sinh học phân tử và tế bào thực vật

TĨM TẮT:
Hiện nay việc nghiên cứu mơ tả sự phát triển của rễ bất định trong in vitro cỏ Hypericum
Perforatum L. được biết phổ biến với cái tên là cây của St.John với chất dinh dưỡng và
nồng độ auxin thấp trong môi trường vi nhân giống lỏng. Rễ được tái tạo từ mô sẹo
(shoot-derived) ngọn chồi trên môi trường MS bổ sung 4mg/l IAA.
IAA và IBA cho kết quả như nhau trong việc cảm ứng tạo rễ từ cấy ngọn chồi. Mơi
trường MS ½ + 1mg/l IAA phù hợp nhất để nuôi cấy rễ trong môi trường lỏng. Tổng sinh
khối 4,13 ± 0,67g gồm 226 ±34,4 chồi ngọn, chồi bên (shoot bud) cùng với rễ thu được
từ 200mg rễ ban đầu. Trước khi xử lý với kinetin (2mg/l) đã làm tăng chồi.
Bình Growtek phù hợp và hiệu quả cao cho việc đưa vào sản xuất cây con. Rễ phát triển
tốt trong in vitro bất chấp nguồn ban đầu của chúng và dễ dàng giám sát nguồn nuôi cấy
để sản xuất cây con sạch bệnh mà không đánh mất tiềm năng phát sinh hình thái trong
suốt quá trình phát triển.
Thực vật đã cho thấy 84-99% sự giống nhau giữa chúng bằng kĩ thuật RAPD. Ngọn chồi
trong in vitro có thể tăng lên nhiều lần hoặc mọc rễ liên tục và chúng cũng có thể được
khảo sát để sản xuất invitro hypericin và hyperforin.


CHỮ VIẾT TẮT
IAA

Indole-3aceticacid

IBA

Indole-3butyricacid

NAA

a-Naphtheleneaceticacid

2,4-D

2,4,Dichlorophenoxyaceticacid

BAP

6-Benzylaminopurine

Kn

Kinetin(6-Furfurylaminopurine)

TDZ

Thidiazuron

RAPD

Randomly amplified polymorphic DNA

RFLP

Restriction fragment length polymorphism


GIỚI THIỆU:
Hypericum perforatum L. (Họ Clusiaceae) là một vị thuốc nam q thường phân
bố ở vùng khí hậu ơn đới tương đối khô của Châu Âu và Bắc Mỹ.Ở Ấn Độ, nó phân bố ở
phía tây dãy Hymalaya giữa 3000 đến 9000 fit so với mặt nước biển. Cây của St.John có
tiềm năng điều trị suy nhược từ nhẹ đến vừa (Desmet và Nolen, 1996) bởi hoạt động

chính của 2 chất “Hypericin và Hyperforin” và đã trở thành một vị thuốc nam phổ biến
bởi hoạt động kháng virut, trị ung thư, sát trùng, kháng viêm và giảm đau (Vatikuti và
Ciddi 2005). Công thức cây của St. John đáng giá khoảng 210 US$ và 570 triệu đô ở Mỹ
và trên khắp thế giới.
Nuôi cấy in vitro là công cụ hấp dẫn để tăng sinh khối và sản xuất hợp chất thứ cấp từ
cây H.perforatum (Cellarova et al., 1992; Zdunek và Alfermann 1992; Murch et al. 2000;
Pretto và Santrarem 2000; Zobayed et al.2004). Sự phát triển invitro, sự gia tăng và sản
xuất hóa chất có nguồn gốc thực vật bị ảnh hưởng bởi nhân tố như sự chọn mô nuôi cấy,
độ tuổi, và sự điều hòa phát thực vật.
Rễ là một nguồn mô đối với nhân giống in vitro chỉ gặp ở một ít lồi (Bhat et al 1992,
Kelka và Krishnamurthy 1998, Zobayed và saxena, 2003; Vinocur et al. 2000). Rễ sẽ
phát triển liên tục khi bị cắt bỏ. Mặc dù, sự thối hóa có thể xảy ra đối với cấy truyền liên
tục, tuy nhiên thao tác cấy mơi trường có thể cứu chữa.
Agrobacterium rhizogenes được dàn xếp biến đổi rễ có được chấp nhận rộng rãi và tiềm
năng cho nuôi cấy số lượng lớn để sản xuất hợp chất thứ cấp và cải tạo thực vật, tuy
nhiên, rễ luôn được cho là sản phẩm căn bản, làm chết tế bào động vật (Paek et al.2005).
Bởi vậy phải chú ý tập trung tiềm năng của vỏ rễ trong nuôi cấy in vitro. Hơn nữa việc sử
dụng quy trình cho vi nhân giống và ni cấy rễ để sản xuất hóa chất từ thực vật có
những thành tựu lớn lao đáng chú ý suốt vài năm vừa qua (Ziv 2005; Hvoslef- Eide et al.
2005; Srivastava và Srivastava , 2007).
Nuôi cấy số lượng lớn của rễ theo quy trình mới có thể cung cấp điều kiện tốt nhất cho
sinh khối và sản xuất hợp chất thứ cấp có thể ngang hay cao hơn rễ ngồi tự nhiên.
-Việc thiết kế quy trình thích hợp bằng việc xem xét một vài yếu tố giới hạn: vật liệu và
hóa chất (chất dinh dưỡng có thể kiếm được, hấp thụ được, sự thoát oxy,..) và nhân tố
khác như khuôn chống đỡ phù hợp để nuôi cấy vật mỏng manh và rễ thực vật nhạy cảm.
Lọ Grotek đã sử dụng thành công để tăng sinh khối (tiết kiệm, thuận lợi) và nuôi cấy rễ.
- Trật tự mô phân sinh được xem xét một cách tổng quát để kháng được sự thay đổi xảy
ra ở bộ gene trong suốt quá trình phân chia TB bởi vậy phương thức này được xem xét để

nâng cao tính ổn định di truyền và đúng với từng loại thực vật. Tần số biến dị dòng soma
phụ thuộc vào nhân tố như lồi, kiểu gene, loại mơ cấy,thành phần của môi trường nuôi
cấy, điều kiện nuôi cấy và duy trì cấy truyền liên lục.
Trong việc đi tìm tất cả những suy xét này, hiện tại có cơng nghệ rất đơn giản cho vi nhân
giống H.perforatum, rễ phát triển trong in vitro từ hai nguồn khác nhau ngẫu nhiên trong
môi trường lỏng. Tăng lọ Grotek và đánh giá độ tin cậy của bản sao thực vật được tái tạo
từ rễ từ cả hai nguồn thông qua phép phân tích RAPD.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:
1/ Vật liệu:
H.perforatum L. được chọn từ Bageshwar (Uttrakhand, Ấn Độ) được giữ ở điều kiện nhà
kính tại nơng trại ngun cứu CIMAP, Lucknow.
a) Vơ mẫu:
Ngọn chồi non được khử trùng bề mặt với ethyl alcohol 70% khoảng 30 giây  rửa nước
cất vô trùng và 0,15 HgCl2 3 phút  rửa nước cất vô trùng.
Ban đầu, cấy mẫu có độ dài 2-3cm được cắt bỏ ngọn chồi với 1-2 đốt gồm nụ ở nách
trong môi trường MS, môi trường được bổ sung Kn và 2,4 D riêng rẽ hay kết hợp (nồng
độ 0.0; 0.25; 0.5; 1.0; 2.0 và 5.0 mg/l), pH 5.86 0.02, hấp khử trùng 121 oC, 15 phút. Điều
kiện nuôi cấy To25 ±2oC, sử dụng ánh sáng trắng và cường độ ánh sáng 20 µmol m -2 s1
.Tối thiểu có 6 bản sao được duy trì cho mỗi nghiệm thức. Sự nhân ngọn chồi và sự phản
ứng phát sinh mô sẹo được kiểm tra sau 8 tuần nuôi cấy.
b) Cảm ứng tạo rễ từ nuôi cấy mô sẹo:
Mô sẹo được truyền sang môi trường chứa IAA, IBA, NAA ( 1.0, 2.0 và 4.0 mg/l ) riêng
rẽ hay kết hợp với Kn ( 0.1, 0.2, 0.4 mg/l) trong lọ 100ml chứa 40ml môi trường +35
sucrose +0.8 % agar. Và môi trường đối chứng (không có bất kì chất điều hịa thực vật).
Theo dõi ghi chép 6 bản sao trên mỗi nghiệm thức và thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tần
số cảm ứng ra rễ được kiểm tra sau 6 tuần nuôi cấy.
c) Sự mọc rễ của micro-shoot(vi chồi) in vitro:
Trong in vitro chồi phát triển 3.0 – 4.0 cm được cắt bỏ và chuyển vào mơi trường MS và

MS ½ bổ sung các auxin khác nhau IAA, IBA và NAA ( 1.0, 2.0 và 4.0 mg/l). Và mơi
trường MS, MS ½ đối chứng . Khoảng 15 bản sao duy trì cho mỗi ngiệm thức trên. Xác
định số lượng rễ phát triển và phát sinh, số rễ/mô sau 6 tuần nuôi cấy. Số lượng rễ trên
chồi được so sánh bởi ANOVA. Student t-test được ứng dụng để so sánh mỗi nghiệm
thức riêng lẻ.
d) Sự phát triển của rễ được cắt bỏ trên môi trường bán rắn:
Đoạn rễ dài khoảng 2cm khơng có bất kì nhánh bên được cắt từ nuôi cấy mô sẹo và ngọn
chồi và được nuôi cấy tách biệt trong pertri chứa mơi trường MS 1 và ½ + IAA và IBA
(1, 2, 4 mg/l). Và môi trường đối chứng.


e) Sự phát triển của rễ bị cắt trong môi trường lỏng:
Đoạn rễ (200mg) dài khoảng 2-3cm bị cắt ra từ ngọn chồi nuôi cấy hay mô sẹo phát triển
trên môi trường bán rắn được chuyển vào môi trường lỏng MS 1 và ½ gồm 0.5, 1, 2, và 4
mg/l IAA và IBA trong lọ 250ml với 30ml môi trường. Và môi trường đối chứng.
Ủ ở 75rpm trên máy lắc trong phịng ni cấy. Ghi chép trong 3 thế hệ tiếp theo. Kết quả
bổ sung nồng độ khác nhau (0.1, 0.5, 1 và 2mg/l) cytokinin( TDZ,BAP và Kn) vào môi
trường ni cấy trong tiềm năng phát sinh hình thái rễ cũng được kiểm tra. Thông số:
tổng số chồi và nụ chồi, độ dài chồi với sự phát triển của rễ cũng được ghi chép. Thông
số tương tự cũng được ghi chép sau 6 tuần đối với sự phát triển của rễ trong lọ 250ml
chứa 30g giọt thủy tinh (glass bead) (3-4mm) như khoảng chống chịu và bình Grotek
gồm 250ml mơi trường lỏng dưới điều kiện khơng đổi.
Trong bình Grotek, khoảng 1g TB rễ được ghép vào raft? . Tối thiểu 3 bản sao được duy
trì cho mỗi nghiệm thức và thí nghiệm được lặp lại 2 lần và được phân tích bằng
ANOVA.
Chỉ số phát triển được tính tốn bởi cơng thưc:
Chỉ số phát triển
Đánh giá độ tin cậy bản sao của cây tái sinh từ rễ bất định.
Độ tin cậy bộ gene giữa mẫu đối chứng, rễ bất định từ 2 nguồn khác nhau (ngọn chồi và
mô sẹo in vitro) và lựa chọn ngẫu nhiên cây từ nhà kính đi làm PCR dựa vào kĩ thuật

RAPD. DNA và mô lá non tươi (1g). mẫu được đánh dấu từ 1 đến 15, mẫu số 1 đại diện
cho cây mẹ, mẫu số 2 và 3 là rễ thu được từ nuôi cấy mô ngọn chồi và mô sẹo, 4-15 là
mẫu lựa chọn ngẫu nhiên từ cây trồng trong nhà kính.
Kiểu NTSys PC 2.02j được sử dụng để biểu diễn tập hợp thông tin đã hồn thành. Đánh
giá tương tự được tính tốn bởi sử dụng hệ số Nei và Li (Nei và Li 1979) và tập hợp
những thông số kĩ thuật được tiến hành bởi phương pháp UPGMA (Unweighted pair
group method arithmetic mean averages) và được biểu diễn như sơ đồ nhánh.


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sự thành lập trong điều kiện vô trùng
Sự phát sinh chồi vào tạo mô sẹo được quan sát sau 8 tuần thành lập trên môi trường MS
bổ sung 5.0mg l-1 Kn và MS bổ sung 0.5 mg l-1 2,4D và 0.25 mg l-1 Kn.
Các cấu trúc mô sẹo này được sử dụng như nguồn ban đầu trong nghiên cứu ở đây.
Thành lập rễ từ mô sẹo
Dữ liệu thu nhận sau 8 tuần cấy mô sẹo cho thấy, thử nghiệm hầu hết tất cả các auxin như
IAA, IBA hoặc NAA chỉ có IAA thúc đẩy phát triển rễ nhanh hơn, mặc dù NAA khuyến
khích cho sự phát sinh mô sẹo.
Dấu hiệu đầu tiên của sự phát sinh rễ từ mô sẹo được quan sát thấy sau 3 tuần sinh trưởng
trên môi trường MS bổ sung 4.0 mg l-1 IAA. Số lượng rễ cao nhất 48.0 ± 6.06/mẫu với độ
dài trung bình là 2.25 ± 0.78 cm được thể hiện ở trên môi trường MS bổ sung IAA (4.0
mg l-1). Mẫu mô sẹo trong môi trường hormone tự do không thấy sự phát triển rễ nào.
Sự thành lập in vitro ở vi chồi
Dữ liệu thu nhận sau 6 tuần cho thấy IAA và IBA (1.0, 2.0 hoặc 4.0 mg l -1) cho kết quả
hiệu quả đối với sự phát triển rễ trong mơ chồi (Hình 1b). Ở nồng độ thấp hơn (1.0 hoăc
2.0 mg l-1) của IAA và IBA cho kết quả hiệu quả hơn so với ở nồng độ cao (4.0 mg l -1).


Hình 1:
IBA trong mơi trường MS ½ ở cả 3 nồng độ nghiệm thức cho 100% cảm ứng tạo rễ ở mô chồi.

Hiệu quả tạo rễ cao hơn ở môi trường MS ½ so với mơi trường MS. NAA tại tất cả các
nồng độ trong MS ½ và MS đều ức chế sự hình thành và phát triển rễ đồng thời chỉ hỗ trợ
sự phát triển mô sẹo. Các dữ liệu cảm ứng auxin gây ra dẫn đến thành lập mô chồi được
thể hiện ở bảng 3.


Sự phát triển của rễ cắt bỏ trên môi trường bán rắn
Sự tạo rễ trên môi trường bán rắn cho thấy quá trình phát triển rễ được hỗ trợ tốt nhất
trong điều kiện MS ½ bổ sung IAA 4.0 mg l -1 sau 6 tuần (Hình 1c). Trên các rễ trung bình
14.6 ± 1.82 với độ dài 1.82 ± 0.62 cm được tạo ra trên mỗi cây mẹ (1cm phần rễ). Sự
phân hố ngọn chồi chính khơng được quan sát thấy trên môi trường bán rắn. IAA hoặc
IBA (1.0 – 4.0 mg l-1) ảnh hưởng kết quả nhiều hoặc ít hơn đối với phát triển rễ trên cả
MS ½ và môi trường MS.


Sự phát triển rễ cắt bỏ và phân hoá chồi de novo trong môi trường lỏng
Quan sát thấy trong các nồng độ thay đổi của IAA (0.5, 1.0, 2.0 hoăc 4.0 mg l -1) bổ sung
trong mơi trường MS ½ thúc đẩy sự phát triển của rễ lẫn sự phát triển của chồi từ mơ rễ
ban đầu. Trong đó, các nồng độ của IAA tương tự trong môi trường MS chỉ thúc đẩy sự
phát triển của rễ. Sự hình thành ngọn khi chồi từ rễ in vitro sau 2 tuần phát triển và các
nốt nhỏ như mô phát triển mạnh hơn trên phần cuối gần gốc (hình 1d) sau 4 tuần và có rất
ít ở phần cuối ngoại vi.
Tuyến hypericin rất đang được chú ý (hình 1e). Các rễ của cây được so sánh dày hơ, màu
nâu đậm và hoá gỗ lớp ngồi, cung cấp chồi ngọn (Hình 1f), do đó rễ mới ra thường
mảnh và rất trắng, khơng sản xuất chồi. Cảm ứng phát sinh hình thái phân cực ở rễ cây
mẹ được quan sát thấy sớm hơn ((Kelkar và Krishnamurthy 1998; Vinocur et al. 2000).
Dữ liệu thu nhận sau 6 tuần của phát sinh chồi cho thấy rễ were mor ecopiously
branched, dài hơn và dày hơn trong MS ½ hơn so với MS nguyên. Sự phát triển rễ và
cảm ứng phát sinh chồi ở MS nguyên bổ sung 1.0 mg l-1 IAA cao nhất ở hầu hết các nồng

độ thí nghiệm (bảng 5).

Sử dụng 200 mg rễ như inoculum (chất tiêm chủng); tổng sinh khối ̴ 4.13 ± 0.67g bao
gồm 226 ± 34.4 chồi và ngọn rễ mỗi cấu trúc mà rễ thu được. (Hình 5, hình 2a)
Ở các chồi ngọn trung bình 9.4/cm phát triển từ một rễ đơn trong môi trường mô lỏng.
Chiều dài TB (5.61 ± 1.0 cm) của rễ cao hơn trên đó (1.82 ± 0.062) kể cả trên môi trường
bán rắn. Khi rễ được hình thành sau sự phân hố ngọn chồi ở mơi trường MS ½ bán rắn
bổ
sung
IAA
(1.0
mg
-1
l ), chồi bắt đầu phát triển trong 2 tuần thành lập, tuy nhiên, độ dài của chồi ngắn hơn
nhiều so với khi nuôi cấy trong môi trường lỏng. Chỉ số phát triển gia tăng cao hơn với số


chồi được thu nhận trong môi trường lỏng bổ sung với hạt thuỷ tinh và Growtek dưới
điều kiện cơ bản của mô được thể hiện trong bảng 6.

Khi rễ được thành lập trong môi trường lỏng 0.1, 0.5, 1.0 hoặc 2.0 mg l -1 TDZ và BAP, rễ
chuyển sang tượng hoa và phân hố chồi khơng được quan sát. Tuy nhiên, thành lập rễ
trên 2.0 mg l-1 Kn trong 2 tuần tiếp theo bởi cáy chuyền sang môi trường MS ½ bổ sung
1.0 mg l-1 IAA tăng tỉ lệ tái sinh chồi (247 ± 41) (Hình 2c). Tất cả những chồi tái sinh có
hình thái tương tự nhau.


Ước lượng của dịng chính xác của phân hố thực vật từ rễ bất định
Khoảng 48 dải mở rộng tái sinh được sản xuất bởi phân tích RADP của 12 cây phát triển
in vitro, điều khiển cây mẹ và mẫu chồi từ 2 nguồn sử dụng 11 mẫu mồi 12 nucleotide

ngẫu nhiên. Số lượng các dải được tạo ra trên mỗi primer được sắp xếp từ 2 đến 6 (Hình
3).
Tất cả các primer được nhiều dạng và tạo một số các hiện tượng đa hình, hơn 48 dải 21
(43.75%) đơn hình và cịn lại 27 (54.25%) đa hình. Phân tích cụm tái hiện như as
dendrogram on the basis of similarity co-efficient generated from dữ liệu RAPD của 48
dải xuất hiện một vùng tương tự từ 0.84 đến 0.99. Tất cả 20 nghiệm thức được nhóm lại
thành một nhóm cụm chính với mức độ 84% (Hình 4)

Các rễ in vitro có nguồn gốc từ chồi và mô sẹo cho kết quả tương tự từ 99-95% với cây
mẹ. Từ nghiên cứu này, rõ ràng sự thay đổi được hiện diện trong vi nhân giống của cây
H.perforatum.
Tính đa hình trong các dải mở rộng có thể cho kết quả từ sự thay đổi các trình tự của
primer-binding site (ví dụ đột biến điểm) hoặc do thay đổi trình tự, làm thay đổi kích
thước hoặc ngăn cản mở rộng thành cơng của DNA đích (ví dự thêm, bớt, đảo)
(Williamsetal. 1990). Sử dụng cơng nghệ RADP, sự hiện diện của các đột biến di truyền


trong vi nhân giống phát sinh từ chồi cũng được báo cáo (Hashmietal. 1997;
Watanabeetal. 1998; Bindiya and Kanwar 2003). Mặt khác, trong một vài báo cáo khác
được công bố, không có dịng soma biến đổi có thể được phát hiện khi sử dụng các
marker phân tử (Rani and Raina 2000). Điều này do thiếu sự sai biệt hoặc phương thức
phát hiện đủ nhạy cảm vẫn còn là vấn đề được tranh cãi. Tuy nhiên, ngay cả khi phân tích
thực nghiệm chỉ là một phần nhỏ trong tổng số bộ gene, do đó tiểu sử của đoạn DNA đa
hình vẫn chưa được phát hiện ra có sự thay đổi gen như thế nào nhưng có thể có sự ổn
định trong trình tự lưa chọn đặc thù (Harding 2004). Sự đa hình này có thể do sự tích luỹ
các đột biến trong quá trình phát sinh cơ quan gián tiếp và phát triển dòng trong thời gian
dài. Tuy nhiên, trong một vài báo cáo gần đây, tính đa hình trên gene đi kèm với nghiên
cứu trao đổi chất thứ cấp có thể mang lại những lợi ích quan trọng. Nghiên cứu đa hình
dịng soma trên cây vi nhân giống ở H. perfornatum được đưa ra sử dụng RFLP
(Halusskova và Cellarova 1997) và phân tích phát sinh tế bào (Brutovska và cộng sự,

1998). Tuy nhiên ngay cả những nghiên cứu trên pân tích RADP cũng không khả dụng.
Ngày càng nhiều các công nghệ phức tạp RFLP, giá cao và được sử dụng đồng vị phóng
xa phổ biến trong phương pháp phát hiện cũng có một số bất lợi trong ứng dụng thơng
thường của hệ thống vi nhân giống. Do đó RAPD có thể phá vỡ một vài vấn đề có liên
quan tới phân tích RFLP. Theo sự hiểu biết tốt nhất hiện nay, đó là địi hỏi là báo cáo đầu
tiên trong phân tích dịng một cách chính xác của những cây tái sinh từ rễ bất định. Từ
các kết quả hiện có đã cho thấy tính tồn vẹn của gene của thực vật vi nhân giống có thể
được xác định trước khi chuyển cây ra ngoài đồng.


Sự đầu tư hiện tại cho thấy tằng sự phát triển rễ bất định invitro khơng kể nguồn của nó
của đáp ứng nguồn như các nguồn luân phiên của cây mẹ cho bước đầu sản xuất invitro
của cây con. Xa hơn, môi trường lỏng là tốt nhất cho sự phát triển chồi và rễ nhanh hơn.
Các nghiên cứu hiện tại cũng chứng minh tìm thấy sớm hơn nơi các đoạn rễ hạt được sử
dụng như nguồn cây mẹ (Zobayed và Saxena 2003), tuy nhiên hoạt động gần đây tỉ mỉ
chính xác sử dụng rễ bất định để pát triển chồi và mô sẹo in vitro cho nguồn cung cấp cây
con. Hơn nữa, sự đầu tư hiện nay yêu cầu nguồn dinh dưỡng thấp, yêu cầu auxin thấp và
bước đầu phụ thuộc cytokinin cho sản phẩm của phân chia chồi cho đến tái sinh chồi, có
thể được gây nên nồng độ cytokinin nội sinh. Bổ sung cytokinin (Kn) cũng làm tăng hoạt
động phân chia của chồi. Điều này có thể có lợi trong nghiên cứu cơ bản hướng phát sinh
hình thái cho đến ứng dụng cơ bản như đánh giá hiệu quả. Trong nghiên cứu của chúng
ta, TDZ khơng kích thuchs phát sinh chồi như các nghiên cứu trước đó (Zobayed và
Saxena 2003). Các vùng gần đỉnh sản xuất với số lượng lớn các chồi mỗi vùng, và tổng
số chồi từ rễ được cắt ra cao hơn so với rễ toàn vẹn không bị cắt. Điều này giống như
vùng gần đỉnh, được gần hơn với chồi, chứa đựng nồng độ hormone nội sinh cao hơn
hoặc nồng độ các nhân tố phá triển cần cho sự tái sinh chồi. Cũng có thể do hoạt động
của vùng kéo dài ngoại biên và vùng giữa có một số lượng giới hạn các tế bào có khả
năng đáp ứng. Điều đó cũng có thể được cho là do cắt bề mặt sẽ tiếp xúc với môi trường
tốt hơn hoăc ảnh hưởng của vết thương – điều khiển sự tái biệt hố trong các cây cơ lập
invitro (Vinocur và cộng sự, 2000). Kể cả sự hỗ trợ matrix như hạt thuỷ tinh trong pha

môi trường tĩnh cũng làm tăng phân chia và kéo dài chồi (Hình 2B). Hạt thuỷ tinh cũng
được sử dụng thành công như một chất hỗ trợ gian bào địi hỏi có khả năng nhân giống
của Rauwwolfia serpentina (Goel và cộng sự 2007). Cũng trong nghiên cứu gần đây, hạt
thuỷ tinh hoàn lại mơ rễ để duy trì điều kiện ngập úng một phần và bản chất tĩnh của hạt
thuỷ tinh hỗ trợ mô và ống Growtek chứng tỏ một ý nghĩa hiệu quả giá trị trong thời kỳ
nạp năng lượng. Do đó sự lựa chọn hệ thống mơ ống (Growtek) là có hiệu quả, đơn giản,
tiết kiệm thời gian và hệ thống có hiệu quả giá trị cao khi đặt sản xuất cây con (Hình
2d,e). Hơn nữa, dễ dàng để thu hoạch sinh khối. Mặc dù Growtek TM là một bioreactor thí
nghiệm quy mơ, xa hơn mở rộng quy mơ là có thể; nhưng nheiefu nghiên cứu cũng có thể
được địi hỏi thông qua nghị định thư hiện tại với quy mô lớn. Dey (2002), thành công
khi sử dụng mô ống Growtek cho dòng khối lượng hiệu quả giá trị của một vài cây kinh
tế quan trọng. Bổ sung dinh dưỡng và oxigen làm tăng lên rõ ràng phát triển sinh khối bởi
vì mơ được hỗ trợ trên một mảng nổi giữ cho mơ khơng thay đổi sự tiếp xúc với mơi
trường.Có một sự sản xuất không ngừng của rễ suốt với chồi trong môi trường giống
nhau như bước đầu tiên. Rễ invitro duy trì tiềm năng tạo hình đến phân hố. Các vi chồi
sản xuất có thể phân chia xa hơn hoặc tạo rễ, hoặc chúng có thể biết được khả năng của


chúng cho sản xuất sinh khối vô trùng và sử dụng ở quy mô lớn mô lỏng sử dụng ống
Growtek có thể làm tăng nhanh và phát triển hơn với bioreactor kích thước lớn.