BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS VIÊM GAN B

VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT
MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS
VIÊM GAN B

TS. Bạch Khánh Hoà

Huế, 06-2006


Đặt vấn đề
 Nhiễm virus viêm gan B: vấn đề mang tính toàn cầu
• Việt Nam: vùng lưu hành dịch cao

 Sự xuất hiện các đột biến trong hệ gen virus gây
khó khăn cho việc chẩn đoán, dự phòng lây nhiễm &
điều trị
• Các đột biến vùng gen S gây biến đổi kháng nguyên bề
mặt

2/29


Virus viêm gan B (HBV)
• Thuộc họ Hepadnaviridae
• Gây bệnh viêm gan B :
o
o

Cấp tính

Mạn tính (xơ gan, viêm gan, ung thư gan)

• Con đường lây truyền:
o
o
o

Từ mẹ sang con
Tiêm chích
Tình dục

3/29


HBsAg
Pre-S1
Pre-S2
ADN

HBcAg

Hình 1. Mô hình cấu trúc HBV
4/29


Hình 2. Cấu trúc hệ gen virus viêm gan B
5/29


Vị trí vùng quyết định

kháng nguyên a:
từ aa 110-160

Loop1

142
145
137

12
4

139

Loop2

147

Hình 3. Mô hình quyết định kháng nguyên “a” trên HBsAg
6/29


Các kỹ thuật phát hiện virus viêm gan B

•
•
•
•

Thử nghiệm miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA)

Thử nghiệm miễn dịch gắn men (ELISA)
Phản ứng khuếch đại trình tự gen (PCR)
Phản ứng phát hiện axit nucleic (NAT)

7/29


Các dạng đột biến virus viêm gan B

•
•
•
•

Đột biến vùng gen S
Đột biến gen lõi (precore, core)
Đột biến gen polymerase
Đột biến gen X

8/29


Mục đích nghiên cứu
•
•

Tìm hiểu tần suất đột biến kháng nguyên bề mặt ở
nhóm đối tượng mang HBsAg chưa qua điều trị.
Khảo sát một số dạng đột biến hay gặp ở vùng gen
S virus viêm gan B.

9/29


Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (1)
• Đối tượng:
o

o

75 bệnh nhân được chỉ định theo dõi viêm gan B
(1 - 12/2005) tại Viện Huyết học - Truyền máu TW
Độ tuổi: 18-43

10/29


Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (2)

 Phương pháp nghiên cứu
• Sàng lọc huyết thanh học
o

o

Kit ELISA Monolisa HBsAg Plus: phát hiện kháng
nguyên bề mặt bình thường
Kit ELISA Monolisa HBsAg Ultra: phát hiện kháng
nguyên bề mặt bình thường + các đột biến vùng gen S

11/29


Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (3)

 Khuếch đại gen bằng PCR
• Tách chiết ADN từ máu toàn phần sử dụng bộ kit
QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN, Mỹ)
• Phản ứng PCR: Kit PCR Master mix (PROMEGA, Mỹ)
• Cặp mồi sử dụng: theo nghiên cứu của Kobayashi &
Koike (4)

 Sản phẩm phản ứng được điện di trên agarose
gel 1,5% và được phát hiện bằng tia UV.

12/29


Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (4)

 Giải trình tự nucleotide & axit amin tương ứng:
• Sử dụng kit sinh phẩm và máy của hãng
AppliedBioSystem (Mỹ).
• Phần mềm xử lý số liệu: Sequencing analysis,
SeqSpace, DNA Star.

13/29


Quy trình nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm
(huyết thanh)

Sàng lọc Monolisa
HBsAg Plus

Sàng lọc Monolisa
HBsAg Ultra

Phát hiện ADN và
khuyếch đại vùng gen
S nhờ PCR
14/29


Điện di ADN trên gel agarose
Tách ADN từ gel agarose
Định lượng và đánh giá
độ tinh sạch của ADN

Giải trình tự gen S

Phân tích kết quả
15/29


Kết quả và bàn luận (1)


Sàng lọc huyết thanh học
Trong tổng số 75 bệnh nhân được tiến hành xét nghiệm
trên cả hai bộ kít, chúng tôi nhận thấy có 09 trường hợp
(12%) có tỷ số OD mẫu/ngưỡng (S/CO) chênh lệch khá
lớn. Những mẫu này nhiều khả năng chứa đột biến
HBsAg, vì vậy chúng tôi lựa chọn để tiếp tục tiến hành
phản ứng PCR.

16/29


Bảng 1. Danh sách mẫu có tỷ số S/CO chênh lệch lớn khi tiến
hành xét nghiệm trên hai bộ kit
STT

Mẫu

S/CO (plus)

S/CO (utral)

1

G7

0,12

17,42

2

G12

1,79

8,30

3

G27

34,43

48,21

4

G28

50,69

66,93

5

G41

50,50

68,50

6

G79

41,76

48,29

7

G88

49,85

68,05

8

G124

50,35

68,45

9

G130

8,20

34,48

17/29


Kết quả và bàn luận (2)
 Phản ứng PCR
– Trong số 9 mẫu được tiến hành tách chiết ADN, khuếch đại bằng
phản ứng PCR có 8 mẫu phát hiện được sản phẩm khuếch đại khi
điện di trên gel agarose 1,5%
– 01 mẫu không phát hiện thấy sản phẩm điện di

18/29


Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%
19/29


Kết quả và bàn luận (3)
 Giải trình tự nucleotide và axit amin tương ứng
- 08 mẫu hiện băng sản phẩm PCR được sử dụng tiếp
cho việc giải trình tự nucleotide. Trình tự thu được sẽ
được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để xác
định trình tự axit amin tương ứng.
- Trình tự axit amin của 8 mẫu trên được so sánh với
trình tự axit amin chuẩn (bình thường) AB031266
nhằm tìm ra những đột biến nếu có.

20/29


Hình 5. Phần mềm giải trình tự nucleotide
vùng gen S virus viêm gan B
21/29


So sánh trình tự axit amin của 8 mẫu HBV với mẫu
chuẩn AB031266

Mẫu

108

118

AB03126
6

PLIPGSSTT
S
- - - - - - - - ---------G
- - - - - - - - -- - - - - - - - -- -D-E T- - - - - - - - - - - -- -L- -T - - -R
- I - - - - - - --

TGPCRTCTTP AQGTSMFPSC CCTKPTDGNC
-------------F-------------A- - - - - - - - ------------------- - - - -A - - - ------------------- - - - - - - R- ------------------- - - - K - -P - ------------------S- - - - - - - - ------------------- - - - K - - - ----------------------------R
-------------------

G12
G27
G28
G41
G79
G88
G124
G130

128

138

22/29


Mẫu

148

AB031266

 TCIPIPSSWA
-------------------------------------------------------------------------

G12
G27
G28
G41
G79

G88
G124
G130
 

158
FAKYLWEWAS

- -TF - - - - - ------------------------------F------ - - - -C - - - ---F------ -TF - - - - - -

168

178

VRFSWLSLV
---------------------------------------------------------------F- - - - - I- - -

 PF
---------

23/29


Bảng 2. Các đột biến phát hiện được sau khi giải trình tự

Mẫu

Đột biến
sai nghĩa

Đột biến
im lặng

Tổng số
đột biến

G12

3

1

4

G27

2

1

3

G28

1

0

1

G41

1

1

2

G79

6

6

12

G88

2

2

4

G124

5

3

8

G130

6

1

7

Tổng số

26

15

41

24/29


Kết quả và bàn luận (4)
Tần số và phân bố ĐB điểm trên gen S:
•
•

Trong số 8 mẫu xác định được 41 ĐB (26 ĐB sai nghĩa +
15 ĐB im lặng) tại 27 vị trí, trung bình: 5 ĐB/mẫu.
Mỗi mẫu đều có ít nhất một đột biến sai nghĩa.

25/29