Bai 2 MOI TRUONG DINH DUONG

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

Bài 2:
2.1. Mục tiêu:

- Giúp sinh viên nắm vững được cách pha, sử dụng, bảo quản các hóa chất, môi
trường dinh dưỡng, chất kích thích sinh trưởng (KTST).
- Sinh viên tự pha thành thạo các môi trường phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2. Cơ sở lí thuyết:
Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tìm ra
thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng và
phát triển được. Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài và bộ phận
nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì mô ở
trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh.
Người ta đã đưa ra rất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí nghiệm nuôi
cấy mô. Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu ra để nuôi
cấy những mô đặc biệt nào đó. Một số môi trường khác có ứng dụng rộng hơn và đảm
bảo sinh trưởng tốt cho nhiều loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho
rằng môi trường nào trong chúng bảo đảm sinh trưởng tốt hơn. Để bắt đầu, cần phải thử
trong những môi trường thông dụng nào đó, chẳng hạn môi trường Murashige-Skoog
(1962) nếu không thành công thì sau đó thử trên các môi trường khác.
Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm năm thành phần
chính:
- (1) Đường cung cấp nguồn carbon: Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để
mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối
của mô không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường có trong môi trường
dinh dưỡng. Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose. Nhưng
saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ
saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng là 2-3%.
- Các muối khoáng đa lượng: Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật
tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa

lượng cần phải cung cấp là: N, P, K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1).


Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô
Stt

Nguyên tố
đa lượng

1

N
(NO3-, NH4+)

Dạng sử dụng
Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3, NH4NO3,

Nồng độ
(mM)
[NO3-, NH4+]

(NH4)2SO4

khoảng 20

2

P

NaH2PO4.7H2O, KH2PO4

khoảng 1

3

K

KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4

khoảng 10

4

Ca

Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O hoặc

khoảng 2

CaCl2.6H2O
5

Mg

6

S

MgSO4.7H2O

0,5-3

(NH4)2SO4

khoảng 1

- Các muối khoáng vi lượng: Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật trong nuôi
cấy là lĩnh vực ít được nghiên cứu. Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là
không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, nó đã
được sinh lý học thực vật chứng minh đối với cây hoàn chỉnh do đó có thể sử dụng được
hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với cây cho mô và tế bào nuôi cấy trong môi
trường nhân tạo. Vì vậy, sự cung cấp này có tính kinh nghiệm trong những trường hợp cụ
thể có thể là không cần thiết (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô
Stt

Nguyên tố
vi lượng

1

Mn

2

Dạng sử dụng

Nồng độ
(mg/L)

MnSO4.4H2O

15-100

B

H3BO3

6-100

3

Zn

ZnSO4.7H2O

15-30

4

Cu

CuSO4.5H2O

0,01-0,08

5

Mo

Na2MoO4.2H2O

0,007-1

6

Co

CoCl2.6H2O

0,1-0,4

7

I

KI

2,5-20

8

Fe

FeSO4.7H2O

15-27,9

- Các vitamin: Bảng 2.3 trình bày các vitamin thường được dùng trong các môi
trường nuôi cấy (chủ yếu là bốn loại đầu). Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm

khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0oC (trong ngăn đá tủ lạnh).


Bảng 2.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô
Stt

Nồng độ
(mg/L)

Tên vitamin

1

myo-inositol

100

2

Nicotinic acid

0,5-1

3

Pyridoxine.HCl (Vit B6)

0,05-0,5

4

Thiamine.HCl (Vit B1)

10-50

5

Panthotenate calcium (Vit B5)

1-5

6

Riboflavin (Vit B2)

1-5

7

Biotin

0,1-1

8

Folic acid

0,1-1

- Các chất điều khiển sinh trưởng: Các chất KTST (Bảng 2.4) đóng vai trò quan

trọng trong sự phân hóa, phát sinh hình thái của nuôi cấy mô tế bào thực vật . Một số chất
sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng cần chú
ý:
+ Đối với 2,4-D, NAA, IAA, IBA và GA3: cân một lượng chất sinh trưởng đủ pha
trong lượng thể tích dung dịch mẹ cần dùng vào một ly khô, thêm 2-3 mL cồn 90% rồi
lắc đến khi tan hết, sau đó mới thêm nước cất đến thể tích cần pha.
+ Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài giọt HCl 1N,
hoặc NaOH 1N, lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha.
+ Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1N trước khi pha đến thể tích cần thiết.
Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA bảo quản trong lọ
màu nâu), cất giữ tủ lạnh. 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vậy trong một
năm. BAP, IBA, KIN, và GA3 bảo quản được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần pha lại hàng
tháng để đảm bảo hoạt tính.
Bảng 2.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng
Chữ
viết tắt

Chất kích thích sinh trưởng

Chữ
viết tắt

Chất kích thích sinh trưởng

BA

Benzyladenin

KIN

Kinetin

BAP

Benzyladeninpurine

NAA

Naphthaleneacetic acid

GA3

Gibberellic acid

2hZ

Dihydrozeatin


IAA

Indoleacetic acid

TDZ

Thidiazuron

IBA

Indolebutyric acid

Zea

Zeatin

2-iP

2-Isopentenyl adenin

2,4-D

NOA

Naphthoxyacetic acid

Pic

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
Picloram

Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần
hóa học xác định (các amino acid, EDTA...) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết
nấm men, dịch chiết cà chua ...).
Ngoài việc xác định được thành phần môi trường phù hợp cho nuôi cấy mô tế bào
thì việc chuẩn bị môi trường dinh dưỡng đúng cách có ý nghĩa hết sức quan trọng trong
nghiên cứu. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thì quá trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy
được tiến hành theo 2 bước: (1) Chuẩn bị các dung dịch stock; (2) Chuẩn bị môi trường
dinh dưỡng nuôi cấy. Trong giới hạn của bài thực hành chúng tôi lựa chọn môi trường
MS làm cơ bản trong các nuôi cấy ở các bài tiếp theo.
Các hóa chất trong môi trường MS, các chất KTST thường được sử dụng với nồng

độ tương đối nhỏ. Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm
việc), người ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới
dạng đậm đặc (stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các dung dịch đậm đặc
được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Nếu chuẩn bị môi trường
tốt thì sẽ giảm một số thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy. Tùy theo mỗi cơ quan
nghiên cứu mà việc phân nhóm dung dịch stock MS và nồng độ pha là khác nhau nhưng
đều đảm bảo độ hòa tan bền vững của dung dịch .
2.3. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị
a. Hóa chất:
- Các hóa chất MS
- Chất KTST: BAP, NAA, 2,4D
- Nước dừa: 500ml
- NaOH 0.1N và NaOH 1N
- HCl 10%
- Agar


- Đường succrose
b. Dụng cụ:
- Chai sirum: 60 cái
- Bình tam giác: 20 cái
- Giấy nhôm
- Xi lanh 50ml
- Cốc đong, ống đong loại 50ml,100ml và 1000ml
c. Thiết bị:
- Nồi hấp khử trùng
- Máy đo pH
- Cân phân tích
- Micropipet 0.5ml, 1.0 ml
- Microwave

2.4. Tiến hành thí nghiệm
2.4.1. Pha các dung dịch stock
a/ Dung dịch stock MS
Trong bài thí nghiệm này, chúng ta sẽ tiến hành pha các dung dịch stock MS theo
bảng 2.5 sau:
Bảng 2.5: Hướng dẫn cách pha, sử dụng và bảo quản các dung dịch stock MS
Lượng sử
Stock
MS

Tên hóa chất

dụng khi

Lượng pha

Cách pha

cho 1 lít (g)

Bảo quản

pha 1 lít
môi trường
(ml)

KNO3

95

Cân và dùng nước cất hoà

Bảo quản ở 40C

KH2PO4

8.5

tan lần lượt từng chất trong

trong thời gian 4

bécher cho tan hoàn toàn.

-5 tháng

20

Tiến hành tương tự như

Bảo quản ở 40C

10

trên

trong thời gian 4

MS1

MS2

NH4NO3

82.5

MgSO4.7H2O
CaCl2.2H20

18.5
33.2

Dùng ống đong 1L điều
chỉnh cho đủ 1 lít.


MS3

H3BO3
MnSO4.H2O
CoCl2.6H2O
CuSO4.5H20
ZnSO4.7H2O
Na2MoO4.2H2
O
KI

0.62
1.69
0.0025

0.0025
1.3042

Tiến hành tương tự như

-5 tháng
Bảo quản ở 40C

trên

trong thời gian 4
-5 tháng

10

0.025
0.083
Cân và hoà tan từng chất

Bảo quản ở 40C

bằng 100mL nước cất trong

trong thời gian 4

mỗi bécher riêng. Đặt 2

-5 tháng

bécher dung dịch nuwocs

FeSO4.7H2O

2.78

ấm và gia nhiệt cho dung
dịch ấm lên vừa có hơi

MS4

nóng bốc lên là được.

10

Khuấy đều và đổ dung dịch
Na2EDTA vào ống đong
1L, rồi cho từ từ dung dịch
Na2-EDTA

4.09

FeSO4 vào, vừa cho vừa
khuấy đều. Bổ sung nước

MS5

Myo-inositol
B1 (Thiamin)
B6
Nicotinic acid
Glycine

10
0.01
0.05
0.05
0.2

cất cho đến thể tích 1 lít
Cân và dùng nước cất hoà

Bảo quản ở 40C

tan lần lượt từng chất trong

hoặc ở ngăn đá

bécher cho tan hoàn toàn.

trong thời gian 4

Dùng ống đong 1L điều

-5 tháng

10

chỉnh bằng nước cất cho đủ
1 lít.

b/ Pha dung dịch stock chất KTST

Để tiện sử dụng các dung địch stock chất KTST thường được pha ở nồng độ 1,0
mg/ml theo bảng 2.6:
Bảng 2.6: Hướng dẫn cách pha, sử dụng và bảo quản các dung dịch stock KTST
Dung dịch stock
KTST
BAP (1,0mg/ml)

Cách pha
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong

Bảo quản
Bảo quản ở 40C,


Kinetin

NAA

IBA

2,4 – D

5ml NaOH 1N, lắc tan. Cho thêm nước cất cho đủ 100

trong 3 tháng

ml.
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong

Bảo quản ở 40C,

5ml NaOH 1N, lắc tan. Cho thêm nước cất cho đủ 100

trong 3 tháng

ml.
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong

Bảo quản ở 40C,

5ml NaOH 1N, lắc tan. Cho thêm nước cất cho đủ 100

trong 12 tháng

ml.
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong

Bảo quản ở 40C,

5ml NaOH 1N, lắc tan. Cho thêm nước cất cho đủ 100

trong 3 tháng

ml.
Cân 100mg 2,4-D (2,4 dichlorophenoxyacetic acid)

Bảo quản ở 40C,

hòa

trong 12 tháng

tan trong 30ml ethanol 50%, lắc tan. Cho thêm nước cất
cho đủ 100ml.

2.4.2. Pha môi trường nuôi cấy
1. Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng lan Dendrobium (kí hiệu:MT1)
* Công thức môi trường bao gồm:
-

MS + 8,0 g/l agar + 30g/l sucrose + 15% (v/v) nước dừa (CW) + 2,0 mg/l BAP
(tham khảo P.H.Vĩnh).

* Cách pha (pha trong 1 lít):
- Bước 1: Đong lần lượt các dung dịch dịch stock (MS1: 20ml, MS2: 10ml,
MS3: 10ml, MS4: 10ml, MS5: 10ml) cho vào cốc đong 1 lít đã có sẵn 200ml nước
cất. Tiếp tục cho lần lượt 30g sucrose, 150 ml CW, 2.0 ml BAP (lấy bằng
micropipette) vào cốc đong rồi dùng đũa thủy tinh khuấy tan hết đường, cho nước
cất lên đến 1 lít rồi đem đi điều chỉnh giá trị pH (pH =5.8 ÷ 5.9). Dùng các dung
dịch NaOH (0.1N, 1N) hoặc HCl (5%,10% ) để điều chỉnh giá trị pH tùy theo giá
trị pH của dung dịch.
- Bước 2: Cho 8g agar vào và đem nấu môi trường để hòa tan agar trong nồi
áp suất với thời gian (7-10 phút).


- Bước 3: Dùng xi lanh phân phối môi trường (khoảng 45÷50ml/ chai) sau
khi nấu vào các chai sirum thể tích 500ml, làm nút kẽm. Xếp môi trường vào giỏ
và đem đi hấp trong nồi hấp vô trùng ở 121 0C/1atm, trong 20 phút. Sau khi hấp vô
trùng đặt chai đựng môi trường lên giá, để nguội.
Chú ý: Trong trường hợp vì một vài trục trặc gì đó không thể hấp vô trùng

thì có thể bảo quản các chai môi trường trong điều kiện nhiệt độ 4-20 0C trong 12
giờ.
2. Môi trường nuôi cấy phôi lúa (Oryza sativa L), kí hiệu MT2
* Công thức môi trường bao gồm:
- MS + 8.0 g/l agar + 30g/l sucrose + 5.0 mg/l BAP + 1.0mg/l casein (tài liệu thực
hành a khánh), pH= 5.8.
* Cách pha (pha trong 1 lít): thao tác tương tự như MT1
3. Môi trường nuôi cấy phát sinh callus cây Ba kích (Morinda officinalis How),
kí hiệu: MT3
* Công thức môi trường bao gồm:
- MS + 8.0 g/l agar + 30g/l sucrose +3,0 mg/l 2,4-D, pH= 5.8.
* Cách pha (pha trong 1 lít): thao tác tương tự như MT1
4. Nuôi cấy huyền phù tế bào cây Ba kích (Morinda officinalis How), kí hiệu:
MT4
* Công thức môi trường bao gồm:
- MS + 30g/l sucrose + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, pH= 5.8.
* Cách pha (pha trong 1 lít): thao tác tương tự như MT1 những chú ý không bổ
sung agar và phân phối vào trong các chai tam giác 250ml.
2.5. Đánh giá kết quả
- Quy trình pha chế các loại dung dịch stock MS2,MS3,MS5 và chất KTST
- Quy trình pha chế các môi trường MT2, MT3, MT4