Sách thực hành môn miễn dịch

Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ

Bài 1. MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU
KỸ THUẬT THỰC BÀO HỒNG CẦU GÀ

1. MỤC TIÊU
1. Minh họa hiện tượng thực bào trên mô hình thực bào hồng cầu gà của đại
thực bào chuột lang.
2. Làm được một số bước của kỹ thuật: thu hoạch đại thực bào, làm tiêu bản
và nhuộm.
3. Biết đọc kết quả và giải thích được các hiện tượng quan sát được.
2. NỘI DUNG
2.1. Chuẩn bị
2.1.1. Dụng cụ
- Bông, cồn sát trùng 700
- Bơm và kim tiêm, loại 5ml, 10ml
- Ống nghiệm nhựa hoặc thủy tinh: 5ml, 10ml, 50 ml
- Bàn mổ chuột lang
- Bộ dụng cụ mổ chuột: dao, kéo, kẹp phẫu tích, pince
- Pipet Pasteur (nhựa)
- Lam kính sạch
- Đèn cồn
- Giá để ống nghiệm,
- Giá nhuộm tiêu bản
- Tủ ấm 370C
- Máy ly tâm
- Kính hiển vi có vật kính dầu 100x.
- Hệ thống camera và màn hình nối với kính hiển vi

Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
2.1.2. Hóa chất
-

Dung dịch NaCl 9‰
Chất chống đông Heparin hoặc Citrat natri 7%
Dung dịch pepton 10% pha trong NaCl 9‰, bảo quản ở 40C
Cồn tuyệt đối
Thuốc gây mê (ete)
Thuốc nhuộm Giêmsa
Dầu đọc tiêu bản

2.1.3. Động vật thí nghiệm
- Gà
- Chuột lang
1.

Thực hiện kỹ thuật

Ngày 1: Thu hút đại thực bào
- Cắt bỏ lông chuột vùng bụng dưới.
- Sát trùng vùng da đã cắt lông bằng cồn 700.
- Dùng bơm và kim tiêm loại 10ml hút 8-10ml dung dịch pepton 1% và tiêm
vào khoang màng bụng chuột lang.
- Đánh dấu chuột đã tiêm và tiếp tục nuôi chuột 24 giờ.
Ngày 2. Thực bào hồng cầu gà bởi đại thực bào đã tập trung
a. Chuẩn bị hồng cầu gà

- Lấy 5ml máu gà cho vào ống nghiệm đã có sẵn chất chống đông (Heparin
hoặc Citrat natri 7%).
- Thêm 5ml NaCl 9‰, trộn đều và ly tâm 2000 vòng/phút x 5 phút.
- Hút bỏ phần huyết tương và giữ lại phần hồng cầu.
- Pha loãng hồng cầu ở nồng độ 6-8% trong NaCl 9‰.
- Để hồng cầu vào tủ ấm 370C ít nhất 10 phút.
b. Tiến hành
- Cố định chuột lang trên bàn mổ.
- Tiêm 3ml hồng cầu gà vào khoang màng bụng, xoa bụng nhẹ nhàng để hồng
cầu gà được dàn đều trong khoang màng bụng.
- 15 phút sau khi tiêm, gây mê chuột bằng bông tẩm ete đặt trong phễu
(phương pháp gây mê hở).


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
- Tiêm 5-10ml NaCl 9‰ vào ổ bụng chuột.
- Mở bụng theo đường giữa, chiều dài đường rạch khoảng 0,5cm.
- Dùng kẹp phẫu tích hoặc pince không có mấu để kẹp và nâng cao miệng vết
mổ.
- Hút dịch ổ bụng bằng pipet Pasteur và cho vào ống nghiệm nhỏ 5ml.
- Nhỏ vào mỗi lam kính sạch một giọt dịch ổ bụng thu được và dàn đều giống
như làm tiêu bản máu đàn
- Sau 15 phút tính từ khi hút dịch ổ bụng lần thứ nhất, dịch ổ bụng lại được
hút ra lần 2 và làm tiêu bản như lần thứ nhất
- Để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng
- Cố định tiêu bản bằng cồn tuyệt đối
- Pha loãng dung dịch Giêmsa 1:20 (1ml Giêmsa + 19ml H 20) và nhỏ đều lên
mặt tiêu bản máu đàn, để 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó rửa bằng nước

máy và để khô tự nhiên.
2.

Đọc kết quả và giải thích hiện tượng
- Nhỏ một giọt dầu lên mặt tiêu bản và đọc kết quả bằng kính hiển vi vật kính
dầu 100x
Yêu cầu: Xác định được:
- Hồng cầu gà, đại thực bào chuột lang
- Các giai đoạn của quá trình thực bào: tiếp cận, nuốt và tiêu hồng cầu gà.
Số lượng bạch cầu đơn nhân thực bào
Phầm trăm thực bào = ------------------------------------------------------------Tổng số bạch cầu đã đọc ( 50 bạch cầu)
Chỉ số thực bào =

Tổng số hồng cầu gà bị thực bào đếm được
----------------------------------------------------Tổng số bạch cầu đã thực bào


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ

Bài 2. MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU
i. Mục tiêu

1. Chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
2. Trình bày được nguyên lý, các bước và cách nhận định kết quả kỹ thuật đánh
dấu enzym (ELISA) để xác định kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B
(HBsAg)
3. Làm được một số kỹ thuật miễn dịch cơ bản trong nhóm kỹ thuật ngưng kết:
xác định nhóm máu, hay phát hiện kháng thể kháng giang mai.

ii. Nội dung

2.1. Kỹ thuật ELISA
2.1.1. Nguyên lý chung
ELISA (Enzym Linked Immuno-Sorbent Assay) là kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn
enzym được dựa vào tính hấp phụ tự nhiên của protein trên một số chất như
polystyren. Các kháng nguyên hoặc kháng thể được gắn lên bản nhựa trên, sau đó
cho kháng thể hoặc kháng nguyên đặc hiệu tương ứng vào để tạo nên phản ứng kết
hợp kháng nguyên-kháng thể. Các kháng thể hoặc kháng nguyên đã biết trước
được gắn với enzym. Enzym sẽ phân hủy cơ chất không màu thành một sản phẩm
có màu đặc trưng. Mật độ màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường hoặc được
đọc chính xác bằng quang phổ kế.


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
2.1.2. Một số loại kỹ thuật ELISA thường dùng.
Dựa trên nguyên lý của các phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. Nếu muốn
tìm kháng nguyên trong hỗn dịch thì phải có kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên
đó đã biết hoặc ngược lại.
2.1.2.1.Kỹ thuật ELISA gián tiếp.
Nguyên lý: Kháng nguyên cần tìm trong mẫu thử được hấp phụ vào giếng nhựa.
Sau khi ủ và rửa, cho kháng thể đã biết rồi lại ủ một thời gian để phản ứng KN-KT
diễn ra. Rửa kháng thể thừa và cho kháng-kháng thể gắn enzym. Cuối cùng, rửa
KT gắn enzym thừa và cho cơ chất TMB. Đo mật độ quang của màu bằng quang
phổ kế hoặc mắt thường (xem sơ đồ 1).
Sơ đồ 1
Sinh màu

Cơ
KN ELISA
KTsandwich.
Kháng
2.1.2.2.Kỹ thuật
chất
cần
đã
KT gắn
tìmkhôngbiết
Nguyên lý: KT
đánh dấu enzym
(đã biết) đã được gắn lên trên chất mang (các
giếng của bản nhựa), sau đó cho mẫu thử có mang KN cần tìm và ủ. Rửa bỏ KN
thừa và cho KT có gắn enzym. Như vậy, nếu có KN thì nó bị kẹp giữa 2 KT (xem
sơ đồ 2). Sau khi rửa lần 2 để loại bỏ KT gắn enzym thừa thì cho dung dịch cơ chất
vào. Enzym sẽ phân hủy cơ chất sinh ra màu đặc trưng và mật độ quang học được
đo bằng quang phổ kế ở bước sóng 450nm.
Sơ đồ 2

KT
đã
biết

KN
cần
tìm

KT
gắn

enzym

Sinh màu
Cơ
chất

2.1.3 . ứng dụng để phát hiện HBsAg trong huyết thanh
(Sử dụng bộ chế phẩm của PHARMATECH- HBsAg EIA).


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
2.1.3.1. Nguyên lý (dựa trên nguyên lý kỹ thuật ELISA-sandwich 1 pha): KT đơn
dòng kháng HBsAg không đánh dấu enzym đã được gắn vào các giếng của bản
nhựa, đồng thời KT kháng HBsAg có gắn enzym peroxidase đã cho sẵn trong các
giếng (hạt màu xanh). Cho huyết thanh nghi ngờ có HBsAg vào và ủ. Rửa bỏ các
huyết thanh và KT gắn enzym thừa, sau đó cho cơ chất TMB (tetramethyl
benzidin). Nếu trong huyết thanh thử có HBsAg thì peroxidase sẽ phân hủy TMB
không màu thành dung dịch có màu xanh.
Sơ đồ 3

Sinh màu
KT
Kháng
HBsAg
đó biết

KN
HBsAg

cần tỡm

KT
gắn
peroxidase

Cơ
chất
TMB

2.1.3.2. Các chất liệu cần cho phản ứng
-

Huyết thanh hoặc huyết tương của máu người không cần nhịn đói.
Chuẩn bị các dung dịch đệm để rửa theo chỉ dẫn đi kèm bộ chế phẩm.
Một số dụng cụ cần thiết: Găng tay cao su, micropipet, đầu côn, giấy thấm.
Máy quang phổ kế để đọc kết quả

2.1.3.3. Các bước tiến hành
- Tính toán và lấy số giếng thử cần thiết
- Cho vào mỗi giếng thử 100µl huyết thanh bệnh nhân hay mẫu chứng gồm
chứng âm (không có HBsAg) và chứng dương (chắc chắn có HBsAg) của
hãng sản xuất.
- Nhỏ 50µl dung dịch kháng thể gắn enzym và mỗi giếng thử.
- ủ các giếng ở 370C trong 90 phút.
- Rửa mỗi giếng 4 lần bằng đệm phosphat. Sau rửa chú ý loại bỏ hết đệm
(dùng máy hút chân không hay đập mạnh trên giấy thấm)
- Nhỏ 100 µl dung dịch TMB cho mỗi giếng thử.
- ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.

Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
- Ngừng phản ứng bằng cách cho thêm 100µl H2SO4 1nmol/l trong mỗi giếng,
gõ nhẹ lên phiến nhựa để trộn đều.
- Kết quả được đọc trong khoảng thời gian 15 phút sau khi dừng phản ứng
bằng mắt thường hay máy đo quang phổ kế ở bước sóng 450 nm.
2.1.3.4. Đọc kết quả.
- Chứng âm: Giếng thử không đổi màu.
- Chứng dương: Giếng thử có màu xanh
- Kết quả mẫu thử âm tính: Màu giống màu chứng âm  trong huyết thanh thử
không có HBsAg
- Kết quả mẫu thử dương tính: Màu giống màu chứng dương trong huyết
thanh thử có HBsAg (độ đậm nhạt phụ thuộc nồng độ HBsAg có trong mẫu
thử).
2.2. Kỹ thuật ngưng kết
2.1.1. Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất
-

Bộ dụng cụ lấy máu đầu ngón tay hoặc bộ dụng cụ lấy máu tĩnh mạch
Lam kính 2,5 & 7,5cm
Bông thấm nước, cồn sát trùng 70 độ
Bộ huyết thanh mẫu để xác định nhóm máu ABO và bộ kit phát hiện kháng
thể kháng giang mai RPR-Nosticon ( Biomerieux).

2.1.2. Tiến hành kỹ thuật
2.1.2.1 Kỹ thuật xác định nhóm máu ABO
* Nguyên lý : Kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu khi gặp kháng thể tương ứng (đã
biết) thì sẽ tạo nên mạng lưới ngưng kết. Hồng cầu sẽ vón lại thành từng mảng hay

các hạt lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường so với mẫu chứng.
* Tiến hành :
-

Nhỏ 3 giọt máu lên lam kính
Sau đó nhỏ 3 giọt huyết thanh mẫu antiA, antiB, antiAB lên cạnh 3 giọt máu
Dùng đũa thủy tinh trộn đều ( sau mỗi lần trộn lau sạch đũa thủy tinh)
Để nhiệt độ phòng đọc kết quả sau 10 phút.


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
* Đọc kết quả: Dựa vào vị trí ngưng kết hay không ngưng kết và tên huyết thanh
đã biết, suy ra nhóm máu tương ứng.
2.1.2.2. Kỹ thuật phát hiện kháng thể giang mai:
* Nguyên lý: Người ta tổng hợp một số chất có cấu trúc giống kháng nguyên giang
mai (VDRL) gắn lên chất mang là cacbon với mục đích khi kháng nguyên kết hợp
với kháng thể thì có thể phát hiện được bằng mắt thường do các mẩu cacbon màu
đen bị ngưng kết thành dạng chấm tròn màu đen.
* Tiến hành
- Nhỏ 1 giọt huyết thanh lên vòng tròn của giấy
- Dùng que nhựa dàn đều huyết thanh
- Nhỏ 1 giọt kháng nguyên ( trước khi nhỏ lắc đều)
- Sau đó lắc tròn lam giấy một lúc để kháng nguyên tiếp xúc tốt với kháng thể
- Đọc kết quả sau 8 phút
* Kết quả:
- Chứng âm: không có chấm tròn màu đen
- Chứng dương: nhiều chấm tròn màu đen
- Mẫu huyết thanh dương tính: Khi thấy xuất hiện các chấm tròn màu đen, vậy

trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể kháng trực khuẩn giang mai


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ

Bài 3: MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM
SỐC TRUYỀN MÁU KHÁC LOÀI
I. MỤC TIÊU

1. Mô tả và giải thích được các thay đổi trong sốc truyền máu khác loài.
2. Phân tích được cơ chế bệnh sinh của sốc truyền máu.
II. MÔ HÌNH SỐC TRUYỀN MÁU

2.1 Trang bị, hoá chất và động vật thí nghiệm.
2.1.1 Động vật thí nghiệm:
- Chó khoẻ có trọng lượng từ 8-10 kg.
- Thỏ khoẻ trọng lượng 2-2,5 kg.
2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm:
- Bàn cố định chó, thỏ
- Bộ dụng cụ mổ
- Hệ thống ghi huyết áp và hô hấp


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
- Bộ dụng cụ đếm hồng cầu, bạch cầu: ống hút hồng cầu, ống hút bạch cầu,
buồng đếm Thoma.

- Kính hiển vi quang học.
- Bộ dụng cụ truyền máu
- Máy ly tâm.
- Đồng hồ bấm giây.
- Ống đo hematorit.
- Ống nghiệm, lam kính, lamen.
- Pipette, cốc đong.
- Bông, gạc, chỉ.
2.1.3 Hoá chất:
- Dung dịch chống đông: Citrat natri 7%, Heparin 5000 UI/ml.
- Dung dịch muối đẳng trương NaCl 9‰.
- Dung dịch đếm bạch cầu: acid acetic 3-5%.
- Thuốc tê Novocain.
2.2 Chuẩn bị thí nghiệm:
2.2.1 Lấy hồng cầu thỏ:
- Thỏ được cố định trên bàn mổ. Cắt lông vùng cổ.
- Gây tê tại chỗ bằng Novocain. Bộc lộ động mạch cảnh.
- Luồn canuyl vào động mạch cảnh.
- Dẫn lưu toàn bộ máu thỏ ra lọ thuỷ tinh có chứa sẵn 20 ml dung dịch
chống đông Citrat Natri 7%.
- Máu chống đông được ly tâm tách riêng hồng cầu bỏ huyết tương và lọc
loại trừ cục máu đông.
- Tái hoà tan hồng cầu bằng đúng thể tích huyết tương đã loại bỏ với dung
dịch NaCl 9‰.
2.2.2. Chuẩn bị chó:
- Chó được cố định trên bàn mổ
- Cắt lông cổ
- Gây tê tại chỗ bằng Novocain ở vùng cổ và vùng bẹn chân sau.
- Bộc lộ động mạch cảnh luồn canuyn vào để đo huyết áp trực tiếp trong
lòng mạch bằng huyết áp kế thuỷ ngân.

- Bộc lộ khí quản, luồn kim đo hô hấp vào khí quản, kim này được nối
thông với trống Marey (có gắn kim ghi biên độ trên băng giấy).
- Bộc lộ tĩnh mạch đùi phải để lấy máu kiểm tra các chỉ số trước và sau
sốc.
- Bộc lộ tĩnh mạch đùi trái để truyền hồng cầu thỏ.
2.3. Tiến hành thí nghiệm:
2.3.1. Xác định các chỉ số ở thời điểm trước truyền:


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
* Các chỉ số về huyết động:
- Huyết áp động mạch: được xác định qua huyết áp kế thuỷ ngân. Đo giá
trị huyết áp động mạch trực tiếp trong lòng mạch, giá trị huyết áp thu
được là giá trị huyết áp lấy điểm giữa của khoảng cách dao động cột thuỷ
ngân.
- Tần số mạch: được xác định qua số lần mạch nảy trong một phút tại động
mạch đùi bên phải.
* Các chỉ số hô hấp:
- Tần số hô hấp: đếm số lần lên xuống của trống Marey trong một phút.
- Biên độ hô hấp: ghi độ dao động của kim ghi trên băng giấy được gắn
trên mặt trống Marey.
* Các chỉ số huyết học:
- Số lượng hồng cầu: Đếm bằng buồng đếm Thoma. Dùng ống hút hồng
cầu hút máu (ngay sau khi lấy máu ra khỏi lòng mạch). Sau đó pha loãng
200 lần với dung dịch nước muối đẳng trương (NaCl 9‰). Lắc đều, bỏ
vài giọt đầu, nhỏ lên buồng đếm và đếm số lượng bằng kính hiển vi
quang học.
- Số lượng bạch cầu: Cũng được xác định bằng buồng đếm Thoma. Dùng

ống hút bạch cầu để hút máu, sau đó pha loãng với dung dịch bạch cầu để
phá vỡ hồng cầu với độ pha loãng 20 lần. Lắc đều bỏ vài giọt đầu, nhỏ
lên buồng đếm và đưa lên kính hiển vi quang học xác định số lượng.
- Hematocrit: Theo phương pháp microhematocrit xác định cột hồng cầu.
Lấy máu cho vào ống đo có tráng Heparin, sau đó bịt một đầu bằng sáp.
Tiến hành ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút x 5 phút, sau đó xác định
tỷ lệ chiều cao cột hồng cầu so với máu toàn phần.
* Các chỉ số khác:
- Thời gian đông máu: Xác định khoảng thời gian từ khi lấy máu ra khỏi
lòng mạch tới khi nghiêng lam kính không có sự biến dạng của cục máu.
Nhỏ một giọt máu lên lam kính sạch với điều kiện giọt máu tròn, có độ
vồng, đường kính 0,7-1,0cm.
- Hiện tượng dung huyết: Lấy 2ml máu chống đông, cho vào ống nghiệm.
Ly tâm tách riêng hồng cầu và huyết tương với tốc độ 5000 vòng/ phút,
quan sát mầu huyết tương thu được.
- Phản ứng chéo giữa hồng cầu thỏ và huyết thanh chó: Nhỏ một giọt hồng
cầu thỏ và một giọt huyết thanh chó lên lam kính, dùng que thuỷ tinh trộn
đều. Lam kính được đưa lên kính hiển vi quang học và quan sát hiện
tượng ngưng kết trên lam kính (cũng có thể quan sát bằng mắt thường).


Tài liệu thực hành môn
Miễn dịch
dùng cho sinh viên hệ bác sĩ
- Chứng minh vai trò bổ thể: Huyết thanh chó chia 2 ống: 01 ống để ở
nhiệt độ phòng, ống còn lại để ở 56°C trong 30 phút sau đó cho một giọt
hồng cầu thỏ vào mỗi ống và ủ ở 37 0Cx10phút. Ly tâm 2000 vòng/phút x
5 phút và nhận xét sự khác nhau giữa 2 ống.
- Tình trạng toàn thân của chó.
2.3.2 Tiến hành truyền dịch hồng cầu thỏ cho chó qua đường tĩnh mạch đùi

với tốc độ
- 25-30 giọt/ phút. Theo dõi sự biến đổi của huyết áp, mạch và hô hấp cũng như
tình trạng toàn thân của chó trong toàn bộ quá trình truyền.
- Khi huyết áp còn 50- 60 mmHg ngừng truyền lấy lại toàn bộ các chỉ tiêu giống
như trước khi truyền, ghi vào biên bản.
Bảng kết quả thí nghiệm sốc truyền máu khác loài:
Các chỉ số

Trước sốc

Sau sốc

Mạch
Huyết áp
Hô hấp
Phản ứng chéo
Vai trò bổ thể
Số lượng bạch cầu
Hematocrit
Thời gian đông máu
Hiện tượng tan máu
Tình trạng toàn thân
2.3.3 Nhận xét và giải thích kết quả thu được, trên cơ sở đó phân tích cơ
chế bệnh sinh của sốc truyền máu khác loài.