ứng dụng của enzyme trong y học

Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CNSH - KTMT

NHÓM: 7
ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG Y HỌC

BÀI BÁO: Anti-inflammatory activity of a sulfated
polysaccharide isolated from an enzymatic digest of brown
seaweed Sargassum horneri in RAW 264.7 cells
BÀI TIỂU LUẬN MÔN: CÔNG NGHỆ ENZYME
GVHD: ĐỖ THỊ HIỀN

TPHCM, ngày 7 tháng 5

năm 2017
1

Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

1.

GVHD: Đỗ Thị Hiền

GIỚI THIỆU
Các macrophages(Đại thực bào (tiếng Anh: "macrophage") là những tế bào

bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch
không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống.
Vai trò chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các
tác nhân gây bệnh) đóng một vai trò quan trọng trong các phản ứng viêm
thông qua việc giải phóng các yếu tố viêm khác nhau như nitric oxide (NO),
Prostaglandins( (PG) là các acid béo không bão hòa ở các mô, có vai trò như
một chất trung gian hóa học của quá trình viêm và cảm nhận đau, ngoài ra còn
có các tác dụng sinh lý ở các mô riêng biệt), enzym tổng hợp oxi nitric
(iNOS), cyclooxygenase (COX) -2 và các cytokine như yếu tố hoại tử khối u
(TNF - tumor necrosis factor) Α và interleukin (IL) -6 [1,2]. Đặc biệt, các đại
thực bào có thể được kích thích bởi các cytokine pro-inflammatory và
endotoxin như lipopolysaccharide (LPS) và nó gây phản ứng viêm [1]. Ngoài
ra, nó đã được chứng minh rằng trong quá trình viêm, sự phát triển bất thường
của NO và prostaglandin E2 (PGE2)(PGE là một loại tan trong môi trường
Ether trong đó

đặc biệt là PGE2 được giải phóng do kích thích cơ học, hóa

học, nhiệt, vi khuẩn có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch
gây viêm và đau.) là do sự kích hoạt của iNOS và COX-2 được biết đến như
là hai chất trung gian gây viêm . pleiotropic điều hòa tập trung tiểu cầu, thấm
qua mạch và Sự hình thành thrombus(một là một cục máu đông gậy để các
bức tường của một mạch máu hoặc cơ quan. Đôi khi một thrombus có thể cản
trở các tàu. Điều này là có hại vì nó ngăn chặn dòng chảy của máu.) [2].
Ngoài ra, kích thích LPS có thể điều chỉnh biểu hiện của COX-2 và iNOS và
các chất bài tiết của TNF-α, IL-1β, và IL-6 được biết đến như các cytokine
2

Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

pro-inflammatory chính bằng kích hoạt yếu tố hạt nhân-kB (NF-κB) (MAPK)
được gọi là phân tử thượng lưu của nó [2,3]. Do đó, việc ức chế các chất
trung gian gây viêm và cytokine có thể là một cách tiếp cận hữu ích để điều
trị các bệnh viêm.
Môi trường biển được xem là một kho tàng vô giá của các hợp chất hoạt
tính sinh học vì chúng có các biến thể hóa học và sinh học lớn [4]. Trong số
các sinh vật biển đã được nghiên cứu, rong biển nâu có nhiều hợp chất với
nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm các phản ứng chống viêm, chống oxy hóa,
chống vi khuẩn và bảo vệ thần kinh [5]. Các nghiên cứu in vitro và in vivo
gần đây cho thấy các polysaccharides phân lập từ tảo biển có khả năng điều
trị tuyệt vời chống lại các phản ứng viêm [6]. Việc cô lập các hợp chất hoạt
tính sinh học từ rong biển phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện chiết xuất. Tuy
nhiên, một lượng lớn các polysaccharides trong các rong biển này hoạt động
như một rào cản vật lý hạn chế việc sử dụng các phương pháp chiết xuất hóa
học và cơ khí truyền thống. Do đó, các phương pháp chiết xuất có hỗ trợ
enzyme (EEMs) có thể tiêu hóa các thành tế bào thường được sử dụng để cô
lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ rong biển [7]. Các chiết xuất enzyme
này cho thấy tính an toàn của thực phẩm tăng lên và tính hòa tan trong nước
so với các chất chiết xuất dung môi hữu cơ, đây là một lợi thế khi sử dụng
EEMs bổ sung vào dung môi chiết [8].
Sargassum horneri (S. horneri) là một loài tảo nâu có thể ăn được, phát
triển trong khu vực bãi triều như là một loài hàng năm dọc theo bờ biển Trung
Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc. Thân hình của S. horneri có thể đạt chiều dài

trên 7 m và trọng lượng tươi là 3 kg [9]. Các báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng
S. horneri bao gồm vitamin, axit amin và polysaccharides đã được sử dụng
như một nguồn thực phẩm cũng như một thành phần trong y học cổ truyền
3
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

trong hàng ngàn năm ở các nước châu Á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản và
Trung Quốc [10,11 ]. Theo các báo cáo trước đây, polysaccharide sulfate và
một số chất chiết xuất từ S. horneri đã gây ra các đặc tính sinh học mạnh mẽ
trong điều kiện in vitro như tính chất chống oxy hoá và chống ung thư [12].
Tuy nhiên, có rất ít thông tin về khả năng chống viêm của polysaccharides
phân lập từ chủng S. horneri Trung Quốc và cơ chế sinh học của nó. Hơn nữa,
trong vài năm gần đây, một số lượng lớn S. horneri đã di chuyển vào bờ biển
đảo Jeju từ bờ biển phía đông của Trung Quốc và gây ra thiệt hại đáng kể
trong ngành đánh bắt cá và vẻ đẹp của bờ biển xung quanh đảo Jeju. Tại thời
điểm này, việc sử dụng S. horneri là rất quan trọng để giải quyết các vấn đề ở
Hàn Quốc đã gây ra từ rong biển này. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi
đã chuẩn bị 4 loại polysaccharides thô từ chủng S. horneri China bằng cách sử
dụng bốn loại enzyme thực phẩm bao gồm amyloglucosidase (AMG),
Celluclast, Viscozyme và Alcalase và đánh giá các hoạt động chống viêm và
cơ chế sinh học của chúng.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU

S. horneri Trung Quốc đã được thu thập từ tháng 5 đến tháng 6 năm

2015, dọc theo bờ biển đảo Jeju ở Hàn Quốc. S. horneri của Trung Quốc đã được
Viện nghiên cứu đa dạng sinh học Jeju (Jeju, Hàn Quốc) xác định.
2.2. HÓA CHẤT

Dòng tế bào macrophage RAW 264.7 đã được mua từ Ngân hàng Dòng Tế
Bào (KCLB, Seoul, Hàn Quốc). Chất trung gian Eagle được cải tiến của
Dulbecco (DMEM), penicillin-streptomycin và huyết thanh của bào thai bò
(FBS) đã được mua từ Gibco BRL (Burlington, ON, Canada). Các sản phẩm này
4
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

đã được mua lại dưới dạng bột KBr của FT-IR, 3- (4, 5-dimetylthiazol-2-yl) -2,
5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), fucoidan
(sản phẩm F5631-1G) Từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Ba enzyme
phân hủy carbohydrate (AMG, Celluclast, và Viscozyme) và một protease
(Alcalase) được mua tại Novo Nordisk (Bagsvaerd, Đan Mạch). Các bộ dụng cụ
ELISA cho TNF-α, IL-1β và PGE2 được mua từ R & D Systems Inc.
(Minneapolis, MN, USA). Tất cả các hóa chất và thuốc thử khác được sử dụng
trong các thí nghiệm này đều thuộc nhóm phân tích.
2.3. PHƯƠNG PHÁP
2.3.1. CHUẨN

BỊ CÁC ENZYME TIÊU HÓA S. HORNERI

Các mẫu S. horneri đã đông khô đã được đồng nhất với một máy xay để

thu được bột mịn. Các phản ứng thủy phân enzyme được thực hiện bằng cách sử
dụng các phương pháp của Heo et al. [số 8]. Tóm lại, 2 g bột S. horneri đã được
ủ trong 100 mL nước cất (DW) với 20 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,
Viscozyme, hoặc Alcalase ở nhiệt độ và độ pH tối ưu như Heo và cộng sự đã mô
tả. [số 8]. Sau 24 giờ, các mẫu được ly tâm ở 2.774 × g trong 10 phút và các dịch
nổi trên bề mặt được lọc với Watman No.4 (GE Healthcare, Buckinghamshire,
Anh). Sau đó, các dịch nổi trên bề mặt được làm khô bằng đông lạnh và được sử
dụng làm enzym tiêu hóa.
2.3.2. TÁCH

CÁC POLYSACCHARID THÔ TỪ ENZYME TIÊU

HÓA
Các polysaccharides thô đã được điều chế từ bốn chất chiết xuất từ
enzyme theo phương pháp của Shao et al. [13] với một số sự thay đổi nhỏ. Tóm
lại, các enzyme tiêu hóa được trộn với 95% ethanol đến một nồng độ cuối cùng
là 66%. Hỗn hợp được bảo quản ở 4 ℃ trong 24 giờ, và sau đó các chất kết tủa
5
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

được thu nhận bằng cách ly tâm ở 10.000 xg trong 20 phút ở 4 ℃. Các kết tủa
được làm khô bằng đông lạnh và được sử dụng làm polysaccharides thô (CPs).
Các CPs đông khô đã được giải thể trong PBS để sử dụng trong các thí nghiệm.
Các CP được tách ra từ bốn loại enzym tiêu hóa với AMG, Celluclast,
Viscozyme, và Alcalase được chỉ định như sau. AMGCP, polysaccharides thô từ

quá trình tiêu hoá enzym AMG; CCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu
hoá enzyme Celluclast; VCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa
enzyme Viscozyme; AlCP, polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzyme
Alcalase.
2.3.3. PHÂN

TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Tổng hàm lượng polysaccharide được đo bằng phương pháp axit phenol
sulfuric như được mô tả bằng phương pháp được mô tả bởi DuBois et al. [14] sử
dụng glucose làm chuẩn. Tổng hàm lượng phenol được định lượng bằng cách sử
dụng một hệ thức được mô tả bởi Chandler và Dodds [15] . Bằng cách sử dụng
axit gallic làm chuẩn. Hàm lượng protein của tất cả các mẫu được định lượng
bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (Thermo
Scientific, Rockford, IL, USA) sử dụng albumin huyết thanh bò theo tiêu chuẩn.
Cuối cùng, hàm lượng sulfat trong CP đã được kiểm tra bằng phương pháp BaCl2
gelatin bằng Na2SO4 theo tiêu chuẩn như được mô tả bởi Saito và cộng sự [16]
với những thay đổi nhỏ.
Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR).
Các phổ hồng ngoại của CP được ghi lại bằng quang phổ FT-IR (quang phổ
Nicolet ™ 6700 FT-IR, Madison, WI, USA). Các CPs đã được đồng nhất với bột
KBr và sau đó ép thành viên để đo FT-IR trong dải tần số 500-4000 cm-1.
2.3.4.

NUÔI CẤY TẾ BÀO
6

Ứng dụng của enzyme trong y học

Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

Tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS không
hoạt hóa, 1% streptomycin (100 μg / mL) và penicillin (100 đơn vị / mL). Các tế
bào RAW 264.7 được ấp dưới 5% CO2 tại 37 ℃ (Vườn ươm Sanyo MCO-18AIC
CO2, Moriguchi, Nhật Bản). Các tế bào nuôi cấy từ đoạn 4-6 đã được sử dụng
cho các thí nghiệm.
2.3.5.

THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CỦA TẾ BÀO

Các cytotoxicity của CPs để RAW 264,7 tế bào đã được đánh giá thông qua
các thử nghiệm MTT colorimetric như được mô tả bởi Mosmann [17], với những
sửa đổi nhỏ. Tóm lại, các tế bào (1 x 105 tế bào / mL) đã được gieo trong một
tấm 24 giếng và ủ trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được điều trị bằng CP (50 μg /
mL và 100 μg / mL) trong 24 giờ. Thuốc thử MTT (200 μg / mL) được thêm vào
mỗi giếng. Sau 3 giờ ủ, các tinh thể formasan đã được hòa tan trong DMSO, và
lượng formazan xanh-đen được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở 540 nm. Mật
độ quang phổ của formazan tạo ra trong các tế bào kiểm soát không được điều trị
được coi là đại diện cho khả năng sống sót 100%. Dữ liệu được biểu diễn dưới
dạng phần trăm trung bình của các tế bào khả thi so với các kiểm soát tương ứng.
Xác định sản xuất NO
Để xác định hiệu quả của CP đối với việc sản xuất NO trong tế bào RAW
264.7 kích thích LPS, chúng tôi đã thực hiện khảo nghiệm griess được Leiro et
al. [18] với những thay đổi nhỏ. Tóm lại, các tế bào (1 x 10^5 tế bào / ml) đã
được gieo hạt trong các tấm 24 giếng và ủ trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được
điều trị với CPs (50 μg / mL và 100 μg / mL) trong 1 giờ và kích thích với LPS
(1 μg / mL) trong 24 giờ. Cuối cùng, dung dịch nuôi cấy và chất thử Griess đã

được phản ứng trong một tấm 96 giếng trong 10 phút, và độ hấp thụ được đo ở
540 nm sử dụng máy đọc ELISA (BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA).
7
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

Mật độ quang học của NO được sản xuất trong các tế bào được điều trị LPS chỉ
được coi là đại diện cho 100%. Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng tỷ lệ phần trăm
trung bình của sản xuất NO so với sản xuất NO của tế bào được điều trị LPS
Xác định sản xuất PGE2
Prostaglandins( (PGE2) là các acid béo không bão hòa ở các mô, có vai trò
làm giảm thành mạch, tăng tính thấm thành mạch, gây viêm và đau. ngoài ra còn
có các tác dụng sinh lý ở các mô riêng biệt) đóng một vai trò quan trọng trong
việc điều chỉnh phản ứng viêm [19]. Các tế bào RAW-264.7 được nuôi cấy và
điều chỉnh với nồng độ (1 x 105 tế bào / ml) các polysaccharide đo được, và sau
1 giờ ủ, tế bào được kích thích với LPS (1 μg / mL). Sau 24 giờ ủ, nồng độ PGE2
trong chất nổi lên được định lượng bằng cách sử dụng một bộ thử miễn dịch
enzyme cạnh tranh, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đo lường sản xuất TNF-α và IL-1β.
Tế bào RAW 264.7 (1 x 105 tế bào / giếng) đã được xử lý trước bằng CCP
(25 μg / mL, 50 μg / mL, và 100 μg / mL) trong 1 giờ và ủ với LPS (1 μg / mL)
trong 24 giờ. Các mức sản xuất TNF-α và IL-1β trong tế bào chất macrophage
được định lượng bằng các bộ dụng cụ ELISA, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.6.

PHÂN TÍCH WESTERN BLOT.

Để xác định hiệu quả của CCP đối với mức biểu hiện protein của iNOS,
COX-2, NF-κB, và MAPK trong các tế bào RAW 264.7 kích thích LPS, việc
phân tích Western blot đã được thực hiện. Tóm lại, các tế bào RAW 264.7 (1 x
105cells / mL) đã được gieo trong 6-giếng và ủ trong 24 giờ. Các tế bào được
điều trị bằng CCP (25 μg / mL, 50 μg / mL và 100 μg / mL) trong 1 giờ. Và sau
đó, các tế bào được kích thích với LPS (1 μg / mL) trong 10 phút hoặc 20 phút và
24 giờ. Các protein nucleic và cytosolic được chiết xuất từ các tế bào bằng bộ
8
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

chiết xuất hạt nhân và tế bào chất của NE-PER® (Thermo scientific, Rockford,
USA).
Sau khi tách trên một gel SDS-polyacrylamide 10% dưới điều kiện biến
tính, các protein tế bào chất (40 μg) được truyền điện trên một màng
nitrocellulose. Sau khi chặn sữa non 5% trong 1 giờ, các blot được ủ riêng với
các kháng thể chính sau đây: các kháng thể polyclonal thỏ (iNOS, p44 / 42
(ERK, kinase điều hoà tín hiệu ngoại bào), phosphoryl hóa p44 / 42 (ERK), P38,
phosphoryl hóa p38, NF-κB p65, NF-κB p50, và nucleolin), và các kháng thể đơn
dòng chuột (COX-2, và β-actin) (Công nghệ báo hiệu bằng tế bào, Beverly, MA,
USA) trong 1 giờ. Các blot được rửa hai lần với Tween 20 / dung dịch đệm Tris
(TTBS) và sau đó ủ với IgG liên hợp HRP hoặc IgG chống lại thỏ trong 45 phút.
Sự liên kết kháng thể được hình dung bằng cách sử dụng thuốc thử hóa học tăng
hóa học (ECL) (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Nồng độ bazơ của mỗi
protein được bình thường hoá bằng cách phân tích mức độ protein β-actin hoặc

nucleolin bằng cách sử dụng chương trình ImageJ.
2.3.7.

PHÂN TÍCH THỐNG KÊ.

Tất cả các dữ liệu được thể hiện như giá trị trung bình của ba thí nghiệm. Các dữ
liệu thu thập được, sẽ được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm phân tích thống
kê SPSS v20. Các giá trị trung bình của mỗi thí nghiệm được so sánh bằng cách sử
dụng phương pháp phân tích một chiều. Phép kiểm định Duncan (DMRT) được sử
dụng để so sánh các cặp của các nghiệm thức và tìm ra sự khác biệt trung bình. Một
giá trị P <0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê.

3. KẾT QUẢ
3.1. Năng suất khai thác và các thành phần chung
9
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

Trước hết, chúng tôi chuẩn bị bốn loại enzyme chiết xuất từ S. honeri và
kiểm tra năng suất chiết xuất của chúng. Kết quả cho thấy sản lượng khai thác của
enzym tiêu hóa (AMG, 16,00 ± 0,50%, Celluclast, 20,17 ± 0,76%, Viscozyme,
21,0 ± 1,00% và Alcalase, 22,17 ± 0,76%) tăng đáng kể so với của chiết xuất DW
(9,50 ± 0,87%).
Tiếp theo, chúng tôi phân lập polysaccharides thô từ các enzyme tiêu hóa
(CPs) và phân tích sản lượng cô lập và thành phần gần nhau. Trong số CP, CCP đã
dẫn tới sản lượng cô lập cao nhất (88,7%), so với các sản phẩm khác (AMGCP,

VCP và AlCP). Như được chỉ ra trong Bảng 1, bốn loại CPs chứa polysaccharide là
chính và hàm lượng protein và polyphenolic nhỏ. Đặc biệt, CCP có hàm lượng
polysaccharide và sulfate cao nhất (tương ứng là 88,7 ± 2,44% và 12,01 ± 0,98%).
Từ những kết quả này, chúng tôi chỉ ra rằng các CCP riêng lẻ có thể tạo các
polysaccharides sulfate do các thành phần polysaccharide và sulfate dồi dào.
BẢNG 1: Các thành phần tổng hợp của polysaccharide thô

Tất cả các giá trị trung bình SD ± (n = 3). Các chữ cái khác nhau trong cùng cột có nghĩa là sự
khác biệt đáng kể giữa các mẫu ở mức P <0,05 bằng xét nghiệm đa lớp của Duncan. AlCP, các
polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzym enzym alcalase; AMGCP, polysaccharides thô từ quá trình
tiêu hoá enzym AMG; CCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hoá enzyme celluclast; VCP, các
polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzyme viscozyme.

3.2. Phổ FT-IR của CP

Quang phổ FT-IR là một cách tiếp cận phân tích hữu ích để xác định dao
động giữa các nguyên tử khác nhau trong các phân tử. Phổ thu được từ 400-4000
cm-1 có thể được sử dụng để phân tích các đặc tính cấu trúc của polysaccharides,
bao gồm các liên kết glucosidic và các nhóm chức [20,21]. Trong nghiên cứu này,
quang phổ FT-IR của bốn CPs được so sánh với quang phổ của loài tảo đá mua từ
Sigma-Aldrich. Điều thú vị là, CCP có phổ hồng ngoại tương tự như phổ loài tảo
đá thương mại (Hình 1). Ngược lại, AlCP cho thấy một mô hình hoàn toàn khác so
với các CP khác và loài tảo đá thương mại. Một báo cáo cho rằng sự hấp thụ mạnh
10
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

ở 840 cm-1 (một nhóm sulfat ở C-4) và hấp thụ ở 820 cm-1 (một nhóm sulfat ở C2) là duy nhất cho loài tảo đá bản địa. Ngoài ra, sự hấp thụ ở 1.240 cm-1 biểu thị
các nhóm este sulfate được tìm thấy trong loài tảo đá thương mại [22,23,24]. Hơn
nữa, các băng tần phát triển ở mức 1,646-1,652 cm-1 do dao động của HOH và các
dải rộng ở trung tâm ở 2920-2940 cm-1 là độ dao động của C-H. Ngoài ra, các dải
trong vùng giữa 3.400-3.410 cm-1 được phát triển do sự dao động kéo dài của O-H
cho thấy nhóm hydroxyl tồn tại trong loài tảo đá [25,26].
Hình 1: Phổ FT-IR của các polysaccharides thô được chiết xuất từ rong biển nâu
S. horneri và loài tảo đá thương mại.

AMGCP, polysaccharides thô từ quá trình tiêu hoá enzym AMG; CCP, các polysaccharides thô từ
quá trình tiêu hoá enzyme Celluclast; VCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzyme
Viscozyme; AlCP, polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzyme Alcalase .

3.3. CCP cho thấy hiệu quả ức chế cao nhất đối với sản xuất NO trong tế bào RAW

264.7 kích thích bởi LPS mà không có độc tới tế bào
Các thí nghiệm về khả năng sống sót của tế bào cho thấy không có
cytotoxicity trong các tế bào RAW 264.7 ở bất kỳ CP nào, với hơn 90% có khả
năng sống sót (Hình 2A). Thêm vào đó, 100 μg / ml AMGCP, CCP, VCP, và AlCP
ức chế sự sản sinh NO của tế bào RAW 264.7 do kích thích LPS (Hình 2B). Cụ
thể, trong số các CP, CCP có tác động ức chế cao nhất đối với sản xuất NO trong tế
bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS, với giá trị IC50 là 95,7 μg / mL và phụ
11
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

thuộc liều lượng. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng CCP có tác dụng ức chế sản
sinh NO trong tế bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS và không gây độc tế bào. Do
đó, CCP đã được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2: (A) độc tính học của các polysaccharides thô (CP) trên các tế bào RAW
264.7 với sự có mặt của LPS. Tính khả thi của tế bào không có mẫu và LPS đã được dùng
làm tài liệu tham khảo (100%). (B) Sự ức chế phụ thuộc liều lượng do NO sản sinh bởi
CPs
trong
RAW264.7
kích
thích
LPS
...

Tế bào RAW 264.7 (1 x 105) được kích thích với LPS (1 μg / mL) trong 24 giờ có hoặc không có
CCP. Dịch nổi thu thập được và các mức PGE2 trong dịch nổi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp
ELISA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Điểm dữ liệu và thanh đại diện cho các số học ± SD (n = 3). Mỗi
điểm dữ liệu thể hiện giá trị trung bình ± SD (* P <0,05 theo thử nghiệm đa phạm của Duncan). DWCP,
polysaccharide thô từ quá trình tiêu hóa nước cất; AMGCP, polysaccharides thô từ quá trình tiêu hoá
enzym AMG; CCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hoá enzyme celluclast; VCP, các
polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzyme viscozyme; AlCP, các polysaccharides thô từ quá trình
tiêu hóa enzym enzym alcalase.

3.4. Liều lượng CCP phụ thuộc vào sự giảm tiết PGE2 khỏi các tế bào RAW 264.7

kích thích bởi LPS
Tiếp theo, chúng tôi đánh giá hiệu quả của CCP đối với sản xuất PGE2
trong các tế bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS. Như thể hiện trong Hình. 2C, sự
kích thích LPS đã tạo ra PGE2 trong các tế bào RAW 264.7.

3.5. CCP làm giảm mức biểu hiện của iNOS và protein COX-2 trong các tế bào RAW
264.7 kích thích bởi LPS
Tác dụng ức chế của CCP đối với sự biểu hiện protein của iNOS và COX-2
được đo bằng phương pháp phân tích western blot. Như thể hiện trong Hình. 3A và
3B, CCP phụ thuộc vào liều lượng giảm xuống mức biểu hiện của iNOS và COX-2
trong tế bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS, so với các mức trong các tế bào được
điều trị LPS duy nhất.
12
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

Hình 3: Ảnh hưởng của các polysaccharides thô từ tiêu hóa enzyme Celluclast
(CCP) đối với sự biểu hiện protein iNOS và COX-2 do LPS tạo ra trong các tế bào RAW
264.7.

Các tế bào (1 x 105 tế bào / ml) được điều trị với nồng độ chỉ định CCP (25, 50, hoặc 100 μg / mL) trong 1 giờ trước
khi LPS (1 μg / mL) trong 24 giờ. Lysates tế bào (40 μg) được giải quyết bằng 10% SDS-PAGE, chuyển sang màng
nitrocellulose, và thăm dò với các kháng thể chống lại iNOS và COX-2. (A) Các protein sau đó được ECL nhìn nhận.
(B) cường độ của dải được đo bằng phần mềm ImageJ. Số lượng tương đối của iNOS và COX-2 so với β-actin và tỉ
lệ mật độ biểu thị cường độ tương đối của mỗi dải so với nhóm chất β-actin. Gel được hiển thị là một đại diện của
các kết quả từ ba thí nghiệm riêng biệt. Ảnh hưởng ức chế của ảnh hưởng của các polysaccharides thô từ CCP đối
với việc sản xuất các cytokine pro-inflammatory trong các tế bào RAW 264.7 kích thích LPS. Tế bào RAW 264.7 (1 x
105) được kích thích với LPS (1 μg / mL) trong 24 giờ có hoặc không có CCP. Supernatants được thu thập, và nồng
độ TNF-α (C) và IL-1β (D) trong môi trường nuôi cấy được xác định bằng phương pháp ELISA theo hướng dẫn của
nhà sản xuất. Điểm dữ liệu và thanh đại diện cho các số học ± SD (n = 3). Mỗi điểm dữ liệu đại diện cho trung bình
± SEM (* P <0,05).

13
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

3.6. CCP làm giảm sự tiết của các cytokine tạo viêm từ các tế bào RAW 264.7 kích
thích LPS
CCP giảm sự tiết các cytokine tạo viêm từ RAW kích thích bởi LPS. Đây là một thực tế
được khẳng định rằng sự sản xuất quá nhiều các cytokine gây viêm, bao gồm TNF-α và
IL-1β, có vai trò quan trọng trong sự hình thành các bệnh viêm nhiễm [27],[ 28],[29]. Do
đó, các hợp chất có tính chất ức chế chống lại TNF-α và IL-1β được coi là các chất chống
viêm. Để kiểm tra tác dụng chống viêm tiềm tàng của CCP, các mức cytokine viêm, như
TNF-α và IL-1β, trong môi trường nuôi cấy nổi được đo bằng ELISA. Kết quả cho thấy
rõ ràng sự bài tiết TNF-α và IL-1β tăng lên đáng kể khi kích thích bằng LPS (Hình 3C,
3D). Thật thú vị, sự tiết ra các cytokine tạo viêm đã được ức chế bằng cách điều chỉnh
CCP với liều lượng thích hợp.
3.7.
CCP ức chế sự truyền tín hiệu NF-κB và MAPK trong các tế bào RAW 264.7
kích thích LPS
Sử dụng phân tích western blot, chúng tôi đã điều tra tác động của CCP đối với các hoạt
động của NF-κB và MAPK trong các tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS. Như
thể hiện trong hình. 4A và 4B, kết quả cho thấy nồng độ protein NF-κB p50 và p65 của tế
bào chất cytosol giảm khi kích thích LPS trong tế bào RAW 264.7, so với các tế bào đối
chứng không điều trị. Tuy nhiên, việc điều trị CCP (100 μg / mL) ức chế sự giảm mức
cytosolic p50 và p65 trong các tế bào RAW 264.7 kích thích LPS. CCP cũng ức chế sự
dịch chuyển của p50 và p65 tới hạt nhân so với các tế bào RAW 264.7 chỉ kích thích LPS

(Hình 4C và 4D). Trong nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi kiểm tra tác động của CCP trên
con đường tín hiệu MAPK được biết đến như là một phân tử thượng nguồn. Điều thú vị
là, CCP giảm quy mô phosphoryl hóa của p38 và ERK nhờ sự kích thích LPS trong các tế
bào RAW 264.7 (Hình 4E và 4F). Từ những kết quả này, chúng tôi cho rằng CCP có tác
dụng chống viêm bằng cách ức chế sự hoạt hóa của MAPK và tín hiệu NF-κB bằng cách
giảm sự phosphoryl hóa p38 và ERK và chuyển NF-κB p50 và p65 thành hạt nhân.
Hình 4: Tác động ức chế của các polysaccharides thô từ enzym tiêu hóa Celluclast
(CCP) trên sự kích hoạt NF-κB và MAPK trong các tế bào RAW 264.7 kích thích LPS.

14
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

Tế bào RAW 264.7 được điều trị bằng LPS (1 μg / mL) hoặc CCP (100 μg / mL) trong 10 hoặc 20 phút. (A) và (B)
Các chất chiết xuất từ tế bào Cytosolic, (C) và (D) được giải quyết bằng SDS-PAGE 10%, chuyển sang màng
nitrocellulose và thăm dò các kháng thể chống lại NF-κB p50 và p65 . Các protein sau đó được ECL nhìn nhận. (E)
và (F) Ảnh hưởng của CCP đối với kích hoạt MAPK do LPS gây ra trong các tế bào RAW 264.7. Tế bào RAW 264.7
được điều trị bằng LPS (1 μg / mL) hoặc CCP (100 μg / mL) trong 10 hoặc 20 phút. Tổng protein (40 μg) được tách
ra bằng 10% SDS-PAGE, chuyển sang màng nitrocellulose, và thăm dò với các kháng thể chống lại ERK và p38.
Các protein sau đó được ECL nhìn nhận. Cường độ của dải được đo bằng phần mềm ImageJ. Tỷ lệ tương đối của tỉ
lệ mật độ biểu thị cường độ tương đối của mỗi dải so với so với tiêu chuẩn của protein. Các kết quả được trình bày
là đại diện cho những kết quả thu được từ ba thí nghiệm độc lập. Mỗi điểm dữ liệu đại diện cho trung bình ± SEM (*
P <0,05).

4.

THẢO LUẬN

EEM là hợp chất chiết xuất màu xanh quan trọng để tăng hiệu suất tách chiết so
sánh khi tách chiết với nước và tách chiết với dung môi hữu cơ. Hợp chất từ EEM là rẻ và
an toàn sử dụng trong thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và các sản phẩm phụ. Theo các tài
liệu tách chiết, chúng ta có thể quan sát được kỹ thuật EEM đạt được hiệu suất tách chiết
tăng đáng kể với những tế bào có khả năng sống và trong phòng tốt hơn để không bị ức
chế bởi nguyên liệu LPS 264.7 tế bào trong nồng độ đối chứng của nước
Rất nhiều polysaccharides chống viêm đã được phân lập từ tảo nâu và vai trò của
chúng như các tác nhân chống viêm đã được ghi chép tốt trong nhiều tài liệu [30].
Fucoidan là một polysaccharide sulfate tự nhiên được tìm thấy trong tảo nâu. Gần đây,
một số nghiên cứu đã chứng minh rằng hoạt động chống viêm của fucoidan xảy ra bằng
cách ức chế sự kích hoạt các con đường NF-κB và MAPK [31,32]. Tuy nhiên, khả năng
chống viêm của các polysaccharide giàu sunfat tách khỏi S. horneri qua quá trình tiêu hóa
15
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

enzyme vẫn chưa được báo cáo. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá các
hoạt động chống viêm của CPs giàu sulfate tách ra khỏi các enzym tiêu hóa của S. horneri
trên các tế bào RAW 264,7 kích thích LPS. Thật thú vị, các polysaccharides sulfate thô
tách ra khỏi enzyme tiêu hóa biểu hiện các hoạt động ức chế NO cao hơn CP được phân
lập từ chiết xuất DW. Dựa trên những kết quả này, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng kỹ
thuật chiết xuất men đã cải thiện năng suất chiết xuất và hàm lượng polysaccharide cũng
như sự ức chế sản xuất NO trong các đại thực bào kích thích bởi LPS. Kết quả của chúng
tôi cũng tương tự như những gợi ý của Wijesinghe et al. [7] rằng CP thu được từ các

enzyme tiêu hóa có hiệu suất tốt hơn và sản lượng polysaccharide cao so với CP thu được
từ chiết xuất DW.
Trong các phản ứng viêm, biểu hiện của iNOS và COX-2 trong đại thực bào dẫn
đến sản xuất NO và PGE2. Ngoài ra, NO và PGE2 sản xuất trong quá trình viêm có thể
gây độc tế bào đối với các tế bào chủ, và sản xuất NO và PGE2 kéo dài trong các tế bào
viêm có thể gây ra một loạt các bệnh viêm và ung thư [33,34]. Hơn nữa, các nghiên cứu
gần đây cho thấy sự tiếp xúc của các đại thực bào vào chất kích thích viêm có thể làm
tăng đáng kể các cytokine gây viêm như IL-1β và TNF-α. Cuối cùng, quá trình tạo ra các
cytokine gây viêm do các đại thực bào hoạt hóa đóng một vai trò quan trọng trong các
bệnh viêm màng sinh lý như viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, và bệnh Parkinson
cũng như các chất trung gian gây viêm [36]. Do đó, giảm mức độ của các trung gian này
có thể là một chiến lược hiệu quả để điều trị các bệnh viêm [37]. Thực tế, các nghiên cứu
trước đây đã chỉ ra rằng các polysaccharides sulfate bao gồm fucoidan có nguồn gốc từ E.
cava và Fucus vesiculosus đã ức chế sự biểu hiện của các chất trung gian gây viêm như
iNOS và COX-2 trong tế bào RAW 264.7 và vi khuẩn BV2 [31]. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tiết lộ rằng CCP đã giảm sản xuất NO và PGE2 thông qua giảm mức biểu hiện
của các chất trung gian gây viêm như iNOS và COX2 cũng như sản xuất các cytokine
viêm như TNF-α và IL-1β. Các kết quả này cho thấy tác dụng ức chế của CCP đối với các
chất trung gian và cytokine viêm là một trong những cơ chế chịu trách nhiệm cho các hoạt
động chống viêm của nó và CCP có thể có tiềm năng phát triển thành một thành phần
thực phẩm chức năng hoặc như một chất điều trị để điều trị các bệnh viêm.
Thông thường, kích thích LPS dẫn đến chứng viêm thông qua hoạt hóa đường dẫn
tín hiệu NF-κB và MAPK [31,38]. Bộ phận phiên mã của NF-κB bao gồm năm yếu tố, cụ
thể là c-Rel, RelB, p50, p52 và p65. NF-κB là một nhân tố phiên mã quan trọng liên quan
đến phản ứng viêm. NF-κB thường bị cô lập trong cytosol và được kích hoạt bởi các chất
kích thích viêm, như LPS [31]. Sau khi kích thích các đại thực bào, các protein NF-κB
cytosolic được vận chuyển vào nhân, nơi chúng tạo ra sự phiên mã của các gen gây viêm,
bao gồm iNOS và COX-2, cũng như các gen mã hóa các cytokine gây viêm [31]. Hơn
nữa, sự kích hoạt NF-κB bị thay đổi là do sự phosphoryl hóa NF-κB, là yếu tố chính góp
phần gây bệnh viêm mãn tính và ung thư. Do đó, ức chế các protein liên quan đến các bậc

16
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

NF-κB là một mục tiêu đầy hứa hẹn để điều trị các bệnh liên quan đến viêm [39]. Thật thú
vị, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng CCP đã ức chế sự kích hoạt tín hiệu NF-κB thông
qua việc ức chế sự phosphoryl hóa NF-κB cũng như sự dịch chuyển của nó tới hạt nhân
trong các tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS.
Việc tiếp xúc các tế bào RAW 264.7 vào LPS có thể kích hoạt các protein liên kết
với các bậc báo hiệu MAPK như ERK, p38, và JNK [40]. Hơn nữa, một số nghiên cứu đã
báo cáo rằng con đường tín hiệu MAPK điều chỉnh việc kích hoạt NF-κB [41,42]. Ngoài
ra, các nghiên cứu đã chứng minh rằng phosphoryl hóa p38 kinase và ERK1 / 2 tham gia
vào quá trình phiên mã các cytokine gây viêm như IL-1β và TNF-α [43,44]. Do đó, việc
ức chế sự biểu hiện protein liên quan đến MAPK cũng được coi là một cách tiếp cận hữu
ích để điều trị các bệnh viêm như là hệ thống báo hiệu MAPK có khả năng điều chỉnh sự
sản sinh cytokine NF-κB và viêm tế bào gây viêm [41,42,45]. Kết quả của chúng tôi cũng
cho thấy rằng CCP ức chế sự phosphoryl hóa ERK1 / 2 và p38. Gần đây, nhiều nhà
nghiên cứu đã báo cáo rằng các polysaccharide khác nhau, bao gồm fucoidan có nguồn
gốc từ rong biển, có tác dụng chống viêm bằng cách ức chế hoạt hóa của đường dẫn tín
hiệu NF-κB và MAPK trong các macrophage chuột có kích thích LPS [30,46,47]. Với
những kết quả này, chúng tôi đã chứng minh được khả năng chống viêm của ĐCSTQ, một
polysaccharide sulfate qua sự ức chế tín hiệu NF-κB có thể là do hiệu ứng ức chế của nó
đối với tín hiệu MAPK.
Kết luận, nghiên cứu này cho thấy CCP đã dẫn tới các hiệu ứng chống viêm bằng
cách ngăn chặn sự hoạt hóa của con đường truyền tín hiệu NF-κB và MAPK. Dựa trên
những kết quả này, chúng tôi kết luận rằng CCP là một ứng cử viên tiềm năng cho việc

hình thành thực phẩm chức năng và thuốc để điều trị các bệnh viêm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB
J. 1992;6:3051–3064.[PubMed]
2. Knöferl MW, Diodato MD, Schwacha MG, Cioffi WG, Bland KI, Chaudry IH.
Cyclooxygenase-2-mediated regulation of Kupffer cell interleukin-6 production following
trauma-hemorrhage and subsequent sepsis. Shock. 2001;16:479–483. [PubMed]
3. Louis E, Franchimont D, Piron A, Gevaert Y, Schaaf-Lafontaine N, Roland S, Mahieu
P, Malaise M, De Groote D, Louis R, Belaiche J. Tumour necrosis factor (TNF) gene
polymorphism influences TNF-α production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated
whole blood cell culture in healthy humans. Clin Exp Immunol. 1998;113:401–
406. [PMC free article] [PubMed]

17
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

4. Simmons TL, Andrianasolo E, McPhail K, Flatt P, Gerwick WH. Marine natural
products as anticancer drugs. Mol Cancer Ther. 2005;4:333–342. [PubMed]
5. Sanjeewa KK, Kim EA, Son KT, Jeon YJ. Bioactive properties and potentials
cosmeceutical applications of phlorotannins isolated from brown seaweeds: a review. J
Photochem Photobiol B. 2016;162:100–105.[PubMed]
6. Wijesekara I, Pangestuti R, Kim SK. Biological activities and potential health benefits
of sulfated polysaccharides derived from marine algae. Carbohydr Polym. 2011;84:14–21.
7. Wijesinghe WA, Jeon YJ. Enzyme-assistant extraction (EAE) of bioactive components:

a useful approach for recovery of industrially important metabolites from seaweeds: a
review. Fitoterapia. 2012;83:6–12.[PubMed]
8. Heo SJ, Jeon YJ, Lee JH, Kim HT, Lee KW. Antioxidant effect of enzymatic
hydrolyzate from a Kelp, Ecklonia cava. Algae. 2003;18:341–347.
9. Pang SJ, Liu F, Shan TF, Gao SQ, Zhang ZH. Cultivation of the brown alga Sargassum
horneri: sexual reproduction and seedling production in tank culture under reduced solar
irradiance in ambient temperature. J Appl Phycol. 2009;21:413–422.
10. Liu L, Heinrich M, Myers S, Dworjanyn SA. Towards a better understanding of
medicinal uses of the brown seaweed Sargassum in traditional Chinese medicine: a
phytochemical and pharmacological review. J Ethnopharmacol. 2012;142:591–
619. [PubMed]
11. Preeprame S, Hayashi K, Lee JB, Sankawa U, Hayashi T. A novel antivirally active
fucan sulfate derived from an edible brown alga, Sargassum horneri. Chem Pharm Bull
(Tokyo) 2001;49:484–485.[PubMed]
12. Shao P, Chen X, Sun P. Chemical characterization, antioxidant and antitumor activity
of sulfated polysaccharide from Sargassum horneri. Carbohydr Polym. 2014;105:260–
269. [PubMed]
13. Shao P, Chen X, Sun P. Improvement of antioxidant and moisture-preserving activities
of Sargassum horneri polysaccharide enzymatic hydrolyzates. Int J Biol
Macromol. 2015;74:420–427. [PubMed]
14. DuBois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for
determination of sugars and related substances. Anal Chem. 1956;28:350–356.
15. Chandler SF, Dodds JH. The effect of phosphate, nitrogen and sucrose on the
production of phenolics and solasodine in callus cultures of solanum laciniatum. Plant
Cell Rep. 1983;2:205–208. [PubMed]
16. Saito H, Yamagata T, Suzuki S. Enzymatic methods for the determination of small
quantities of isomeric chondroitin sulfates. J Biol Chem. 1968;243:1536–1542. [PubMed]
17. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65:55–63. [PubMed]
18

Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

18. Leiro J, Alvarez E, García D, Orallo F. Resveratrol modulates rat macrophage
functions. Int Immunopharmacol. 2002;2:767–774. [PubMed]
19. Park JW, Choi YJ, Suh SI, Kwon TK. Involvement of ERK and protein tyrosine
phosphatase signaling pathways in EGCG-induced cyclooxygenase-2 expression in Raw
264.7 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;286:721–725. [PubMed]
20. Yang L, Zhang LM. Chemical structural and chain conformational characterization of
some bioactive polysaccharides isolated from natural sources. Carbohydr
Polym. 2009;76:349–361.
21. Patankar MS, Oehninger S, Barnett T, Williams RL, Clark GF. A revised structure for
fucoidan may explain some of its biological activities. J Biol Chem. 1993;268:21770–
21776. [PubMed]
22. Bernardi G, Springer GF.
Chem. 1962;237:75–80. [PubMed]

Properties

of

highly

purified

fucan. J

Biol

23. Qiu X, Amarasekara A, Doctor V. Effect of oversulfation on the chemical and
biological properties of fucoidan. Carbohydr Polym. 2006;63:224–228.
24. Wijesinghe WA, Athukorala Y, Jeon YJ. Effect of anticoagulative sulfated
polysaccharide purified from enzyme-assistant extract of a brown seaweed Ecklonia cava
on Wistar rats. Carbohydr Polym. 2011;86:917–921.
25. Gómez-Ordóñez E, Rupérez P. FTIR-ATR spectroscopy as a tool for polysaccharide
identification in edible brown and red seaweeds. Food Hydrocoll. 2011;25:1514–1520.
26. Chen Y, Mao W, Gao Y, Teng X, Zhu W, Chen Y, Zhao C, Li N, Wang C, Yan M, Shan
J, Lin C, Guo T. Structural elucidation of an extracellular polysaccharide produced by the
marine fungus Aspergillus versicolor. Carbohydr Polym. 2013;93:478–483. [PubMed]
27. Bertolini A, Ottani A, Sandrini M. Dual acting anti-inflammatory drugs: a
reappraisal. Pharmacol Res. 2001;44:437–450. [PubMed]
28. Tilg H, Wilmer A, Vogel W, Herold M, Nölchen B, Judmaier G, Huber C. Serum
levels of cytokines in chronic liver diseases. Gastroenterology. 1992;103:264–
274. [PubMed]
29. Sestini P, Armetti L, Gambaro G, Pieroni MG, Refini RM, Sala A, Vaghi A, Folco GC,
Bianco S, Robuschi M. Inhaled PGE2 prevents aspirin-induced bronchoconstriction and
urinary LTE4 excretion in aspirin-sensitive asthma. Am J Respir Crit Care
Med. 1996;153:572–575. [PubMed]
30. Wijesinghe WA, Jeon YJ. Biological activities and potential industrial applications of
fucose rich sulfated polysaccharides and fucoidans isolated from brown seaweeds: a
review. Carbohydr Polym. 2012;88:13–20.
31. Park HY, Han MH, Park C, Jin CY, Kim GY, Choi IW, Kim ND, Nam TJ, Kwon TK,
Choi YH. Anti-inflammatory effects of fucoidan through inhibition of NF-κB, MAPK and
19
Ứng dụng của enzyme trong y học

Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

Akt activation in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells. Food Chem
Toxicol. 2011;49:1745–1752. [PubMed]
32. Wu GJ, Shiu SM, Hsieh MC, Tsai GJ. Anti-inflammatory activity of a sulfated
polysaccharide
from
the
brown
alga
Sargassum
cristaefolium. Food
Hydrocoll. 2016;53:16–23.
33. Posadas I, Terencio MC, Guillén I, Ferrándiz ML, Coloma J, Payá M, Alcaraz MJ.
Co-regulation between cyclo-oxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase expression
in the time-course of murine inflammation. Naunyn Schmiedebergs Arch
Pharmacol. 2000;361:98–106. [PubMed]
34. Attur MG, Patel R, Thakker G, Vyas P, Levartovsky D, Patel P, Naqvi S, Raza R, Patel
K, Abramson D, Bruno G, Abramson SB, Amin AR. Differential anti-inflammatory
effects of immunosuppressive drugs: cyclosporin, rapamycin and FK-506 on inducible
nitric oxide synthase, nitric oxide, cyclooxygenase-2 and PGE2 production. Inflamm
Res. 2000;49:20–26. [PubMed]
35. Heo SJ, Yoon WJ, Kim KN, Ahn GN, Kang SM, Kang DH, Affan A, Oh C, Jung WK,
Jeon YJ. Evaluation of anti-inflammatory effect of fucoxanthin isolated from brown algae
in
lipopolysaccharide-stimulated
RAW

264.7
macrophages. Food
Chem
Toxicol. 2010;48:2045–2051. [PubMed]
36. Tews DS, Goebel HH. Cytokine expression profile in idiopathic inflammatory
myopathies. J Neuropathol Exp Neurol. 1996;55:342–347. [PubMed]
37. Jung WK, Ahn YW, Lee SH, Choi YH, Kim SK, Yea SS, Choi I, Park SG, Seo SK,
Lee SW, Choi IW. Ecklonia cava ethanolic extracts inhibit lipopolysaccharide-induced
cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase expression in BV2 microglia via the
MAP kinase and NF-κB pathways. Food Chem Toxicol. 2009;47:410–417. [PubMed]
38. Kang JS, Yoon YD, Lee KH, Park SK, Kim HM. Costunolide inhibits interleukin-1β
expression by down-regulation of AP-1 and MAPK activity in LPS-stimulated RAW
264.7 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;313:171–177. [PubMed]
39. Viatour P, Merville MP, Bours V, Chariot A. Phosphorylation of NF-κB and IκB
proteins: implications in cancer and inflammation. Trends Biochem Sci. 2005;30:43–
52. [PubMed]
40. Xiao YQ, Malcolm K, Worthen GS, Gardai S, Schiemann WP, Fadok VA, Bratton DL,
Henson PM. Cross-talk between ERK and p38 MAPK mediates selective suppression of
pro-inflammatory
cytokines
by
transforming
growth
factor-β J
Biol
Chem. 2002;277:14884–14893. [PubMed]
41. Aga M, Watters JJ, Pfeiffer ZA, Wiepz GJ, Sommer JA, Bertics PJ. Evidence for
nucleotide receptor modulation of cross talk between MAP kinase and NF-κB signaling
pathways in murine
RAW 264.7 macrophages. Am J Physiol Cell

Physiol. 2004;286:C923–C930. [PubMed]
20
Ứng dụng của enzyme trong y học


Công nghệ Enzyme

GVHD: Đỗ Thị Hiền

42. DeFranco AL, Hambleton J, McMahon M, Weinstein SL. Examination of the role of
MAP kinase in the response of macrophages to lipopolysaccharide. Prog Clin Biol
Res. 1995;392:407–420. [PubMed]
43. Mahtani KR, Brook M, Dean JL, Sully G, Saklatvala J, Clark AR. Mitogen-activated
protein kinase p38 controls the expression and posttranslational modification of
tristetraprolin, a regulator of tumor necrosis factor alpha mRNA stability. Mol Cell
Biol. 2001;21:6461–6469. [PMC free article] [PubMed]
44. Koistinaho M, Koistinaho J. Role of p38 and p44/42 mitogen-activated protein
kinases in microglia. Glia. 2002;40:175–183. [PubMed]
45. Tegeder I, Pfeilschifter J, Geisslinger G. Cyclooxygenase-independent actions of
cyclooxygenase inhibitors. FASEB J. 2001;15:2057–2072. [PubMed]
46. Yang JW, Yoon SY, Oh SJ, Kim SK, Kang KW. Bifunctional effects of fucoidan on
the expression of inducible nitric oxide synthase. Biochem Biophys Res
Commun. 2006;346:345–350. [PubMed]
47. Ale MT, Mikkelsen JD, Meyer AS. Important determinants for fucoidan bioactivity: a
critical review of structure-function relations and extraction methods for fucosecontaining sulfated polysaccharides from brown seaweeds. Mar Drugs. 2011;9:2106–
2130. [PMC free article] [PubMed]

21
Ứng dụng của enzyme trong y học