Bài giảng học phần công nghệ sinh học thực vật

7/11/2017

BÀI GIẢNG HỌC PHẦN CNSH THỰC VẬT
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
BIÊN SOẠN: TS. PHẠM THỊ MINH THU
THÁNG 1/2017

CHỦ ĐỀ 1:
VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG
CỦA CNSH THỰC VẬT

1


7/11/2017

CÔNG NGHỆ SINH HỌC (BIOTECHNOLOGY)

Karl Erky

1917
"Tất cả những công việc trong đó các sản phẩm
được sản xuất ra từ các nguyên liệu thô với sự
giúp đỡ của các vật chất sống“.

Định nghĩa chung
Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia
của các tác nhân sinh học (ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa trên các
thành tựu tổng hợp của nhiều bộ môn khoa học, phục vụ cho việc tăng của cải vật
chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người.

Nghị định số 18/CP của Chính phủ ngày 11/3/1994
“Công nghệ sinh học là một tập hợp các ngành khoa học (sinh học phân tử, di
truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học và công nghệ học) nhằm tạo ra các công
nghệ khai thác ở quy mô công nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào
thực vật và động vật.”

2


7/11/2017

PHÂN LOẠI THEO ĐỐI TƯỢNG PHỤC VỤ
- CNSH nông nghiệp.
- CNSH y tế.
- CNSH môi trường.
- CNSH năng lượng.
- CNSH vật liệu.
- CNSH chế biến thực phẩm.
- CNSH hóa học.

PHÂN LOẠI THEO TÁC NHÂN SINH HỌC
• Công nghệ sinh học động vật.
• Công nghệ sinh học thực vật.
• Công nghệ sinh học vi sinh vật.
• Công nghệ sinh học enzym.
• Công nghệ sinh học gen.
• Công nghệ sinh học protein.

3

7/11/2017

MỤC ĐÍCH
- Chọn, tạo giống
- Nhân giống
- Bảo quản, duy trì giống tốt

NỘI DUNG
- Nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Di truyền phân tử

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Ở VIỆT NAM
Vai trò của CNSHTV từ nay đến năm 2020
1. Vấn đề an toàn lương thực
• CNSH góp phần tăng năng suất cây trồng, đảm bảo chất lượng để tăng
an toàn lương thực cho con người.
• CNSH tạo các giống mới kháng virus, vi khuẩn, nấm gây bệnh.
2. Vấn đề phủ xanh đất trống, đồi trọc
• CNSH nhân nhanh giống cây rừng có giá trị cao.
• CN gen tạo các giống kháng sâu bệnh.

4


7/11/2017

CHỦ ĐỀ 2.
NCMTB THỰC VẬT – GIỚI THIỆU CHUNG

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT (NCMTBTV)
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant cell and tissue culture) là phạm trù khái niệm chung cho
tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm)
Nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm, gọi là nuôi cấy in vivo.

5


7/11/2017

NCMTBTV-ỨNG DỤNG

- Nhân nhanh vô tính các giống cây quý: lưu ý biến dị qua quá trình cấy chuyền.
- Cải thiện giống cây trồng bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristerm).
- Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy tế bào hạt phấn.
- Khắc phục lai xa bằng cách thụ phấn trong ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi.
- Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast).
- Tạo giống cây trồng mới bằng kĩ thuật chuyển gen.
Ngoài ra, mô và tế bào nuôi cấy in vitro còn là nguyên liệu sử dụng trong các nghiên
cứu khác như chuyển gen và biểu hiện gen tạm thời; kiểm tra các phản ứng sinh lý,
sinh hóa trên qui mô tế bào hay mô/cơ quan…

NCMTBTV-ỨNG DỤNG
TOMATO + POTATO = ?

6

7/11/2017

DUNG HỢP TB TRẦN

(Melchers et al., 1978)

GHÉP CÂY

(Thompson and Morgan, 2013)

NCMTBTV-CƠ SỞ KHOA HỌC
Thuyết tế bào (1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann )
+ Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào.
+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất
của sự sống.
+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó.

Tính toàn thế (totipotency)
Khả năng biệt hóa thành bất cứ loại
tế bào nào từ tế bào ban đầu.

7


7/11/2017

NCMTBTV-CƠ SỞ KHOA HỌC
Tính toàn thế (totipotency)
- Miller và Skoog (1953) tạo được rễ từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc lá.
- Reinert và Steward (1958) đã tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi

cấy trong dung dịch.
- Cocking (1960) tách được tế bào trần và Takebe (1971) tái sinh được cây hoàn chỉnh từ
nuôi cấy tế bào trần của lá cây thuốc lá.
- Tế bào soma, dưới các điều kiện thích hợp, có thể phân hóa để phát triển thành một cơ
thể thực vật hoàn chỉnh.
Phân hóa và phản phân hóa (Cell differentiation and dedifferentiation)

NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

khởi xướng
1898

nghiên cứu
phát sinh
nghiên cứu sinh lý hình thái
1930

1950

triển khai NCM vào CNSHTV

1960

Giai đoạn khởi xướng (1898-1930)
- Haberlandt (1898-1902): đề xướng ra tính toàn năng của tế bào.
- Kotte và Robbins (1924): thành công trong việc nuôi cấy đầu rễ trong 12 ngày.
- Schnucker (1929), Scheitterer (1931), Pfeiffer (1931-1933), Larue (1933): nuôi cấy
thành công đoạn rễ riêng rẽ trong môi trường nhân tạo.
Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950)
Xây dựng, vận dụng có kết quả môi trường nửa nhân tạo, đồng thởi phát hiện được vai

trò của một số vitamin đảm bảo sự thành công trong nuôi cấy đối với cơ quan (rễ) và
mô (thượng tầng) ở thực vật.
- 1934, White nuôi cấy được một dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh và liên tục.
- 1934, Gautherets đã thành công trong nuôi cấy mô thượng tầng trên môi trường
Knop bổ sung glucose và cysteinhypochloride.
- 1983, White nuôi cấu được mô thượng tầng của cây thuốc lá lai.

8


7/11/2017

NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 -1960)
Đại diện cho giai đoạn này là Miller, Skoog và Reinert.
- 1956, Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô
thuốc lá nuôi cấy
- 1955, Skoog phát hiện ra kinetin là một chất điều
khiển quá trình phân bào (thuộc nhóm Cytokinin) và
phân hóa chồi mầm.
- 1958- 1959, Steward và Reinert sử dụng nước dừa
vào nuôi cấy tế bào cà rốt và thu được phôi.
- 1960, Bergmann tạo được khối mô sẹo từ một tế bào
đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa
thạch như trải tế bào vi sinh vật.

Kinetin (N6-furfuryladenine)

NCMTBTV-LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào Công nghệ sinh học thực vật
- 1959 Melchers sử dụng mô đơn bội của Antrirrinum majus nghiên cứu tính biến
động mức bội thể trong nuôi cấy và gây đột biến.
- 1960 Cooking tách được tế bào trần (protoplast) và từ đó trở đi nuôi cấy tế bào
tách rời đã có những bước phát triển đáng khích lệ.
- 1964 Guha và Mahefwari tạo được vây cà độc dược có bộ NST đơn bội từ nuôi
cấy bao phấn.
- 1967 Nitsch, 1968 Nakata và Tanaka tạo được cây đơn bội từ bao phấn thuốc lá,
mở ra triển vọng ứng dụng đơn bội vào công tác giống và nghiên cứu di truyền.
- 1968 Niieki và nuôi cấy thành công bao phấn và tạo cây đơn bội ở lúa.
- 1971 Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast.
- 1977 Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây.
- 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.
- 1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản
xuất đại trà ở Nauy. Ở Mĩ, có hàng tram giống cây mang gen biến nạp đạ được sản
xuất hàng loạt và thị trường chấp nhận.

9


7/11/2017

NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN

NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN

PHÂN LOẠI THEO NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT
- Nuôi cấy phôi
- Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
- Nuôi cấy mô phân sinh

- Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, noãn
- Nuôi cấy tế bào đơn
- Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

PHÂN LOẠI THEO HÌNH THÁI PHÁT SINH
- Nuôi cấy mô sẹo
- Nuôi cấy tạo phôi
- Nuôi cấy phát sinh chồi

10


7/11/2017

NCMTBTV-CÁC KĨ THUẬT CƠ BẢN

Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
(A) Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp.
(C) Mô sẹo C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus.
(F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana.
(H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.

NCMTBTV-PHÒNG THÍ NGHIỆM

1. Phòng rửa và sản xuất nước cất
2. Phòng sấy hấp, kho thủy tinh sạch
3. Phòng chuẩn bị môi trƣờng
4. Phòng chuẩn bị mẫu
5. Phòng cấy vô trùng

6. Phòng ảnh
7. Phòng kính hiển vi
8. Phòng nuôi
9. Phòng nuôi
10. Phòng sinh hóa

11


7/11/2017

NCMTBTV-ĐẢM BẢO ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG
Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy mô thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Một
khi bị nhiễm các VSV này, chúng sẽ phát triển lấn át mẫu thực vật.
Các nguồn nhiễm tạp chính
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường.
Khử trùng (clip: khử trùng gì? Ntn?)
- Khử trùng phòng cấy và tủ cấy
- Khử trùng dụng cụ và hóa chất
- Khử trùng mẫu cấy thực vật
- Thao tác của người thực hiện

NCMTBTV-ĐẢM BẢO ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG
KHỬ TRÙNG PHÒNG CẤY VÀ TỦ CẤY
- Phòng hẹp, cửa 2 lớp.
- Sàn, tường lát gạch men.
- Lần đầu tiên sử dụng: formaldehyde 4%

(24h), trung hòa bằng NH3 25% (24h).
- Đèn tử ngoại trên trần.
- Lau chùi định kì với dung dịch chống
nấm hay các dung dịch khử trùng khác.
- Tủ cấy thổi gió: mở quạt, lau bề mặt
bằng cồn 700 trước khi làm việc 15ph.

Phòng nuôi
- Xà bông bột, cồn, javen.
- Tránh khuấy động các nguồn nhiễm.

12


7/11/2017

KHỬ TRÙNG DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
Hấp khử trùng
121C, 1atm, hơi nước
-

Sấy, đốt

Dụng cụ thủy tinh
Cao su, bông
Giấy
Môi trường khoáng

Lọc

- Dụng cụ kim loại

- Chất kháng sinh
- ĐHTTTV (một vài)
- …

Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng nồi
hấp (autoclave) ở 121C tại 103,4 kPa
Thể tích môi trƣờng (mL)

Thời gian hấp khử trùng
(phút)

<50

15

70

20

250-500

25

1000

30

13

7/11/2017

KHỬ TRÙNG MẪU CẤY THỰC VẬT
- Mô cấy càng non, càng được bao bọc bên trong thì càng sạch.
- Khử trùng bề mặt: tiêu diệt VSV, giữ khả năng sống của mẫu thực vật.
- Dung dịch khử trùng:
- Các chất hoạt động bề mặt: Tween 80, Fotoflo, Teepol
Một số tác nhân khử trùng thông dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tác nhân vô trùng

Nồng độ %

Thời gian xử lý

Hiệu quả

( phút)

Calci hypochloride

9 – 10

5 – 30

Rất tốt

Natri hypochloride

2

5 – 30

Rất tốt

10 – 12

5 – 15

Tốt

1–2

2 – 10

Rất tốt

0,1 – 1

2 – 10

Trung bình

4 – 50 mg/l

30 – 60

Khá tốt

Hydro peroxide
Nƣớc Brom
HgCl2
Chất kháng sinh

KHỬ TRÙNG MẪU CẤY THỰC VẬT
Rửa nước

Rửa xà phòng

Rứa nước, vòi nước chảy

Cồn 70
Pha sẵn
Dung dịch khử trùng

Nước (cất) vô trùng

Hấp sẵn

14


7/11/2017

THAO TÁC TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN:
- Trước khi làm thí nghiệm
- Trong khi làm thí nghiệm

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
- Các vitamin
- Các amino acid
- Nguồn carbon
- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây,
bột chuối khô...
- Chất kháng sinh
- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar).

15


7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng là > 0.5 mM, vi lượng là <
0.5 mM.
- Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mM nitrate và potassium.
- Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mM.
- Nói chung, nồng độ thường được sử dụng đối với Cu và Co là 0,1 μM, Fe và
Mo là 1 μM, I là 5 μM, Zn là 5-30 μM và Mn là 20-90 μM.

16

7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
- Vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ: Nitơ, lưu huỳnh, phốt-pho là
các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và
nhiều chất hữu cơ khác. Canxi và axít boric được tìm thấy chủ yếu ở thành
tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh
học.
- Thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các co-factor): Magie,
kẽm, sắt...
- Ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá
của thực vật. Ví dụ, K và Ca rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của
tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym.

17


7/11/2017

Cấu trúc của nucleic acid

Cấu trúc của Chlorophyll a

Ca2+

Cấu trúc của amino acid

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Nguồn carbon

18


7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Nguồn carbon
- Đường sucrose (saccharose) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường
xuyên. Nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục
đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và
tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước).
- Glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả

tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn
fructose cho hiệu quả kém hơn.
- Các carbohydrate khác, như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,
melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và
chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt.
- Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thể dùng.
- Glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng.

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Nguồn carbon

- Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên
trong tế bào, nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền
phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm
thấu, hoặc tương tự sucrose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress
nước.
- Các loại rƣợu như ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol
thì rất độc.
- Acid hữu cơ thường không phải là nguồn carbon thích hợp cho tế bào
nuôi cấy. Thí nghiệm với các acid: folic, succinic, pyruvic và keto-glutaric
chỉ đạt 15% sinh trưởng so với sucrose.

19


7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Các vitamin
-

Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1,
0,1-10 mg/l), acid nicotinic (PP, 0,1-5 mg/l), pyridoxine (B6, 0,1-10 mg/l)
và myo-inositol (50-5000 mg/l).

-

Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid,
vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử
dụng trong một số môi trường nuôi cấy.

-

Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở

các loài khác nhau là khác nhau hoặc thậm trí còn có hại (gây độc).

20


7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
- Không giống như các N vô cơ, các amino acid được các tế bào thực vật hấp
thụ nhanh hơn.
- Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế
bào và nuôi cấy tế bào trần.
- Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế
bào thực vật là hỗn hợp amino acid.
- Casein hydrolysate (0,05-0,1%), L-glutamine (8 mmol/L), L-asparagine
(100 mmol/L), L-glycine (2 mmol/L), L-arginine và L-cystein (10 mmol/L)
là nguồn N hữu cơ thích hợp được dùng trong các môi trường nuôi cấy.
Tyrosine (100 mmol/L) chỉ được dùng khi có bổ sung agar vào môi trường.
- Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể
cản trở sự tăng trưởng của tế bào.

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Than hoạt tính:
- Hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi
trường.
- Thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% (w/v).

Nƣớc dừa
- Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và
chất kích thích sinh trưởng.

- Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v).

Bột chuối
Hàm lượng sử dụng vào khoảng 40g bột khô/l.

21


7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)
Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng.
Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng.

Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH)
Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào
thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid.

Hỗn hợp amino acid nhân tạo

pH 5.0 – 6.0

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Chất làm rắn môi trường
- Agar: không phản ứng với các thành phần của môi trường; không bị thủy
phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ
nuôi cấy.
- Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế
sử dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC).
- Các hợp chất khác đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel,

alginate, phytagel và gel-rite.
- Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper
bridge), bấc giấy lọc (filter paper wick), bọt polyurethane (polyurethane
foam) và xốp polyester (polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá
thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào.

22


7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Thuốc kháng sinh
Streptomycin/ kanamycin ở nồng độ thấp ngăn chặn hiệu quả sự nhiễm hệ thống
VSV.
Vai trò của kháng sinh trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật:

- Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy tế bào
và mô thực vật.
- Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy.
- Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi
môi trường và mô nuôi cấy.
- Sử dụng kháng sinh trong môi trường chọn lọc để chọn các tế bào hoặc mô
đã được chuyển gen (mang gen chỉ thị kháng kháng sinh). Các tế bào không
được chuyển gen sẽ bị chết trong môi trường có kháng sinh ở nồng độ thích
hợp.

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Một số môi trường
thông dụng trong
NCMTB thực vật

MS Murashige and Skoog,
G5= Gamborg et al.,
W= White,
LM= Lloyd and McCown,
VW= Vacin and Went,
Km= Kudson modified,
M= Mitra et al.,
NN= Nitsch and Nitsch.

23


7/11/2017

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Giới thiệu tóm tắt về một số chất điều hoà sinh trưởng chính ở thực vật
Tên
Nhóm
Auxin

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Nhóm
1.
Cytokinin 2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Indole-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-butyric acid (IBA)
1-naphthaleneacetic acid (NAA)
2,4-dichlorophenoxy- acetic acid (2,4-D)

(2,4,5-T)
Picloram
Dicamba
p-chlorophenoxy- acetic acid (CPA)
Phenylacetic acid (PAA)
Kinetin
6-Bezylamino- purine (BAP)
Zeatin (Z)
Zeatinriboside (ZR)
Isopentenyladenosine (iPA)
Isopentenyladenine (iP)
Thidiazuron (TDZ)
N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea (CPPU)

Chức năng trong hệ thống
NCMTBTV
- Phân chia tế bào
- Tạo và nhân callus
- Tạo rễ bất định(ở nồng độ cao)
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)
- Tạo phôi soma (2,4-D)
- Ức chế chồi nách

- Phân chia tế bào
- Tạo và nhân callus
- Kích thích bật chồi nách.
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)
- Ức chế sự hình thành rễ
- Ức chế sự kéo dài chồi
- Ức chế quá trình già (hoá vàng) ở lá

NCMTBTV-MÔI TRƢỜNG

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng
phụ thuộc vào một số yếu tố
- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác
nhau về thành phần môi trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi

cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc
dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…)
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).

24


7/11/2017

CHỦ ĐỀ 3.
THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY PHÔI
IN VITRO

I. Nuôi cấy phôi hữu tính
- Các kiểu nuôi cấy phôi
- Kỹ thuật nuôi cấy
- Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi
II. Thụ phấn in vitro
- Tính bất hợp của giao tử trước và sau thụ tinh
- Khái niệm thụ phấn in vitro
- Phương pháp thụ phấn in vitro

- Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro
- Ứng dụng của thụ phấn in vitro
III. Công nghệ phôi vô tính (nuôi cấy phát sinh phôi soma)
- Khái niệm về phôi vô tính
- Sự phát sinh và phát triển của phôi soma
- Ảnh hưởng của tuổi sinh lí lên khả năng phát sinh phôi soma
- Đặc điểm của thực vật tái sinh từ con đường hình thành phôi vô tính

25