Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa alcaloid

BỘYTẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU H ưjN G
«

NGHIÊN CỨU THÀNH LẬP TIÊU CHUẨN KIỂM n gh iệm m ột
m

m

m

SỐ Dược LIỆU CHỨA ALCALOID
ể

m

( KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP DUỌC s ĩ KHOÁ 2001-2006)

Người hưóng dẫn:

TS. Nguyễn Viết Thân
TS. Bành Như Cưcttig
Nơi thực hiện:
Bộ môn ĨXrợc liệu
Trữòng Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: Tháng 2-5/20Ò6

HÀ NỘI, THÁNG 5/2006

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc thầy:

TS. Nguyễn Viết Thán
TS, Bành N hư Cương
đ ã tận tình hướng dẫn, giúp đ ỡ tôi trong thời gian học ĩập và thực hiện
khoá luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các ĩhẩy cô ẹiáo, các cátì bộ
nhân viên các p h ò n g ban, đặc hiệt tà hộ m ôn D ược liệu đ ã giúp đ ỡ tạo
điều kiện v ề thời gian, trang thiết hị trong quá trình tôi thực hiện khoá
luận.
N h â n d ịp này em xin cảm ơn gia đinh, bạn bè, những người đ ã
tạo điều kiện, động viên tôi rất nhiều trong su ố t thời gian qua.

Hà Nội, tháng 5/2006
Nguyễn Thị Thu Hương


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Mục lục
Chú giải chữ viết tắt
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

PHẦN I.TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về alcaloid...............................................................3
1.2. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu.......................................... 5

PHẦN 2. THựC NGHIỆM VÀ KẾT

q u ả n g h iê n

CÚU

2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu.............................................................. 5
2.1.2. Phưcfng pháp nghiên cứu...............................................6
2.2

Kết quả thực nghiệm
2.2.1. Bách bộ...........................................................................9
2.2.2. Dừa cạn....................................................................... 15
2.2.3. Đ ạ i............................................................................ 23
2.2.4. Lạc tiê n ..................................................................... 32
2.2.5. Mã tiề n ...................................................................... 39
2.2.6. Hoàng n à n ................................................................. 48
2.2.7. Ô đầu ....................................................................... 54

PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.........................................................62
Tài liệu tham khảo
Phu luc


CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT

HPTLC

: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

uv 254nm : Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm
uv 366nm : Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm


ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngay từ thưở sơ khai, nhân dân ta đã biết lựa chọn, tìm hiểu các loại
cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh. Trải qua bao thế hệ, với những
kinh nghiệm truyền từ đời này sang đời khác, kho tàng dược liệu Việt Nam
không ngừng được bổ sung, hoàn thiện đã trở nên vô cùng đa dạng, phong
phú. Thêm vào đó, sự phát triển vượt bậc của công nghệ khoa học hiện đại
giúp phát hiện thêm nhiều loại cây thuốc mới, với những tác dụng chữa bệnh
mới. Việc kết hợp hài hòa tân dược và đông dược tạo nên hiệu quả chữa bệnh
rất tích cực, đồng thời cũng mở rộng thêm nhiều phương thuốc đông y mới.
Nhưng cũng chính sự phát triển nhanh chóng, mạnh mẽ của ngành dược
liệu như hiện nay, sự đa dạng, phong phú của cây thuốc, sự biến đổi phức tạp
về hình thái và thành phần hoá học trong quá trình chế biến, đã đặt việc kiểm
nghiệm, quản lý chất lượng trước nhiều khó khăn, thách thức, đôi khi dãn đến
tình trạng thả nổi. Nhất là trước thực trạng ngành kiểm nghiệm còn nhiều
thiếu thốn: trang ihiết bị, máy móc; nhân lực; thông tin không đầy đủ, rõ ràng
dễ dẫn đến sự nhầm lần.
Bởi vậy, với mong muốn góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm
dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài: “N g h iê n c ứ u th à n h lậ p tiê u c h u ẩ n
k iể m n g h iệ m m ộ t sô dư ợ c liệu c h ứ a a ỉc a lo id ” với mục đích xây dựng
dữ liệu góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứíì
aicaloid, giúp việc kiểm nghiệm dễ dàng, thuận tiện hơn. Dược liệu chứa
alcaloid chiếm một lượng rất ỉớn, trong đề tài này, chúng tôi chỉ lựa chọn
nghiên cứu một sô' dược liệu thông dụng, phổ biến, đó là: Bách bộ, Dừa cạn,
Đại, Lạc tiên, Mã tiền, Hoàng nàn, Ô đầu phụ tử.
Với mục đích như trên, nội dung của đề tài bao gổm:

* Chọn dược liệu chuẩn. Chụp anh và mô tả đặc điểm hình thái, đặc


điểm hiển vi các dược liệu nghiên cứu
* Thực hiện các phương pháp kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển
Việt Nam
* ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao vào kiểm
nghiệm dược liệu. Thành lập sắc ký đổ dịch chiết các dược liệu nghiên cứu
trong một số điều kiện nhất định.


Phần I
TỔNG QUAN
1. Sơ bỏ về dươc liêu chứa alcaloid:
Từ xưa đến nay, nhiều dược liệu chứa aicaloid vẫn luôn được biết đến
như những vị thuốc quý, được sử dụng rộng rãi trong Y học: Reserpin từ Ba
gạc, Vinblastin, Vincistin lừ Dừa cạn, Morphin từ Thuốc phiện, Aconitin (Ô
đầu), Strychnin (Mã tiền)...Bởi có tác dụng điều trị cao và rộng, lại rấl phổ
biến trong thực vật nên alcaloid được chú ý nghiên cứu rất nhiều ở Viột Nam,
dù rằng hiện nay các alcaloid dùng được trong Y học ít hơn rất nhiều so với
các loại alcaloid đã phát hiện [8], Thực tế hàm lượng alcaloid trong cây
thường rất thấp (Một dược liệu chứa 1-3% alcaloid đã được coi là cổ hàm
lượng alcaloid khá cao), nhưng ngay ở hàm lượng rất thấp đó aỉcaloid đã có
thể cho hiệu quả rõ rệt trên lâm sàng, đặc biệt ở những dược liệu có độ độc
cao như: Lá ngón, 0 đầu (2-5mg aconitin đã có thể gây chết người lớn), Mã
tiền.. .Bởi vậy việc kiểm nghiệm càng cần phải cẩn trọng, chính xác, đảm báo
sự an toàn cho người bệnh.
Theo định nghĩa của Pôlônôpski: "Aỉcaloid là những hợp chất hữu cơ có
chứa nitơ, đa số có nhân dị \òng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực
vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số

thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alcaloid".
Hiện nay, nhiều alcaloid đã được tìm thấy ở động vật (Bufotenin từ
nhựa Cóc, samandarin ở loài Kỳ nhông Salamandra maculosa...) nhưng thực
vật vẫn là nguyên liệu chủ yếu để sản xuất các alcaloid, đặc biệl là thực vật
bậc cao. Thực vật bậc cao chứa alcaloid chiếm 15-20% tổng số các loại cây,
lập trung ở một sô' họ thực vật như: Apocỵnaceae (họ Trúc đào) với gần 800
alcaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alcacloid, Loganiaceae (họ
Mã tiền) có 150 alcaloid...


Trong cây, alcaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định (ở hạt
như Mã tiền, Cà phê..., ở củ như Ô đầu, Bách b ộ..., ở vỏ như Đại, Hoàng
nàn...) và có thể thay đổi trong quá trình phát triển của cây cả về hàm lượng
lẫn vị trí, “nơi tạo ra alcaloid không phải lúc nào cũng là nơi tích tụ alcaloid”:
Nhiều alcaloid được tạo ra ở rễ tại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây,
sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quíi, hạt.
Đây cũng là một khó khăn không nhỏ cho việc kiểm nghiệm các dược liệu
chứa alcaloid. Các alcaloid trong cây thường ở dạng hỗn hợp, hiếm khi chỉ có
một loại duy nhất, khi đó alcaloid có hàm lượng cao sẽ được gọi là alcaloid
chính. Các alcaloid rất ít khi ở trạng thái tự do mà ở dạng muối của các acid
hữu cơ như citrat, tactat, malat, oxalat, acetat... (Đôi khi ở dạng muối của acid
vô cơ) tan trong dịch tế bào, ở một số cây alcaloid kết hợp với tanin hoặc với
acid đặc biệt cua chính cây đó như acid aconitic có trong cây Ô đầu, acid
tropic trong một số cây họ Cà. ..[9]
Kiểm nghiệm dược liệu chứa alcaloid thường tiến hành như sau [9]:
- Các đặc điểm đặc trưng về hình thái cây thuốc, hình ảnh bột, vi phẫu được
mồ tả tỉ mỉ giúp nhân thức cây thuốc, vị ihuốc.
- Để định tính alcaloid, sử dụng các phản ứng tạo tủa và tạo màu đặc trưng:
+ Muốn xác định xem trên tiêu bản thức vật có alcaloid không và có ở vị trí
nào người ta thường dùng thuốc thử Bouchardat, nhỏ một giọl ihuốc thử lên

tiêu bản thực vật mới cắt sẽ thấy xuất hiện tủa nâu, tuy nhiên để kết luận chắc
chắn, cẩn làm thêm một tiêu ban đối chứng đã loại hết các alcaloid.
+ Để chứng minh là alcaloid gì thì còn phái làm thêm phản ứng tạo màu đặc
hiệu, ngày nay thường kết hợp với phương pháp sắc ký nhất là sắc ký lớpmỏng
có alcaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh, phương pháp phổ hổng ngoại,
phổ tử ngoại, khối phổ.
- Định lượng alcaloid thường có hai giai đoạn:


+ Chiết riêng alcaloid ra khỏi dược liệu: Yêu cầu dược liệu phải được chiết
kiệt ở từng giai đoạn
+ Định lưcmg: Lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp tính chất từng
alcaloid. Các phương pháp hay dùng là ; phương pháp cân, phưcfng pháp trung
hòa, phương pháp so màu.
2. Tổng quan về các dươc liêu nghiên cứu:
Để tiện cho việc theo dõi và đối chiếu, tổng quan về các dược liệu
nghiên cứu sẽ được trình bày theo từng dược liệu cùng với phần kết quả thực
nghiệm.

Phần II.
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguỵén liệu và phương pháp nghiên cứu.
2.1.1. _Nguyên liệu
Các mẫu nghiên cứu được thu hái trực tiếp, bảo quản và sơ chế theo yêu
cầu quy định, Một số mẫu được thu inua trên thị trường để kiểm tra, đối chiếu
so sánh, tổng quát hóa các đặc điểm.
+ Bách bõ (Stemona tuherosa Luor..): Rễ củ Bách bộ được lấy mẫu tại
Viện Dược liệu - Hà Nội.
* Dừa can (Catharanĩhus roseus (L.) G. Don.ì: Phần trên mặt đất của
cây Dừa cạn được thu hái tại Vườn thực vật trường ĐH Dược Hà Nội.

* Đai (Pĩưmeria rubra L. var. acutifolia ('Poir.) Bailev): Hoa và vỏ thân
Đại được thu hái tại vườn hoa Thanh niên - Hà Đông - Hà Tây
* Lac tÌén {PassỉAora toetida L.): Phần trên mặt đất của Lạc tiên được
thu mảu tại Vườn thực vật trường ĐH Dược Hà Nội.
* Hoàng nàn iStrychnos waỉlichiana Steud. ex. D Q : v ò Hoàng nàn
được thu mua tại trung tâm phân phối dược liệu ở Lãn ô n g - Hà Nội.
* Mã tiên (Strvchnơs nux ~ vomica L.): Hạt Mã tiền được thu hái tại


Vườn Bách thảo - TP Hồ Chí Minh.
* Ô đáu phu tử iAconitum fort line i HemsL): Các mẫu Ôđầu

phụ tử

được thu mua tại Sapa - Lào Cai; Lãn ông - Hà Nội.
2.1.1.

Phương pháp nghiên cứu

Xử Iv và bảo quản mẫu.
Mẫu dược liệu nghiên cứu có thể là dược liệu tươi hay đã qua chế biến phơi
khô. Sau khi thu mẫu, dược liệu được xử iý, bảo quản theo phương pháp
chung, cụ thể:
- Mẫu dược liệu cắt vi phẫu có thể dùng mẫu tươi hoặc mẫu khô được
iàm mềm, bảo quản trong hỗn hợp Cồn : Nước : Glycerin (1:1:1).
- Mẫu dược liệu dùng soi bột được thái nhỏ, sấy khô,nghiềnihành bột,
bảo quản trong lọ có nút kín, ghi nhãn, để nơi khô ráo.
- Mẫu dược liệu để định tính được thái lát mỏng, sấy khô ư nhiệt độ
<60^C, bảo quản nơi khô ráo.
Nghiên cứu đăc diểm hình thái bẽn ngoài.

^ Mô tả đặc điểm thực vật cây íhuổc:
Cây thuốc được chụp ảnh, mô ta đặc điểm tại nơi thu hái trực tiếp.
* Mô tả đặc điểm được ỉiệii:
Các mẫu nghiên cứu được chụp ảnh, mô tả tỉ mỉ về hình dạng, kích
thước, màu sắc, thể chất, mùi vỊ.
Nghiên cứu dăc điểm vi hoc.
^ Nghiên cím đặc điểm vỉ phẫu của dược ỉiệu:
Làm tiêu bản vi phẫu cố định theo các bước sau:
Cắt vi phẫu:
Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm được cắt ngang bằng dụng cụ cắt
vi phău cầm tay, chọn các lát cắt mỏng.
Tẩy nhuộm:


Ngâm vi phẫu trong dung dịch Cloramin hay nước Javen để tẩy các chất
có chứa trong tế bào, thời gian ngâm tùy loại nguyên liệu, có thể rút ngắn thời
gian bằng cách đun nóng.
Rửa nước ^ ngâm Cloral hydrat với vi phẫu có nhiểu tinh bột rồi rửa
nước lần nữa.
Rửa bằng acid acetic 5%-lO%, rồi rửa nước cho hết acid acetic
Nhuộm vi phẫu bằng đỏ son phèn —>■rửa nước

nhuộm xanh mctylen

rửa nước. Thời gian nhuộm tùy thuộc vào tính chất bắt màu của từng mâu.
C ổ định:
Sau khi nhuộm, vi phẫu được loại nước lần lượt bằng cồn 30", 50", 70'*,
95^ và cồn tuyệt đối.
Lắc vi phẫu ba lần trong xylen.
Đặt vi phẫu vào một giọt bôm canada trên phiến kính, đậy lá kính, để ở

chỗ thoáng 2 - 3 tuần.
Tiêu bản vi phẫu cố định được quan sát mô tả đặc điểm và chụp ảnh qua kính
hiển vi.
* Nghiên cứit đặc điểm bột dược Ịịệit.
Dược liệu được sấy khô, nghiền thành bột.
Xác định màu sắc, mùi vị bột dược liệu bằng cảm quan.
Sử dụng các dung dịch khác nhau để lên kính: nước, cloral hydrat, glycerin...
Quan sát dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm bột dược liệu.
Nghiên cứu vé thành phần hỏa hoc
*

Nghiên cứii bằng phương pháp sắc kỷ lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Nguyên tắc: sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao vẫn dựa trên nguyên tắc sác ký
[ớp mỏng thông thưòíng [6]: "Dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp
mỏng chất hấp phụ mịn, vố cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định. Trong
quá trình di chuyển, mỗi thành phẩn chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy


theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau".
Nhưng nhờ được tiến hành trong một số điều kiện chuẩn nhất định với sự hỗ
trợ của của máy móc và phần mềm vi tính chuyên dụng khiến HPTLC có
những đặc tính uru việt nổi trội hơn hẳn như:
-

Khả năng phân tích tốt

-

Độ nhạy, độ chính xác, độ lặp lại, tính khách quan cao

-

Tốn ít thời gian

Các bước tiến hành:
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cho 3-5g dược liệu được nghiền thành bột
thô, sấy khô, cho vào một ống nghiệm, thêm 20-30ml methanol ngâm trong
24 giờ. Lọc, lấy dịch lọc để chấm sắc ký.
Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 chuẩn của hãng
Merck, được hoạt hóa ở 1 lO^C trong Ih, cắt thành các bản 20x lOcm'
Chấm sắc ký: sử dụng máy chấm sắc ký CAMAG - Linomat 5.0 với
phần mềm điều khiển winCATS. Cụ thể:
Bản mỏng được đặt vào đúng vị trí trên mấy chấm Linomat 5.0
Dùng xiỉanh chuẩn lấy một thể tích mâu chấm thích hợp.
Sử dụng máy vi tính với phần mềm winCATS để điều khiển quá írình
chấm: Vị trí vết, chiều dài, hình dạng, thể tích vết có thể lựa chọn điều chỉnh
được, đảm bảo độ chính xác cao. Sau khi nhập các dữ liệu,quá trình chấm vết
được tự động tiến hành, đổng thời có sự thổi khí nén làm khô vết chấm nhanh.
Triển khai sắc ký: Bằng các hệ dung môi phù hợp từng mẫu dược liệu
Quá trình triển khai được tiến hành trong bình sắc ký tiêu chuẩn, đặt trên
mặt phẳng, bình kín, không di động khi chạy sắc ký
Bản mỏng sau khi triển khai được sấy nhẹ để bay hơi hết dung môi
Quan sát và chụp ảnh: Quan sát và chụp ảnh trong buồng quan sál của
hệ thống CAMAG Reprostar 3 với sự hỗ trợ của phần mểm winCATS dưới


ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm, 366nm, và ánh sáng trắng sau khi phun
thuốc thử hiện màu.
Xử ỉý kết quả: Bằng phần mềm Videoscan với độ phân giải thích hợp.

Kết quả bao gồm hình ảnh sắc ký đồ các dịch chiết, đồ thị biểu diễn độ đậm,
diện tích, Rf các vết nhìn thấy được.
*

Các phương pháp nghiên cứu thành phấn hoá học khác

Các phương pháp nghiên cứu định tính khác được tiến hành theo đúng các
chuyên luận trong Dược điển Việt Nam (I, III), và sẽ được trình bày theo từng
dược liệu cụ thể.

2.2 Kết quả thực nghiệm
2 2 1 BÁCH BỘ

Tổns quan
Bách bộ (hay còn gọi là Dây ba mươi) có tên khoa học là Stemona
tuberosa Lour., họ Bách bộ - Stemonaceae.
Bách bộ phát triển tốt ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Malaixia, Nhậl
Bản, Châu Úc. ở nước ta, Bách bộ mọc hoang ở nhiều vùng rừng núi như: Hoà
Bình, Phú Thọ, Bắc Giang, Thanh Hóa....Bách bộ thuộc loại dây leo sống
nhiều năm. Rễ củ vàng nhạt, mọc thành chùm.
Về thành phần hoá học: Trong rễ củ Bách bộ mọc ở Việt Nam {Stemona
tuberosa) có hàm lượng alcaloid toàn phần là 0,5-0,6%, trong đó alcaloid
chính là tuberostemonin LG. Ngoài ra trong rễ củ còn có glucid, lipid, prolid
và các acid hữu cơ.
Về tác dụng, công dụng: Bách bộ đùng chữa ho lâu ngày do viêm khí
quản, ho gà, lao hạch, trị viêm đại tràng mạn tính. Tác dụng trị ho của Bách bộ
đã được khoa học hiện đại chứng minh là do khả năng giảm thấp sự hưng phấn
của Irung khu hô hấp, dịch chiết Bách bộ còn có tác dụng kháng khuẩn mạnh,

ức chế vi khuẩn lao
* Tiêu chuẩn kiểm nghiệm
Dược điển Việt Nam III có quỵ định các tiêu chuẩn kiểm nghệm đối với vị
thuốc Bách bộ: Các tiêu chuẩn về đặc điểm hình thái, đặc điểm hiển vi, định tính
(bằng phản ứng hoá hoạc hoá học và phương pháp HPTLC với chất chuẩn là
dung dịch tuberostemonin LG hoặc Bách bộ chuẩn), định lượng bằng phương
pháp acid-base với hàm lượng alcaloid toàn phần khồng dưới 0,5%
Kết quả thưc nehiêm
Mẫu dược liệu chuẩn được lấy tại Viện Dược liệu, có thu mua ihêm các mẫu
Bách bộ trên thị trường để so sánh
Đăc đỉêni hình thái bên ngoài
* Mô tả cdv
Bách bộ thuộc loài dây leo, sống nhiều năm, dài 5-lOm. Thân nhỏ, nhẵn.
Lá mọc đối hay so le, phiến lá hình tim, gân chính hình cung, có nhiều gân
ngang nhỏ và rõ. Hoa mọc ỏ kẽ lá gồm 1- 2 hoa, hoa màu vàng lục, mặt trong đỏ
tía, mùi hôi. Bao hoa gồm bốn phiến, có bốn nhị. Rễ củ màu vàng nhạt, mọc
thành chùm, có nhiều rễ phình to.(Ảnh la)
* Mô tả dược liệu
Dược liệu là rễ củ phơi hay sấy khô của cây Bách bộ. Rễ nhỏ để ngu yen,
loại to bổ dọc. Đầu trên hơi phình to, còn vết gốc thân, đầu dưới thuôn nhỏ, mặt
ngoài vàng nâu có nhiều vết nhăn nhỏ. Thể chất mềm dẻo. Mặt cắt ngang ihấy
mô mềm vỏ khá dày, màu vàng nâu, trụ giữa màu tráng ngà. Vị đắng, hơi ngọt
(Ảnh Ib)
Đặc điểm hiển vi
* Đặc điểm vi phản:
Mặt cắt rễ củ hình tròn. Từ ngoài vào trong có: Lớp bần cấu lạo bơi những
tế bào thành dày hoá gỗ. Mảnh vỏ gồm các tế bào to nhỏ không đều, thành
mỏng, xếp lộn xộn, rải rác có sợi hình đa giác hoặc hình tròn và tinh thể calci
oxalat hình cầu gai nhỏ. Nội bì cấu tạo bởi một lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều

đặn. Vỏ trụ là một lớp tế bào hình chữ nhật xếp xen kẽ với các tế bào nội bì. Libe
là các tế bào nhỏ tập hợp thành các bó xếp xát vỏ trụ xen kẽ các bó gỗ. Các bó gỗ
cấu tạo bởi những mạch gỗ xếp tuần tự thành hình tam giác, đầu nhọn quay ra
ngoài xát vỏ trụ, phía trong gỗ liền nhau thành vòng tròn. Mảnh ruột là các tế bào
thành mỏng to nhỏ không đều, kích thước nhỏ hơn tế bào mô mềm vỏ, xếp lộn
xộn. Trong mô mềm ruột rải rác có các mạch gỗ lớn
* Đặc điểm bột dược liệu:
Bột có màu xám, khống mùi, vị đắng. Soi dưới kính hiển vi ihấy: Bần màu
vàng gồm các tế bào hình nhiều cạnh, thành dày. Mảnh mô mềm tế bào hình tròn
hoặc chữ nhật, màng mỏng có khi chứa tinh bột. Hạt tinh bột kích thước khoảng
0,02-0,03mm, có rốn hạt và vân khá rõ, đứng riêng lẻ hay tập trung thành đám.
Sợi dài có thành dày, khoang rộng. Mảnh mạch có mạch chấm, mạch vạch.
Các đặc điểm cảm quan, đặc điểm hiển vi đã nghiên cứu hoàn toàn phù
hợp các đặc điểm đã được chụp ảnh, mô tả kỹ trong tài liệu [14]
Định tính về mặt hoá học
* Định tính bằng các phản ứng hữá học
- Cân khoảng 2g bột dược liệu, thấm ẩm bằng amoniac đậm đặc (TT), để
20 phút. Thêm 15ml chloroform (TT), đun cách thuỷ 5 phút, lọc, bốc hơi dịch lọc
trên cách thuỷ đến khô. Hoà tan cắn trong 6ml aciđ hỵdrocỉoric 0,1 N (TT), lọc.
Dùng dịch cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống Iml, tiến hành các phản ứng sau:
Ống 1: Nhỏ một giọt thuốc thử Mayer, xuất hiện tủa trắng
Ống 2: Thêm một giọt thuốc thử Bouchardat, xuất hiện tủa đỏ nâu
Ống 3: Nhỏ một giọt thuốc thử DragendortT

tạo tủa đỏ gạch

Ống 4: Nhỏ một giọt dung dịch bão hoà acid picric(TT), xuất hiện tủa vàng
- Cần Ig bột dược liệu , thêm 5ml nước, đun sồi, lọc. Lấy Iml dịch lọc,
thêm Iml thuốc thử Fehling (TT), đun sôi

xuất hiện tủa đỏ gạch

* Định tính hằng phương pháp tiPTLC
Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phưcmg pháp nghiên cứu mục 2. ỉ .2


với hệ dung môi khai triển: Benzen ' aceton - methanol [9 : 1 : 11. Kết quả thu
được là:
- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liêu các thông số của sác ký đồ
dịch chiết Bách bộ trong methanol quan sál ở uv 254 nm (Hình 1.1)
- Sắc ký đổ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký đồ
dịch chiết Bách bộ trong methanol quan sát ở uv 366nm (Hình 1.2)
- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký đồ
dịch chiết Bách bộ trong methanol quan sát ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc
thử hiện màu Dragendorff (Hình 1.3)
Nhân xét\ Các phản ứng hoá học định tính các mẫu Bách bộ đều dương tính.
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng theo Dược điển Việt Nam III với
chất chuẩn là dịch chiết Bách bộ chuẩn. Bản mỏng sau khi phun thuốc thử hiện
màu Dragendorff, trên sắc ký đồ của dịch chiết Bách bộ chuẩn xuất hiện 4 vết, và
trên sắc ký đổ dịch chiết các mẫu thu mua ngoài thị trường đều có các vết cùng
màu, cùng Rf với dịch chiết chuẩn. Sô' vết hiện màu ít hơn yêu cầu trong Dược
điển (6 vết), có thể do quá trình chế biến, bảo quản mẫu.
Nghiên cứu chạy sấc ký dịch chiết Bách bộ trong methanol với nhiều hệ dung
môi khai triển khác nhau, kết quả là có nhiều hệ tách được trong đó hệ benzen aceton - methanol [ 9 : 1 : 1 ] cho các vết tách tốl, rất ổn định, sau khi phun thuốc
thử Dragendorff được 2 vết trên sắc ký đồ.
Kết luận
Các đặc điểm hiển vi, đặc điểm hình thái, định tính bằng các phản ứng hoá học
tạo tủa của các mẫu Bách bộ đều đạt các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cua Dược điển
Việt Nam ÍII

Về sác ký lớp mỏng, có thể sử dụng phưcíng pháp khác trong Dược điển,
đơn giản hơn, đó là chiết bằng methanol. Với HPTLC, phân tích kết quả sắc ký
bằng máy móc cho ta biết sự thay đổi các thành phần trong dược liệu, giúp bổ
sung thêm các dữ liệu để đưa việc kiểm nghiệm đạt đến một mức tiêu chuẩn cao
hơn


Änh lb: Vi thuöc Bach bö

Anh la: Cäy Bach bö

H'inh 1.1; Ket qua sät; ky dich chiet Bach b<>
quan sal cVänh sang liür njioai biriVc song 254nm

Trdck 1
CxlOO)

Tu ck 1
P « .ik

S t illt

M ax.

End

=

Rf

1

0 .0 2 2

1 5 3 2 ,5

0 .0 3 2

1 6 1 9 ,3

49 .4 5

0 ,0 8 6

2

0 .1 8 2

52.1

0 .2 0 7

2 4 5.6

7.50

3

0 .5 6 9

37.1

0 ,5 9 4

2 1 5,0

6,57

4

0 .7 0 4

4 6 4.2

o .n ?

6 2 3 ,0

6

0.741

5 7 0.2

0 .7 4 4

5 7 1 ,5

H

T o ta lH e ig h t 3 2 7 4 .3 8

RI

H

To ta l A r e a : 3 7 21 4

IM

Rf

.11 « 0
H

A

S iib s t
t'^1

9.3

1 8 1 6 9 .6

4 8 .8 2

0 .2 3 4

0,7

2 6 5 5 ,3

7,14

0 ,5 9 9

2 0 5.3

1 7 0 2 ,0

4,5 7

19 .0 3

0.741

5 7 0.2

8 5 9 5 .8

2 3 .1 0

17 .4 5

0 ,7 7 8

21 7.6

6 0 9 1 .2

1 6 .3 7

N d iii«


T io c k 2

Hinh 1.2: Kél quá sát ky dich chiét Biich bo
quan sal á luih saag tir ngoai hiri'tf song 366nm

Cxi00)
40

-

30

-

20

-

f|V|

10 *

'

Oil

! ■'

0.1

I

'

02

!

'

0.3

I

OA

'

I

'

0.5

I

0.6

'

1

'

0.7

I

'

I

08

0.9

T ra ck 2
Pedk

S t d it

a

Rf

1

0,249

2

0,448

3

M tix .
H

E iu l

a ie a

S iih s t

Rf

H

814,2

0.285

1596.8

21.23

0.290

1505.6

2 062 8 .9

29.64

429.2

0,476

1365.7

18,16

0,479

1342.6

10744.9

15.44

0.494

1200.9

0.496

1208,4

16.07

0.531

243.7

10 S3 E 9

15.80

4

0.620

122.3

0.640

562.7

7.48

0.682

103.3

5837.1

8,39

5

0.957

0.0

0.975

2 7 87 .0

37.06

0,992

506.9

2 139 3 .0

30.74

Total Height 7520.5B

Rf

[*•]

H

N am e

(%1

Total Area : 6960G.9

H in h

Tu ck 2

(xlOO)

■ T ”

A

1 .3 ; K é 't q u a s i c J c y d i c t i c h ié t

B á d i b d q u a a sat 6

áoh. sá a g

tcá a g

s a u j d i i p b u a i h u 6 c t b iir ( l i e a m a u

■i.'
10
''

' 'r '*

8

'

"r/.

M

6
4

'■ if
V

2
0

T"'' I... '■ Í" '"'I
0.0

0.1

0.2

0,3

0.4

0,5

0.6

'...r

0.7

08

Oá

T r .ic k 2
Peak

S t d it

M ax.

End

.l i e a

S i ib s t

s

Rf

1

0 .0 2 7

0.0

0 .0 4 2

166.5

12.14

0 .0 5 5

7.3

943,4

4,39

2

0.197

1 5 5,5

0 ,2 6 4

1 2 04 ,9

8 7 ,8 6

0 ,2 8 9

58,2

2065 6 ,6

95,61

H

Rf

Total Heignt 1371 39

H

Total Area : 21606

r» i

Rf

H

A

VA

N am e


2.2.2 DỪA CẠN

Tổns quan.
Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L.) G. Don. {=Vinca
rosea L.) họ Trúc đào {Apocynaceae). Dừa cạn còn được gọi là Trường xuân
hoa, Dừa tây, Bông cải, Hải đằng.
Dừa cạn có nguồn gốc ở đảo Madagasca, hạt di chuyển vào nước ta và
phát triển rất tốt tại các vùng ven biển từ Quảng Bình đến Kiên Giang, đảo
Phú Quốc, Côn Đảo. Dừa cạn không chỉ đirợc trồng làm thuốc mà còn trồng
làm cảnh ở rất nhiều nơi trên cả nước, bởi chúng dễ phát triển, dễ ra hoa, hoa
có nhiều màu sắc: trắng hoặc hồng. [3] [9] [17]
Thành phần hoá học [9]: Có tới trên 70 alcaloid trong Dừa cạn được
chia thành 3 nhóm chính
-

Nhóm alcaloid có nhân indol: peridin, perosin,...

-

Nhóm alcaloid có nhân indolin: vindolin,ajmalin,...

- Nhóm alcaloid có 2 vòng indol hoặc 1 vòng indol và 1 vòng
indolin. Đặc biệt trong nhóm này có những alcaloid có tác dụng chữa bệnh
ung thư như vinblastin, vincristin...
Về tác dụng và công đụng;
Cao lỏng Dừa cạn có tác dụng hạ huyết áp, an thần, gây ngủ và
chỉ có độc tính nhẹ. Thực tế việc phát hiện tác dụng ức chế ung thư của

alcaloid Dừa cạn Vinca rosea đã thúc đẩy các công trình nghiên cứu alcaloid
của cây này, đặc biệt là khi lượng bệnh nhân mác bệnh ung thư ngày càng
tăng. Trong các alcaloid của Dừa cạn thì vinblastin, vincristin được sử dụng để
điều trị bệnh ung thư biểu mô, đặc biệt đối với bệnh lympho hạt, bệnh bạch
cầu [3] [8] [9]. Hiện nay trên thị trường có lưu hành lọ bột đông khô pha tiêm
tĩnh mạch lOmg của Vinblastin Sulfat và lọ bột pha tiêm tĩnh mạch Img
Vincristin Sulfat.


* Tiêu chuẩn kiểm nghiệm
Dược điển Việt Nam III có quy định các tiêu chuẩn kiểm nghiệm lá
Dừa cạn về đặc điểm dược liệu, vi phẫu, đặc điệm bột, định tính (bằng các
phản ứng hoá học), định lượng bằng phưcfng pháp cân với hàm lượng alcaloid
toàn phần không dưới 0,7%.

Kết quả thưc nshỉêm
Đặc đỉểm hình thái bẽn ngoài
* Mô tả cây
Về đặc điểm thực vât, Dừa cạn là cây thuộc thảo, sống nhiều năm, cao
40-80cm, cành thẳng đứng, lá mọc đối, thuôn dài, đầu hơi nhọn, phía cuống
hẹp, nhọn, không có nhựa mủ. Hoa tráng hoặc hồng mọc riêng lẻ ở kẽ lá ngắn,
phiến có 5 thuỳ. Quả gồm 2 đại, mọc thẳng đứng, hạt nhỏ màu nâu nhạt. Mùa
hoa, quả gần như quanh năm, (Ẳnh 2a)
* Mô tả dược liệu
Dược liệu là lá phơi hay sấy khô của Dừa cạn. Lá hình bầu dục dài, màu
lục xám, đầu hơi nhọn, gốc lá thuôn hẹp dài 4-5cm, phiến có mép nguyên.
Gân hình lông chim, lồi ờ mật dưới lá. Cuống dài 0,3-0,7cm. Vị đắng, mùi hơi
hắc. Thân cành Dừa cạn có màu xanh nâu hay xanh xám, nhiều đốt, giòn, dễ
bẻ gãy. Có nhiều vân dọc thân. Vị đắng, mùi thơm. (Ảnh 2b)
Đặc điểm vi học

* Đặc điểm vi phẫu lá
Biéu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào xếp đều đặn, đa số hình tròn
được bao phủ bởi lớp cutin và mang 2 loại lông che chở, lông che chở đa bào
với tế bào chân ngắn, tế bào đầu đài nhọn, lông che chở đơn bào ngắn.
Phần gân lá: Dưới lớp tế bào biểu bì trên là đám mô dày ở góc. Mồ
mềm gồm những tế bào màng mỏng, kích thước không đều, có hình tròn, giữa
các tế bào mô mềm để hở những khoảng gian bào hình đa cạnh. Bó libe - gỗ


chồng kép hình cung, xếp giữa gân lá, gồm những đám libe tế bào nhỏ, xếp
thành hai cung bao bọc lấy cung gỗ. Mạch gỗ xếp đều đặn.
Phiến lá: Gồm một hàng tế bào mô mềm giậu xếp đều đặn và mô mềm
khuyết tế bào nhỏ, màng mỏng, xếp không đều. (Ảnh 2c)
* Đặc điểm vi phẫu thân
Mặt cắt thân hình tròn. Từ ngoài vào trong gồm có: Biểu bì là một lớp tế
bào hình tròn xếp đều đặn, kích thước khá đều, được bao phủ bởi một lớp
cutin và mang lông che chở đơn bào hay đa bào. Mô mềm vỏ là những tế bào
hình tròn, kích thước không đều, giữa các tế bào để hở những khoảng gian bào
hình đa cạnh. Trong mô mềm vỏ xát ngoài vòng libe là vòng các bó sợi không
liên tục. Các tế bào libe nhỏ, thành mỏng. Tầng phát sinh libe - gỗ. Gỗ là vòng
liên tục, mạch gỗ hình tròn, xếp thành dãy xuyên tâm. Xát chân mạch gỗ vòng
li be quanh tuỷ. Mô mềm ruột các tế bào hình tròn, không đều. (Ảnh 2d)
* Đặc điểm bột
Bột màu xanh xám, mùi hơi hắc, vị đắng.
Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì mang lỗ khí, lỗ khí có kích
thước khoảng 0,02-0,03mm. Mảnh gân lá với các tế bào màng mỏng , hình
chữ nhật, gần như trong suốt (dài khoảng 0,0t0,02mm, rộng 0,04-0,05 mm).
Nhiều sợi thành dày thưòng tụ lại thành bó, các sợi có đường kính 0,01-0,02
mm ■Mảnh biểu bì phiến lá có hai loại: Một loại gồm các tế bào hình đa giác
xếp xít nhau, kích thước khá đều đặn khoảng 0,04-0,06mm, một loại gồm các

tế bào hình ngoằn ngoèo. Mảnh mô giậu. Lông che chở đom bào hoặc đa bào,
thành dày, có từ 2-5 tế bào, bề mặt lấm tấm, tế bào đầu dài, nhọn. Mảnh mạch
có mạch mạng, mạch điểm, mạch xoắn có đường kính 0,008-0,015mm, nằm
riêng lẻ hay xếp thành dãy trong phiến lá. (Ảnh 2e)
Trong Dược điển Việt Nam III chỉ có tiêu chuẩn kiểm nghiệm lá Ọì

17

iSằK


Các đặc điểm hiển vi, đặc điểm hình thái các mẫu lá Dừa cạn đều đạl các
tiêu chuẩn yêu cẩu của Dược điển Việt Nam IIL
Định tính về mặt hoá học
* Định tính bằng các phản ứng hoá học.
Lấy 3g bột dược liệu cho vào bình nón, thấm ẩm với 2ml amoniac đâm
đặc (TT). Thêm 30 ml cloroform (TT), để yên 30 phút, thỉnh thoảng lắc đều.
Lọc dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5 ml dung dịch acid sulfuriclO% (TT) trong
2-5 phút. Để lắng, gạn lấy lớp acid cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml, lần
lượt thực hiện các phản ứng sau:
Ống 1: Nhỏ 2 giọt thuốc thử Mayer

có tủa trắng vẩn đục.

Ống 2: Nhỏ 2 giọt thuốc thử Bouchardat —>■xuất hiện tủa nâu đỏ
Ống 3: Nhỏ 2 giọt thuốc thử Dragendorff -^■có tủa đỏ cam
Ông 4: Nhỏ 1 giọt dung dịch acid picric bão hoà (TT), xuất hiện tủa vàng.
* Định tính bằng phương pháp HPTLC
Nghiên cứu chạy sắc ký dịch chiết Dừa cạn trong methanol với nhiều hệ
dung môi khai triển khác nhau, chúng tôi đã tìm được một số hệ phù hợp,

trong đó hệ Toluen - aceton - ethanol - amoniac 25% [4 : 5: 0,6 : 0,4] cho các
vết tách rất rõ, ổn định nhất trên sắc ký đồ.
Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu mục 2.1.2
với hệ dung môi khai triển:
Toluen - aceton - ethanol - amoniac 25% [4 : 5: 0,6 ; 0,4]
Cố kết quả:
- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc
ký đồ dịch chiết Dừa cạn trong methanol quan sát ở uv 254nm (Hình 2.1)
- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc
kỷ đồ dịch chiết Dừa cạn trong methanol quan sát dưới uv 366nm (Hình 2.2)


-

sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đổ dịch chiết Dừa cạn trong methanol quan sát ở ánh sáng trắng sau khi
phun thuốc thử hiện màu Dragendorff (Hình 2.3).
Nhận x é t Các mẫu Dừa cạn đều đạt các tiêu chuẩn định tính về hoá học như
trong Dược điển Việt Nam III.
Kết luân :
Đề tài đã bổ sung các hình ảnh cụ thể, rõ ràng đặc điểm hiển vi, đặc
điểm hình thái cây và dược liệu Dừa cạn. Mồ tả, bổ sung đặc điểm kiểm
nghiệm hiển vi thân Dừa cạn. Lựa chọn, tìm hệ dung môi khai triển sắc ký phù
hợp, sau đó sử dụng HPTLC xây dựng hình ảnh sắc ký đồ chuẩn và các thông
sô phân tích sắc ký đồ của dịch chiết Dừa cạn trong methanol, để tạo thêm các
dữ liệu giúp việc kiểm nghiệm chính xác, hiệu quả hơn.


2d

Ảnh 2a. Cành Dừa cạn
Ảiứi 2b. Duợc liệu Dừa cạn
Ảnh 2c. Vi phẫu lá Etóa cạn
Ảnh 2d. Vi phẫu thân Dừa cạn

V'

17,
4

5

R

^

s

*1

10

'3

t5

t • ->' 4' : ‘

• Í• X•

1. Mimh bi^u bi
phid'n la
2. Manh g^n la
3. Manh bi^u bi mang
16 khi
4. Bo sofi
5. Manh m6 gi^u
6. L6ng che chcf
dabao
7. M ^ h mach m ^ g
8. Manh mach di^m
9. Manh mach x o ^

Anh 3e. M6t s6 dac di^m b6t D&a can
T t iic k 2

Hinh 2.1: Ket qua siic ky dich chiet Dira can
quan sal tf anh siing la ngoai bmk: sonj: 254nnri

(xlOO)

jifvA
“T

T

07

0.8

~r
0.9

Tu ck 2
P e .ik

S M It

M ox.

End

.11 e d

S iiU s t

B

Rf

1

0 .0 3 5

0.0

0 .0 5 6

2 6 9 ,4

4,5 6

0,072

0,1

1840,1

2.42

2

0 .0 9 3

0.0

0 .1 3 8

1 0 8 5 .3

1 8 .3 8

0,142

1 0 7 9 ,2

1 2 1 8 6 ,3

1 6 ,0 3

3

0 .1 4 2

1 0 7 9 .2

0 .1 4 7

1 0 6 0 ,4

1 6 ,3 0

0,175

1002,1

1 3 6 4 9 ,2

1 7 .9 6

4

0 .2 2 2

9 0 5.4

0 .2 2 5

9 0 8 .5

1 5 .3 8

0,252

6 2 4,8

1 0 5 5 9 ,0

1 3 ,8 9

5

0 .3 0 5

7 2 2.5

0 .3 1 3

7 6 1 ,5

1 2 ,6 9

0,333

6 8 8,4

7962,1

1 0 .4 8

6

0 .6 5 8

3 4 9,5

0 .6 6 8

3 9 6 ,0

6,71

0,685

3 0 2,0

3 8 8 4 ,6

5.11

7

0 .6 9 5

3 2 5,9

0 .7 1 0

4 1 6 .9

7.0B

0,760

1 7 4.9

6 0 2 9 ,3

10 57

8

0 .8 4 0

1 8 6.2

0 :8 9 7

586 5

993

0,923

4 S4 .6

1 4 0 0 0 ,8

1 8 .4 2

9

0 .9 3 8 )

3 9 9.7

0 ,9 4 0

4 0 0 ,9

6,7 9

0,993

0,9

3 8 8 7 ,0

5.11

H

Frt

Total HBigtit 5 9 0 5 .3 9

H

T o ta lA re a : 7 5 9 9 6 .4

[M

Rf

H

A

r%]

N f iiiie