Vài trò của vi sinh vật trong sản xuất enzyme amylaza

Đề tài: “sản xuất enzym amylase”


I.Đặt Vấn Đề
• Một trong những thành tựu khoa học và công
nghệ trong những năm gần đây llà các nghiên
cứu và ứng dụng về enzymes.Nó đặc trưng
cho sự phát triển của khoa học trong mấy thập
niên qua: Đó là những khám phá về cấu trúc
hoá họcvà cơ chế xúc tác kỳ diệu của enzymes
– chất xúc tác sinh học.Enzymes đóng vai trò
cực kỳ quan trọng trong ngành công nghệ sinh
họchiện đại và cùng với những thành tựu đạt
được trong nghiên cứu lý thuyết,các ứng dụng
của enzyme ngày càng được mở rộng và đạt
được hiệu quả cao.


• Ở Việt Nam công nghệ enzymes đang được
quan tâm và đàu tư mạnh để đáp ứng được nhu
cầu sản xuất. Ở nước ta sản xuất enzymes còn
nhỏ chủ yếu ở các phòng thí nghiệm ở Vện công
nghệ Thực Phẩm và ở các trường đại học
lớn,việc áp dụng vào các ngànhcông, nông
nghiệpvà đời sống còn rất hạn chế.Cho tơi nay
mới có khoảng 30 loại enzymes được ứng dụng
ở quy mô lớn và được sử dụng nhiều nhất là
enzymes Amylase trong nhiều lĩnh vực: công
nghiệp dệt, công nghiệp giấy,nông nghiệp, y
học, xử lý môi trường , đặc biệt trong công
nghiệp thực phẩm.

• Với phạm vi ứng dụng rộng rãi cung như lợi ích mà
enzymes Amylase mang lại cho các ngành công
nghiệp do đó nhu cầu enzymes ngày càng lớn,tuy
nhiên số chế phẩm enzymes amylase vẫn chưa đáp
ứng được nhu cầu ma vẫn phải nhập từ nước ngoài
nên việc ứng dụng các chế phẩm còn hạn chế.
• Vì vậy yêu cầu đặt ra cho các nhà nghiên cứu để tim
ra quy trình sản xuất enzymes với số lượng cao, chấy
lượng tốt, giá thành rẻ.
• Trong các nguồn thu nhận ezymes amylase thì việc
thu hồi enzymes amylase từ VSVlà phương pháp tối
ưu nhất.Do VSV sinh sản nhanh, tạo sinh khối lớn,
quy trình sản xuất không gặp nhiều khó khăn, hiệu
suất thu hồi cao…Vậy chung tôi đề xuất quy trình:”
Sản Xuất Enzymes Amylase Từ Vi Sinh Vật”.


II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.
• *Ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt
gồm những giai đoạn sau:
• -Chuẩn bị:
• a.Nguyên liệu chuẩn bị nuôi cấy có thể là bột ngô, cám gạo,vỏ
trấu, vỏ lạc …và được phối trộn theo tỷ lệ sau:
•
-Bột ngô:70-80%
-Cám gạo
•
-Vỏ trấu: 20-30%

•
-Cám gạo;80-90%
-Cám gạo:85-95%
•
-Vỏ trấu: 10-20%
-Bột ngô:15-25%
•
Tuỳ theo chất lượng của nguyên liệu ta chọn tỷ lệ cho hợp lý để
thu được amylase theo ý muốn.Lượng nước đua vào chiếm
khoảng 50-60l/100kg.


II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.
• b.Hấp phối liệu.
• -Sau khi trộn đều ta đưa phối liệu vào hấp
nhằm hai mục đích: hấp chín nguyên liệu và
tiệt trùng.Thời gian hấp kéo dài từ 3,4-4h nếu
tiến hành ở áp suất thường và 2h nếu ở áp
suất 2kg/cm2.Nguyên liệu khi chin phải có mùi
thơm nhẹ và dễ chịu.
• -Tiếp theo đem vò tơi và làm nguội tới 34350C rồi trộn giống vào tuỳ theo chất lượng
của giống(Tỷ lệ giống có thể đưa vào từ 0,21%.


II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.
• c.Trộn giống.
• -Có thể tiến hành theo nhiều kiểu khác nhau: Trộn
giống với ít môi trường,sau đó lại trộn đều với
lượng môi trường lớn hơn và tiếp tục cho đến khi
hết giống và môi trường.Biện pháp này giúp bào tử

hút nước và sẽ nhan phát triển khi đưa vào phòng
nuôi mà không cần ủ giống.
• -Tốt nhất là hoà nấm giống vào dung dịch HCl
0.1N. Để yên khoảng 30 phút loại tạp khuẩn sau đó
vẩy vào môi trường và trộn đều.


II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.
• d.Tải canh trường vào mành mành phải
được vệ sinh, thanh trùng và làm ráo
nước,Khi tải canh trường vào mành mành
phải chú ý giữ vệ sinh tay chân và dụng cụ
nhằm tránh bị lẫn tạp các loại VSV bất
lợi.Chiều dầy canh trường phải đều, là
3cm nếu vào mùa đông và 2cm nếu vào
mùa hè, xung quanh mép mành nên vun
dầy hơn để tránh bị khô.


II.Thu nhận Amylase từ nấm mốc.
• e.Phòng nuôi mốc.
• - Tuỳ thuộc vào năng suất và cách bố trí sản
xuất của xí nghiệp mà phòng nuôi có thể khác
nhau.Chiều cao nên từ3-3.5m ,có hệ thống
điều hoà giúp giữ nhiệt độ và độ ẩm ổn định
nếu không có thể bố trí hệ thống ống phun
nước quanh tường ,phun nước lạnh vào mùa
hè ,nước ấm vào mùa đông.Giá đặt mành nên
có chiều cao vừa phải để dễ thao tác, khoảng
cách giữa các mành là 0.2m, mỗi giá đặt 6-7

mành.


• *Quá trình phát triển của nắm chia làm 3 giai đoạn.
• -Gđ1:Nầm phát triển chậm, nhiệt đọ chưa tăng mùa đông cần
giữ ẩm để nâm phat triển bình thương.
• -Gđ2: Nầm phát triển mạnh , toả nhiệt, nhiệt độ canh có thể đạt
tới 400C vị vậy phải tải nhiệt kịp thời .Cần tăng cường không
khí lạnh , ẩm để làm ổn đinh nhiệt độ và cung cấp oxygen để
cho nầm phat triển bình thường.Sau 20-24h nấm tạo nhiều sợi
lien kết thành mảng lớn cần dung que vô trùng lật dưới lên trên
nhằm tạo điều kiện toả nhiệt tốt(không làm vỡ nấm thành
những miếng bé gây tổn thương tới sự phát triển của sợi nấm)
• -Gđ3:Nấm phát triển chậm dần, nhiệt độ giảm nhưng enzymes
vẫn được tích tụvà đạt cao ở cuối giai đoạn khi trên bề mặt
nấm lơ thơ xuất hiện các bào tử.Nếu kéo dài để bào tử mọc
nhiều sẽ làm giảm hoạt độ của enzymes.Khi kết thúc chu kỳ
nuôi cấy ta có thể sử dụng ngay sản phẩm để đương hoá tinh
bột hoăc đem sấy ở 40-500C đến độ ẩm còn 8-10% sau đó
đưa đi bảo quản


III.Sản xuất enzymes từ vi khuẩn.
• -α Amylase được sản xuất từ vi khuẩn
Bacillus stearothermophillus và Bacillus
licheniformis . Đặc biệt người ta phát hiện ra
α Amylase từ Bacillus licheniformis có nhiều
ưu điểm hơn hẳn so với các vi khuẩn khác
đó là khả năng chịu nhiệt cao(nhiệt độ tối ưu
là 90-950C) thậm chí có thể chịu đựng được

nhiệt độ từ 105-1100C.Chủng vi khuẩn
Bacillus licheniformis tham gia suất α
Amylase là Bacillus licheniformis B.56.


III.Sản xuất enzymes từ vi khuẩn.
• 3.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus licheniformis
• -Là trực khuẩn Gram(+), sinh bào tử hình
ovan,không phình thuộc nhóm II theo phâm loại
của priest và (S)
• -Các tế bào vi khuẩn này đứng riêng lẻ hoặc sắp
xếp với nhau thành từng chuỗi tế bào ngắn ,
nhỏ, có chiều dài thay đổi tuỳ từng chủng từ 15μm, đường kính từ 0.5-1μm


III.Sản xuất enzymes từ vi khuẩn.
• 3.2.Sản xuất α Amylase từ Bacillus licheniformisB56.
• *Môi trường nuôi cấy:Dùng môi trường tinh bột gạo, ngô,
sắn..tuy nhiên qua nghiên cứu cho thấy nuôi cấy từ môi trương
tinh bột gạo cho hiệu quả kinh tế lớn nhất.
• *Phương pháp nuôi cấy:Thời gian lên men thích hợp nhất để
thu hồi là 48h sau đó nuôi cấy với chế độ lắc 200vòng/phút, ở
370C,pH = 6.5
• *Thu hồi:Lượng enzymes được sản xút ra thu hồi qua kết tủa
bằng enthanol nồng độ 75%,tỷ lệ enthanol/ dịch enzymes thích
hợp là 3.5/1
• -sau khi kết tủa đem sấy nhan ở 500C để đuổi hết lượng
enthanol dư.
• -Lượng enzymes kết tủa sẽ đựoc thu hồi bằng cách cho ly
tâm với tốc độ 500vòng/phút trong thời gian 2phút

IV.Sử dụng nấm men E.fibuligera
E.capsularis (Endomycopis) lên men
chìm để sản xuất amylase.

• E.fibuligera là loại protease acid ,phạm vi pH ổn
định4.5-7 và pH tốt nhất 2.3-2.6.Có khả năng lên men
chậm và yếu các đường
glucose,sacarose,mantose.Đồng hoá được mantose,
sacarose,eritose, không lên men galactose, không
đồng hoá galactose,xilase,Bào tử hình dạng mũ.
• E.capsularis lên men chậm glucose, mantose,đồng
hoá mantose,eritose, không lên men được
galactose,sacarose.Không đồng hoá được
galactose,sacarose,xilase.Bào tử hình bầu dục.


IV.Sử dụng nấm men E.fibuligera
E.capsularis (Endomycopis) lên men
chìm để sản xuất amylase.
• Endomycopis để phát triển tốt và sinh sản nhiều
amylase cần nguồn cacbon là tinh bột, nitơ là cám,
(NH4)2SO4 và cần các chất khoáng(K,P..) và acid
béo,lipid chứa trong(dầu cám,dầu hạt bôngdầu hạt
cải).Có thể sử dụng các môi trường với tỷ lệ sau:
•
.1:tinh bột(0.8%),cao ngô(1.5%),bột cá(0.5%),
(NH4)2SO40.33% ,CaCl20.04, KH2PO40.15%
•

.2:Bột ngô 4.75%,bột đậu tương 6.2%, cao ngô
2.7%,KH2PO42.25%.
•
.3:Cám tiểu mạch 5%, tinh bột 1% ,dầu cám 3-5%,
KH2PO40.1%


IV.Những biến đổi chủ yếu xảy ra khi
nuôi cấy VSV với mục đích thu nhận
enzymes.

• Để sinh trưởng và phát triển các VSV cần năng lượng
được cung cấp bởi quá trình oxyhoa Glucid hoàn toàn
hoặc không hoàn toàn:
•
*Tinh bột + đường→CO2 + H2O +Q1
•
CO2 + Rượu + acid hữu cơ
•
*protid→pepton→polypeptidđaciamin
• Song song với quá trình thuỷ phân là quá trình tổng
hợp protid và tinh bột tử acid amin và đương đơn
giản.
• 3C6H12O6+3O2→ 6CH3CHO+6H2O+ 6CO2
• 6CH3CHO+ 3NH3 +9/2O2 →C12H20N3O4+ 6.5H2O


VI.Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh
trưởng và phát triển của VSV và tích
luỹ enzymes

• 6.1.Chủng VSV: Đây là điều quan trọng hàng
đầu ,muốn có chế phẩm với hoạt độ cao trước hết
phải tuyển chọn nghiên cứu xemchủng ,giống nào
có khả năng tích tụ nhiều enzymes mà ta mong
muốn.
• VD: Muốn thu nhận α Amylase ta có thể dung vi
khuẩn subtilis hoặc Asp.oyae ,thu nhận
glucoamylase người ta sử dụng nấm mốc
Asp.niger,Asp.awamori…hoặc nấm men
Endomycosip


• 6.2.Môi trường dinh dưỡng:Khi nuôi cấy ta có
thể sử dụng nhiều chất khác nhau để chuẩn bị
môi trường.Cho tới nay sử dụng nguyên liệu là
thực vật là chủ yếu.Trong sản xuất chế phẩm
amylase theo phương pháp bề mặt hay dung
nhất là cám lúa mỳ(Chứa khoảng 20-30%tinh
bột và 10-12% là protid ngoài ra còn chứa các
nguyên tố vi lượng, muôí khoáng,vitamin.)Ở
nước ta do không có cám lúa mỳ nên thay thế
bằng bột ngô vàng ,cám ngô, trấu đem trộn lẫn
theo tỷ lệ khác nhau.


• Ngoài tinh bột môi trường cần chứa mantose và
dextrin.Sựcó mặt của glucose ,fructose, sacarose có
tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng
lại hạn chế sự tích tụ enzymes.Ngược lại khi cho
thêm lactose và MgO vào môi trường thì nấm mốc

kém phát triển nhưng lại tích tụ nhiều amylase.
• Ngoài Glucid để phát triển và tổng hợp enzymes
VSV đều cần đến protid và các sản phẩm thuỷ phân
của chúng.Nguồn nitơ có thể có sẵn trong nghuyên
liệu hoặc bổ xung từ tinh dầu lạc, khô dầu đậu
tương hoặc từ các muối amonium hoăc urê.Nấm
mốc Asp.awanori có thể phát triển tốt trong môi
trường chứa 0.05% đạm vô cơ nhưng để tạo ra αamylase thì cần tăng nồng độ lên0.15%,để tạo ra
glucoamylase thì cần tăng lên 0.4%


• 6.3.Điều kiện nuôi cấy
• *Nhiệt độ:Nấm men và nấm mốc có nhiệt độ tối
ưu 28-320C vi khuẩn 34-380C.Biết rằng trong
quá trình sinh trưởng và phát triển VSV phải
đồng hoá chất dinh dưỡng và thải ra một lượng
nhiệt khá lớn, do đó cần có trang thiết bị phù
hợp để duy trì ổn định nhiệt độ canh trường
• *Độ ẩm môi trường:Trong điều kiện vô trùng ở
phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu nằm trong giới
hạn65-70%.Trong thực tê sản xuất với mức độ
vô trùng không bằng trong phòng thí nghiệm
nên thưòng nuôi cấy ở ẩm độ thấp hơn nhằm
hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn(50-60%)


• Oxygene:Rất cần thiết trong quá trình tích tụ
enzymes, khi nuôi theo phương pháp bề
mặt, nấm men và nấm mốc dễ dàng tiếp
xúc với không khíqua sợi nấm và mixen qua

đó nhận được O2 từ không khí.Do đó môi
trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo
nhiều sợi và tích tụ được nhiều.
• Mức độ hoà tan O2 phụ thuộc vào nhiều
yếu tố:nhiệt độ,nồng độ chất va phương
pháp sục khí,nhiệt độ cao thì O2 hoà tan
kém còn nồng độ tỷ lệ nghịch với hoà tan
O2


V.Kết luận
- Qua nghiên cứu và tìm hiểu các phương
pháp sản xuất enzymes amylase đăc biệt là
nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới sự
phát triển của VSV và quá trình tích luỹ
ezymes chúng ta thấy được tầm quan trọng
của E.amylase trong cuộc sống.Qua đó sẽ
nghiên cứu để sản xuất ra enzymes có chất
lượng cao và giá thành rẻ và đươc ứng dụng
rộng rãi trong đời sống.
-