây ra những thiệt hại như:
- Thiệt hại do các bệnh gây ra từ thực phẩm đối với cá nhân là chi phí
khám bệnh, phục hồi sức khỏe, chi phí do chăm sóc người bệnh, sự mất thu
nhập do phải nghỉ làm việc,...
- Đối với nhà sản xuất, đó là những chi phí do phải thu hồi, lưu giữ sản
phẩm, huỷ hay loại bỏ sản phẩm, những thiệt hại do mất lợi nhuận do thông
tin quảng cáo... và thiệt hại lớn nhất là mất lòng tin của người tiêu dùng.
- Ngoài ra còn có các thiệt hại khác như phải điều tra, khảo sát, phân tích,
kiểm tra độc hại, giải quyết hậu quả.
Do vậy, vấn đề đảm bảo ATVSTP để phòng các bệnh gây ra từ thực
phẩm có ý nghĩa thực tế rất quan trọng trong sự phát triển kinh tế xã hội, bảo
vệ môi trường sống của các nước đã và đang phát triển, cũng như nước ta [13].
1.3. Một số chỉ tiêu vi sinh có trong tiết canh
1.3.1. Coliform
1.3.1.1. Đặc điểm chung

Coliforms là nhóm sinh vật chỉ thị mức độ ATVSTP vì số lượng nhất
định hiện diện trong thực phẩm, trong nước hay trong mẫu môi trường được
coi như dấu hiệu chỉ thị khả năng có mặt của các VSV gây bệnh khác [5].
1.3.1.2. Phân loại
4


Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, Coliforms được chia thành 2 nhóm nhỏ
là Coliforms và Coliforms phân. Coliforms phân được quan tâm nhiều hơn và
có nguồn gốc từ người, động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia
(bao gồm: E.coli), Klebsiella, Enterobacter.
Coliforms có nguồn gốc từ phân phát triển nhanh khoảng thời gian 16
giờ trong môi trường dinh dưỡng ở 44oC.
Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc từ thủy
sinh, hay từ đất, mọc nhanh ở 4oC trong 3- 4 ngày và trong 10oC trong 1 ngày.
Loại vi khuẩn này không mọc ở 41oC và ở 44oC ức chế hoàn toàn [8].
1.3.1.3. Đặc điểm sinh vật hóa học
Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có phản
ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β – galactosidase. Vi khuẩn này
có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính
bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có khả năng lên mên lactose sinh acid và
sinh hơi ở 37oC trong 24- 48h [8].
1.3.1.4. Sự hiện diện của Coliforms
Coliforms là nhóm vi khuẩn rất phổ biến, có mặt ở khắp mọi nơi, có thể
tìm thấy cả trong đất, da, nước sông, nước ao hồ, rau cải và trong phân động vật.
Sự có mặt của Coliforms trong nước hay rau được xem là một chỉ số về
sự tinh khiết của nước hay rau.
Nhưng chỉ số này cũng không đáng tin cậy, bởi vì Coliform có thể sống
sót trong nước ấm, nhất là ở những vùng nhiệt đới như nước ta; do đó, sự hiện
diện của Coliform trong nước không hẳn có nghĩa là nước bị nhiễm phân [13].

1.3.2. Escherichia coli
1.3.2.1. Hình thể
Trực khuẩn E.coli có hình thẳng, kích thước dài ngắn khác nhau, trung
bình dài 2-3 µm, rộng 0,5 µm. Ở môi trường không thích hợp, trực khuẩn có

5


thể dài như sợi chỉ. Một số ít chủng có vỏ, hầu hết có lông và di động, không
sinh nha bào, bắt màu gram âm.
1.3.2.2. Sức đề kháng
Thuốc sát khuẩn thông thường như nước Javen 1/200, phenol 1/200
giết chết vi khuẩn này sau 2-4 phút, ở nhiệt độ 55oC vi khuẩn này chết sau 1
giờ, 60oC chết sau 30 phút.
1.3.2.3. Tính chất sinh vật hóa học
- E.coli len men nhiều loại đường và sinh hơi như glucose, manitol,
lactose, ngoại trừ loại EIEC lactose (-); Thử nghiệm MR (+), VP (-), H2S (-).
- Thử nghiệm Urease (-), Indole (+); Citratsimmons (-).
1.3.2.4. Khả năng gây bệnh
- Nhóm ETEC: gây bệnh do ngoại độc tố LT (Labiletoxin). LT là loại
độc tố ruột giống độc tố của phảy khuẩn tả. Loại độc tố náy bám vào thụ thể ở
ruột làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết ion Cl- và HCO3-.
- Nhóm EIEC: gây bệnh do có khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại
tràng, gây bệnh gây bệnh giống trực khuẩn lỵ.
- Nhóm EAEC: gây bệnh do bám vào niêm mạc làm tổn thương chức
năng ruột.
- Nhóm EHEC: làm tổn thương xuất huyết ở ruột, độc tố của nhóm này
có cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác động giống ngoại độc tố của S.shiga.
1.3.2.5. Sự hiện diện của E.coli
Trong tự nhiên: có trong đường ruột của các động vật nhai lại đặc biệt là

trâu, bò, cừu. Trong thực phẩm: có trong rau cải, thịt, các sản phẩm từ sữa [4].
1.3.3. Salmonella
1.3.3.1. Hình thể
Salmonella là những trưc khuẩn có kích thước trung bình dài 3µm, rộng
0,5µm, có nhiều lông xung quanh thân, rất di động, không có vỏ. Không sinh
nha bào, nhuộm bắt màu gram âm.
6


1.3.3.2. Sức đề kháng
Trực khuẩn Salmonella bị chết ở nhiệt độ 50oC/1 giờ hoặc 100oC/5
phút. Với các thuốc sát khuẩn thông thường, trực khuẩn Salmonella dễ bị tiêu
diệt. Trong nước, trực khuẩn Salmonella sống được 2- 3 tuần, trong nước đá
và trong phân sống được 2- 3 tháng.
1.3.3.3. Tính chất sinh vật hóa học
- Lên men đường glucose kèm theo sinh hơi (trừ S.typphi), không lên
men đường lactose, sinh H2S (trừ S.paratiphy A sinh chậm).
- Lên men đường manitol, di động.
- LDC (+), trừ S.paratyphi A.
- MR (+),VP (-) và citratsimmons (+/-).
- Indol (-), ureas (-), ONPG (-).
1.3.3.4. Độc tố
- Nội độc tố: nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột lang
hoặc chuột nhắt liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết. Ruột non chuột
xung huyết, màng payer phù nề, đôi khi hoại tử. Nội độc tố có vai trò quyết
định trong tính chất gây bệnh của Salmonella.
- Ngoại độc tố: ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và
nuôi cấy kị khí, ngoại độc tố có thể điều chế thành giải độc tố.
1.3.3.5. Cơ chế gây bệnh
Ngộ độc do Salmonella là loại ngộ độc thường gặp và có thể gây tử

vong, điều kiện cần thiết để gây ngộ độc là thực phẩm phải nhiễm với số
lượng lớn, vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn, sức đề
kháng của cơ thể bị suy giảm.
Người tiêu dùng sử dụng thực phẩm bị nhiễm khuẩn, từ đó vi khuẩn sẽ
vào trong ruột và phát triển làm phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, sau đó vào
máu và tiết ra độc tố gây viêm ruột. Độc tố thấm qua thành ruột vào máu gây
nên các triệu chứng liên quan đến dạ dày như: đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy,
7


sốt cao kéo dài đến vài ngày. Ngoài ra, vi khuẩn Salmonella còn có thể theo
hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên nhiểm trùng máu.
1.3.3.6. Sự hiện diện của Salmonella
Trong tự nhiên: Salmonella hiện diện trong đường ruột của động vật
trong nước, động vật có vú, các loài chim máu nóng, lạnh. Trứng có thể bị
nhiễm do tiếp xúc với phân.
Trong thực phẩm: Salmonella hiện diện trong thịt gia súc, gia cầm, trứng,
rau cải, xà lách, các sản phẩm bơ, sữa, cá và các loại tôm cua sò ốc [4].
1.3.4. Staphylococcus aureus
1.3.4.1. Hình thể
Tụ cầu là những vi khuẩn hình cầu có đường kính 0,8-1 µm đứng tụ lại
với nhau thành từng đám như chùm nho; đôi khi có thể đứng riêng rẽ hoặc
thành từng đôi hay từng chuỗi ngắn. Tụ cầu thường không có vỏ, không có
lông, không di động, không sinh nha bào, bắt màu gram dương.
1.3.4.2. Tính chất sinh vật hóa học
Coagulase (+), lên men manitol, tan máu β, phản ứng catalase (+) và
phản ứng oxydase (-).
1.3.4.3. Sức đề kháng
Tụ cầu nhiễm vào thức ăn sau 4-5 giờ sẽ sản sinh ra ngoại độc tố ruột,
ngoại độc tố này chỉ bị phá hủy ở 100oC trong 1-2 giờ. Ở nhiệt độ thấp độc tố

này có thể duy trì được trong 60 ngày và nó không làm thay đổi mùi vị của
thức ăn do đó rất khó phát hiện và dễ gây bệnh.
1.3.4.4. Độc tố
- Dung huyết tố (hemolysin) có 3 loại:
+ Dung huyết tố (α ); gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37oC, huyết tố
này cũng có thể gây hoại tử da và gây chết.
+ Dung huyết tố ( β): có tác dụng làm tan hồng cầu cừu ở 4oC, ít độc
hơn dung huyết tố
8


+ Dung huyết tố (γ); có tác dụng lên hồng cầu và gây hoại tử da.
- Nhân tố diệt bạch cầu: nhân tố này làm bạch cầu mất tính di động và bị
phá hủy nhân.
- Các độc tố ruột: gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp. Có 6 loại độc
tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt trong đó có 2 loại được
biết rõ là:
+ Độc tố A: được tạo ra do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm
độc thức ăn.
+ Độc tố B:được tạo ra do một chủng phân lập từ bệnh nhân viêm ruột.
1.3.4.5. Khả năng gây bệnh
Ngoại độc tố của tụ cầu vàng khi vào dạ dày, nhanh chóng thấm vào
niêm mạc dạ dày, ruột và vào máu sau đó tác động lên hệ thần kinh thực vật
làm cường phó giao cảm gây tăng nhu mô động ruột làm dạ dày co bóp dẫn
đến triệu chứng ngộ độc.
1.3.4.6. Sự hiện diện của Staphylococcus aureus
Trong tự nhiên: có khoảng 30-50% dân số mang Staphylococcus trong
mũi và họng, nó được tìm thấy ngẫu nhiên trên da và tóc.
Trong thực phẩm: có trong thịt sống và các sản phẩm thực phẩm từ sữa,
các thực phẩm đóng hộp [4].

1.3.5.Streptococcus suis (liên cầu lợn)
1.3.5.1. Hình thể
Liên cầu là những cầu khuẩn bắt màu gram dương, đường kính 0,6-0,8
µm, xếp liên tiếp nhau thành từng chuỗi, dài ngắn khác nhau và có thể đứng
với nhau thành từng đôi hoặc từng đám. Liên cầu không có lông, không di
động, không sinh nha bào và có vỏ.
1.3.5.2. Sức đề kháng

9


Vi khuẩn liên cầu lợn có sức đề kháng kém, chúng dễ bị tiêu diệt bởi
các chất sát khuẩn và tẩy uế thông thường như Chloramin, nước Javen, nước
vôi hoặc vôi bột...
Các điều kiện thuận lợi để liên cầu phát triển ở lợn, đó là điều kiện
chuồng trại kém, nhiễm phân rác ở chuồng trại, không có thông khí, lợn được
chăn nuôi tập trung..
1.3.5.3. Tính chất sinh vật hóa học
Liên cầu lợn cũng như các liên cầu khác:
- Không có enzym catalase.
- Liên cầu lợn không bị ly giải bởi muối mật: optochin (-), thử nghiệm ly
giải bởi muối mật (-).
- Không mọc trong môi trường có 6% NaCl.
- Thủy phân bile esculine, CAMP test (-), Bacitracin test (-).
1.3.5.4. Sự hiện diện của liên cầu lợn
Liên cầu lợn luôn có mặt trong môi trường và ký sinh bình thường ở
lợn nhưng không gây bệnh, hoặc chỉ gây các bệnh viêm nhiễm không thành
dịch như viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi. Liên cầu lợn chủ yếu
sống ở các loài lợn đã thuần hóa, nhưng đôi khi cũng tìm thấy ở các loài lợn
rừng, ngựa, chó, mèo và chim.

Nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn là ở đường hô hấp trên đặc biệt là mũi,
đường tiêu hóa và đường sinh dục. Hiện có 2 typ liên cầu lợn thường gây
bệnh ở lợn, typ 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, typ 2
gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau. Cả 2 typ này đều cư trú ở amidal, tỷ lệ
mang liên cầu lợn không triệu chứng trong một đàn lợn khoảng 60-100%.
Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất [1],[6].

10


1.3.5.5. Khả năng gây bệnh
Gây bệnh ở lợn
Lợn bị liên cầu khuẩn có thể có các biểu hiện sau: da lợn có thể có các
màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp
bị sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề, dịch
não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có
mủ, viêm phế quản, viêm phổi. Vi khuẩn có thể gây các bệnh ở lợn là viêm
màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi, bại huyết, bệnh đường tiêu hoá,
viêm khớp, xuất huyết ở da, gây sẩy thai và gây chết đột ngột.
Gây bệnh ở người
Bệnh liên cầu lợn (Streptococcus suis) được phát hiện ở nhiều nơi trên
thế giới. Người nhiễm đầu tiên được phát hiện vào năm 1960 và số lượng
bệnh nhân nhiễm 4 ngày càng tăng.
Nhiễm Streptococcus suis có thể gây ra những bệnh rất nặng và nguy
hiểm đến tính mạng bệnh nhân, hay gặp nhất là gây viêm màng não, nhiễm
khuẩn máu, viêm màng trong tim, một số trường hợp tiến triển tối cấp rất
nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc khuẩn gây suy đa phủ tạng và tử vong mà
không kịp điều trị gì. Thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến 3 ngày [1].
1.4. Các con đường VSV nhiễm vào tiết canh và giới hạn cho phép các chỉ
tiêu vi sinh trong thực phẩm.

1.4.1. Các con đường nhiễm VSV vào tiết canh
VSV nhiễm vào tiết canh do 4 con đường:
- Do môi trường không đảm bảo vệ sinh, VSV từ đất, nước bẩn, không
khí, dụng cụ, và các vật dụng khác nhiễm vào tiết canh như dao, thớt bẩn,...
- Do thiếu vệ sinh trong quá trình chế biến, có thể nhiễm từ tay bẩn của
người chế biến.
- Không che đậy để côn trùng vật nuôi tiếp xúc vào tiết canh có mang
theo vi khuẩn như ruồi, gián...
11


- Do bản thân của tiết canh là nguồn chứa các loại VSV gây bệnh. VSV
này có thể bị nhiễm trong quá trình giết mổ, vận chuyển, bảo quản, chế biến,
đặc biệt là các loài động vật đã mang vi khuẩn từ trước [8].
1.4.2. Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm (Quyết
định số 867 của Bộ Y tế ngày 4/4/1998) [8]
Bảng 1.1. Giới hạn cho phép các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm
Giới hạn cho phép
Thực phẩm

VSV

số lượng vi khuẩn
trong 1g hay 1ml
thực phẩm

Thịt tươi: thịt đông
lạnh, thịt xay nhỏ, thịt
chế biến... (Phải qua
xử lý nhiệt trước khi

sử dụng

Sản phẩm chế biến từ
thịt: thịt hun khói,
pate, nem chua,... (sử
dụng trực tiếp

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

106

E.coli

102

S.aureus

102

Coliforms

102

Salmonella

0

B.cereus

102

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

3.105

Coliforms

50

E.coli

3

Cl.perfringens

10

Salmonella

0

B.cereus

10

S.aureus

10

12

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Mẫu tiết canh
Tiêu chuẩn:
- Được bán trên địa bàn thành phố Hải Dương.
- Khối lượng mẫu lớn hơn 100g.
2.1.2. Các chỉ tiêu xét nghiệm vi sinh
- Coliforms
- E.coli
- Salmonella
- S.aureus
- S.suis
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).
- Tủ ấm, để duy trì môi trường đã nuôi cấy, các đĩa và ống ở trong dải
nhiệt độ 35oC ± 1oC hoặc 37oC ± 1oC.
- Tủ sấy hoặc tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ từ 25oC ± 1oC đến 50oC
± 1oC.
- Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì được nhiệt độ ở
47oC ± 2oC.
- Ống nghiệm, bình hoặc lọ có nắp vặn, có dung tích thích hợp để khử
trùng, bảo quản môi trường cấy và ủ dạng lỏng; đặc biệt các ống đựng dung
dịch hồng cầu vô trùng, hoặc các lọ đáy tròn có kích thước khoảng 10 × 75
mm.
- Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc nhựa.
- Que cấy thẳng và pipet Pasteur.

13


- Pipet chia độ xả hết, có dung tích 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch
tương ứng 0,1 ml; 0,1 ml và 0,5 ml.
- Dụng cụ dàn mẫu vô trùng, bằng thủy tinh hoặc nhựa.
- PH mét, có thể đọc chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 25oC, có thể đo
chính xác đến ± 0,1 đơn vị PH.
2.2.2. Môi trường, hóa chất
- Nước đệm pepton
- Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL)
- Canh thang mật lactoza lục sáng
- Tha ̣ch trypton – mâ ̣t – glucoronid (TBX agar)
- Môi trường thạch Baird Parker
- Huyết tương thỏ
- Môi trường Magie clorua – lục malachit ( Rappaport – Vasiliadis
Broth)
- Môi trường Selenit – cystin ( Selenit Cystin Broth)
- Thạch đỏ phenol-lục sáng (Brilliant-Green - Phenol red Lactose Agar)
- Thạch Hektoen enteric (Hektoen Enteric Agar)
- Thạch dinh dưỡng (Nutrient agar)
- Thạch 3 đường sắt ( TSI agar)
- Thạch Ure ( Ure Christensen Agar)
- Môi trường L – Lysin decacboxyl
- Thuốc thử - Galactosidase
- Thuốc thử Voges – Proskauer (VP)
- Thuốc thử Indol
- Thuốc thử Kovacs
- Canh thang Trehalose
- Canh thang 1% Salicin

14


Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều
chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm
và được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút) [11].
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
- Lấy mẫu
Mẫu được mua tại các chợ và các cửa hàng bán tiết canh trên địa bàn
thành phố Hải Dương trong buổi sáng. Lấy một cách ngẫu nhiên đủ số lượng
và lớn hơn khối lượng mẫu tối thiểu là 100g. Mẫu được lấy riêng biệt trong
mỗi túi nylon khô, sạch bảo quản mẫu trong nước đá cho tới khi vận chuyển
về phòng xét nghiệm để phân tích. Mỗi ngày chỉ lấy vừa đủ số mẫu để làm
ngay trong buổi sáng.
Trên mỗi túi mẫu sẽ được dán tờ giấy có đánh số và loại tiết canh để
phân biệt rõ ràng giữa các mẫu.
- Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu
Mẫu tiết canh được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy Stomatcher
trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
Cân chính xác 25g tiết canh đã được chuẩn bị cho vào bình có chứa 225
ml nước pepton đệm, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có
chứa sẵn 9 ml nước pepton đệm, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử
10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch mẫu thử 10-3 [11].
2.3.2. Phương pháp định lượng Coliforms – kỹ thuật đếm khuẩn lạc
2.3.2.1. Cấy và ủ mẫu
- Chuẩn bị 2 đĩa petri.
- Dùng pipet vô trùng cho vào tâm của mỗi đĩa 1ml của mẫu thử, hoặc
các dung dịch pha loãng.

- Rót khoảng 15ml môi trường VRBL ở 44oC đến 47oC vào mỗi đĩa petri
15


- Trộn đều dịch cấy với môi trường và để cho hỗn hợp đông đặc lại, đặt
đĩa ở một mặt phẳng.
- Đồng thời chuẩn bị một đĩa kiểm tra với 15ml môi trường để kiểm tra
độ vô trùng.
- Sau khi đông đặc hoàn toàn, rót khoảng 4ml môi trường VRBL ở
44oC đến 47oC lên bề mặt của môi trường cấy, để cho đông lại.
- Lật ngược các đĩa để vào tủ ấm ở 30oC hoặc 37oC trong 24 giờ.
2.3.2.2. Đếm các KL
- Chọn các đĩa có từ 10 – 150 KL.
- Đếm các KL màu đỏ ánh tía có đường kính 0.5 mm hoặc lớn hơn (đôi
khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh) bằng mắt thường. Các KL này được
coi là các KL Coliforms điển hình và không cần khẳng định tiếp.
- Đếm các KL không điển hình (ví dụ: kích cỡ nhỏ hơn, ...). Việc
chuyển hóa đường không phải là đường lactoza có thể làm cho hình dạng KL
nhìn tương tự như Coliforms điển hình.
2.3.2.3. Khẳng định (KL không điển hình)
- Cấy 5 KL của từng loại không điển hình (nếu có), cho vào các ống
nghiệm canh thang mật lactoza lục sáng.
- Ủ các ống nghiệm trong tủ ấm ở 30oC hoặc 37oC trong 24h.
- Quan sát kết quả: các ống Durham cho thấy có sinh khí thì được coi là
có chứa Coliform.
2.3.2.4. Biểu thị kết quả
- Tổng số KL hoặc các KL điển hình
Tính số lượng (N) vi khuẩn có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ 2
độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức:

16