Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.36 MB, 78 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
------------------------
ĐẶNG THỊ THU GIANG
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT
ADN TỪ DẤU VẾT MÁU TRÊN CÁC VẬT MANG LÀ VẢI
SAU KHI BỊ GIẶT BẰNG XÀ PHÒNG TRONG CÁC VỤ ÁN
HÌNH SỰ PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2015
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
------------------------
ĐẶNG THỊ THU GIANG
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT
ADN TỪ DẤU VẾT MÁU TRÊN CÁC VẬT MANG LÀ VẢI
SAU KHI BỊ GIẶT BẰNG XÀ PHÒNG TRONG CÁC VỤ ÁN
HÌNH SỰ PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Văn Hà
HÀ NỘI - 2015
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành bản luâ ̣n văn này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắ c tới
Đại tá, PGS.TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc T rung tâm giám đinh
̣ Sinh
học Pháp lý - Viê ̣n Khoa ho ̣c hiǹ h sự - Bô ̣ Công an đã rấ t tâ ̣n tiǹ h hướng dẫn
tôi trong suố t quá trin
̀ h nghiên cứu và hoàn thành bản luâ ̣n văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lañ h đa ̣o Viện Khoa học hình sự , Lãnh đạo
Trung tâm và các đồng nghiệp trong Trung tâm giám đinh
̣ Sinh ho ̣c Pháp lý Viê ̣n Khoa ho ̣c hin
̀ h sự - Bô ̣ Công an đã đô ̣ng viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong
quá trình làm luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầ y cô giáo th uô ̣c Viê ̣n Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật , Viện Công nghệ Sinh học đã tâ ̣n tiǹ h truyề n đa ̣t kiế n
thức và giúp đỡ tôi trong suố t quá triǹ h ho ̣c tâ ̣p.
Cuố i cùng tôi xin bày tỏ lòng biế t ơn đế n gia điǹ h và ba ̣n bè , đã đô ̣ng
viên, góp ý và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2015
Học viên
Đặng Thị Thu Giang
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài .................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 4
4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 4
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 5
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 6
1.1. Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự....................................... 6
1.2. Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự ...................... 7
1.2.1. Khái niệm về máu ............................................................................ 7
1.2.2. Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu ..................................... 8
1.3. Ảnh hưởng của xà phòng lên dấu vết máu ............................................. 9
1.4. Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng 11
1.4.1. Mục đích ......................................................................................... 11
1.4.2. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải .............. 12
1.4.3. Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài 12
1.5. Tách chiết ADN từ dấu vết máu ........................................................... 15
1.6. Định lượng ADN................................................................................... 16
1.7. Khuếch đại ADN (PCR) ....................................................................... 17
1.8. Những khó khăn trong nâng cao hiệu quả PCR và chất lượng ADN ... 21
1.9. Kỹ thuật điện di ..................................................................................... 22
1.9.1. Nguyên lý của kỹ thuật điện di ....................................................... 22
1.9.2. Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130
Genetic Analyzer ...................................................................................... 23
1.10. Phân tích dấu vết ADN khi bị lẫn ....................................................... 23
1.11. Vấn đề nhiễm ADN ............................................................................ 24
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
1.12. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước đối với lĩnh vực
nghiên cứu của đề tài ................................................................................... 26
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 28
2.1. Vâ ̣t liê ̣u .................................................................................................. 28
2.1.1. Thiế t bi ̣ máy móc ........................................................................... 28
2.1.2. Dụng cụ ........................................................................................... 28
2.2. Hóa chất ................................................................................................ 29
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 29
2.3.1. Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải .............. 29
2.3.2. Phương pháp giám định định hướng dấu vết máu .......................... 29
2.3.3. Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép – Ouchterlony ................. 30
2.3.4. Phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu ................................ 31
2.3.5. Định lượng ADN ............................................................................ 34
2.3.6. Phương pháp PCR........................................................................... 36
2.3.7. Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn(Capillary Electrophoresis - CE). 36
2.4. Thiết kế bố trí thí nghiệm...................................................................... 37
2.4.1. Các mẫu khảo nghiệm được tạo ra ................................................. 37
2.4.2. Các mẫu tạo ra được ký hiệu 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A,
5B, 5C, 6A, 6B, 7A, 7B, được tiến hành các bước thí nghiệm như sau: ...... 43
2.4.3. Tách chiết ADN bằng dung dịch Chelex 5% và bộ kít PrepFiler .. 44
2.4.4. Thử nghiệm kết quả tách chiết bằng bộ kít PrepFiler trên các mẫu
từ các vụ án cụ thể .................................................................................... 44
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 47
3.1. Kết quả nghiên cứu ............................................................................... 47
3.1.1. Kết quả xác định định hướng dấu vết máu thu từ các vụ án với dung
dịch phenolphthalein ................................................................................. 47
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
3.1.2. Kết quả xác định protein loài sử dụng kỹ thuật khuếch tán miễn
dịch kép theo Ouchterlony ........................................................................ 47
3.1.3. Kết quả thực nghiệm tách chiết bằng phương pháp sử dụng chelex
5% và tách chiết bằng bộ kít PrepFiler ..................................................... 47
3.1.4. Kết quả tách chiết bằng phương pháp PrepFiler ứng dụng vào mẫu
vụ án thực tế .............................................................................................. 56
3.1.5. Hình ảnh điện di một số mẫu thực nghiệm, mẫu án thực tế ........... 58
3.2. Thảo luận kết quả nghiên cứu ............................................................... 66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
DANH MỤC CÁC TƢ̀ VIẾT TẮT
ADN (DNA)
: Axit deoxyribonucleic
ARN
: Axit ribonucleic
LR
: Likelihood Ratio (tỉ lệ khả dĩ)
RFU
: Relative Flourescence Units (đơn vị huỳnh quang tương đối)
RFLP
: Restriction fragment Length Polymorphism (đa hình chiều
dài đoạn cắt giới hạn)
PCR
: Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân bội gen)
ProK
: Proteinaza K
STR
: Short Tandem Repeat (đoạn lặp lại ngắn)
VNTR
: Variable Number Tandem Repeats (đoạn lặp có độ dài
trung bình)
KHHS
: Khoa học hình sự
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH MINH HỌA
Bảng 1.1: Thành phần và thể tích phản ứng PCR ........................................... 36
Bảng 1.2: Các thành phần hóa chất sử dụng để điện di mao quản ................. 37
Bảng 2.1: Kết quả định lượng ADN tách chiết bằng chelex 5% ................... 48
Bảng 2.2: Chất lượng ADN tách chiết bằng chelex 5% ................................. 50
Bảng 2.3: Kết quả định lượng ADN tách chiết bằng bộ kít PrepFiler ........... 52
Bảng 2.4: Chất lượng ADN tách chiết bằng bộ kít PrepFiler ......................... 54
Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN với mẫu máu trên vải đã bị giặt trong
vụ án cụ thể ..................................................................................................... 56
Bảng 3.2: Chất lượng ADN thu được từ dấu vết máu đã bị giặt trong các vụ
án cụ thể .......................................................................................................... 57
Hình 4.1: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 1A, lần thực nghiệm 1.1 ................... 58
Hình 4.2: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 1B, lần thực nghiệm 1.2 .................... 59
Hình 4.3: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 6B, lần thực nghiệm 1.2 .................... 60
Hình 4.4: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA1.1 ............................................... 61
Hình 4.5: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA2.1 ............................................... 62
Hình 4.6: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA2.2 ............................................... 63
Hình 4.7: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA3.2 ............................................... 64
Hình 4.8: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA4.2 ............................................... 65
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài
Phân tích dấu vết ADN đã trở thành một phần không thể thiếu trong
công tác giám định hình sự nói chung và giám định dấu vết sinh học nói riêng
và là một công cụ quan trọng cho các nhà điều tra phá án. Thông qua phân
tích ADN có thể truy nguyên, nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm
tung tích nạn nhân, người mất tích trong các vụ cháy, vụ tai nạn, thảm họa…
hoặc xác định quan hệ huyết thống.
Mỗi năm Viện Khoa học hình sự nhận được hàng trăm trưng cầu giám
định ADN từ các vụ án, chủ yếu là từ dấu vết máu, tinh trùng, tóc, tế bào,
răng xương, mô và tổ chức cơ thể, móng tay móng chân… Thống kê năm
2014 tại Viện Khoa học hình sự có 421 vụ án yêu cầu giám định ADN, trong
đó số lượng trưng cầu giám định ADN từ dấu vết máu là 146 vụ và số vụ án
có dấu vết máu trên vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm… là 54 vụ
với 144 mẫu cần giám định, trong số đó có nhiều vụ án vật mang dấu vết máu
là vải được đưa đến giám định trong tình trạng đã qua ngâm giặt bằng xà
phòng, dấu vết trên vật mang không còn nguyên vẹn, giảm đáng kể về số
lượng và chất lượng ADN. Gây khó khăn rất lớn trong công tác giám định.
Trong các vụ án hình sự việc khẳng định dấu vết máu của nạn nhân để
lại trên quần áo của đối tượng gây án hay máu của đối tượng bám dính trên
các vật mang là vải để lại hiện trường là một nguồn chứng cứ rất quan trọng,
thủ phạm có thể do vô tình hay cố ý đã dùng hóa chất như xà phòng, chất tẩy
rửa để giặt quần áo, hay các vật mang là vải có bám dính dấu vết máu trên đó.
Vì vậy việc tách chiết ADN từ các dấu vết máu này gặp rất nhiều khó khăn.
Do chất tẩy rửa tác động lên dấu vết phá hủy và rửa trôi dấu vết. Trong thực
tế khi gặp những trường hợp như vậy mà áp dụng phương pháp tách chiết
thông thường như đối với các dấu vết máu có chất lượng tốt thì tỉ lệ thành
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
1
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
công là rất thấp. Hơn nữa do phải tách chiết, PCR, chạy điện di nhiều lần gây
tốn kém hóa chất và mất rất nhiều thời gian, mặt khác do lượng dấu vết
thường không nhiều nên đòi hỏi phải có phương pháp tách chiết hiệu quả để
tránh sử dụng hết dấu vết mà không cho kết quả phân tích ADN dẫn đến
không góp phần giải quyết được vụ án.
Trong thực tế các vụ án có dấu vết máu trên các vật mang là vải theo như
lời khai của đối tượng là đã qua ngâm giặt bằng xà phòng và thực tế trong giám
định quan sát bằng mắt cũng thấy vật mang dấu vết tương đối sạch, lượng dấu
vết bám dính trên vật mang là khá mờ nhạt thì với phương pháp tách chiết thông
thường hiện nay là dùng chelex 5% không cho hiệu quả cao với lý do:
- Lượng ADN tách chiết được không đủ để thực hiện phản ứng PCR.
- Không loại bỏ được hết các chất ức chế ảnh hưởng đến chất lượng ADN.
- Hình ảnh điện di kém: Mất alen, nhiều alen lặp ảnh hưởng đến việc
phân tích kiểu gen.
Trong quá trình giải quyết các vụ án thực tế thấy rằng nhiều khi dấu vết
máu để lại trên vật mang là nguồn chứng cứ duy nhất nếu không tách chiết
được ADN có chứa trên đó để phân tích giám định thì vụ án sẽ đi vào bế tắc.
Trước tình hình đó, chúng tôi thấy rằng việc nghiên cứu thử nghiệm các
phương pháp tách chiết khác nhau đối với dấu vết máu trên vật mang là vải
sau khi bị giặt bằng xà phòng là rất cần thiết, nhằm tạo ra quy trình ổn định
trong tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải đã bị giặt bằng
xà phòng trong các vụ án, góp phần giải quyết yêu cầu thực tế đặt ra, cũng
như góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN đối với loại dấu vết khó
thường gặp và có giá trị này. Vì vậy việc tiến hành triển khai đề tài: “Nghiên
cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang
là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công
tác giám định ADN” là một yêu cầu cấp thiết.
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
2
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
2. Mục tiêu nghiên cứu
Sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% và bộ kít tách chiết
PrepFiler để tách chiế t ADN từ dấu vết máu trên các vật mang
là vải sau khi
bị giặt bằng xà phòng với trang thiết bị, phương tiện, hóa chất của phòng thí
nghiệm Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an.
Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích phân tích, đánh giá sự
tác động qua lại của một số yếu tố lý, hóa như: xà phòng, chất liệu vải, thời
gian tồn tại của dấu vết máu trên vải trước khi bị giặt, cách thức giặt … lên
dấu vết máu bám dính trên các vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối
đệm…. Chất lượng và số lượng của ADN tách chiết được từ các dấu vết máu
trên các vật mang là vải như quần áo chăn ga gối đệm…. sau khi đã bị giặt
bằng xà phòng trong các vụ án cụ thể và trên các mẫu khảo nghiệm.
Kết quả nghiên cứu giúp đưa ra nhận định với phương pháp tách chiết
nào thì tối ưu nhất đối với dấu vết máu trên vải đã bị giặt bằng xà phòng, phục
vụ tốt nhất công tác giám định gen hình sự, góp phần hoàn thiện cơ sở lý luận
hiện có về quy trình tách chiết ADN nói chung cũng như tách chiết ADN từ
những dấu vết có chất lượng kém nói riêng phục vụ cho công tác giám định
ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an.
Kết quả đánh giá ADN tách chiết từ dấu vết máu thể hiện qua các bảng
kết quả nồng độ ADN tổng số được tách chiết trực tiếp từ dấu vết máu; biểu
đồ về hình thái các peak biểu thị cho các alen thu được ở 16 locus gen theo hệ
STR (IdentifilerTM), qua đó giúp giám định viên gián tiếp đánh giá số lượng
và chất lượng đối với từng alen của ADN tách chiết được từ mẫu máu cần
khảo sát.
Việc sử dụng kỹ thuật định lượng bằng realtime PCR chỉ là một khâu
trong quy trình giám định giúp đánh giá được về hàm lượng ADN tách chiết
được từ các dấu vết máu, từ đó định hướng điều chỉnh hàm lượng ADN
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
3
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
khuôn đưa vào mỗi phản ứng PCR. Kết quả định lượng bằng Real time PCR
không hoàn toàn phản ánh chất lượng ADN phục vụ cho phản ứng PCR các
locus hệ Identifiler
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu thực nghiệm các phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết
máu trên vật mang là vải sau khi đã giặt bằng xà phòng.
- Mẫu thực nghiệm được tạo ra và thu từ các vụ án mà cơ quan điều tra
công an các tỉnh thành trong cả nước gửi giám định ADN tại phòng thí
nghiệm của Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an.
4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Sử dụng các phương pháp để tách chiết ADN
Qua tham khảo tài liệu và thực tế giám định tại Viện Khoa học hình sự
hiện nay cho thấy có 2 phương pháp tách chiết thông dụng và đạt hiệu quả
đảm bảo cho quá trình giám định ADN từ dấu vết máu đó là:
- Phương pháp tách chiết bằng chelex 5%.
Phương pháp tách chiết bằng chelex 5% là phương pháp thông dụng
nhất, giá thành rẻ, dễ thao tác, nhanh. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi chất
lượng của ADN phải tốt, số lượng của ADN phải tương đối nhiều có độ tinh
khiết cao. Như vậy dấu vết gửi giám định phải tương đối tốt ít bị biến tính.
- Phương pháp tách chiết bằng bộ kít PrepFiler.
Phương pháp tách chiết bằng bộ kit tách chiết PrepFiler cho hiệu quả
cao và tối ưu nhất hiện nay áp dụng đối với các mẫu có hàm lượng ADN
thấp, bị biến tính và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế. Tuy nhiên giá thành cao,
dễ bị nhiễm trong quá trình thao tác.
Bởi vậy chúng ta phải có những khảo sát để có được sự lựa chọn phù
hợp. Xác định phương pháp tách chiết tối ưu với từng loại mẫu vật cụ thể,
vì lượng dấu vết trong các vụ án thường không nhiều nếu chúng ta lựa chọn
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
4
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
không đúng phương pháp tách chiết thì có thể sẽ sử dụng hết mẫu vật mà
vẫn không cho kết quả. Ngoài ra việc lựa chọn đúng phương pháp tách chiết
còn vừa tiết kiệm chi phí vừa tiết kiệm thời gian.
4.2. Quy trình đánh giá và kết quả dự kiến
- Sản phẩm tách chiết được định lượng bằng phương pháp Real-time.
Mỗi mẻ thí nghiệm sau khi tách chiết ADN bằng phương pháp chelex 5% và
bộ kít PrepFiler sẽ được chạy phản ứng PCR , sau đó điện di phân tích kết quả.
- Toàn bộ sản phẩm tách chiết bởi phương pháp chelex 5% và bộ kít
PrepFiler sẽ được so sánh, đánh giá lượng ADN thu được bằng phương pháp
định lượng, chạy PCR và phân tích kết quả hình ảnh điện di từ đó rút ra
phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất.
- Trên cơ sở kết quả của các phương pháp tách chiết, luận văn dự kiến
sẽ áp dụng phương pháp tách chiết phù hợp cho dấu vết máu trên vật mang là
vải sau khi bị giặt bằng xà phòng.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, đã tách chiết được lượng ADN hiệu
quả nhất nhờ lựa chọn đúng phương pháp phù hợp đối với dấu vết máu trên
các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự, góp
phần rút ngắn thời gian, tiết kiệm chi phí.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Ứng dụng để tách chiết thành công ADN đối với các dấu vết máu trên
các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự.
Giúp truy nguyên được cá thể, có căn cứ để xác định tội phạm, là nguồn
chứng cứ để giải quyết các vụ án hình sự.
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
5
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự [3]
Trong giám định kỹ thuật hình sự có nhiều phương pháp để truy
nguyên cá thể người, giám định ADN hiện nay là một trong những phương
pháp đắc lực nhất để giúp các nhà điều tra hình sự xác định chính xác tội
phạm, truy tìm tung tích nạn nhân cũng như xác định quan hệ huyết thống.
Giám định ADN ra đời dựa trên nền tảng của sinh học phân tử và gắn liền với
sự phát triển của nó. Theo thời gian, cùng với sự phát triển của sinh học phân
tử, công nghệ thông tin và các ngành khoa học khác có liên quan… giám định
ADN ngày càng được hoàn thiện và phát triển không ngừng, trở thành một
phương pháp giám định mang tính toàn cầu
Năm 1985, Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester
nước Anh khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hóa cho myoglobin trong máu
người đã phát hiện ra trình tự của các base nitơ được lặp lại một số lần với
chiều dài đoạn lặp từ 10 - 15 base pair hoặc vài chục base pair, các đoạn lặp
này được gọi là tiểu vệ tinh (Minisatellite) hay VNTR (Variable Number
Tandem Repeats). Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử
dụng làm đầu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng
siêu biến (hypervariable regions) ở các vật liệu di truyền khác nhau. Kỹ thuật
để Jeffreys phân tích các đoạn lặp VNTR là kỹ thuật RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism). Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch
sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói
riêng. Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí
khác nhau trong genome của người. Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn
lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau. Alec Jeffreys coi đây là đặc
điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể. Giám định ADN
cho mục đích tư pháp ra đời từ đây. Phương pháp RFLP lần đầu tiên được sử
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
6
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
dụng để xác định đối tượng trong một vụ hiếp dâm xảy ra tại Anh vào năm
1986. Kể từ đó, việc kiểm tra truy nguyên cá thể bằng giám định ADN được
phổ biến rộng rãi.
Cũng vào thời điểm năm 1985, tác giả Kary Mullis đã công bố kết quả
thử nghiệm thành công phản ứng chuỗi nhân gen PCR. Phản ứng PCR có ưu
điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng kỹ thuật RFLP là chỉ cần một
lượng rất ít ADN khuôn ban đầu sau hơn 20 - 30 chu kỳ phản ứng đã tạo ra
được hàng triệu bản sao tạo điều kiện dễ dàng trong việc phát hiện và nghiên
cứu phân tích.
Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định ADN được giới
thiệu, đó là phương pháp phân tích sử dụng các đoạn lặp ngắn (STR - Short
Tandem Repeats) có gắn chất huỳnh quang hay còn gọi là Microsatellite. Các
STR thường có đoạn lặp từ 2 - 6 base pair. Hiện nay các hãng sản xuất đã đưa
ra các bộ kít PCR cho các locus STR rất thuận lợi cho việc thiết lập phản ứng
PCR và Identifiler là một trong những bộ kít như vậy.
1.2. Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự
1.2.1. Khái niệm về máu [8]
Máu là chất lỏng có màu đỏ chảy trong hệ thống mạch của người và
động vật, có vai trò quan trọng nhiều mặt đối với sự sống của cơ thể
Theo các nhà tổ chức học thì máu là mô liên kết đặc biệt mà chất căn bản
ở thể lỏng. Trong cơ thể do sức đẩy của tim, máu được lưu thông trong hệ tuần
hoàn máu theo một chiều xác định. Thành phần lỏng của máu là huyết tương và
thành phần hữu hình là các tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu).
Khi ra khỏi hệ tuần hoàn, máu bị đông lại, chất fibrinogen, một protein
ở dạng hòa tan trong huyết tương, biến thành lưới sợi fibrin không hòa tan
bao lấy tế bào máu, tạo thành cục máu đông. Khối này dần dần co lại tiết ra
chất lỏng màu vàng nhạt, đó là huyết thanh.
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
7
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
Máu chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng trong cơ thể người và động
vật bởi nhiều chức năng khác nhau: Điều hòa hoạt động tuần hoàn, duy trì
huyết áp, cung cấp oxy, đào thải CO2, bảo vệ cơ thể...và là một loại dấu vết
hình sự quan trọng trong giám định sinh học pháp lý.
1.2.2. Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu [8]
Giám định dấu vết máu trong điều tra hình sự để truy tìm thủ phạm đã
được ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX (Uhlenhuth 1900 – 1901)
bằng việc phân biệt giữa máu người và máu động vật trong các vụ án giết
người. Về sau với việc phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO (Landsteiner và
cộng sự 1901) và các hệ thống nhóm máu khác thì việc sử dụng dấu vết máu
để phục vụ cho công tác điều tra ngày càng được mở rộng.
Mỗi thành phần có trong huyết thanh và tế bào máu đều có vị trí quan
trọng, chứa đựng các thông tin cần thiết về một cá thể mà không ai giống ai
(tính cá biệt). Đây là vấn đề mấu chốt để truy nguyên cá thể thông qua dấu vết
máu. Tuy nhiên để đáp ứng yêu cầu này đòi hỏi một quá trình lâu dài của phát
triển khoa học và công nghệ. Mỗi giai đoạn phát triển của ngành huyết học và
giám định sinh học pháp lý thì các chỉ số khai thác được từ dấu vết máu đều
có những giá trị nhất định.
Mọi sự tương tác đều để lại dấu vết – Đây là nguyên lý nổi tiếng trong
Khoa học hình sự do Giáo sư Edmund Lo- Card trường đại học Y khoa
Jurisprudence ở Lyon đề ra và được gọi là Nguyên lý Locar. Có rất nhiều ví
dụ chứng minh cho nguyên lý này. Chẳng hạn, trong những hoạt động hàng
ngày, con người luôn để lại những dấu vết của mình như: Lông tóc rụng khi
chải đầu, tế bào da tay khi cầm điện thoại, tế bào niêm mạc khi hút thuốc
lá…Trong một vụ án hiếp, giết người ta có thể phát hiện được dấu vết tinh
dịch, tế bào biểu bì của đối tượng trong âm đạo, trong móng tay của nạn nhân
và dấu vết máu của nạn nhân trên quần áo đối tượng và từ đó có thể phân tích
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
8
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
ADN để truy nguyên đối tượng hoặc tìm tung tích nạn nhân. ADN có trong tất
cả các tế bào có nhân vì vậy sẽ có trong các chất sinh học có nguồn gốc từ cơ
thể người như máu, lông tóc, nước bọt, tinh dịch…để lại hiện trường vụ án.
Giám định gen từ máu chủ yếu là phân tích ADN trong bạch cầu vì
bạch cầu chiếm số lượng lớn trong máu là những tế bào có nhân. Bạch cầu
được chia làm 2 loại:
- Bạch cầu hạt gồm:
+Trung tính: 55% - 56%
+Ưa xít: 2% - 4%
+Ưa bazơ: 0,5%
-
Bạch cầu không hạt gồm:
+ Lymphoxit: 20% - 40%
+ Monoxit: 4% - 7%
Trung bình trong 1 ml máu người có khoảng 6.000 – 9.000 bạch cầu,
mỗi bạch cầu chứa khoảng 5-6 pg (picrogam) ADN, khi tách chiết 1ml máu
có thể thu được từ 20-50 ng (nanogam) ADN. Do vậy khả năng phân tích
được ADN từ dấu vết máu là rất cao.
1.3. Ảnh hƣởng của xà phòng lên dấu vết máu
Khái niệm về xà phòng:
Xà phòng là những muối natri (hoặc muối kali) của axit béo cao.
Những muối natri của axit béo cao RCOONa là xà phòng rắn, còn muối kali
của chúng, RCOOK là xà phòng mềm. Các dầu mỡ giàu axit béo no cũng cho
xà phòng rắn và các dầu chứa nhiều axit chưa no cho xà phòng mềm hơn.
Xà phòng là những chất hoạt động bề mặt. Nó có tác dụng làm giảm
sức căng bề mặt giữa các chất bẩn và quần áo, đồng thời xà phòng làm cho
khả năng thấm ướt của quần áo nhanh hơn.
Xà phòng có cấu tạo như sau:
R _COO Na
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
9
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
Phần gốc hidrocacbon –R là phần kỵ nước, tan tốt trong các dung môi
hữu cơ, dầu mỡ nhưng không tan trong nước. Nhóm – COONa là phần ưa
nước bị tan trong nước, ít tan trong các dung môi hữu cơ. Khi giặt giũ quần áo
bằng nước xà phòng thì phần kỵ nước (các gốc R khá dài) hòa nhập vào các
hạt dầu mỡ (vì chúng dễ dàng tan vào nhau). Trong khi đó, phần ưa nước (các
gốc _COONa) lại ở trên bề mặt các hạt bẩn đó và làm cho sức căng bề mặt
của hạt bẩn giảm đi vì chúng có điện tích cùng dấu. Khi sức căng bề mặt giảm
đi thì các hạt bẩn sẽ bị chia nhỏ ra, lực liên kết giữa hạt bẩn và quần áo yếu đi
làm tăng khả năng thấm ướt và hạt bẩn tan dần vào trong nước. Ngày nay khi
sản xuất xà phòng người ta còn cho thêm các enzym và cơ chế tác dụng làm
sạch vết bẩn của enzym là phân giải chất bẩn thành các đoạn, các phần có
khối lượng phân tử thấp hơn, dễ hòa tan hơn. Ví dụ: protease, amylase, lipase
có thể thủy phân các vết bẩn protein, tinh bột, dầu/mỡ ngay cả khi nó ở dạng
rắn, nhiệt độ thấp hơn 400C[ 2 ].
Chính vì những cơ chế nêu trên nên dấu vết máu tồn tại trên vật mang
là vải sau khi đã bị giặt bằng xà phòng thường có số lượng rất ít và chất lượng
rất kém, dẫn đến lượng và chất của ADN thu được cũng giảm đáng kể. Chất
lượng ADN giảm là do chúng bị rửa trôi, biến tính, bị phân hủy. Mặt khác các
hóa chất trong xà phòng cũng gây ức chế phản ứng PCR nên hiệu quả PCR
thường không cao.
Các phương pháp phân tích dựa vào PCR ngày nay như phân tích phức
hợp các locus STR (multiplex Short Tandem Repeat typing) trở nên rất ưu việt
bởi lẽ chỉ cần những lượng cực nhỏ ADN cũng có thể khuếch đại chúng đến
một mức nào đó mà chúng ta có thể được phát hiện ra. Với lượng chỉ nhỏ hơn 1
ng ADN cũng có thể được phân tích nhờ sự khếch đại PCR với một phức hợp
các locus STR so với việc yêu cầu lượng 100 ng hay nhiều hơn khi sử dụng kỹ
thuật RFLP trong những năm trước đây. Tuy nhiên, khi sử dụng kỹ thuật với độ
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
10
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
nhạy cao đòi hỏi lượng ADN nguồn vào thấp cũng đem lại nhiều rủi ro, rất khó
trong việc tránh sự tạp nhiễm gây ra bởi các cán bộ điều tra vụ án, hay các cán
bộ khám nghiệm hiện trường, những người có nhiệm vụ thu thập, bảo quản các
mẫu chứng cứ sinh học mà cụ thể là các dấu vết máu ở hiện trường. Để việc
khuyếch đại PCR được diễn ra thành công, ADN khuôn cũng cần phải được
nguyên vẹn ở một mức độ nhất định, đặc biệt ở vị trí gắn cặp mồi cũng như vị
trí giữa các mồi sao cho việc tổng hợp kéo dài có thể được diễn ra. Trong
trường hợp không có được một mạch ADN nguyên vẹn xung quanh vùng lặp
STR đóng vai trò như một mạch khuôn, thì phản ứng PCR sẽ không thành công
bởi vì việc kéo dài đoạn mồi sẽ bị tạm dừng ở vị trí đứt gãy trên mạch khuôn.
Với một mẫu ADN bị phân hủy càng nhiều thì sẽ có càng nhiều sự đứt gãy xảy
ra trong ADN khuôn và càng ít phân tử ADN có được chiều dài đầy đủ, cần
thiết cho sự nhân bội được chính xác trong mỗi phản ứng PCR.
Vấn đề quan trọng đặt ra là làm cách nào có thể tách chiết được một
lượng ADN đủ về số lượng và đảm bảo chất lượng để có thể thực hiện được
phản ứng PCR như đã nói ở trên.
1.4. Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng
1.4.1. Mục đích
Trong số các loại dấu vết ADN hình sự thì dấu vết máu là loại dấu vết
dễ bị phân hủy và biến tính nhất vì bản thân máu là chất lỏng, đó là môi
trường thuận lợi để các vi sinh vật, các enzym dễ dàng xâm nhập và phân
hủy dấu vết máu.
Việc phát hiện, thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải là một công
việc rất khó khăn vì không phải loại vải nào cũng là vải sáng màu và dễ phát
hiện dấu vết máu và việc phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt
là một công việc còn khó khăn hơn rất nhiều. Do đó việc tìm kiếm phát hiện
phải tỉ mỉ và không được bỏ sót bất kỳ một dấu vết nghi ngờ nào. Nếu thu được
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
11
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
tối đa dấu vết máu có trên vật mang thì giúp ích rất nhiều cho việc tách chiết
ADN, có thể phân tích được đầy đủ kiểu gen của cá thể để lại dấu vết máu.
1.4.2. Đánh giá, tìm dấu vết máu trên vật mang là vải
Dấu vết máu xuất hiện chủ yếu do tác động của ngoại lực làm rách
phần mềm cơ thể. Việc tìm kiếm dấu vết máu cần chú ý đến những điểm sau:
Nắm vững các thông tin có liên quan đến vụ việc để có định hướng
xem loại dấu vết nào có thể xuất hiện, vị trí dấu vết xuất hiện. Đồng thời xác
định phương pháp, tìm kiếm và thu dấu vết [7].
Đánh giá mức độ thương tích trên cơ thể nạn nhân để phán đoán lượng
máu có thể để lại trên vật mang nhiều hay ít.
Máu khi ra khỏi cơ thể có màu đỏ, quá trình khô làm cho máu chuyển
thành màu nâu, nâu sẫm, thậm chí màu đen, nên khó phát hiện hoặc dễ nhầm
lẫn với các dấu vết khác [7].
Xem xét toàn diện tỉ mỉ tất cả các vị trí có khả năng có dấu vết để lại,
trên vật mang, đặc biệt những vị trí khó quan sát.
Đối với các vật mang là quần áo, mũ, tất… phải tìm dấu vết không chỉ
ở mặt ngoài mà phải xem xét ở cả mặt trong, vì khi quần áo bị giặt tuy mặt
ngoài không nhìn thấy máu nhưng vẫn có thể nhìn thấy ở mặt trong, nhất là ở
đường chỉ may, mặt trong túi áo…[7].
1.4.3. Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài
+ Giám định định hướng dấu vết máu:
Sử dụng dung dịch phenolphthalein để xác định định hướng dấu vết máu.
Nguyên lý chung của các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu
Sơ đồ 1: Nguyên lý của các phương pháp định hướng dấu vết máu[9]
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
12
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
Thành phần phản ứng:
- Chất tạo màu (các hoá chất thay đổi màu như benzidine,
tetramethylbenzidine, luminol,...)
- Hydrogen peroxide (H2O2) là chất oxi hoá.
- Chất xúc tác (haemoglobin hoặc peroxidase)
H2O2 oxi hoá hoá chất không màu thành hoá chất có màu.
Sơ đồ phản ứng chung:
Chất nhận + H2O2 <=> Chất nhận bị oxi hoá + H2O
Trong kít xác định dấu vết máu, TMB (hoặc các chất khác) là chất nhận:
TMB không màu + H2O2 <=> TMB (màu xanh) + H2O
- Kết quả âm tính (không màu hoặc không thay đổi màu sắc) có nghĩa
là dấu vết cần giám định không phải là máu.
- Kết quả dương tính (hiện màu hoặc thay đổi màu sắc) có nghĩa là dấu
vết cần giám định có khả năng là máu.
Các kít định hướng tạo phản ứng màu hoặc phát ra ánh sáng.
Các kít dựa vào đặc tính catalase của máu (sự có mặt của haemoglobin.
Đặc điểm của các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu:
- Ứng dụng chất tạo màu (hoá chất thay đổi màu)
- Ứng dụng tác nhân oxi hoá (hydrogen peroxidase).
- Chất xúc tác của phản ứng là haemoglobin.
Sự thay đổi màu nhanh là kết quả dương tính. Điều này có nghĩa là dấu vết
được thử là máu.
Dương tính giả: Kết quả dương tính được xác định khi thử những chất
không phải là máu, do những chất này cũng có thể xúc tác như: tác nhân oxi
hoá hoá chất, nguyên liệu thực vật.
Âm tính giả: Phản ứng cho kết quả âm tính mặc dù chất đó là máu
hoặc có mặt thành phần máu là do:
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
13
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
- Dấu vết có thể quá lâu hoặc máu quá loãng nên không tạo phản ứng.
- Những chất làm ảnh hưởng đến quá trình phản ứng vào phản ứng
(hợp chất khử, axit).[10]
+ Xác định tính đặc hiệu loài
Sử dụng phương pháp khuếch tán miễn dịch kép trên thạch theo
Ouchterlony để xác định tính đặc hiệu loài của protein trong dấu vết.
Sử dụng kỹ thuật này để xác định protein đặc hiệu loài trong dấu vết máu:
Nguyên tắc của phản ứng là trong huyết thanh, trong các dịch cơ thể
đều có chứa các kháng nguyên đặc hiệu loài. Khi các kháng nguyên này kết
hợp với các kháng thể đặc hiệu sẽ tạo thành dạng kết tủa, nhìn thấy được.
Trong kỹ thuật này, sự khuếch tán của kháng nguyên và kháng thể gặp
nhau từ những giếng trên thạch. Nhìn chung, giếng trung tâm chứa phần
kháng nguyên, các huyết thanh thử nghiệm được đặt ở các giếng xung
quanh. Để một cặp kháng nguyên – kháng thể xuất hiện, vị trí của vạch kết
tủa trên thạch phụ thuộc duy nhất các hệ số khuếch tán điện kháng và không
phụ thuộc vào nồng độ. Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự kết tủa:
- Chất lượng của thạch.
- pH và nhiệt độ.
- Bản chất kháng nguyên.
- Sự xuất hiện kết tủa liên quan đến nồng độ kháng nguyên – kháng thể.
Phương pháp này được ứng dụng trong tự miễn để phân tích chất lượng của 1
hỗn hợp kháng thể đôi khi phức tạp. Sự xuất hiện nhiều vạch kết tủa chỉ ra sự
hiện diện một số cặp kháng nguyên – kháng thể giống nhau (1 vài cặp có thể
xếp chồng lên nhau). Hơn nữa, nó cho phép nhận dạng các kháng thể bằng
cách so sánh các phản ứng của chúng đối diện với các huyết thanh mẫu chứng
đặc hiệu đơn nghĩa là “huyết thanh mẫu chuẩn”. Như vậy, bằng sự so sánh
các vạch tạo bởi 2 hệ thống kháng nguyên – kháng thể, có thể suy luận quan
hệ của chúng.[1]
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
14
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
1.5. Tách chiết ADN từ dấu vết máu
Tách chiết ADN là công đoạn đầu tiên rất cần thiết và không thể thiếu
trong hoạt động của các nhà sinh học phân tử. Do các tế bào ở các mô khác
nhau có các đặc điểm cấu trúc khác nhau nên các nhà khoa học đã tìm ra rất
nhiều phương pháp tách chiết khác nhau để tách chiết ADN nhằm đạt hiệu
quả cao nhất [6].
Mỗi một loại dấu vết đòi hỏi có một quy trình tách chiết riêng biệt, phù
hợp với dấu vết đó thì tách chiết ADN mới đạt được hiệu quả cao. Tách chiết
ADN kém hiệu quả, một phần là do chất lượng dấu vết, do ảnh hưởng của vật
mang dấu vết và một phần cũng là do phương pháp tách chiết chưa phù hợp [9].
Hiện nay tại viện Khoa học hình sự, đối với dấu vết máu thì chủ yếu
vẫn đang sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% (Chelex® 100
Resin hãng Bio-rad-Mỹ)
Chelex là một loại nhựa tạo phức có ái lực cao đối với các ion kim loại
đa hóa trị. Nó là chất cấu tạo bởi styren và divinnylbenzen có chứa cặp ion
imiodiacetat hoạt động là nhóm tạo phức. Sự có mặt của Chelex trong khi
đun ở 100oC sẽ ngăn cản quá trình biến tính của ADN bởi các ion kim loại
tạo phức có thể xúc tác quá trình làm gãy ADN ở nhiệt độ cao trong những
dung dịch có cường độ ion thấp. Chelex còn liên kết cả với những chất bẩn
ngăn cản quá trình nhân bội ADN
Phương pháp tách chiết này đạt hiệu quả cao đối với các dấu vết máu
có hàm lượng ADN cao và tinh khiết tuy nhiên với những dấu vết máu đã bị
biến tính, số lượng ADN ít và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế thì phương pháp
này chưa đạt hiệu quả cao.
Đối với dấu vết máu có chất lượng kém, để thu được đầy đủ kiểu gen là
rất khó khi sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% do nồng độ ADN
thu được từ phương pháp tách chiết này không đủ để thực hiện phản ứng PCR
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
15
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
thành công và dẫn tới điện di cho hình ảnh kém như mất alen, nhiều alen lặp.
Hiện nay, Viện khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit tinh sạch Zymo
Research có tên DNA Clean & Concentrator TM-5 (hãng Epigenetics, Mỹ). Tuy
nhiên phương pháp này vẫn có những hạn chế nhất định đó là ADN có thể bị
mất do quá trình rửa và vẫn không loại bỏ hoàn toàn được một số chất ức chế
phản ứng PCR. Mong muốn chọn lựa phương pháp tách chiết phù hợp, hiệu
quả đặc biệt là đối với dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi đã bị gặt bằng
xà phòng.
Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kít PrepFiler là phương pháp
tách chiết sử dụng hạt từ tính rezin để hấp phụ ADN. Qua đó thu được tối đa
lượng ADN nguyên vẹn, tinh khiết có trong mẫu và có những ưu điểm vượt
trội sau và phù hợp với những mẫu đã bị biến tính, số lượng ADN ít và lẫn
nhiều tạp chất, chất ức chế:
a) Tách chiết hầu hết hoặc tất cả ADN có trong dấu vết;
b) Loại bỏ thành phần ức chế PCR mà không làm mất ADN;
c) Sử dụng toàn bộ sản phẩm ADN tách chiết được để PCR;
d) Có thể bơm trực tiếp hóa chất PCR vào ống đựng ADN sau tách
chiết nếu lượng ADN quá ít, hơn là phải chuyển ADN vào một ống riêng có
hóa chất PCR (để loại bỏ sự mất mát xảy ra khi chuyển ADN, ví dụ: ADN
dính trên thành ống, dính vào đầu côn).
1.6. Định lƣợng ADN
Định lượng ADN là một quy trình quan trọng trong giám định ADN hình
sự, bởi lượng ADN thu được từ các dấu vết là không giống nhau. Do đó bước
định lượng ADN giúp ta xác định chính xác hàm lượng ADN thu được từ dấu
vết và từ đó tính toán lượng ADN cần thiết đưa vào thực hiện phản ứng PCR.
Định lượng từng mẫu có thể đảm bảo hiệu quả tối đa phản ứng PCR và
ngăn chặn việc phân tích lặp lại, thất thoát nguồn mẫu chứa ADN.
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
16
Luận văn cao học
Đặng Thị Thu Giang
Việc xác định hàm lượng ADN tách chiết được từ mẫu là rất cần thiết
vì khi biết được chính xác hàm lượng và độ tinh sạch của ADN trong mẫu thì
sẽ tính được nồng độ tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR và khi
đó phản ứng PCR sẽ cho kết quả tốt nhất.
Sản phẩm sau tách chiết được tiến hành định lượng ADN sử dụng kit
Quantifiler® Human DNA Quantification dùng cho định lượng bằng phương
pháp Real time PCR trên máy định lượng 7500 Real time PCR System của
hãng ABI - Mỹ.
Phương pháp thực hiện kỹ thuật PCR nhờ có thiết bị Real time PCR
với hệ thống nhận biết sản phẩm sau mỗi chu kỳ PCR bằng cách kích hoạt
chất phát quang trong sản phẩm PCR. Độ phát quang đậm nhạt của sản phẩm
PCR sau mỗi chu kỳ sẽ được máy ghi lại và dùng trong log tự động so sánh
với thang ADN định lượng chuẩn đã được chạy và nhập sẵn vào máy trước
đó ở dạng đồ thị.
Như vậy, chỉ cần sau một số chu kỳ ban đầu khi đã có sản phẩm PCR,
chúng ta có thể xác định được chính xác hàm lượng sản phẩm PCR thu được
từ mẫu vật chứ không nhất thiết phải đợi phản ứng PCR kết thúc, đó cũng là
điểm ưu việt của thiết bị này. Song để thiết bị có thể nhận biết được sản phẩm
thu được trong quá trình PCR, đòi hỏi sản phẩm PCR thu được sau mỗi chu
kỳ phải được gắn chất nhận biết phát quang. Thường chất nhận biết đó được
gắn vào mồi (primer) đã được các hãng sản xuất kèm theo trong bộ kit. Do
đó, để định lượng chính xác hàm lượng ADN thu được sau khi tách chiết
bằng thiết bị Realtime PCR, chúng ta phải mua bộ kit có sẵn của hãng. Hiện
nay, tại Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit Quantifiler® Human
DNA Quantification (hãng ABI, Mỹ).
1.7. Khuếch đại ADN (PCR)
Một đoạn ADN bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần
mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn. Điều đó xảy ra trong phản ứng tổng
K17 - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật
17
