Xác định cadidate gen kháng bệnh bạc lá trong các giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ công tác chọn tạo giống (LV thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

CẤN THỊ KHÁNH HUYỀN

XÁC ĐỊNH GEN ỨNG VIÊN (CANDIDATE GENE)
KHÁNG BỆNH BẠC LÁ TRONG CÁC GIỐNG LÚA BẢN
ĐỊA CỦA VIỆT NAM ĐÃ ĐƢỢC GIẢI MÃ PHỤC VỤ
CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2015


i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

CẤN THỊ KHÁNH HUYỀN

XÁC ĐỊNH CANDIDATE GENE KHÁNG BỆNH
BẠC LÁ TRONG CÁC GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA
VIỆT NAM ĐÃ ĐƢỢC GIẢI MÃ PHỤC VỤ CÔNG TÁC
CHỌN TẠO GIỐNG
Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số

: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Khuất Hữu Trung

Hà Nội – Năm 2015


ii

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn các anh chị, cô chú trong bộ môn Kỹ thuật di
truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện học tập và nghiên cứu trong
một môi trường học tập khoa học, cũng như các thầy cô giáo của Viện Sinh Thái
và Tài Nguyên Sinh Vật đã trực tiếp giảng dạy, giúp em có những kiến thức
vững vàng khi bước vào đời. Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn sự chỉ bảo tận
tình của thầy giáo TS. Khuất Hữu Trung đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho em
trong suốt quá trình em làm luận văn tốt nghiệp này.
Đề tài luận văn tốt nghiệp của em là: “Xác định cadidate gen kháng bệnh
bạc lá trong các giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ công tác chọn tạo
giống”. Đây là đề tài có khối lượng cơng việc tương đối lớn, nhưng do thời gian
thực hiện cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi thiếu sót. Vì vậy em rất mong được
sự đóng góp ý kiến của các thầy cơ giáo và bạn bè để bản đồ án tốt nghiệp của
em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015
Sinh viên

Cấn Thị Khánh Huyền

iii

LỜI CAM ĐOAN
Luận văn này được thực hiện dưới sự hỗ trợ của Phòng Kỹ Thuật Di
Truyền, viện Di Truyền Nông Nghiệp. Em xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác.

Học viên

Cấn Thị Khánh Huyền


iv

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................... ii
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................. iii
MỤC LỤC .......................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................... ix
MỞ ĐẦU ..............................................................................................1
1. Lí do chọn đề tài ......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 3
2.1. Mục tiêu tổng quát ................................................................................ 3
2.2. Mục tiêu cụ thể ...................................................................................... 3
3. Cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn............................................................. 3
3.1. Cơ sở khoa học ...................................................................................... 3
3.2. Cơ sở thực tiễn ...................................................................................... 4
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 4

4.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ......................................................... 4
4.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................5
1.1. Tổng quan về nghiên cứu bệnh bạc lá ở cây lúa .................................. 5
1.1.1. Bệnh Bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae. pv.oryzae) ........................... 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới. 6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ở Việt Nam . 9
1.2. Tổng quan về gen ứng viên (candidate gene) ..................................... 10
1.2.1. Candidate gene là gì? ....................................................................... 10


v

1.2.2. Các bước xác định candidate gene ................................................... 11
1.2.2.1. Chọn CG chức năng .................................................................. 11
1.2.2.2. Chọn CG vị trí ........................................................................... 11
1.2.2.3. Sàng lọc CG .............................................................................. 12
1.2.2.4. Xác nhận CG ............................................................................. 12
1.2.3. Tổng quan các phương pháp xác định candidate gene .................... 13
1.2.3.1. Phương pháp truyền thống ........................................................ 13
1.2.3.2. Phương pháp NBS-LRR (Nucleotide Binding Site-Leucine Rich
Repeat)........................................................................................ 13
1.2.3.4. Ứng dụng candidate gene trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc
lá ................................................................................................. 15
1.3. Tổng quan về thiết kế maker ................................................................ 16
1.3.1. Thiết kế mồi chung (degenerateprimer) ........................................... 16
1.3.2. Thiết kế marker dựa trên BlastDigester ........................................... 17
1.4. Tổng quan về chọn tạo giống nhờ ứng dụng của chỉ thị phân tử ..... 23
1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng .. 23

1.4.1.1. Ứng dụng MAS trong các chương trình chọn giống[4]............ 23
1.4.1.2. Ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại
(MABC)[4] ................................................................................. 25
1.4.2. Ứng dụng chị thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bạc lá .... 27

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 33
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................... 33
2.1.2. Hoá chất........................................................................................ 34
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 35
2.2.1. Phương pháp xác định candidate gene ............................................. 35
2.2.2 Phương pháp thiết kế các marker ...................................................... 35


vi

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu để lai tạo nguồn vật liệu mang candidate
gen ..................................................................................................... 38
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu để kiểm tra sự có mặt các candidate gen
kháng bạc lá ....................................................................................... 39
2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số ........................................................... 39
2.2.4.2. Kỹ thuật PCR ............................................................................ 39
2.2.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................... 40
2.2.4.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide .................................................................................. 40

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................42
3.1. Kết quả xác định gen ứng viên (candidate gene) kháng bạc lá........ 42
3.1.1. Kết quả phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA
Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên (candidate
gene) xa5 ........................................................................................... 42

3.1.2. Kết quả tầm soát và thiết kế mồi nhận dạng candidate gen xa5 kháng
bạc lá.................................................................................................. 47
3.2. Thiết kế marker xác định gen ứng viên kháng bạc lá xa5 ............... 51
3.3 Kết quả lai tạo nguồn vật liệu mang candidate gene xa5 kháng bạc lá
.............................................................................................................. 56
3.3.1 Đặc điểm nông sinh học của các dòng bố và mẹ .............................. 56
3.3.2. Kết quả lai tạo F1 vụ 1 (Xuân 2014)................................................ 57
3.3.3 Kết quả lai tạo BC1F1 vụ 2 (mùa 2014) ........................................... 61
3.4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của các candidate gene kháng bạc lá ở
thế hệ con lai (BC1F1). ....................................................................... 63
3.4.1. Cặp lai An dân 11 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2.................................... 63
3.4.2. Cặp lai DT39- Quế Lâm x OM6377 ............................................... 64
3.4.3. Cặp lai Q1-8-1 x Chấn thơm ............................................................ 64


vii

3.4.4. Cặp lai OM6976 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2...................................... 65
3.4.5. Cặp lai Thủ đô 1 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2...................................... 66

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................68
4.1. Kết luận .................................................................................................. 68
4.2. Đề nghị .................................................................................................... 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................70


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng1.1: Các giống lúa mang gen kháng bạc lá được chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của
chỉ thị phân tử (MAS) và đã thương mại hóa ở Châu Á ........................................ 8
Bảng 1.2: Mã suy biến trong thiết kế mồi chung ................................................. 16
Bảng 2.1. Danh sách các giống lúa bản địa đã được giải mã genome ................. 33
Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 34
Bảng 2.3. Điều kiện phản ứng PCR ..................................................................... 40
Bảng 3.1. Thống kê nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence)
gen/candidate gen xa5 .......................................................................................... 42
Bảng 3.2. Thống kê tỉ lệ (%) amino acid của gen/candidate gen xa5 .................. 45
Bảng 3.3. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các candidate gen xa5 ở
các giống lúa đã giải mã ....................................................................................... 47
Bảng 3.4. Đặc điểm nơng sinh học của dịng bố .................................................. 56
Bảng 3.5. Đặc điểm nơng sinh học của dịng mẹ ................................................. 57
Bảng 3.6. Các tổ hợp lai tạo dòng F1 ................................................................... 58
Bảng 3.7. Các tổ hơp lai tạo dòng BC1F1 ........................................................... 61
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra candidate gen xa5 .................................................... 66


ix

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các bước tạo marker CAPS với BlastDigester. ................................... 19
Hình 2.1. Thiết kế mồi PCR trong một khu vực được lựa chọn .......................... 37
Hình 2.2. Kết quả phân tích PCR được liệt kê trong Vector NTI Explorer......... 37
Hình 3.1. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng bạc lá
xa5 của một số giống lúa bản địa (đoạn mất 35nu) ............................................. 50
Hình 3.2. Sơ đồ thiết kế mồi xa5_add35.............................................................. 54
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra PCR đối với mồi xa5add35F/xa5add35R nhận biết
gen xa5 ở các giống lúa bản địa của Việt Nam .................................................... 55
Hình 3.4. Ruộng gieo mạ và ruộng cấy các nguồn vật liệu bố mẹ phục vụ lai tạo

F1 .......................................................................................................................... 59
Hình 3.5. Ghép cặp cho các tổ hợp lai ................................................................. 60
Hình 3.6. Bao cách ly sau khi khử nhị ................................................................ 60
Hình 3.7. Hạt lai sau khi thụ phấn 7 ngày ............................................................ 60
Hình 3.8. Cặp lai Q1-8-1x Chấn Thơm và An Dân x CNBN2 thế hệ BC1F1.... 62
Hình 3.9. Hạt lai BC1F1(D8 x OM6876) sau khi thu hoạch ............................... 62
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai An
dân 11 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 với cặp mồi xa5add35 ..................................... 63
Hình 3.11. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai
OM6377 x DT39- Quế Lâm với cặp mồi xa5add35 ........................................... 64
Hình 3.12. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai
Q1-8-1 x Chấn thơm với cặp mồi xa5add35 ........................................................ 65


x

Hình 3.13. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai
OM6976 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 với cặp mồi xa5add35 ................................. 65
Hình 3.14. Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 của tổ hợp lai
Thủ đô 1 x Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 với cặp mồi xa5add35 ................................. 66


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra,
là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối với nhiều vùng trồng lúa
khác nhau trên thế giới. Đối với miền Bắc nước ta, bệnh gây hại ở cả vụ xuân lẫn
vụ mùa và hại trên nhiều giống khác nhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các
giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Để phòng trừ, người ta sử dụng nhiều biện
pháp khác nhau, như áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác, bón phân sớm,

cân đối, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý và dùng giống kháng
bệnh, trong đó chọn tạo giống kháng bệnh có ý nghĩa kinh tế nhiều mặt, không
gây ô nhiễm môi trường và tạo được nông sản sạch. Để tạo giống kháng bệnh
bạc lá bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng bệnh, sau đó phải xác
định chính xác được số và thành phần các chủng hiện có ở mỗi vùng, nghiên cứu
xác định gen kháng bệnh hữu hiệu rồi quy tụ nhiều gen kháng vào một giống.
Hiện người ta đã xác định được gần 40 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau
trên thế giới, tương ứng đã xác định được mỗi nước có một số chủng gây bệnh
nhất định như ở Philippin có 6 chủng, Ấn độ 9 chủng, Nhật Bản có 12 chủng. Ở
Việt Nam, theo Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 trên cơ sở lây nhiễm các dòng
đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10
chủng[6]. Đồng thời đã xác định được 4 gen kháng hữu hiệu là Xa4, xa5, Xa7 và
Xa21, kháng mạnh và kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập. Tuy
nhiên, do phương pháp lây nhiễm nhân tạo có một số nhược điểm như phụ thuộc
vào môi trường, tốn thời gian, nhiều khi kết quả thu được chưa thật chính xác.
Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phải xác định một cách chính xác sự
đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử DNA. Trên thế giới có khá
nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phân lập và
xác định các chủng vi sinh vật gây bệnh. Lee và cộng sự, 2005 đã lần đầu tiên
1


cơng bố đã xác định được trình tự DNA của genom vi khuẩn Xoo, vòng genom
dài 4,9 triệu bp, trong đó đã xác định được một số vùng bảo thủ và những vùng
dễ biến động, đây có thể là cơ sở phân tử để phân ra các chủng khác nhau[18].
Cùng với phân tích tồn bộ hệ gen (genome-wide scanning), candidate
gene (CG) là một cách tiếp cận khác để phân tích tỉ mỉ các tính trạng phức tạp và
tính trạng số lượng. Mỗi cách tiếp cận có những thuận lợi và bất lợi riêng. Phân
tích tồn bộ gen thường tiến hành mà khơng có bất kỳ giả định liên quan đến tầm
quan trọng của tính năng chức năng cụ thể của các đặc điểm điều tra, nhưng tốn

kém và cần có nguồn nhân lực chuyên sâu. Trong khi đó, cách tiếp cận bằng
candidate gene đã được chứng minh là cực kỳ hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc di
truyền của các tính trạng phức tạp, phương pháp này hiệu quả và kinh tế hơn
nhiều so với phương pháp phát hiện gen trực tiếp.
Nghiên cứu candidate gene, các gen có vai trị trong con đường sinh tổng
hợp của tính trạng, có thể phát hiện ra một sự liên kết cung cấp thông tin về chức
năng của nó theo con đường đó. Tương tự, nếu thất bại trong việc tìm kiếm liên
kết với tính trạng quan tâm cũng cung cấp bằng chứng chống lại biến thể về chức
năng trong con đường đó. Cách tiếp cận bằng candidate gene đã được ứng dụng
rộng rãi trong nghiên cứu bệnh di truyền, nghiên cứu di truyền liên kết.
Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tôi chọn đề tài “Xác định
cadidate gen kháng bệnh bạc lá trong các giống lúa bản địa của Việt Nam
phục vụ công tác chọn tạo giống” nhằm sử dụng kỹ thuật toán tin, sinh tin và
các marker phân tử để nhanh chóng tìm kiếm các gen kháng bạc lá có trong một
số giống lúa bản địa của Việt Nam phục vụ cho các chương trình nghiên cứu
chọn tạo giống lúa kháng bạc lá và trực tiếp phục vụ sản xuất.

2


2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Sử dụng tin sinh học khai thác được dữ liệu genome lúa bản địa của Việt
Nam, xác định được các gen ứng viên (candidate gen) kháng bạc lá phục vụ công
tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định 1-2 gen ứng viên (trình tự, vị trí, bản đồ vật lí) đối với tính
trạng kháng bệnh bạc lá có trong tập đồn các giống lúa bản địa của Việt Nam đã
giải mã;
- Thiết kế bộ chỉ thị phân tử mới (PCR based: các marker chức năng, các

marker đặc hiệu SSR, SSLP, SNP/CAPs/dCAPs...) liên kết với candidate gen
kháng bệnh bạc lá

3. Cơ sở khoa học và cơ sở thực tiễn
3.1. Cơ sở khoa học
Sử dụng các kỹ thuật toán tin, sinh tin và các marker phân tử để tạo cơ sở
cho việc tìm kiếm các gen kháng bạc lá có trong một số giống lúa bản địa của
Việt Nam phục vụ cho các chương trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa và nâng
cao tiềm năng di truyền của các giống lúa kháng bạc lá trong sản xuất.
Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa kháng bạc lá có ý nghĩa
quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng
chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng
cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa kháng bạc lá ở mức phân
tử.

3


3.2. Cơ sở thực tiễn
Nghiên cứu để xác định các gen ứng viên kháng bạc lá góp phần nâng cao
hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất
cao lại có khả năng kháng bệnh bạc lá, phù hợp với điều kiện canh tác lúa và cơ
cấu sản xuất lúa ở các vùng khác nhau của Việt Nam.

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
Tập đoàn giống lúa kháng bạc lá bản địa của Việt Nam đã giải mã và 5 tổ
hợp lai:

DT39

X

An dân 11 X

OM6377
CNBN2

OM6976

X CNBN2

Q1-8-1

X

Thủ Đô 1 X

Chấn Thơm
CNBN2

4.1. Phạm vi nghiên cứu
Các nghiên cứu về lĩnh vực Tin - Sinh học, phân tích genome, các thí
nghiệm về Sinh học phân tử, thiết kế marker được thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật
Di truyền, Viện Di truyền Nông Nghiệp.

4


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về nghiên cứu bệnh bạc lá ở cây lúa
1.1.1. Bệnh Bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae. pv.oryzae)
Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm
1884. Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do
acid đất. Nhưng khơng lâu sau đó, người ta đã cơng nhận ngun nhân của nó là
do vi khuẩn gây nên và thuộc loại Bacillus oryzae. Vi khuẩn này cuối cùng đã
được Ezuka (1974) xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên.
Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế
giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước
trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ, Philippin, Indonexia, Trung Quốc . Bệnh bạc lá
lúa có xu hướng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân[13]. Hiện nay, bệnh đã gây
hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới.
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh
bạc lá lúa là: bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek). Cho đến nay
mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm
trong nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc
dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh. Các giống lúa khác
nhau có thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá. Triệu chứng vàng
nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng
có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra.
Theo Lê Lương Tề (1980) thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá
hại suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ cây
lúa trên ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa[5].

5


Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng
dễ nhầm lẫn với các triệu chứng khác. Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu
chứng ở mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng

rồi nâu bạc, lá dễ bị khô.
Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều
tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngồi nhưng nói chung vết bệnh có những
đặc điểm điển hình sau đây:
- Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân
chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá.
- Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mơ bệnh xanh tái
vàng lục, cuối cùng cháy khơ có màu nâu xám.
- Thơng thường ranh giới giữa mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ
rệt, có giới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc khơng vàng, có khi chỉ một
đường viền màu nâu sẫm, đứt qng hay khơng đứt qng.
Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh. Tuy
nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều kiện
bên ngoài, nhất là ở mạ, do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khơ đầu lá
sinh lý[1].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trên thế giới
Có rất nhiều phương pháp được áp dụng để tạo giống lúa kháng bạc lá
như: Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp chọn lọc truyền thống và
chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các
dịng đẳng gen (Near Isogenic Line) có mang gen kháng sau đó lai quy tụ
(pyramiding) nhiều gen kháng hoặc nhiều QTL từ nhiều nguồn bố mẹ vào trong
một giống. Cho đến nay, với những thành tựu đạt được trong việc phát hiện các

6


gen kháng về cả định lượng và định tính đã đặt nền tảng cho những nghiên cứu
chọn tạo giống kháng bệnh.
Đối với bệnh bạc lá, các gen xa4, xa5, Xa7 và Xa21 được các chuyên gia
lưu tâm nhất vì các gen này khi tổ hợp cùng với nhau có phổ kháng rộng. Tại Ấn

Độ, việc quy tụ nhiều gen kháng vào cùng một tổ hợp gen đã được thực hiện và
tạo ra được các dòng mang nhiều gen kháng làm nguồn vật liệu tốt để chuyển tổ
hợp gen này vào các giống lúa thương mại tăng tính kháng bạc lá của các giống,
dòng NH56 mang 4 gen (Xa4, xa5, Xa7 và Xa21)[24]. Trong chương trình lúa lai
tại Trung Quốc, việc quy tụ các gen kháng bệnh vào các dòng phục hồi để tăng
tính kháng của lúa lai cũng được quan tâm đặc biệt; các gen Xa7, Xa21 đã được
quy tụ vào giống lúa Minhhue 63[29].
Trong các chương trình chọn giống sử dụng phương pháp lai trở lại, MAS
giúp đẩy nhanh việc tích hợp các gen mong muốn. Chen và cs (2000, 2001) đã
áp dụng MAS để cải thiện được tính kháng bệnh bạc lá của hai dòng phục hồi ưu
việt là “6078” và “Minghui 63” nhờ quy tụ gen kháng Xa21 từ “IRBB21” vào 2
dòng phục hồi này. Các con lai có bố mẹ là các dịng phục hồi đã được cải tiến
này có năng suất cải thiện đáng kể trong điều kiện dịch bệnh[11],[12].
Các gen xa5, Xa13 và Xa21 kháng mạnh với các chủng nấm bệnh bạc lá ở
Ấn Độ đã được lai quy tụ vào giống lúa Indica (PR106) nhờ sự hỗ trợ của MAS
(Singh và cs., 2001). Năm 2002, Indonesia đã thương mại hóa hai giống lúa
Angke và Conde, là hai giống lúa có mang tổ hợp gen Xa4+xa5 và Xa4+Xa7 [8].
Các nhà chọn tạo giống Philippin cũng đã thành cơng khi tích hợp tổ hợp
gen Xa4+xa5+Xa21 (có nguồn gốc từ giống NSIC Rc142 và NSIC Rc154) vào
giống IR64 nhờ sự hỗ trợ của MAS[27]. Ở Trung Quốc, dòng lúa bất dục đực
nhạy cảm với ánh sáng - 3418s[19], dịng duy trì R8006 và R1176[9],[10], và
dịng Kang 4183[20] mang gen Xa21, có khả năng kháng bạc lá cao đã được phát
7


triển. Các gen Xa13 và Xa21 đã được tích hợp vào giống Pusa Basmati 1 nhờ sự
hỗ trợ của MAS [16]. Cũng với giống lúa Pusa Basmati 1, ba gen xa5, Xa13 và
Xa21 đã được tích hợp vào giống này và tạo ra giống Pusa Basmati 1 cải tiến.
Đây là giống lúa đầu tiên được chọn tạo nhờ sự hỗ trợ của MAS đã được
thương mại ở Ấn Độ vào năm 2007 [14]. Song song với những nỗ lực này, các

nhà chọn tạo giống của Cục Nghiên cứu lúa gạo (DRR)cũng đã tích hợp 3 ba gen
kháng bạc lá này (xa5, Xa13 và Xa21) vào giống lúa ưu tú SambaMahsuri nhờ sự
hỗ trợ chỉ thị phân tử [26]. Pandey và cs (2013) đã cải tiến hai giống Basmati
mẫn cảm với bệnh bạc lá (Taraori Basmati và Basmati 386) nhờ tích hợp hai gen
Xa13 và Xa21 sử dụng kỹ thuật lai trở lại với sự hỗ trợ của marker (MABC) kết
hợp với lựa chọn kiểu hình[23].
Bảng1.1: Các giống lúa mang gen kháng bạc lá đƣợc chọn tạo nhờ sự hỗ trợ
của chỉ thị phân tử (MAS) và đã thƣơng mại hóa ở Châu Á
Giống
thƣơng mại

Angke

Giống gốc

Tổ hợp
gen

Năm
Quốc gia

thƣơng
mại

IR64

Indonesia

2002

Xa4/xa5

Cơ quan nghiên
cứu
Trung tâm
Nghiên cứu lúa
Indonesia và

Conde

IR64

Indonesia

2002

Xa4/Xa7
NSICRc142

IR64

Xa4/Xa21

Philipin

2006

PSB Rc14

Xa4/Xa21

Philipin

2007

Zhong9A/R8006

Xa4/Xa21

Trung

2004

(Tubigan 7)
NSIC Rc154
(Tubigan
11) 1
Guodao

Quốc
8

Trung tâm Công
nghệ Sinh học
Viện nghiên cứu
Nông nghiệp và
lúa Philippin
Phát triển nguồn
Viện nghiên cứu
gen Indonesia

lúa Philippin
(ICRR/ICABIOG
Viện RAD)
nghiên cứu


Guodao 1
Guodao 1

Zhong8A/R8006
NeixiangIIA/R800

Xa4/Xa21
Xa4/Xa21

Sambha Mahsuri

Xa21,

Mahsuri cải

xa5,

tiến
Sambha

Xa13
Xa21,

Mahsuri cải

Pusa Basmati-1

tiến

Quốc
Trung

2004

lúa Quốc gia
Trung Quốc

2006

(CNRRI)

2007

Ủy ban Chuyển

Quốc

6
Sambha

Trung

Ấn Độ

giao Giống Trung
Ấn Độ

xa5,

2007

ương Ấn Độ
(CVRC)

Xa13

Với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử, nhiều giống lúa cải
tiến mang nhiều gen kháng bệnh nói chung và bạc lá nói riêng đã và đang được
chọn tạo. Tính đến nay, khu vực Châu Á đã có hơn 10 giống lúa kháng bệnh bạc
lá đã được phát triển và thương mại hóa. Các giống này đều được chọn tạo nhờ
sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) [28].
1.1.3. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ở Việt Nam
Trước đây ở Việt Nam, các nhà chọn tạo giống thường sử dụng phương
pháp nhân giống truyền thống để tạo ra các giống lúa kháng bạc lá. Tuy nhiên
phương pháp này thường tốn thời gian và không phân biệt được kiểu gen dị hợp
tử. Gần đây, với sự phát triển nhanh chóng cũng như là đặc điểm ưu việt của các
chỉ thị phân tử, các nhà nghiên cứu của Việt Nam đã bước đầu ứng dụng chỉ thị
phân tử trong chọn tạo giống.
Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Thị Lang (2004) đã sử dụng các chỉ thị STS
(RG556, RG136, pTA248), SSR (RM21, RM114, RM122, RM164, RM190) để
phát hiện các gen Xa21, xa5, xa13 trên các giống lúa địa phương và bố mẹ lai
[22]. Lã Vinh Hoa đã sử dụng các chỉ thị Npb 181, P3 và RG 556 để phát hiện ra

9

các gen Xa4, Xa7, xa5 trong số 150 mẫu giống thu được từ các địa phương ở
miền Bắc Việt Nam [3].
Vũ Hồng Quảng đã thành công sử dụng các chỉ thị RM5509 và pTA248
để phát hiện gen kháng bạc lá Xa7, Xa21 ở các dòng bố mẹ 9311BB, D42BB,
R308BB. Chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen Xa21,Xa7: pTA248, RM5509
tương ứng đã được sử dụng để phát hiện các gen này trên 3 dòng bố 9311BB,
D42BB, R308BB. Kết quả kiểm tra cho thấy: Dịng bố R308BB có 90% số cá
thể của mang gen kháng Xa21 đồng hợp tử, 10% số cá thể mang gen dị hợp tử;
dòng bố D42BB có 10% số cá thể mang gen kháng dị hợp tử, dịng bố 9311BB
có 100% số cá thể mang gen Xa7 và tất cả các cá thể này đều đồng hợp tử về gen
Xa7 [7].
Trong công tác chọn tạo giống, chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh
bạc lá ở Miền Bắc của Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội dùng phương pháp
thu thập mẫu bệnh, ứng dụngcông nghệ sinh học để phân lập, nuôi cấy và phân
biệt gen kháng bệnh bằng PCR đãxác định 16 chủng vi khuẩn Xanthomonas
oryzea gây bệnh khác nhau. Các dòngchỉ thị IRBB5 (xa5), IRBB7 (Xa7),
IRBB21 (Xa21) có tính kháng đa số các chủng vi khuẩn gây bệnh.
Tại Viện Di truyền Nông Nghiệp, tác giả Vũ Đức Quang và nhóm tác giả đã
thu thập được một số giống nhận gen trong các tổ hợp lai, dòng NILs mang đơn
gen kháng Xa21; Xa4; xa5; Xa7, chọn được 15 nịi vi khuẩn có độc tính cao và
đánh giá được một số đặc tính nơng học của các mẫu giống.

1.2. Tổng quan về gen ứng viên (candidate gene)
1.2.1. Candidate gene là gì?
Candidate gene (CG) là các gen với các đa hình phân tử về mặt di truyền
liên kết với locus hoặc QTLs chính, hoặc là các gen với các đa hình phân tử về
mặt thống kê liên kết với các biến thể của tính trạng đang được nghiên cứu
10

1.2.2. Các bƣớc xác định candidate gene
Candidate gene có thể được xác định bởi một số phương pháp, bao gồm
kiến thức đã biết về con đường sinh học, các nghiên cứu liên kết gen, nghiên cứu
biểu hiện gen, và nghiên cứu liên kết trên toàn bộ hệ gen. Các bước xác định
candidate gene bao gồm: Chọn CG, sàng lọc CG và xác nhận CG
1.2.2.1. Chọn CG chức năng
CG trước tiên được đề xuất dựa trên các nghiên cứu phân tử và sinh lý
(CG chức năng) hoặc dựa trên dữ liệu liên kết của locus đang được xác định (tất
cả các gen liên kết chặt chẽ, có thể là CG vị trí). Các thí nghiệm sơ bộ tạo thuận
lợi cho sự lựa chọn CG. Việc xây dựng các thư viện cDNA riêng biệt tương ứng
với các cơ quan khác nhau, các giai đoạn phát triển hoặc các phản ứng với stress
kèm theo việc sàng lọc các thư viện này hỗ trợ việc tách biệt CG. Công nghệ
cDNA- và oligonucleotide microarray cũng cho một hứa hẹn lớn trong việc xác
định CG và điều chỉnh sự biểu hiện của mRNA hoặc sự biểu hiện của các đa
hình trong DNA hệ gen. Các đột biến biểu hiện các kiểu hình đặc biệt cũng là
nguồn khác của CG
1.2.2.2. Chọn CG vị trí
Phương pháp này kết hợp phân tích tồn hệ gen và candidate gene, trong
đó việc xác định candidate gene chủ yếu dựa trên thông tin liên kết vật lý trong
đoạn nhiễm sắc thể xác định QTL. Cách tiếp cận này tập trung vào vùng lân cận
của QTLs đã biết, và candidate gene được tìm ra từ hàng chục đến hàng trăm
thành viên gen có trong các vùng nhiễm sắc thể mục tiêu.
Bản đồ các marker cho các gene đã biết chức năng có thể hỗ trợ việc chọn
CG vị trí. Sự lựa chọn này được hoàn thành bởi đánh giá mức độ gần của liên kết
với các locus của tính trạng. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong việc
tách các dòng gen kháng bệnh ở thực vật, cũng như gen điều chỉn thời gian nở
hoa ở Arabidopsis. Phân tích bản đồ so sánh cũng hỗ trợ việc chọn lựa các CG vị
11

trí. Bởi các lồi có quan hệ họ hang thường bảo tồn các cấu trúc hệ gen. Việc bảo
tồn các trình tự, thứ tự và phân bố gen giữa các lồi cũng hỗ trợ lựa chọn CG vị
trí giả định. Giải trình tự hệ thống của các dịng cDNA cung cấp một số lượng
expressed sequence tags (ESTs) mà rất hiệu quả cho phân tích bản đồ so sánh.
Bản đồ liên kết của marker EST đã được xây dựng ở ngô và lúa.
1.2.2.3. Sàng lọc CG
Một khi đã chọn một candidate gene, bước tiếp theo các nhà nghiên cứu
phải lựa chọn đa hình nào sẽ là hữu ích nhất để xác định vị trí của CG trên bản
đồ di truyền liên kết giữa markers của CG và locus đang được xác định và để
tính tốn mối tương quan thống kê giữa đa hình của CG và biến thể kiểu hình
trong một tập các cá thể không cùng phả hệ. Trong thực vật, hai phương pháp
đang được sử dụng là: vị trí bản đồ di truyền của các CG chức năng giả định và
các locus mục tiêu liên quan trong tính trạng nghiên cứu cần được so sánh. Các
thí nghiệm để tinh lập bản đồ là cần thiết để xác định vị trí chính xác cả CG và
locus
1.2.2.4. Xác nhận CG
Khi candidate gene và đa hình thích hợp được chọn, các nhà nghiên cứu
thường tiếp tục kiểm tra vai trò của gen này trong các mẫu bệnh và mẫu không
bệnh được chọn ngẫu nhiên. Việc chọn lọc thành các nhóm riêng biệt giúp cho
cách tiếp cận candidate gene có thể trả lời câu hỏi: Liệu có 1 alen của một
candidate gene biểu hiện thường xun hơn trong nhóm bệnh hay nhóm khơng
bệnh?
Để xác nhận CG, phân tích sinh lý bao gồm đo mức độ biểu hiện của CG
ở mức độ mRNA (bằng RT-PCR số lượng hoặc northern blotting) và/hoặc mức
độ protein và/hoặc bằng xác định hoạt động enzyme của CG.

12

Chuyển gen là cách cuối cùng để xác định một CG cho một tính trạng đơn
gen. Tuy nhiên, trong một số trường hợp và đặc biệt là các tính trạng phức tạp,
nó khơng cung cấp bằng chứng khơng thể chối cãi rằng CG xác định sự thay đổi
tính trạng. Trong những trường hợp này, bằng chứng có thể chỉ thu được thông
qua tái tổ hợp tương đồng.
1.2.3. Tổng quan các phƣơng pháp xác định candidate gene
1.2.3.1. Phương pháp truyền thống
Phương pháp này chọn lọc các candidate gene chủ yếu dựa trên các chức
năng sinh học đã biết, trực tiếp hoặc gián tiếp điều chỉnh các quá trình phát triển
của các tính trạng cần điều tra, tính trạng cần được xác nhận bởi đánh giá ảnh
hưởng của biến thể gen gây bệnh trong phân tích liên kết
1.2.3.2. Phương pháp NBS-LRR (Nucleotide Binding Site-Leucine Rich
Repeat)
Có rất nhiều lớp gen kháng mã hóa cho protein chứa một vị trí gắn
nucleotide (nucleotide binding site) và đoạn lặp giàu leucine (leucine-rich
repeats). Vùng NBS có liên quan đến tín hiệu, và chúng bao gồm các motifs có
thứ tự chặt chẽ và tính bảo tồn cao, chẳng hạn như P-loop, kinase-2 và motifs
Gly-Leu-Pro-Leu. LRRs là vùng cấu trúc có khả năng thích ứng cao chủ yếu ở
tương tác protein-protein, và chúng có thể mở ra những đặc trưng kết nối rất
khác nhau. LRRs đang làm thay đổi việc lựa chọn, trong khu vực này, các
protein NBS-LRR không chỉ thiếu tính bảo tồn, mà cịn đa dạng hơn so với dự
kiến từ trôi dạt di truyền ngẫu nhiên. Clustering của NBS-LRR gen do sự sao
chép song song và trùng lặp ngoài tử cung tiếp theo sắp xếp lại địa phương và
chuyển đổi gen cũng là quá trình quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của gia
đình gen này

13

1.2.3.3. Phương pháp tin sinh học để xác định candidate gene gây bệnh
Với sự bùng nổ về thông tin di truyền và di truyền chức năng thông tin về
gen, các phương pháp xác định gen gây bệnh đã nhanh chóng phát triển. Cơ sở
dữ liệu bây giờ là rất cần thiết cho quá trình lựa chọn các candidate gene gây
bệnh. Khi trình tự hệ gen được giải mã, việc xác định candidate gene trở nên dễ
dàng hơn, tuy nhiên cũng chỉ với các gen đơn. Việc phân tích di truyền các tính
trạng phức tạp vẫn cịn là nhiệm vụ khó khăn, và hầu hết các gen quy định các
bệnh do nhiều yếu tố vẫn chưa được phát hiện.
Ngày nay, cơ sở dữ liệu đã trở thành một nguồn cốt lõi cho cho các nhà
săn gen. Các hệ thống thu hồi như Trung tâm Quốc gia về Thông tin ông nghệ
sinh học của Entrez, Hệ thống thu hồi trình tự và Hệ thống thu hồi của Maarten
cung cấp một sự truy cập dễ dàng và nhanh chóng vào một tập hợp các cơ sở dữ
liệu thường xuyên được sử dụng. Trọng tâm chính của các hệ thống thu hồi là để
lấy một tập hợp các cơ sở dữ liệu nhằm đáp ứng các thắc mắc của người sử
dụng. Tích hợp các dữ liệu dựa trên bối cảnh di truyền, chẳng hạn như trong
trường Đại học California, trình duyệt gen Santa Cruz và Ensembl, từng bước
hình thành nên giao diện (ví dụ như EnsMart) mà trích xuất dữ liệu dựa trên vị
trí nhiễm sắc thể, biểu hiện gen và bản chất gen. Việc làm giàu các candidate gen
bệnh sử dụng các giao diện cơ sở dữ liệu, tuy nhiên, phụ thuộc nhiều vào kỹ
năng hoạt động của các nhà nghiên cứu. Phương pháp khác đã được phát triển
một cách hệ thống để phát hiện bộ dữ liệu cho hầu hết các candidate gene bệnh.
Để xác định candidate gene bệnh bằng các nguồn dữ liệu khác nhau, một
số phương pháp đã được phát triển, chẳng hạn như Gene2Diseases (G2D).
Phương pháp này tạo ra khả năng kết hợp các dạng kiểu hình với các dạng chức
năng thơng qua các dạng hóa học. Phương pháp G2D gần đây đã được mở rộng
với dữ liệu gắn trình tự được biểu hiện (expressed sequence tag - EST). Hệ thống
mới này làm cho đầu vào kiểu hình cũng đã được cải thiện, nghĩa là làm giảm
14