Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở
CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở
CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON)
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN - 2016


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn
khoa học của PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm.
Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực, chưa
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Thái Nguyên, ngày

tháng

Tác giả luận văn

Đỗ Huy Hoàng

i

năm 2016


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo để tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ.
Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng, phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào
đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm của luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè luôn
quan tâm, ủng hộ và tạo động lực cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Thái Nguyên, ngày … tháng …. năm 2016

Người thực hiện

Đỗ Huy Hoàng

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii
MỤC LỤC........................................................................................................iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................iv
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH..........................................................................................vi
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................3
1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn ....................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây dừa cạn ................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn ................................................. 4
1.1.3. Thành phần hóa học và một số công dụng của cây dừa cạn .............. 5
1.1.4. Alkaloid chính trong cây dừa cạn ..................................................... 6
1.2. Công nghệ chuyển gen thực vật và ứng dụng.......................................... 6
1.2.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .......................................... 6
1.2.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở
cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen ............................................. 10
1.3 Một số thành tựu trong nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen gus 12
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................19
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 19
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................. 19
2.1.2. Chủng vi khuẩn .............................................................................. 19

2.1.3. Hóa chất và thiết bị ........................................................................ 19
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 20
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro......................................................... 20

iii


2.3.2. Phương pháp chuyển gen ............................................................... 20
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................25
3.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ A. tumefaciens, nồng
độ acetosyringone, thời gian nhiễm khuẩn, nồng độ kanamycin đến hiệu quả
chuyển gen ở cây dừa cạn ............................................................................. 25
3.1.1. Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở
cây dừa cạn .............................................................................................. 25
3.1.2. Xác định nồng độ acetosyringone (AS) phù hợp cho chuyển gen ở
cây dừa cạn .............................................................................................. 27
3.1.3. Xác định thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens phù hợp cho chuyển
gen ở cây dừa cạn ..................................................................................... 29
3.1.4. Xác định nồng độ kanamycin (Km) thích hợp để chọn lọc cây chuyển
gen ........................................................................................................... 31
3.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn và ra cây............................... 36
3.3. Đề xuất quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn ..................................... 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................43

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên đầy đủ

AS

Acetosyringone

BAP

6 - Benzyl amoni purin

Cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

gus

β - Glucuronidase gene

IBA

Indol - 3 - butyric acid

Km

Kanamycin

LB

Môi trường nuôi cấy Luria - Bertani

MS

Môi trường cơ bản Murashige and Skoog

nptII

Neomycin phototranspherase II gene

OD

Optical density (Mật độ quang học)

PCR

Polumerase chain reaction (Phản ứng dây chuyền polimerase)

T - DNA

Transfer – DNA

X - gluc

5-bromo-4 chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. tumefaciens đến tỉ lệ biểu
hiện gen gus tạm thời .................................................................... 25
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ biểu hiện gen
gus tạm thời .................................................................................. 27
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ biểu hiện gen
gus tạm thời .................................................................................. 30
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu không
chuyển gen.................................................................................... 32
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu chuyển gen ...... 34
Bảng 3.6: Kết quả biến nạp gen gus vào dừa cạn ............................................ 37

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Ba giống Catharanthus roseus .........................................................4
Hình 1.2: Sơ đồ Ti plasmid ..............................................................................9
Hình 1.3: Quá trình chuyển T-DNA từ A.tumefaciens sang tế bào thực vật..... 10
Hình 2.1: Sơ đồ vector pCB-gusplus............................................................... 19
Hình 3.1: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn A.
tumefaciens đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ............................... 26
Hình 3.2: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ
biểu hiện gen gus tạm thời ................................................................ 28
Hình 3.3: Kết quả biểu hiện gen gus tạm thời ................................................. 29
Hình 3.4: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ
biểu hiện gen gus tạm thời ................................................................ 31

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến hiệu quả chọn lọc mẫu
không chuyển gen ............................................................................. 33
Hình 3.6: Đồ thị phản ánh ảnh hưởng của kanamycin đến tỉ lệ sống sót
của mẫu chuyển gen.......................................................................... 35
Hình 3.7: Mẫu chuyển gen trên môi trường chọn lọc bổ sung nồng độ
kanamycin 50 mg/l............................................................................ 36
Hình 3.8: Kết quả biểu hiện bền vững gen gus................................................ 38
Hình 3.9: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens................................................................................... 39
Hình 3.10: Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dừa cạn .................................... 41

vi


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bệnh ung thư là một căn bệnh nguy hiểm, số người mắc căn bệnh này
ngày một gia tăng và độ tuổi mắc phải ngày càng trẻ hóa, tạo gánh nặng lớn
cho gia đình và xã hội. Trong khi đó, các loại thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều
và giá thành của chúng khá đắt. Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp làm tăng
hàm lượng alkaloid ở cây thảo dược để hạ giá thành thuốc chữa bệnh được
nhiều nhà khoa học trên thế giới và trong nước quan tâm.
Cây dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol
alkaloid như vinblastine, vincristine có dược tính quan trọng trong chế tạo các
loại thuốc chống ung thư, đặc biệt được sử dụng trong chống ung thư máu.
Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật (khoảng 1
phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với vinblastine còn đối với vincristine thì ít
hơn 10 lần nữa) và không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do có cấu trúc
rất phức tạp. Trong cây dừa cạn, con đường dẫn tới sự tổng hợp vinblastine và
vincristine qua một số sản phẩm trung gian, dưới sự xúc tác của một số enzym.

Trong đó, deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme chìa
khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng của quá trình tổng hợp vindoline [26]. Do
vậy, nghiên cứu biện pháp

nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và

vincristine ở cây dừa cạn bằng công nghệ gen để phục vụ cho việc tạo thuốc
chữa bệnh ung thư là rất cần thiết.
Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần tạo thành công cây dừa cạn
chuyển gen với mục đích nâng cao năng suất tổng hợp hai loại ankaloid nói
trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình
chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn để phục vụ chuyển
gen mục tiêu.

1


3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu xác định loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ tế bào vi
khuẩn A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩn A.
tumefaciens và nồng độ kanamycin phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn;
- Nghiên cứu chuyển gen gus vào cây dừa cạn và tạo cây dừa cạn chuyển gen;
- Đề xuất quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn.

2


Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây dừa cạn
Giống Catharanthus có nguồn gốc ở đảo Madagasca thuộc châu Phi với
8 loài (trừ loài C. pusillus (Murr) G. Don tìm thấy ở Ấn Độ). Vào giữa thế kỉ
18, dừa cạn được trồng nhiều ở Paris, sau đó được di nhập sang nhiều nước
nhiệt đới Nam Á cũng như Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam và đảo Hải
Nam - Trung Quốc. Được biết đến phổ biến nhất là loài Madagasca Periwinkle
hay còn gọi là vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó.
Ở Việt Nam, dừa cạn xuất hiện ở nhiều địa phương (nhất là ở các tỉnh
đồng bằng và ven biển) do tính chất dễ trồng và phát triển nhanh của cây này.
Dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến
Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung
như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình
Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi
mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi
thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển.
Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [17].
Cây dừa cạn có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L.) G. Don, tên
đồng nghĩa là Vinca rosea L. Hay còn được gọi là hải đằng, dương giác, bông
dừa, tứ thời hoa, cây sừng dê, cây nhật tân, trường xuân hoa, thuộc Họ:
Apocynaceae, Chi: Catharanthus, Loài: Catharanthus roseus.
Catharanthus roseus (L.) G. Don là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng
loại alkaloid terpenoid indole được biết đến với 3 giống cây khác nhau:
‘roseus’ với hoa màu hồng tím; ‘ocellatus’ với hoa màu trắng, nhụy đỏ; ‘albus’
với hoa màu trắng. Trong đó giống hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine
và vinblastine cao nhất [16], [30].

3

C. roseus var. roseus

C. roseus var. ocellatus

C. roseus var. albus

Hình 1.1: Ba giống Catharanthus roseus [30]
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn
Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60cm, phân nhiều
cành, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Thân hình trụ có 4 khía dọc, có
lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím. Cây có
bộ rễ phát triển và mọc thành bụi dày.
Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4 7cm, rộng 2 - 3cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông. Cuống lá ngắn, dài 3 5cm. Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới,
cong hướng lên trên.
Hoa trắng hoặc đỏ tím, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn.
Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5. Cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở
dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 4mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần
họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hây hồng tím, trắng, ... ở mặt
trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm; miệng ống tràng có nhiều lông và có
màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu
hoa màu hồng tím). Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị rời đính ở
phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi
tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt
phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn rời ở bầu nhưng dính ở vòi và

4


đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn

mép, bầu trên. Vòi nhụy dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy
hình trụ, màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng. 2
đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn [17].
Quả gồm 2 đại, dài 2 - 4cm, rộng 2 - 3cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang
hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ
màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc.
Mùa hoa quả gần như quanh năm [17].
1.1.3. Thành phần hóa học và một số công dụng của cây dừa cạn
Dừa cạn trồng ở Việt Nam chứa khoảng 0,1 - 0,2% alkaloid toàn phần.
Trong đó, loại hoa màu hồng tím có tỷ lệ hoạt chất cao nhất. Có nhiều loại
alkaloid được tìm thấy trong dừa cạn, chủ yếu là vinblastine, vincristine,
tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicin…
Trong đó, ajmalicin có hiệu quả tốt trong điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn
vinblastine và vincristine có liên kết đặc hiệu với tubulin, protein ống vi thể ở
thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế
bào ở pha giữa. Vì thế, chúng được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc
điều trị ung thư [17].
Chiết xuất alkaloid trong dừa cạn được dùng dưới dạng muối sulfat để
chữa bệnh ung thư. Vinblastine sulfat được coi là lựa chọn hàng đầu để điều trị
ung thư biểu mô tinh hoàn, ngoài ra nó rất hiệu quả trong liệu pháp trị bệnh
Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận.
Vinblastine sulfat cũng dùng để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú,
ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da. Vincristine sulfat là một trong
những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các
bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu
lympho cấp. Đây là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết
không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt

5

cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân. Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp,
vincristine sulfat còn được dùng cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u
nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính. Nhân dân ta đã có
bài thuốc chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và lá
cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân lá khô/ngày) [27].
Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng
thân và lá phơi khô, sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm
thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, chữa bệnh ngoài da [17].
1.1.4. Alkaloid chính trong cây dừa cạn
Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base.
Alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất
là đối với hệ thần kinh. Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết
người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [19].
Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 - 1,15%, ở thân
0,40%, rễ chính 0,7 - 2,4%, rễ phụ 0,9 - 3,7%, hoa 0,14 - 0,84%, vỏ quả 1,14%,
hạt 0,18%. Có khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ Catharanthus roseus.
Trong số đó đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric, là những nhóm có hoạt
tính chống ung thư bao gồm vinblastine và vincristine. Vinblastine có ở lá với
hàm lượng 0,013 - 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015%, ở rễ 0,23% (cây bị
bệnh asteryllow-virus thì không có vinblastine). Vincristine với hàm lượng thấp
hơn 0,0003 - 0,0015% [23].
1.2. Công nghệ chuyển gen thực vật và ứng dụng
1.2.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết
kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các
gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện

6


các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Gen chuyển phải được di truyền cho
thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản phẩm biểu hiện của gen phải thể hiện được chức
năng sinh học [11].
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng định
tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hóa cho các tính
trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông qua
chuyển gen các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học có thể nghiên cứu các
quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại
cảnh lên hoạt động của gen.
Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật nhưng có thể phân loại
thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và
phương pháp chuyển gen gián tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp thường được sử dụng là chuyển gen
bằng súng bắn gen (gene gun). Với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn một lần
được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm gần đây
phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng thành công trên
lúa, mía, đu đủ, bông. Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi phí thiết bị đắt tiền
và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển vào tế bào cùng lúc gây
khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen
không bền vững.
Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ biến là chuyển gen
nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được
nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát hiện ra Agrobacterium
tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu
năm 1980 đã biến loài này trở thành một công cụ quan trọng nhất trong chuyển
gen thực vật với những ưu điểm nổi trội: (i) Gen chuyển ít bị đào thải; (ii) Số
lượng bản sao ít, do đó tránh được hiện tượng ức chế và câm lặng lẫn nhau; (iii)

7


Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do phụ thuộc vào hệ thống protein Vir;
(iv) Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản,
dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Mặc dù vậy, phương pháp này
mới chỉ được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả với
cây một lá mầm còn thấp (do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu
hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol
như cây hai lá mầm). Khi nhược điểm này được khắc phục thì phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sẽ ngày càng được quan tâm và dẫn
trở thành một phương pháp chuyển gen được các nhà nghiên cứu ưu tiên lựa
chọn vì lúa, ngô, lúa mì, … là những cây lương thực thiết yếu [28].
* Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng khối u ở thực vật
Agobacterium là vi khuẩn gram âm, gây ra các triệu chứng bệnh ở cây
khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium thì A. tumefaciens
được sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen. Vi khuẩn A. tumefaciens không tự
sản xuất được một số amino acid như octopin, nopaline. Để tồn tại nó chuyển
gen của nó vào thực vật, thực vật sản xuất các chất cần thiết, vi khuẩn phân hủy
các chất này để lấy năng lượng. Trong quá trình cộng sinh này, vi khuẩn cũng
chuyển các gen kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia
vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật. Ti plasmid - một loại plasmid đặc
hiệu được vi khuẩn chuyển nạp vào tế bào thực vật - là tác nhân gây nên tình
trạng khối u [29].
Ti plasmid là một phân tử DNA kép, gồm 150.000 – 200.000 cặp
nucleotit. Tuy nhiên chỉ có một đoạn gồm 20.000 – 30.000 cặp nucleotit có khả
năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ, đó là đoạn T-DNA. T-DNA có
chứa các đoạn gen gây ra sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào thực vật,
đó là các gen mã hóa auxin và cytokynin. Trên Ti plasmid còn có vùng vir chứa

các gen chịu trách nhiệm lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hóa opine [31].

8


Hình 1.2: Sơ đồ Ti plasmid [31]
* Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn
Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất có bản chất phenol là
acetosyringone và hydroxyacetosyringone. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập
trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng vir là A, B,
C, D, E, F, G và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này này có hai chức
năng chính: (i) Cắt đứt đoạn bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA; (ii)
Bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật để tiếp cận với
genome cây chủ. Vết thương của cây được nhận diện thông qua tín hiệu hóa
học acetosyringone. Tín hiệu này được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A
sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi
chất của vết thương trên thực vật. Protein vir A tự phosphoryl hóa đồng thời
làm cho protein vir G được phosphoryl hóa và kích hoạt sao mã các gen vir B,
C, E, F, G, H [20]. Tiếp đó, các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện
chức năng giải phóng sợi T-DNA. Protein D2 cắt T-DNA ở vị trí 5’ của bờ phải
và 3’ của bờ trái, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme
nuclease trong cây. Protein C1, C2 đồng thực hiện chức năng tăng cường giải
phóng T-DNA. Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm.
Protein vir B có chức năng tạo kênh xuyên màng tế bào giúp sợi đơn T-DNA
vào nhân tế bào. Đồng thời protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp
năng lượng cho vận chuyển T-DNA [18], [20].

9

Hình 1.3: Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật
1.2.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở
cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen
Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình thành do sự xâm nhiễm của vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật tổn thương từ lâu đã được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng
của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi
thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật. Nguyên nhân của sự phát triển rễ tơ
đã được xác định liên quan đến vùng TL-DNA nằm trên plasmid Ri của các
chủng Agrobacterium rhizogenes, trong đó giữ vai trò quan trọng là 4 locus gen
rolA, rolB, rolC và rolD. Các nghiên cứu về hàm lượng alkaloid, vincristine và
vinblastine ở cây dừa cạn cho thấy, các chất này có hàm lượng cao ở rễ. Vì vậy,
nghiên cứu sự phát triển rễ tơ ở cây dừa cạn đã được một số nghiên cứu đề cập.
Javier và cs (1998), thu được các dòng rễ Catharanthus roseus chuyển gen phát
triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường muối B5
1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng indole alkaloid
trong rễ nuôi cấy đã được xác định. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng rễ dừa

10


cạn chuyển gen được phân tích đều có mặt của vindoline và catharanthine, hai
tiền chất tổng hợp vinblastine và vincristine. Trong điều kiện nuôi cấy của thí
nghiệm, rễ với hình thái mỏng cho lượng sản phẩm gen rolC cao nhất. Như
vậy, các rễ nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng thấp thì có khả năng sản xuất
alkaloid cao. Ngược lại, những rễ mập là những rễ có khả năng tăng trưởng
nhanh hơn thì lại cho hàm lượng alkaloid thấp hơn [21]. Cũng bằng nghiên cứu
chuyển các gen mã hóa các enzyme chìa khóa của con đường tổng hợp TIAs
vào rễ tơ C.roseus qua Agrobacterium rhizogenes, sau đó tiến hành phân tích
các dòng rễ chuyển gen bằng RT-PCR và HPLC, Goklany và cs (2009), đã

nhận thấy có sự tăng hàm lượng các chất tương ứng trong con đường tổng hợp
TIAs [24].
Tuy nhiên, hạn chế của các nghiên cứu này là mới chỉ dừng lại ở việc tạo
được các dòng rễ chuyển gen và phát hiện ra mối quan hệ giữa hình thái rễ với
khả năng tổng hợp alkaloid nói chung và các tiền chất của vincristine,
vinblastine. Wang và cs (2012) đã phát triển phương pháp chuyển gen ở cây
dừa cạn bằng cách sử dụng Agrobacterium tumefaciens chủng EHA được biến
nạp vector nhị thể pCAMBIA2301chứa gen β-glucuronidase (gus) và gen
neomycin phosphotransferase II (nptII). Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens
chủng EHA tái tổ hợp nói trên vào mô sẹo, chồi và rễ, sau đó chuyển các mẫu
lên môi trường nuôi cấy bổ sung kanamycin, các tác giả đã thu được các dòng
cây tái sinh. Biểu hiện của gen gus được xác định thông qua biểu hiện kiểu hình
của mô nuôi cấy trên môi trường bổ sung X-gal. Sự có mặt của gen gus được
xác định bằng phản ứng dây chuyền polymerase và phân tích southern blot. Để
chứng minh hiệu quả của kĩ thuật chuyển gen thông qua gen chỉ thị gus vào
Catharanthus

roseus,

gen

DAT

mã

hóa

deacetylvindoline-4-O-

acetyltransferase đã được chuyển vào cây dừa cạn và thu được 16 cây T0

chuyển gen thành công, hiệu suất chuyển gen là 11%. Kết quả phân tích bằng

11


HPLC cho thấy, có sự tăng hàm lượng của vindoline trong cây chuyển gen.
Đây là báo cáo đầu tiên tính đến thời điểm công bố chuyển gen qua A.
tumefaciens ở cây dừa cạn. Quan trọng hơn, việc chuyển thành công gen DAT
vào cây dừa cạn sử đã khẳng định kĩ thuật chuyển gen cây dừa cạn được phát
triển hoàn thiện, nâng cao tích lũy vindoline trong cây chuyển gen [26].
Các nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn hiện nay trên thế giới mới chỉ
công bố thành công ở mức độ mô nuôi cấy và cây trong phòng thí nghiệm.
Song các kết quả nghiên cứu này đã khẳng định tính khả thi của hướng nghiên
cứu tạo cây dừa cạn chuyển gen nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine phục vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư hiệu quả.
1.3 Một số thành tựu trong nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen gus
Gen β-glucuronidase (gus) được phân lập từ chủng E. Coli RA201. Gen
gus là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase, đây là một
hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có
màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronidase thường dùng nhất trong
phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của
enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam. Nhờ khả năng này mà
các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển gen để làm chỉ thị
dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển [22].
Có nhiều vector chuyển gen vào thực vật được thiết kế có mang gen gus
như pB1121, pCAM301,… nhưng nhược điểm của các vector này là không
được thiết kế đoạn intron ở đầu 5’ trước gen gus. Vì vậy khi nhuộm X-gluc gen
gus biểu hiện trong cả tế bào vi khuẩn và trong cả tế bào thực vật, điều này gây
khó khăn cho việc nhận biết chính xác sự có mặt của gen gus trong mô tế bào
thực vật. Để khắc phục nhược điểm này, vector pPTN289 đã được thiết kế

thêm đoạn intron ở đầu 5’ trước gen gus. Vì thế, khi phân tích gen gus, màu

12


xanh chàm chỉ biểu hiện trong mô tế bào thực vật mà không biểu hiện trong vi
khuẩn khi có mặt của cơ chất X-gluc [25].
Trong vài năm trở lại đây các nhà nghiên cứu nước nhà đã thực hiện xây
dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở nhiều loại cây thiết yếu trong lĩnh
vực lương thực - thực phẩm và lâm nghiệp.
Cây lúa là cây lương thực chính của Việt Nam nên rất được quan tâm
nghiên cứu. Năm 2008, Đoàn Thu Thủy và cs đã nghiên cứu và đánh giá sự
hoạt động của các promoter để chọn ra một promoter thích hợp cho quá trình
chuyển một gen nhất định vào trong cây lúa góp phần làm tăng giá trị của cây
lúa chuyển gen. Hoạt động của 4 promoter (Rd29A, Gt1, RCg2 và CaMV35S)
trong việc điều khiển quá trình tổng hợp của các gen chuyển trong cây lúa đã
được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện của gen gus. Kết quả cho thấy, các
promoter khác nhau không có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành callus và
khả năng tái sinh cây. Sự biểu hiện tạm thời của gen gus ở phôi non của lúa sau
khi bắn gen cũng không phụ thuộc vào promoter được chuyển. Màu xanh đặc
trưng của gus được thể hiện trên phôi non mới được chuyển gen ở tất cả các
công thức điều này chứng tỏ các promotor khác nhau không ảnh hưởng đến sự
biểu hiện tạm thời của gen gus. Trong khi đó, sự biểu hiện bền vững của gus
chỉ quan sát được ở cây lúa chuyển gen với sự điều khiển của promoter RCg2.
Trong số các cây lúa chuyển gen thu được ở thế hệ T0, 11 cây có biểu hiện sự
hoạt động của gen gus với sự điều khiển của promoter RCg2 [14]. Cùng năm
đó, Lê Trần Bình (2008), đã hoàn thiện quy trình chuyển gen vào dòng lúa
indica. Kết quả nghiên cứu của tác giả cho thấy mật độ vi khuẩn thích hợp là
OD = 1,6 - 1,9, và nồng độ AS tối ưu là 200µM. Sử dụng thể nhận gen là phôi
non và mô sẹo 3 tuần tuổi đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens chủng

LBA4404 mang plasmid pTOK233 trong 3 ngày và cấy chuyển sang môi
trường tái sinh chọn lọc MSRe có carbenicillin 250 mg/l và cefotaxim 100

13


mg/l. Các mô sẹo phát triển sau 3 tuần lần lượt được chuyển sang môi trường
chọn lọc MSSe có bổ sung hygromycin 30 mg/l trong 3 tuần và hygromycin 50
mg/l. Các dòng kháng hygromycin được chuyển sang môi trường tăng sinh
N6P trong 2 tuần trước khi chuyển sang môi trường tái sinh. Hiệu suất chuyển
gen nhìn chung còn thấp, đạt 6 - 12,5% [1]. Mới đây, Hoàng Thị Giang và cs
(2015), đã cải tiến thành công quy trình chuyển gen vào giống lúa Taichung 65
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển gen cao,
thao tác đơn giản, giảm thiểu khối lượng công việc phải làm. Trong quy trình
đưa ra, tác giả đã tối ưu hóa các bước tiến hành, chuẩn hóa thành phần môi
trường nuôi cấy và đưa ra một số nhân tố quan trọng trong thao tác. Kết quả thí
nghiệm cho thấy sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm và phơi mẫu không chỉ làm
tăng tỷ lệ tạo mô sẹo từ phôi mà còn tăng kích thước và chất lượng mô sẹo
dùng cho quá trình chuyển gen. Dịch khuẩn với mật độ OD600nm = 0,1 là tối ưu
với tần số biểu hiện gen gus ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp. Ở
giai đoạn chọn lọc sau lây nhiễm, mô sẹo phát triển tốt hơn khi tiến hành phơi
mẫu và sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm. Phân tích sự có mặt của promoter
R4 cho thấy tỷ lệ cây tái sinh mang cấu trúc gen biến nạp cao (90,24%). Đánh
giá sự biểu hiện của gen gus ở cây lúa chuyển gen đã chứng tỏ sự hoạt động
mạnh của promoter R4, điều khiển quá trình phiên mã, dẫn tới tổng hợp enzym
gus. Kết quả phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền
ổn định của gen biến nạp sang thế hệ sau [3].
Sau lúa và ngô, đậu tương là cây trồng truyền thống cũng rất được coi
trọng. Năm 2007, Đinh Thị Phòng và cs, đã tiến hành chuyển gen gus vào đỉnh
phôi hạt chín giống đậu tương DT12 thông qua Agrobacteria tumefaciens.

Nghiên cứu này cho thấy thời gian nhiễm khuẩn cho hiệu quả biến nạp gen gus
tốt nhất là 2h, biểu hiện qua tỷ lệ mẫu sống sót là 67,5 %, tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi
là 47% và hiệu quả biểu hiện gen gus ở cây tái sinh in vitro đạt 12,8% [10].

14


Quy trình chuyển gen ở các cây lương thực - thực phẩm khác như khoai
lang, sắn, cà chua, dưa dấu cũng đã được xây dựng. Năm 2013, Vũ Thị Lan và
cs, đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen gus vào khoai
lang thông qua Agrobacterium tumefaciens. Trong nghiên cứu này, các yếu tố
ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang thông qua Agrobacterium
sử dụng gus làm gen chỉ thị đã được tối ưu. Các yếu tố chuyển gen được tối ưu
bao gồm mật độ vi khuẩn, nồng độ acetosyringone, vật liệu thực vật dùng làm
thể nhận gen, thời gian nhiễm khuẩn, ngưỡng nồng độ chất chọn lọc
kanamycin. Kết quả ở điều kiện tối ưu: mảnh cấy từ đỉnh ngọn được nhiễm với
Agrobacterium tumefaciens C58 ở nồng độ OD600nm = 0,8, bổ sung
acetosyringone 150µM trong 20 - 30 phút, thu được tỉ lệ biểu hiện tạm thời gen
gus cao nhất (38%). Mô sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường CP3 bổ
sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l trong 3 - 4 tuần. Chồi tái sinh từ
các mô sẹo sống sót được chọn lọc tiếp trên môi trường ra rễ MS bổ sung
kanamycin 100 mg/l. Kết quả ban đầu về chuyển gen gus vào giống khoai lang
KB1 là hầu hết các dòng mô sẹo sống sót đều biểu hiện hoạt động gen gus (có
màu xanh chàm rất đậm ) và thu được 8/21 dòng cây khoai lang chuyển gen
gus ra rễ trên môi trường chọn lọc bổ sung kanamycin 50 mg/l [6]. Năm 2007,
Đỗ Xuân Đồng và cs, đã nghiên cứu quy trình tái sinh và hệ thống chuyển gen
cà chua của Việt Nam. Theo nghiên cứu của tác giả: các mẫu lá mầm nảy mầm
sau 7 ngày được cắt hai đầu và nhiễm dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens (OD600nm = 0,3) trong thời gian 30 phút, sau đó chuyển sang môi
trường đồng nuôi cấy 48h trong tối. Tỉ lệ tái sinh cây trên môi trường chọn lọc

có bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/l cho thấy cây sống sót có bộ rễ sinh
trưởng và phát triển bình thường sau chọn lọc là 13,6% so với mẫu ban đầu [2].
Năm 2012, Nguyễn Thị Thanh Nga và cs, đã nghiên cứu quy trình chuyển gen
vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb). Tác giả sử dụng chủng vi khuẩn
CV58 mang vector nhị phân pCB-gusplus chứa gen chọn lọc kháng kanamycin

15


nptII và gen chỉ thị gus-intron được dùng để chuẩn hóa. Vật liệu chuyển gen
là các mảnh lá mầm 5 đến 7 ngày tuổi được nhiễm với vi khuẩn ở nồng độ
OD600nm = 0,7 trong 30 phút. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy các mảnh lá mầm
được tái sinh trên môi trường chọn lọc MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l, IBA
0,5 mg/l, kanamycin 200 mg/l và cefotaxim 500 mg/l. Các chồi chuyển gen
ra rễ trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,2 mg/l, kanamycin 100 mg/l,
cefotaxim 250 mg/l. Có sự khác nhau đáng kể về sự khác nhau đáng kể về
hiệu quả chuyển gen giữa các dòng dưa hấu khác nhau. Dòng L2 (F1
TG939) cho hiệu quả chuyển gen là 1,87%, tiếp đến là dòng D2 (F9 Tiểu
Long - Thăng Long) 1,85%, các dòng dưa hấu L1 (F1 kingkong) và D1 (có
nguồn gốc Bình Thuận) cho hiệu quả là 0%. Kết quả phân tích cây chuyển
gen thông qua biểu hiện gen gus đã khẳng định sự có mặt ổn định của gen
được chuyển trong cây chuyển gen [9].
Các cây lâm nghiệp cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm. Năm 2012,
Vương Đình Tuấn và cs, đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến chuyển
gen gus vào phôi trưởng thành 6 gia đình Thông nhựa bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Kết quả nghiên cứu bước đầu khẳng định việc
chuyển gen gus vào phôi trưởng thành và cung cấp một số thông số phục vụ
chuyển gen vào Thông nhựa bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Một số
yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen gus vào phôi trưởng thành Thông nhựa bằng
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy

kanamycin 35mg/l có thể được sử dụng để chọn lọc chuyển gen bền vững,
trong khi Timentin 400 - 500mg/l có thể loại vi khuẩn dư sau đồng nuôi cấy có
hiệu quả tốt. Nồng độ của vi khuẩn ở OD600nm từ 0,4 - 0,6 tỏ ra có hiệu quả tốt
hơn các nồng độ 0,3 và 0,8 trong chuyển gen gus vào phôi thông với thời gian
đồng nuôi cấy trong khoảng 36 giờ. Thân mầm 4 ngày tuổi cũng có thể được
dùng làm vật liệu biến nạp gen gus. Tuy nhiên tỷ lệ sống rất thấp sau biến nạp
[15]. Năm 2011, Võ Thị Huệ và cs, đã thiết lập quy trình tái sinh in vitro và

16