Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc cimetidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

======

PHẠM THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
CIMETIDIN CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học
ThS. PHẠM THỊ KIM DUNG

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn cô
giáo ThS. Phạm Thị Kim Dung, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh KTNN cùng các thầy cô tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và
Chuyển giao công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Do bước đầu đi vào thực tế và sáng tạo trong nghiên cứu khoa học,
kiến thức của tôi còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi
những thiếu sót là điều chắc chắn, tôi rất mong nhận được sự góp ý quý báu
của quý thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của tôi

được hoàn thiện hơn nữa.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 17 tháng 04 năm 2017
Sinh viên
Phạm Thị Hà


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được
sự hướng dẫn khoa học của ThS. Phạm Thị Kim Dung. Những số liệu kết quả
trong khóa luận này là trung thực, không có sự trùng lặp hoặc sao chép của
một đề tài khác. Trong đề tài này, tôi có trích dẫn một số dữ liệu của một số
tác giả. Tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của
mình. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày 17 tháng 04 năm 2017
Sinh viên
Phạm Thị Hà


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A.xylinum

Acetobacter xylinum

cs

cộng sự

CVK

Cellulose vi khuẩn

ĐH

Đại học

ĐHSP

Đại học Sư phạm

FDA

Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

Nxb

Nhà xuất bản

OD

Mật độ quang phổ


MỤC LỤC
Conten\

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 3

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
NỘI DUNG .................................................................................................................... 5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng và lĩnh vực nghiên cứu ....................... 5
1.1.1. Màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn .......................... 5
1.1.1.1 Đặc điểm của Acetobacter xylinum ................................................................. 5
1.1.1.2. Đặc điểm của màng Cellulose vi khuẩn ......................................................... 5
1.1.1.3. Đặc điểm của môi trường chuẩn .................................................................... 6
1.1.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng Cellulose từ
vi khuẩn A.xylinum ............................................................................................ 6
1.1.2.1. Độ pH ................................................................................................................ 6
1.1.2.2. Nhiệt độ ............................................................................................................. 7
1.1.2.3. Độ thông khí...................................................................................................... 7
1.1.2.4. Thời gian nuôi cấy ............................................................................................ 7
1.1.2.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V) ....................... 8
1.1.3. Thuốc Cimetidine .................................................................................... 8
1.1.3.1. Công thức .......................................................................................................... 8
1.1.3.2. Tác dụng của Cimetidine ................................................................................. 8
1.1.3.3. Đặc điểm dược động học ................................................................................. 9
1.1.3.4. Đặc điểm dược lực học ..................................................................................10
1.1.3.5. Tương tác thuốc ..............................................................................................10


1.1.3.6. Tác dụng phụ ..................................................................................................11
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................. 11
1.2.1. Màng Cellulose vi khuẩn ....................................................................... 12
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................12
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................................12
1.2.2. Thuốc Cimetidine .................................................................................. 13
1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................13

1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................................13
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................15
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.1.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................... 15
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất .......................................................................... 15
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 15
2.1.3.1. Thiết bị .............................................................................................................15
2.1.3.2. Dụng cụ ...........................................................................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường chuẩn ................ 15
2.2.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc và
xác định lượng màng Cellulose vi khuẩn tạo thành và độ dày của màng ...... 16
2.2.3. Phương pháp kiểm tra giá độ tinh khiết của màng Cellulose vi khuẩn 17
2.2.4. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của Cimetidine trong HCl 0,1N 18
2.2.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng Cellulose
vi khuẩn ........................................................................................................... 19
2.2.6. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................. 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................22
3.1. Kết quả tạo màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn ...... 22
3.2. Quá trính xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc .......... 22


3.3. Đo bề dày màng Cellulose vi khuẩn ........................................................ 23
3.4. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của màng Cellulose vi khuẩn ......... 24
3.5. Khối lượng hấp thụ thuốc vào màng Cellulose vi khuẩn ......................... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................32
4.1. Tài liệu tiếng Việt..................................................................................... 32
4.2. Tài liệu tiếng Anh..................................................................................... 33

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Công thức môi trường chuẩn ................................................................ 14
Bảng 2.2. Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng............................................... 16
Bảng 2.3. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Cimetidine ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3)...................................................................................... 17
Bảng 3.1. Giá trị đo độ dày của màng Cellulose vi khuẩn ................................... 23
Bảng 3.2. Giá trị OD (y) trung bình của thuốc Cimetidine sau khi hấp thụ thuốc
ở các khoảng thời gian khác nhau 30 phút; 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ (n = 3) ............ 26
Bảng 3.3. Khối lượng và tỉ lệ thuốc Cimetidine hấp thụ vào màng Cellulose vi
khuẩn sau 2h (n = 3)………………......................................................................27


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận Cellulose vi khuẩn ...........................16
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Cimetidine .............................................19
Hình 3.1. Hình ảnh màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn ........22
Hình 3.2. Các quy trình xử lý màng Cellulose vi khuẩn .........................................23
Hình 3.3. Đo độ dày màng Cellulose vi khuẩn sau khi tinh sạch ...........................24
Hình 3.4. Kết quả thử sự hiện diện của đường glucose ...........................................25
Hình 3.5. chuẩn bị màng Cellulose vi khuẩn để hấp thụ thuốc...............................25
Hình 3.6. chuẩn bị hấp thu thuốc Cimetidine ở độ dày màng Cellulose vi khuẩn
khác nhau ......................................................................................................................26
Hình 3.7. Lắc màng Cellulose vi khuẩn trong dung dịch thuốc Cimetidine
20% và rút dịch định kì đo OD ....................................................................... 26
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ giữa các thao tác của hai màng có độ
dày 0,3cm và 0,5cm .....................................................................................................29
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh từng thao tác với màng Cellulose vi khuẩn 0,3cm ......29
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh từng thao tác với màng Cellulose vi khuẩn 0,5cm....29

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cùng với sự phát triển của công nghiệp hóa, hiện đại hóa con người bị
cuốn đi trong cuộc sống hiện đại trở nên bận rộn hơn với công việc nên không
có nhiều thời gian nấu nướng vì thế nhiều các loại thức ăn nhanh, đồ ăn đóng
hộp ra đời thêm nữa việc ăn uống không đúng thời gian, không theo quy luật
và một số nguyên nhân khác như do quá căng thẳng, stress, hay do thức
khuya không ngủ đủ giấc... dẫn tới chứng đau dạ dày, lâu dần dẫn tới viêm
loét dạ dày thậm chí cả ung thư dạ dày cũng ngày một xuất hiện nhiều hơn.
Với sự phát triển của ngành y học, hiện nay có rất nhiều các loại thuốc nhằm
chữa trị, hạn chế việc đau, viêm loét dạ dày... trong đó có thuốc Cimetidine.
Cimetidine là chất đối kháng có cạnh tranh thuận nghịch với Histamine
ở thụ thể H2 của tế bào thành dạ dày. Cimetidine làm ức chế tiết dịch acid cơ
bản (khi đói) ngày và đêm của dạ dày và cả tiết dịch acid được kích thích bởi
thức ăn, histamin, pentagastrin, cafein và insulin. Lượng pepsin do dạ dày sản
xuất ra cũng giảm theo… Thuốc có tác dụng điều trị ngắn hạn loét dạ dày tiến
triển lành tính, duy trì loét tá tràng với liều thấp sau khi ổ loét đã lành, ngăn
chặn chứng trào ngược dạ dày thực quản gây loét, các trạng thái bệnh lý tăng
tiết dịch vị như hội chứng Zollinger - Ellison, bệnh đa u tuyến nội tiết, chảy
máu tiêu hóa do loét dạ dày tá tràng và phòng chảy máu đường tiêu hóa trên ở
người có bệnh nặng [2].
Cimetidine có tác dụng hiệu quả cao tuy nhiên nó lại tương tác với rất
nhiều thuốc như metformin, warfarin, qunidin, procaznamimd, lidocain,
propanolol, nifedipin, phenytoin, acid valproic, pheophylin… làm ảnh hưởng
sự hấp thu, cạnh tranh với sự đào thải ở ống thận, thay đổi lượng máu qua gan
và một số tác dụng phụ như: ỉa chảy, mệt mỏi đau đầu, phát ban, dị ứng kể cả
sốc phản vệ… [2].

1

Hiện nay, màng cellulose vi khuẩn (CVK) là đối tượng của nhiều
nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài.
Đây là một loại nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như:
thực phẩm, y học, mỹ phẩm... Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng
Cellulose vi khuẩn được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể
sản xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất Cellulose vi khuẩn có độ
tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy
sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, CVK còn có độ bền tinh
thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng.
Cellulose vi khuẩn còn là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ nước
rất lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề
mặt (lực bền cơ học cao), đường kính sợi nhỏ... Đồng thời là một hàng rào
cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào
và ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, màng
Cellulose vi khuẩn còn có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài giúp
tăng hiệu quả chữa bệnh [14], [18].
Màng Cellulose vi khuẩn có thể được lên men từ rất nhiều môi trường
khác nhau như: nước vo gạo, nước dừa già… Tuy nhiên môi trường được sử
dụng nhiều nhất và được coi là môi trường tối ưu nhất trong lên men màng
Cellulose vi khuẩn là môi trường chuẩn Hestrin - Schramm (HS) (2wt%
glucose, 0,5wt% nấm men chiết xuất, 0,5wt% peptone, 0,27wt% disodium
phosphate và 0,15wt% acid citric) [26].
Để khắc phục các yếu điểm của Cimetidine em đã nghĩ đến việc kết hợp
nó với màng Cellulose vi khuẩn để hạn chế sự đào thải thuốc, giúp cho lượng
thuốc ngấm vào cơ thể nhiều hơn làm tăng hiệu quả chữa trị nên em quyết
định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc
Cimetidine của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
2

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và thu sản phẩm Cellulose vi khuẩn từ
Acetobacter xylinum trong môi trường chuẩn, từ đó chế tạo hệ thống vận tải
thuốc trên màng CVK nhằm tìm ra tìm ra phương pháp và điều kiện để cho
thuốc Cimetidine được hấp thụ nhiều nhất vào màng Cellulose vi khuẩn.
Ngoài ra, việc nghiên cứu này còn có thể giúp đưa ra các định hướng để sản
xuất thuốc trên quy mô công nghiệp.
3. Phạm vi nghiên cứu
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý học người và động vật
khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 và Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu
khoa học và chuyển giao công nghệ trường ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
- Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng Cellulose vi khuẩn.
Về mặt khoa học thì việc nghiên cứu ứng dụng màng Cellulose vi
khuẩn vào việc khắc phục hạn chế của thuốc Cimetidine sẽ mở ra một hướng
nghiên cứu mới không chỉ dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này
mà còn có thể ứng dụng trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y
học ngày một phát triển hơn.
Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của
màng Cellulose vi khuẩn để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các
đặc tính cả màng Cellulose vi khuẩn, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng
dụng màng trên nhiều các lĩnh vực khác nhau.
- Tìm ra điều kiện để thuốc Cimetidine có thể được hấp thụ tốt nhất trên
màng Cellulose vi khuẩn được lên men từ môi trường chuẩn.

3

4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng được quy trình tạo màng Cellulose vi khuẩn từ chủng
Acetobacter xylinum trong môi trường chuẩn.
- Định hướng sử dụng màng Cellulose vi khuẩn để tăng khả năng hấp
thụ thuốc Cimetidine, nhằm làm hạn chế tác dụng phụ không mong muốn, rút
ngắn thời gian điều trị và giảm chi phí cho người bệnh.
- Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

4


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng và lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn
1.1.1.1 Đặc điểm của Acetobacter xylinum
Cho đến nay, Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có
khả năng sinh màng Cellulose vi khuẩn hiệu quả nhất trong tự nhiên, một tế
bào A.xylinum có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành cellulose trong một
giờ [19]. A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, là loài vi khuẩn gram âm sống hiếu
khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa nhất của
nhóm vi khuẩn. Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng gram của chúng có thể bị
biến đổi do tế bào già đi hay do môi trường [3].
Vị trí phân loạị: A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi
Acetobacter, họ Pseudomonadaceae.
Chúng là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose
ngoại bào.

A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc
vào chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng
và cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho
hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose.
1.1.1.2. Đặc điểm của màng Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer 𝛽 - 1,4
glucopyranose không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc
hóa học cơ bản của Cellulose vi khuẩn giống cellulose của thực vật.
Theo AJ. Brown (1886), Cellulose vi khuẩn gồm nhiều sợi siêu nhỏ có
bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó,
nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3-8nm.
5


Khi nuôi cấy theo phương pháp động, một lượng nhỏ cellulose được
hình thành dưới dạng huyền phù phân tán, trong đó chuỗi β - 1,4glucopyranose xếp một cách ngẫu nhiên. Cellulose vi khuẩn được tạo ra bằng
phương pháp nuôi cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và
không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy.
Trong nuôi cấy tĩnh, Cellulose vi khuẩn tích lũy trên bề mặt môi trường
dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô
tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5nm. Sản phẩm
này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi
tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp
xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu
nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [11]. So với phương pháp nuôi cấy
động thì phương pháp nuôi cấy tĩnh cho khối lượng màng Cellulose vi khuẩn
khô nhiều hơn [6], [21].
Với các tính chất này Cellulose vi khuẩn được ứng dụng rất nhiều
trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học: Almeida và các
cộng sự [14] đã sử dụng màng Cellulose vi khuẩn như hệ thống phân phối

thuốc, ngoài ra nó còn được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, năng
lượng, mỹ phẩm…
1.1.1.3. Đặc điểm của môi trường chuẩn
Môi trường chuẩn Hestrin - Schramm (HS) do hai nhà khoa học
Hestrin và Schramm tìm ra với công thức: 2wt% glucose; 0,5wt% nấm men
chiết xuất; 0,5wt% peptone; 0,27wt% disodium phosphate và 0,15wt% acid
citric [26]. Đây được coi là môi trường nuôi cấy A. xylinum tốt nhất hiện nay
với thời gian nuôi cấy tạo màng ngắn nhất cũng như tạo ra màng nhẵn mịn,
dẻo dai... hơn các loại môi trường nuôi cấy khác.
1.1.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng Cellulose
từ vi khuẩn A.xylinum
1.1.2.1. Độ pH
6


Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Vi
khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3- 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là
pH = 5,5. Do đó, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic
nhằm acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn,
giúp ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật có hại [10].
1.1.2.2. Nhiệt độ
Theo Beyger (1992) nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A. xylinum từ 25 - 300C.
Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt
động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên
men sẽ giảm [19].
1.1.2.3. Độ thông khí
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc [19]. Điều kiện tiên
quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá
trình lên men, lượng oxi cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ
thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp Cellulose vi khuẩn. Vì vậy hình

thức sục khí cung cấp oxi và sử dụng cách khuấy trong lên men động là phù
hợp cho sản lượng Cellulose vi khuẩn cao trong lên men chìm. Lên men tĩnh
cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng [16],
[24].
Wanatabe và Yamanaka (2009) [35] phát hiện ra áp suất oxi cũng ảnh
hưởng đến khả năng hình thành CVK. Cellulose hình thành dưới áp suất oxi
thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxi cao. Do
đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng Cellulose
vi khuẩn.
1.1.2.4. Thời gian nuôi cấy
Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện
một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 -

7


48 giờ, hình thành một lớp trong và ngày càng dày.
Theo Thesis Holmes (2004) [29], hàm lượng glucose trong môi trường
giảm dần sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi
khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5 - keto axit gluconic trong quá trình
trao đổi chất. Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng
thái tốt nhất.
1.1.2.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V)
Theo PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự [8], [9] khả năng hình
thành màng tốt nhất ở tỷ lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ
lên men h = 1,25cm.
1.1.3. Thuốc Cimetidine
1.1.3.1. Công thức
Công thức phân tử: C10H16N6S
Phân tử lượng: 252,3 đvC

Công thức cấu tạo:

Tên khoa học: N" - cyano - N methyl - N' - [2 - [[(5 - methyl - 1H imidazol - 4 - yl) methyl] thio] - ethyl] - guanidin [2].
Độ nóng chảy: 1420 C
Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng [1].
Tan trong acid clohydric (HCl), khó tan trong nước [1].
1.1.3.2. Tác dụng của Cimetidine
Tác dụng chủ yếu của thuốc Cimetidine là ức chế tế bào thành dạ
dày tiết acid với chỉ định rộng rãi trong điều trị chứng ợ nóng và loét dạ dày.
Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng Cimetidine, các nhà lâm sàng đã phát hiện
rất nhiều tác dụng của nó trong một số bệnh nhờ cơ chế ức chế thụ thể
8


histamin H2 của tế bào T ức chế. Vì thế, ngoài tác dụng kháng tiết acid trong
bệnh viêm loét dạ dày được FDA Hoa Kỳ công nhận, Cimetidine còn được sử
dụng trong điều trị một số bệnh da liễu [32].
1.1.3.3. Đặc điểm dược động học
Hấp thụ và sinh khả dụng
Cimetidine được hấp thụ nhanh chóng, không hoàn toàn ở đường tiêu
hóa sau khi uống thuốc. Theo Pedersen P.U, Miller R (1980), sinh khả dụng
của thuốc ở trong khoảng từ 56 - 68% ở bệnh nhân loét [28].
Nồng độ của Cimetidine trong huyết tương đảm bảo làm giảm đến 50%
lượng acid tối đa là 0,5 - 1,0 mcg/ml [22].
Phân phối
Thể tích phân phối của Cimetidine ở mức xấp xỉ 0,8 - 1,39 L/kg. Tuổi
bệnh nhân càng tăng thì thể tích phân phối càng giảm. Cimetidine phân bố
rộng khắp phần lớn trong dịch cơ thể, các cơ quan và mô người, không có
trong mô mỡ [2].
Tỉ lệ phân phối trung bình của Cimetidine giữa dịch não tủy và huyết

thanh thay đổi từ 0,03 - 0,18. Tỷ lệ này là 0,2 - 0,5 ở người bệnh gan hay
thận. Tỉ lệ gắn protein huyết tương của Cimetidine là 18 - 26,3% ở mức nồng
độ giữa 0,05 - 50 mcg/ml. Ở những bệnh nhân loét dạ dày tá tràng thì tỉ lệ này
đạt khoảng 13 - 25% (trung bình 19%) [2].
Chuyển hóa và thải trừ
Cimetidine có thể uống hoặc tiêm, thuốc đào thải chủ yếu qua nước
tiểu. Sau khi tiêm phần lớn thuốc (khoảng 75%) được đào thải dưới dạng
không biến đổi sau 24 giờ. Sau khi uống, thuốc được đào thải chủ yếu dưới
dạng chuyển hóa là sulfoxid; nếu uống một liều đơn, thì 48% thuốc được đào
thải ra nước tiểu sau 24 giờ dưới dạng không biến đổi [13].
Độ tuổi đóng một vai trò quan trọng trong dược động học của
9


Cimetidine. Tuổi càng trẻ thì độ thanh thải càng lớn, trừ trẻ sơ sinh, độ thanh
thải này giảm một nửa từ độ tuổi 30 - 65 [17]. Một lượng nhỏ liều thuốc tiêm
tĩnh mạch được đào thải qua mật (Spence và cs, 1977) và phân (Griffiths và
cs, 1977; Taylor và cs 1978). Ngoài ra, Cimetidine có thể qua hàng rào nhau
thai, được bài tiết qua sữa mẹ và ở những người mẹ cho con bú, thuốc vào
được cơ thể trẻ nhiều mg/ngày [17].
1.1.3.4. Đặc điểm dược lực học
Cimetidine ức chế cạnh tranh với histamin tại thụ thể H2 của tế bào bìa
dạ dày, ức chế tiết dịch acid cơ bản (khi đói) ngày và đêm của dạ dày và cả
tiết dịch acid được kích thích bởi thức ăn, histamin, pentagastrin, cafein và
insulin [13]. Vì quá trình tiết acid cơ bản dài nhất xảy ra vào ban đêm nên
việc dùng thuốc sau ăn tối hoặc trước khi ngủ sẽ đạt hiệu quả tối ưu.
Ngoài ra, Cimetidine tăng cường sự bảo vệ niêm mạc dạ dày và có khả
năng chữa khỏi các rối loạn liên quan đến acid, đặc biệt là loét và chảy máu
dạ dày do stress, bằng cách tăng sản xuất chất nhầy dạ dày, tăng tiết chất nhầy
do bicarbonat, tăng lưu lượng máu ở niêm mạc dạ dày, tăng tổng hợp

prostaglandin nội sinh và tăng tốc độ tái tạo tế bào biểu mô.
1.1.3.5. Tương tác thuốc
Cimetidine tương tác với rất nhiều thuốc nhưng chỉ có một số tương tác
có ý nghĩa lâm sàng. Cimetidine thường làm chậm sự đào thải và tăng nồng
độ của những thuốc này trong máu. Ða số các tương tác là do sự liên kết của
Cimetidine với cytochrom P450 ở gan dẫn đến sự ức chế chuyển hóa oxy hóa
ở microsom và tăng nồng độ trong huyết tương của những thuốc chuyển hóa
bởi những enzym này. Một số cơ chế tương tác khác, thí dụ như ảnh hưởng sự
hấp thụ, cạnh tranh với sự đào thải ở ống thận và thay đổi lượng máu qua gan
chỉ đóng vai trò thứ yếu. Một số tương tác của Cimetidine với:
 Metformin: Cimetidine ức chế sự bài tiết của metformin ở ống thận,
làm tăng nồng độ của thuốc này trong huyết tương.
10


 Warfarin: Cimetidine ức chế chuyển hóa của warfarin, làm tăng tác
dụng của thuốc, gây tăng nguy cơ chảy máu.
 Quinidin: Cimetidine ức chế sự thanh thải của quinidin khoảng 30% gây
tăng hàm lượng chất này trong huyết tương.
 Procainamid: Cimetidine làm giảm sự đào thải của procainamid và chất
chuyển hóa của nó là N - acetyl procainamid qua thận gây tăng nồng độ
những chất này trong huyết tương. Do đó làm tăng nguy cơ loạn nhịp
của procainamid, có thể gây tử vong… [13].
1.1.3.6. Tác dụng phụ
- Trên đường tiêu hóa: Tiêu chảy (nhẹ), tần suất 1/100 bệnh nhân [2].
- Trên tuyến nội tiết: Chứng vú to đã được báo cáo. Theo báo cáo của
L.A. Garcia Rodriguez và Hershel Jick tác dụng phụ này gặp ở những người
dùng Cimetidine > 1 g/ngày trong thời gian từ 7 - 12 tháng, hiện tượng này
thường trở lại bình thường.
- Trên hệ thần kinh trung ương: Đau đầu (nhẹ đến nặng), chóng mặt và

buồn ngủ (nhẹ). Các rối loạn tâm thần như kích động, lo âu, ảo giác, trầm
cảm, mất phươnghướng, mất đi sau 3 - 4 ngày ngừng thuốc. Thường khi
ngừng điều trị [33], [34]. Theo S.M. Sabesin, nếu uống Cimetidine kéo dài
với liều > 5 g/ngày mới có thể gây bất lực và chứng vú to ở nam giới [25].
- Trên thận: Tăng creatinin huyết thanh (tăng nhẹ), có thể gặp viêm
thận kẽ và bí tiểu phải ngừng điều trị.
- Đối với tim mạch: Nhịp tim chậm, nhanh và block nhĩ thất đã được
báo cáo với thuốc đối kháng thụ thể H2. Theo S.Saltissi (1981) cho thấy
không có sự thay đổi đáng kể nào lên hệ tim mạch của 24 bệnh nhân dùng
400 mg Cimetidine/ngày trong 4 tuần [31].
- Trên cơ xương khớp: Đau khớp và đau cơ tự hồi phục.
- Trên da và phần phụ: Phát ban nhẹ, hội chứng Stevens - Johnson, hoại tử
thựợng bì nhiễm độc, hồng ban đa dạng, đỏ da bong vảy toàn thân, rụng tóc.
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
11


1.2.1. Màng Cellulose vi khuẩn
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Màng Cellulose vi khuẩn nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực: y
học, thực phẩm, mỹ phẩm như: Trong y học Cellulose vi khuẩn được các nhà
nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bỏng ở người như đề tài của thầy Nguyễn
Văn Thanh trường ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh [6]. Trong lĩnh vực thực
phẩm màng Cellulose vi khuẩn nghiên cứu sản xuất thạch dừa như đề tài của
cô Đinh Thị Kim Nhung trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2. Trong sản xuất mỹ
phẩm có cô Nguyễn Thị Nguyệt trường ĐH Sư phạm Hà Nội nghiên cứu làm
mặt nạ dưỡng da [12]… Tuy nhiên việc nghiên cứu hệ thống vận tải thuốc từ
màng Cellulose vi khuẩn ở nước ta còn là hướng đi mới.
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới màng Bacterial cellulose (Cellulose vi khuẩn) đã được

ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau. Tác giả Brown
(1989), dùng màng Cellulose vi khuẩn làm môi trường phân tách cho quá
trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho
tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad (1998) dùng màng như là một chất để
chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [21]. Đặc biệt trong
lĩnh vực y học, màng Cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm da tạm thời
thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu
trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người [21].
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng
Cellulose vi khuẩn làm hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc được báo cáo
[15], trong đó có 9 nghiên cứu với màng Cellulose vi khuẩn tinh khiết, 2
nghiên cứu với thể chất biến đổi màng Cellulose vi khuẩn và 7 nghiên cứu với
các vật liệu nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được
tiến hành nghiên cứu.
12


Một số nghiên cứu về hệ thống vận tải thuốc từ màng cellulose vi khuẩn như:
Amin và cs [16] đã báo cáo việc sử dụng màng Cellulose vi khuẩn làm
màng phân phối thuốc bằng cách sử dụng kỹ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy
màng Cellulose vi khuẩn có thể làm thành một màng phim dẻo, trong suốt để
phân phối thuốc, giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài, làm tăng
hiệu quả sử dụng của thuốc [14].
Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming
Zhang and Guang Yang đã thiết kế hệ thống vận tải thuốc Beberin từ màng
Cellulose vi khuẩn [26].
1.2.2. Thuốc Cimetidine
1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, phần lớn Cimetidine được sử dụng là một loại thuốc để

chữa trị bệnh viêm loét và trào ngược dạ dày, ngăn ngừa tái phát sau khi bị
viêm loét dạ dày.
Ngoài ra, Cimetidine còn được ứng dụng trong chữa các bệnh về da liễu,
Hà Nguyễn Phương Anh của trường Đại học Y Dược đã thành công với luận
án “Nhiễm Human papillomavirus trên bệnh nhân bị nhiễm trùng lây truyền
qua đường tình dục và tác dụng của Cimetidine trong phòng tái phát bệnh sùi
mào gà” [1].
Tuy nhiên, hiện nay việc nghiên cứu hệ thống vận tải thuốc Cimetidine
ở nước ta còn rất ít.
1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Fukuda Ml., et al. [23] đã chứng minh hiệu quả của Cimetidinee là một
chất đối kháng thụ thể histamin H2 điều trị tổn thương dạ dày cấp tính, ung
thư đại trực tràng.
Arisawa T., et al. [18] có công trình nghiên cứu sự kết hợp Cimetidine
và Rabeprazole đơn trị liệu điều trị các tổn thương dạ dày cấp tính thông qua
đường miệng tái tạo mô liên kết.
13


Nghiên cứu của Franco I. (2000) [22] dùng Cimetidine với liều 30 - 40
mg/ngày, dùng trong 3 tháng liền để chữa mụn cóc trên bốn trẻ em. Kết quả là
bốn trẻ đều khỏi mụn cóc.

14


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Loài vi khuẩn A. xylinumg thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí

nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất
- Thuốc Cimetidine dạng tinh khiết (Sigma - Mỹ) > 99%
- Sử dụng các hóa chất đặc biệt: cao nấm men, peptone.
- Các hóa chất thông thường: Disodium phosphat, acid acetic, NaOH,
HCl, đường glucose, ... và một số chất khác.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
2.1.3.1. Thiết bị
- Nồi hấp khử trùng HV-110, máy ép màng, tủ sấy, máy lắc, cân phân
tích - Sartorius TE 214S, cân kĩ thuật - Sartorius TE 3102 S ...
- Thiết bị nghiên cứu hấp thụ của thuốc: Máy quang phổ tử ngoại UV Nhật Bản….
2.1.3.2. Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, ống nghiệm, bình định mức loại
100ml, 500ml, 1000ml, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml,... và các dụng cụ khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường chuẩn
- Bước 1: Pha môi trường chuẩn để lên men tạo màng Cellulose vi
khuẩn. Công thức môi trường chuẩn dưới bảng 2.1 sau:
Bảng 2.1. Công thức môi trường chuẩn
Đường Glucose

20 g

Nước cất 2 lần

Disodium photphat

2,7 g

1000 ml

Acid citric

1,5g

Pepton

5g

Acid axetic

20 ml

Cao nấm men

5g

Dịch giống A. xylinum

100 ml

15


- Bước 2: Môi trường được hấp sau khi pha được khử trùng ở 113 oC
trong 15 phút. Sau đó tiếp tục khử trùng bằng tia UV trong 30 phút.
- Bước 3: Để nguội môi trường sau đó bổ sung 10% dịch giống và 2%
acid axetic, phủ khăn xô lên bình đựng.
- Bước 4: Sau đó nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 26oC trong 6 - 14 ngày [6].
- Bước 5: Sau khi thu màng, rửa sạch với nước cất sẽ thu được màng

Cellulose vi khuẩn thô [6].
2.2.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc
và xác định lượng màng Cellulose vi khuẩn tạo thành và độ dày của màng
Màng Cellulose vi khuẩn sau khi thu được chứa một lượng lớn môi
trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì
vậy, trước khi hấp thụ thuốc cần phải xử lý màng theo quy trình sau [6].
Tách màng
Cellulose vi khuẩn
thô
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép

Ngâm trong HCl 3%
48h, rửa và ép

Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
Màng CVK tinh chế
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận Cellulose vi khuẩn
16


Bề dày màng Cellulose vi khuẩn (CVK) được xác định bằng thước kẻ.
Ta đo ở nhiều vị trí khác nhau. Sau đó xác định được bề dày bằng cách tính
toán các lần đo. Thí nghiệm được bố trí trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng
Mẫu

d1 (cm)

d2 (cm)

d3 (cm)

d4 (cm)

1

Vị trí 1

Vị trí 2

Vị trí 3

Vị trí 4

2

Vị trí 1

Vị trí 2

Vị trí 3

Vị trí 4

3

Vị trí 1

Vị trí 2

Vị trí 3

Vị trí 4

4

Vị trí 1

Vị trí 2

Vị trí 3

Vị trí 4

dtb (cm)

Cellulose vi khuẩn sau khi được tách ra khỏi môi trường, xử lý qua
công đoạn hóa học thu được Cellulose vi khuẩn tinh chế. CVK tinh chế được
ép loại nước, ta được khối lượng Cellulose vi khuẩn tạo thành với độ dày
mỏng, khối lượng khác nhau.
2.2.3. Phương pháp kiểm tra giá độ tinh khiết của màng Cellulose vi khuẩn
 Mục đích: nhằm đảm bảo màng Cellulose vi khuẩn sau khi xử lý đã
loại được các tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đường
glucose trong màng Cellulose vi khuẩn.
 Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện
diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
 Cách tiến hành:
- Dịch thử của màng Cellulose vi khuẩn các loại sau khi đã xử lý hóa

học.
- Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D-glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút. Quan sát kết tủa xuất
hiện trong ống nghiệm.
17