LUẬN án TS NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN LIMONOID của lá cây NEEM AZADIRACHTA INDICA a JUSS TRỒNG ở NINH THUẬN

www.DaiHocThuDauMot.edu.vn
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THỊ Ý NHI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LIMONOID
CỦA LÁ CÂY NEEM AZADIRACHTA INDICA A. JUSS
TRỒNG Ở NINH THUẬN

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62 44 27 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2012


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn
MỞ ĐẦU
Họ Xoan (Meliaceae) có khoảng 50 chi với khoảng 550 loài, trong đó chi
Azadirachta là một chi thuộc họ này, nó có ba loài là A. indica, A. excelsa và
A. siamensis. A. indica là một loài được biết đến nhiều nhất trong chi với tên
thường gọi là cây neem (neem Ấn Độ). Hai loài còn lại thường thấy ở khu vực
Đông Nam Á là A.excelsa hay còn gọi là marrango (cây neem Philippine) và
A. siamensis (cây neem Thái). Ở Việt Nam hiện nay, cây neem được trồng đại
trà ở các vùng ven biển miền Trung, đặc biệt nhiều nhất ở huyện Ninh Phước,
tỉnh Ninh Thuận. Cây neem từ lâu đã xuất hiện trong nhiều bài thuốc dân gian,
được xem là loại thảo dược quen thuộc trong y học cổ truyền với những công
dụng trị liệu hết sức thiết thực như trị ho, sốt rét, da liễu, viêm loét, tiểu

đường…Ngoài ra, người ta còn quan tâm đến những hợp chất có hoạt tính tiêu
diệt sâu bệnh, bảo vệ mùa màng, dùng lá neem khô trộn lẫn với hạt để chống
sâu mọt…
Việc nghiên cứu thành phần hóa học cây neem đã bắt đầu từ rất lâu, cho
đến nay, người ta đã cô lập được hàng trăm hợp chất từ cây neem với thành
phần chủ yếu là các tetranortriterpenoid hay còn gọi là các limonoid. Các hợp
chất limonoid là những hợp chất chính gây nên tính đắng trong các bộ phận
của cây neem, trong đó bộ phận hạt là đắng nhất. Với tinh thần mong muốn
góp phần tìm hiểu mối liên hệ giữa thành phần hóa học và dược tính của cây
neem thuộc chi Azadirachta, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ly trích các hoạt
chất limonoid từ lá cây neem trồng ở Ninh Thuận và khảo sát khả năng ức chế
enzym α-glucosidase của các cao trích và các hợp chất cô lập được.
ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Trong phần cô lập các hợp chất limonoid tinh khiết từ cao etyl acetat của
lá cây neem trồng ở Ninh Thuận, chúng tôi đã cô lập được 20 hợp chất
limonoid, trong đó có 16 hợp chất mới gồm 12 hợp chất tetranortriterpenoid là
NEEM 39, NEEM 33, NEEM 31, NEEM 25, NEEM 3, NEEM 19, NEEM 20,

1


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

NEEM 22, NEEM 1, NEEM17, NEEM 4, NEEM 30 và 4 hợp chất
pentanortriterpenoid là NEEM 35, NEEM 14, NEEM 28 và NEEM 34.
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase trên 17 hợp chất
limonoid tinh khiết cho thấy đa số các hợp chất limonoid có hoạt tính ức chế
enzym α-glucosidase với giá trị IC50 <100 µM, thấp hơn giá trị tương ứng của
chất đối chứng dương khá nhiều.
BỐ CỤC LUẬN ÁN

Luận án gồm 138 trang với 4 chương, 20 bảng, 13 sơ đồ, 63 hình, 106 tài
liệu tham khảo và 156 phụ lục các phổ. Trong đó, mở đầu 1 trang, tổng quan
38 trang, thực nghiệm 11 trang, kết quả và thảo luận 73 trang, kết luận 2 trang,
kiến nghị 1 trang, danh mục công trình 1 trang, tài liệu tham khảo 11 trang.
NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
- Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học và dược tính của
loài Azadirachta indica của các tác giả trong và ngoài nước.
- Trình bày ngắn gọn các quá trình sinh tổng hợp các limonoid trong
Azadirachta indica
- Trình bày sơ lược về bệnh đái tháo đường.
Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Lá cây neem được thu hái tại xã Phước Dinh, huyện Ninh Phước, Tỉnh
Ninh Thuận, Việt Nam vào tháng 03/2006.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Trong phần này, chúng tôi trình bày ngắn gọn về các hóa chất và thiết bị
sử dụng trong phần thực nghiệm của luận án.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Điều chế các loại cao
2


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Lá neem được sấy khô, xay nhỏ, và ngâm với dung môi metanol, thu được
cao thô metanol. Phần cao thô metanol tiếp tục được hòa tan bằng nước sau đó
lần lượt trích lỏng-lỏng với các dung môi eter dầu hỏa, etyl acetat và nbutanol. Dịch trích eter dầu hỏa, etyl acetat và n-butanol được làm khan, cô
quay dưới áp suất kém, thu hồi dung môi thu được các cao tương ứng.

2.2.2. Trích ly, cô lập các hợp chất limonoid
Việc trích ly và cô lập được thực hiện bằng sắc ký cột cổ điển với silica
gel pha thường hoặc pha đảo RP-18 kết hợp với sắc ký bản mỏng. Sử dụng kỹ
thuật kết tinh để tinh chế các chất. Trong một số trường hợp, sắc ký lỏng điều
chế hiệu năng cao cũng được sử dụng.
2.2.3. Xác định cấu trúc
Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng các phương pháp phổ nghiệm
như 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, LC-MS, HR-ESIMS và so sánh với số liệu phổ từ tài liệu tham khảo.
2.2.4. Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym -glucosidase
Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase in vitro được tiến hành theo
phương pháp của Sigma Aldrich.96 Để khảo sát hoạt tính ức chế -glucosidase
từ Saccharomyces cerevisae, p-

- - -

p-

α-D-glucose. Xác định lượng p-nitrophenol sinh ra bằng
cách đo độ hấp thu quang tại bước sóng 400 nm. Lượng glucose sinh ra tỷ lệ
thuận với PNP, vì vậy, dựa trên độ hấp thu của PNP ở bước sóng 400 nm để
xác định lượng glucose sinh ra. Khi mẫu thử nghiệm có sự ức chế αglucosidase thì hàm lượng PNP tạo thành sẽ giảm. So sánh hàm lượng glucose
sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không có ức chế để xác định % ức chế.
Xây dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định
chỉ số IC50.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học
3


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Từ cao etyl acetat, chúng tôi đã cô lập và xác định được 20 hợp chất
triterpenoid, trong đó có 16 hợp chất được xác định là mới. Do khuôn khổ có
hạn, chúng tôi xin chỉ trình bày phần biện luận cấu trúc các hợp chất mới.
3.1.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 39
Hợp chất NEEM 39 có dạng bột vô định hình, không màu. Khối phổ
phân giải cao HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z

543,3292

[M+H2O+Na ] tương ứng với công thức phân tử C30H46O6 (M 502,3294).
+

Phổ 1H- và

13

C-NMR của NEEM 39 (bảng 3.3) cho thấy NEEM 39 là

một limonoid với sự hiện diện của hai nhóm acetyl ở C-1 và C-7, một nhóm
OH tự do ở C-3 và nhánh vòng tetrahydrofuran trên C-17. Phổ NMR của
NEEM 39 không cho thấy tín hiệu của nhóm CH2 oxygen hóa ở C-28, điều
này phù hợp với việc C-28 trong NEEM 39 xuất hiện là nhóm CH3. Kết hợp
phổ 1H-,

13

C-, DEPT-NMR, COSY, HSQC và HMBC, cấu trúc hợp chất

NEEM 39 được xác định và gọi tên là azadirachtolid G. Hóa lập thể của

NEEM 39 được xác định qua phổ NOESY (Hình 3.4).
29

O
H3C C O

1

3

4

10
5

OH
28
H
OAc CH 3 H

8

9
6

17
18

H
H

14

15

O

CH 2
C
O

22

H

CH 3

7

O C CH 3
O

Hình 3.3. Một số tương quan trong phổ HMBC
và COSY của hợp chất NEEM 39

13

11

H

H
H-H COSY
HMBC

HO

CH 3

O
20

CH 3

19

CH 3
H

21

H

30

O

C
CH 3

Hình 3.4. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 39

3.1.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 33
25

Hợp chất NEEM 33 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D

+

o

110,0 (c 0,36; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy là 170-174 C.
Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
515,3405 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C31H46O6. Phổ 1H- và 13CNMR của NEEM 33 (bảng 3.3) cho thấy NEEM 33 cũng là một limonoid với
sự hiện diện của một nhóm senecioyloxy ở C-1, hai nhóm OH tự do ở C-3 và
C-7 và nhánh vòng tetrahydrofuran trên C-17. Cấu trúc của hợp chất NEEM
4


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

33 được đề nghị là 3-desacetyldeoxyazadirachtolid. Hóa học lập thể của hợp
chất NEEM 33 được xác định qua phổ NEOSY (hình 3.6).
22

O

30

19

O

29

O

CH 3
H

CH 3
H
10

1

H
3

OH

HO
O

H
OH
H

H-H COSY

HMBC

Hình 3.5. Một số tương quan trong phổ HMBC
và COSY của hợp chất NEEM 33

OSen
28

6

5

H

O

CH 3

13

11

H
7

H
OH

17

21

H H

18

8

9

O
20

H

14

CH 3
15

Hình 3.6. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 33

Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất NEEM 39, NEEM 33 và NEEM 31

(Ghi chú: Sen: senecioyl, Meth: Methacryloyl)

5

www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Bảng 3.4. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp
chất NEEM 39, NEEM 33 và NEEM 31

3.1.3. Khảo sát cấu trúc hóa học
của hợp chất NEEM 31
Hợp chất NEEM 31 có dạng
tinh thể hình kim, không màu.
[α]D25 + 132,5 (c 0,35; MeOH).
Khối phổ phân giải cao HR-ESIMS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
543,3344 [M+H]+ tương ứng với
công thức phân tử C32H46O7.
Phổ 1H- và 13C-NMR cho thấy
hợp chất NEEM 31 cũng là một
limonoid với sự hiện diện của liên
kết eter giữa C-6 với C-28, một
nhóm OH tự do ở C-1, nhóm acetyl
ở C-3, một nhóm methacryloyloxy
ở

C-7

và

nhánh

vòng

tetrahydrofuran trên C-17. Cấu trúc

hợp chất NEEM 31 được xác định
và

gọi

tên

1-desenecioyl-7-O-

methacryloyldeoxyazadirachtolid.
Hóa học lập thể của hợp chất
NEEM 31 được xác định qua phổ
NOESY ( hình 3.8).
O

21
30

CH 3
H

H
AcO

OH
28

H

6

10
5

3

(Ghi chú: Sen: senecioyl, Meth: Methacryloyl)

19
1

4

H

CH 3

CH 3
H

29

H

O

13

11

7

H
O

H

23

20
22
17

H

18

8

9
6

H

14

CH 3

CH 2
C C CH

3
O

15

Hình 3.8.Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 31


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

3.1.4. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 25
Hợp chất NEEM 25 t hu được dưới dạng tinh thể hình kim, không

màu. [α]D25 -359,4 (c 0,22; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy 168,0-171,0 oC
Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
529,3210 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C31H44O7. Phổ 1H- và 13CNMR (bảng 3.6) cho thấy NEEM 25 cũng là một limonoid có sự hiện diện
một liên kết eter giữa C-6 và C-28, một nhóm senecioyl ở C-1, hai nhóm OH
tự do ở C-3 và C-7 và một nhánh vòng lacton trên C-17. Cấu trúc của hợp chất
NEEM 25 được xác định là 3-deacetylazadirachtolid. Hóa lập thể của hợp
chất NEEM 25 cũng được xác định qua phổ NOESY ( hình 3.11).
O

O

H
O

30

19

CH 3
H
4

H

10

1
5

3

OH

HO
O

HMBC

Hình 3.10. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 25

H

H
OH

O
23

20
22
17

H

18

8
7

6

13

11
9

H
OSen
O
OH 28
H
H

H-H COSY

CH 3

CH 3
H

29

O

O

21

H

14

CH 3
15

Hình 3.11. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 25

3.1.5. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 3
Hợp chất NEEM 3 được cô lập dưới dạng tinh thể hình kim, không

màu. [α]D25 -284,5 (c 0,4; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy 262,5-264,0 oC.
Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
557,30931 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C32H44O8. Phổ 1H- và
13

C-NMR (bảng 3.6) cho thấy NEEM 3 là một limonoid với sự hiện diện của

liên kết eter giữa C-6 với C-28, một nhóm acetyl ở C-3, nhóm methacryloyl ở
H

30

CH 3

19

CH 3
H

29
2

CH 3
H
4

H

5

3

H
AcO

10

1

OH
28

H

H

6

O

7

H

20

18

8

H
O

17

13

11
9

O

21

14

CH 3

CH 2
C C CH
3
O

23

C-7 và nhánh vòng lacton trên C-17.

O

Cấu trúc của hợp chất NEEM 3 được

22

H

xác

15

định

là

1-desenecioyl-7-O-

methacryloylazadirachtolid. Hóa lập
thể của hợp chất NEEM 25 được xác

Hình 3.13. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 3

định qua phổ NOESY (hình 3.13).
7


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn
Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 25 và NEEM 3

(Ghi chú: Sen: senecioyl; Meth: methacyoyl, Ac: acetyl)

3.1.6. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 19
Hợp chất NEEM 19 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D25 -

39,0 (c 0,4; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 221,0 - 223,0 oC.

Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
573,3455 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C33H48O8. Trên phổ NMR
cho thấy hợp chất NEEM 19 cũng là một limonoid tự nhiên với sự hiện diện
8


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

của một nhóm acetyl ở C-3, nhóm methacryloyl ở C-7, một liên kết eter giữa
C-6 với C-28 và một nhóm hydroxyl tự do ở C-1. Sự hiện diện của nhóm
metoxy ở vị trí C-23 trong NEEM 19 được xác định qua tương quan HMBC
của proton ở H 3,31 (s, 23-OCH3) tới C-23 và proton ở H 4,91 (d, J = 5,0 Hz,
H-23) tới 23-OCH3 (hình 3.14). Hợp chất NEEM 19 vì thế được xác định là
23-metoxy-1-desenecioyl-7-O-methacryloyldeoxyazadirachtolid.

Cấu

hình

tương đối của các tâm thủ tính trong hợp chất NEEM 19 được xác định qua
phổ NOESY (hình 3.15).
H-H COSY
HMBC

O

O

OCH 3

CH 3
H

CH 3
H

OH

CH 3

AcO

H

H
AcO

O C C
O CH 3

O

OH
H

Hình 3.14. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 19

H H
CH 3

H
CH 2

OCH 3

H

H

O

H
O

CH 2
C C CH
3
O

Hình 3.15. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 19

3.1.7. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 20
Hợp chất NEEM 20 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D25 +

80,0 (c 0,35; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 221,0 - 223,0 oC.
Phổ (+)-HR-ESI-MS cho tín hiệu ở m/z 587,3604 [M+H]+ cho thấy
NEEM 20 có công thức phân tử C34H51O8. Phổ 1H- và 13C-NMR (bảng 3.7 và
3.8) cho thấy hợp chất NEEM 20 có nhiều điểm giống với hợp chất NEEM

19 ở trên. Sự khác biệt được nhìn thấy là sự biến mất của các tín hiệu của
nhóm methacryloyloxy ở vị trí C-7, thay vào đó là nhóm senecioyloxy. Cấu
O
CH 3
H

CH 3
H

CH 3

trúc hóa học của hợp chất NEEM

OCH 3

20 được xác định là 23-metoxy-1-

H
H

desenecioyl-7-O-

CH 3

H

H

H
AcO

OH
H

H

O

H
O

senecioyldeoxyazadirachtolid.

H
C
O

CH 3

Cấu

hình tương đối của các tâm thủ tính

CH 3

Hình 3.17. Một số tương quan trong

trong hợp chất NEEM 20 được xác

phổ NOESY của NEEM 20

định qua phổ NOESY (hình 3.17).
9


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

3.1.8. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 22
Bảng 3.8. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp
chất NEEM 19, NEEM 20 và NEEM 22

Hợp chất NEEM 22 có dạng

tinh thể hình kim, không màu.
[α]D25 - 38,0 (c 0,41; MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy 265,0 - 267,0
o
C. Phổ (+)-HR-ESI-MS cho tín
hiệu ở m/z 635,3623 [M+H]+ cho
thấy NEEM 22 có công thức phân
tử C38H50O8. Phổ 1H- và

13

C-NMR

(bảng 3.7 và 3.8) cho thấy hợp chất
NEEM 22 có nhiều điểm giống với
hợp chất NEEM 19 và NEEM 20,
ngoại trừ nhóm acyl ở C-7 được

thay thế bởi nhóm trans-cinnamoyl
trong NEEM 22. Cấu trúc của hợp
chất NEEM 22 được xác định là 23metoxy-1-desenecioyl-7-Ocinnamoyldeoxyazadirachtolid. Hóa
học lập thể

của NEEM 22 cũng

được xác định qua phổ NOESY
(hình 3.19) tương tự như hợp chất
NEEM 19 và NEEM 20.

CH 3
H

CH 3
H

H

CH 3

CH 3

H

O

OCH 3

H

H

H
AcO

OH
H

H

O

H
O

H
C
O H

Hình 3.19. Một số tương quan trong
phổ NOESY của NEEM 22

(Ghi chú: Meth: methacryloyl; Sen: senecioyl;
Cin: cinnamoyl)

10


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

3.1.9. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 1
Hợp chất NEEM 1 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D25 -

228,0 (c 0,28; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 156,0 - 158,0 oC.
+
Phổ (+)-HR-ESI-MS cho tín hiệu ở m/z 485,2162 [M+H] cho thấy
NEEM 1 có công thức phân tử C27H32O8. Phổ 1H- và 13C-NMR (bảng 3.10)
cho thấy NEEM 1 là một C-seco limonoid với sự hiện diện của hai liên kết
eter giữa C-6 và C-28, C-7 và C-15, một nhóm ceton liên hợp dạng 2-en-1-on
trong vòng A, một nhóm metyl ester ở C-12 và nhánh vòng 23-hydroxy-21butenolid trên C-17. Hợp chất NEEM 1 được đặt tên là azadirachtonenlid.
Hóa học lập thể của hợp chất NEEM 1 được xác định thông qua phổ NOESY
(hình 3.22).
O

O

OH
O

H3COOC
H HC
3

O

O
O

H-H COSY

HMBC

Hình 3.21. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 1

H

COOMe

CH3

MeOOC
CH3

CH3

H

H

H

O

H

HO
H

O

H
O

H

H

OH

Hình 3.22. Tương quan NOESY
của hợp chất NEEM 1

3.1.10. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 17
Hợp chất NEEM 17 được cô lập dưới dạng tinh thể hình kim, không

màu. [α]D25 - 117,25 (c 0,28; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy 219,0 221,0 oC. Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân
tử ở m/z 531,2227 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C28H34O10.
Phổ 1H- và 13C-NMR (bảng 3.10) cho thấy NEEM 17 là một limonoid với sự
hiện diện của một nhóm ceton liên hợp dạng 2-en-1-on trong vòng A, một liên
kết eter giữa C-7 với C-15, hai nhóm metyl ester ở C-12 và C-28, một nhóm
hydroxyl tự do ở C-6 và nhánh vòng 21-hydroxy-23-butenolid trên C-17. Hóa
lập thể của hợp chất NEEM 17 được xác định qua phổ NOESY (hình 3.24).

11


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn
O

HO

O

Me O2C

O
H HC
3

O

CH3

MeOOC
CH3

CH3

H

H

H

O
OH
CO 2Me

H-H COSY

H

COOMe

HMBC

Hình 3.23. Một số tương quan HMBC
và COSY của hợp chất NEEM 17

OH

H

HO
H

O

H
O

H

H
O

Hình 3.24. Tương quan NOESY
của hợp chất NEEM 17

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 1 và NEEM 17

3.1.11. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 4
Hợp chất NEEM 4 có dạng tinh thể hình kim, không màu. Khối phổ LCMS (ghi nhận tín hiệu ion dương) cho mũi ion giả phân tử ở m/z 545,1 [M+H]+
tương ứng với công thức phân tử C29H36O10.
12


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

O

O

Phổ NMR của hợp chất NEEM 4

OCH 3

cho thấy NEEM 4 cũng là một limonoid

Me O2C
O

với sự hiện diện của một nhóm ceton
O
H-H COSY
HMBC

OH
CO 2Me

Hình 3.25. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 4

liên hợp dạng 2-en-1-on, hai nhóm
metyl ester ở C-12 và C-28, một liên kết
eter giữa C-7 với C-15 và nhánh vòng

trên C-17 là vòng γ-hydroxybutenolid với nhóm metoxy gắn ở vị trí C-23.
Hợp chất NEEM 4 được đặt tên là 23-metoxyazadirachtolid A.
3.1.12. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 35
25

Hợp chất NEEM 35 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D

+

o

452 (c 0,2; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 192,0 - 195,0 C.
Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
489,2157 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C26H32O9 (M 488,2046).
Các phổ 1H-,

C-NMR (bảng 3.12) của hợp chất NEEM 35 cho thấy

13

NEEM 35 cũng là một limonoid mở vòng C với phần nhánh là vòng γhydroxybutenolid. Tuy nhiên, carbon C-28 tại C-4 của NEEM 35 đã được
thay thế bằng một nhóm hydroxyl tự do, phù hợp với CTPT C26H32O9 của

NEEM 35 đã được xác định bằng HR-MS. Cấu trúc hợp chất NEEM 35 được
xác định và đặt tên là nimbandiol A. Hóa học lập thể của hợp chất NEEM
35 được xác định thông qua phổ NOESY (hình 3.27).
H-H COSY
HMBC

O

HO

O

O
H HC
3

MeO 2C

CH3

MeOOC
CH3

CH3

H

H

O

O

H
O

H

OH OH

Hình 3.26. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 35

OH

HO
H

H

H
O

O
H

H

HO

Hình 3.27. Tương quan NOESY
của hợp chất NEEM 35

3.1.13. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 14
13


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Hợp chất NEEM 14 có dạng tinh thể hình kim, không màu. Nhiệt độ nóng
chảy: 191,0 - 193,0 oC
O

O

Khối phổ phân giải cao (+)-HR-

OH

ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z

MeO 2C

489,2160 [M+H]+ tương ứng với công

O
O
OH OH

H-H COSY

HMBC

Hình 3.28. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 14

thức phân tử C26H32O9 (M 488, 2046).
Các phổ 1H-,

13

C-, DEPT-NMR (bảng

3.12) của hợp chất NEEM 14 tương tự

như phổ của hợp chất NEEM 35 đã được xác định cấu trúc ở trên, cho thấy
NEEM 14 cũng là một pentanortriterpen mở vòng C với phần nhánh là vòng
γ-hydroxybutenolid như NEEM 35 và được đặt tên là nimbandiol B .
Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 35 và NEEM 14

3.1.14. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 30
14


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

25

Hợp chất NEEM 30 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D

+168,0 (c 0,38; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 162,0 – 165,0 oC.

Khối phổ phân giải cao (+)-HR-ESI-MS cho mũi ion giả phân tử ở m/z
595,2792 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C30H42O12 (M 594,2676).
Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (bảng 3.13) cho thấy hợp chất NEEM 30 cũng là
một limonoid mở vòng C với sự hiện diện của nhóm ceton liên hợp dạng 2-en1-on trong vòng A, liên kết eter giữa C-7 với C-15, hai nhóm metyl ester ở C12 và C-28 và cấu trúc phần nhánh trên C-17 được xác định là 20,22dihydroxy-21,23-dimetoxytetrahydrofuran. Đề nghị cấu trúc của hợp chất
NEEM 30 là 20,22-dihydroxy-21,23-dimetoxynimbinolid. Hóa học lập thể
của NEEM 30 cũng được xác định thông qua phổ NOESY (hình 3.30).
O
OH

H3CO

OCH 3

O

OH

MeOOC
O

H HC
3

CH3

OCH3

H
H-H COSY

H

HMBC

3

Hình 3.29. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 30

COOMe

OH

H

H

O
OH
COOCH

CH3

MeOOC
CH3

H

OH

H

OCH3

H

HO
H

O

O

H H

Hình 3.30. Tương quan NOESY
của hợp chất NEEM 30

3.1.15. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 28
Hợp chất NEEM 28 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D25

+100,0 (c 0,38; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 114,0-116,0 oC.
O
OH

H3CO

OCH 3
O
H HC

3

OH

MeOOC
O

MeOOC

CH3

CH3

CH3

H

O

H-H COSY
HMBC

Hình 3.31. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 28

H

OH

OH

OCH3

H

OH OH

H

H

HO
H

H

H
O

H

OH
O

H

H

OCH3

Hình 3.32. Tương quan NOESY

của hợp chất NEEM 28

Phổ HR-ESI-MS xác định hợp chất NEEM 28 có công thức phân tử
C28H41O11 từ mũi ion giả phân tử ở m/z 553,2699 [M+H]+. Phổ 1H- và

13

C-

NMR (bảng 3.13) của hợp chất NEEM 28 cho thấy NEEM 28 cũng là một
15


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

limonoid mở vòng C tương tự như hợp chất NEEM 30, trong đó nhóm metyl
ester ở C-28 gắn trên C-4 trong NEEM 30 được thay thế bằng nhóm hydroxyl
tự do. Hợp chất NEEM 28 được xác định là 20,22-dihydroxy-21,23dimetoxynimbandiol. Hóa lập thể của hợp chất NEEM 28 được xác định
thông qua phổ NOESY (hình 3.32).
Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 30 và NEEM 28

3.1.16. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NEEM 34
25
Hợp chất NEEM 34 có dạng tinh thể hình kim, không màu. [α]D
+11,13 (c 0,4; MeOH). Nhiệt độ nóng chảy: 86,0 - 88,0 oC. Phổ HR-ESIMS xác định hợp chất NEEM 34 có công thức phân tử C26H33O7N từ mũi ion
16


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn
giả phân tử ở m/z 472,2367 [M+H]+. Các phổ 1H-, 13C-NMR (bảng 3.14) của

hợp chất NEEM 34 có nhiều điểm giống với phổ của hợp chất NEEM 14,
NEEM 35 đã được xác định cấu trúc ở trên, cho nên NEEM 34 cũng là một
limonoid mở vòng C với phần nhánh là vòng lactam và được gọi tên là
nimbadiolactam-23. Hóa lập thể của hợp chất NEEM 34 được xác định qua
phổ NOESY (hình 3.34).
H-H COSY

H

HMBC

N

O
O

MeOOC

H HC
3

MeOOC
CH3

CH3
CH3

H

H

O

H

O
H

OH

OH OH

Hình 3.33. Một số tương quan trong phổ
HMBC và COSY của hợp chất NEEM 34

HO
H

H

NH
O

H
O

H

H

Hình 3.34. Tương quan NOESY
của hợp chất NEEM 34

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất NEEM 34

3.2. NHẬN XÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM PHỔ NMR CỦA CÁC TRITERPEN
THUỘC AZADIRACHTA INDICA
Các hợp chất triterpenoid cô lập được từ cây neem tồn tại ở dạng khung
sườn cơ bản là khung tirucallan (apo-tirucallan) hoặc khung euphan (apoeuphan). Các triterpen bốn vòng 6-6-6-5 với khung sườn cơ bản là khung
17


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

tirucallan (apo-tirucallan) hoặc khung euphan (apo-euphan) thường có năm tín
hiệu proton ở dạng mũi đơn ứng với năm nhóm metyl đặc trưng ở khoảng
0,90-2,00 ppm, tương ứng với các tín hiệu carbon ở vùng trường cao từ 15,027,0 ppm. Ngoài ra, có một số điểm đặc trưng có thể giúp cho việc nhận diện
các loại hợp chất limonoid, cụ thể được trình bày trong phần kế tiếp.
3.2.1. Nhận diện limonoid mở vòng C và limonoid không mở vòng C

Hình 3.35. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất limonoid
không mở vòng C và hợp chất mở C.

3.2.2. Nhận diện đặc điểm đặc trƣng trên vòng A
3.2.2.1. Vòng A có nối đôi liên hợp dạng en-on

Hình 3.37. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng của hợp chất
có nối đôi liên hợp dạng en-on trong vòng A.

3.2.2.2. Vòng A không có nối đôi liên hợp dạng en-on

Nếu vòng A không có nối đôi liên hợp dạng en-on thì ở vị trí C-1 và C-3
sẽ gắn với nhóm thế -OR (R là các gốc: H-, acetyl-, tigloyl-, senecioyl-,
methacryloyl-, iso-valeroyl-, cinnamoyl- …) (hình 3.35, hình 3.36).
3.2.3. Nhận diện liên kết eter
Nếu hợp chất có liên kết eter giữa C-6 với C-28:Trên phổ 1H-NMR cho
thấy có mũi đôi AB đặc trưng của H2-28 ở vùng 3,26-4,10 ppm với hằng số
ghép J=7,5 Hz, tương ứng với tín hiệu carbon C-28 ở # 77,8-79,5 ppm (hình
3.38). đây là dấu hiệu đặc trưng để nhận diện liên kết eter giữa C-6 với C-28
18


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

vì trong vùng từ 75,0-80,0 ppm trên phổ 13C-NMR không có xuất hiện các tín
hiệu carbon metylen oxygen hóa nào khác. Các tín hiệu carbon metylen
oxygen hóa khác thường xuất hiện trong vùng từ 60,0-72,6 ppm.
Nếu có liên kết eter giữa C-7 với C-15: Hai tín hiệu carbon C-7 và C-15
là dấu hiệu đặc trưng để nhận diện liên kết eter giữa C-7 với C1-5 vì trong
vùng từ 85,0-89,0 ppm trên phổ 13C-NMR không có xuất hiện các tín hiệu
carbon carbinol khác. Các tín hiệu carbon carbinol khác thường xuất hiện
trong vùng từ 70,0-75,0 ppm. Đây cũng là dấu hiệu nhận diện limonoid mở
vòng C.

Hình 3.39a
Hình 3.39b
Hình 3.39c
Hình 3.39d
Hình 3.39. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng cho các hợp chất có
liên kết eter giữa C-6 với C-28 và C-7 với C-15

3.2.4. Nhận diện mạch nhánh trên C-17
3.2.4.1. Mạch nhánh trên C-17 là vòng furan
3.2.4.2. Mạch nhánh trên C-17 là vòng tetrahydrofuran
3.2.4.3. Mạch nhánh trên C-17 là vòng γ-hydroxybutenolid
Nếu mạch nhánh trên C-17 là vòng γ-hydroxybutenolid, sẽ có hai dạng
21-hydroxy-23-butenolid hoặc 23-hydroxy-21-butenolid:

Hình 3.42. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR đặc trưng cho các hợp chất
có nhánh vòng γ-hydroxybutenolid
Như vậy, trên phổ 1H-NMR, proton gắn trên carbon hemiacetal –O-CHOH có giá trị δH ở khoảng 6,0 ppm, tương ứng với carbon hemiacetal ở 96,019


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

97,0 ppm. Tín hiệu của carbon carbonyl (ở C-23 trong vòng 21-hydroxy-23butenolid hoặc ở C-21 trong vòng 23-hydroxy-21-butenolid) có giá trị δC
thường ở khoảng 171,0-171,7 ppm. Sự khác nhau của các tín hiệu proton
olefin H-22 và hai tín hiệu carbon olefin C-20 và C-22 (hình 3.42) trên vòng
γ-hydroxybutenolid trong hai trường hợp chính là dấu hiệu giúp phân biệt
vòng 21-hydroxy-23-butenolid và vòng 23-hydroxy-21-butenolid trên C-17.
3.3. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC
Các cao chiết gồm cao eter dầu hỏa, cao etyl acetat, cao butanol, cao
metanol và các hợp chất tinh khiết cô lập từ cao etyl acetat được đem thử
nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase trên ống nghiệm. Hoạt tính ức
chế enzym α-glucosidase được thực hiện theo phương pháp của SigmaAldrich96 cho các cao chiết và các hợp chất limonoid cô lập từ cao etyl acetat
của lá neem.
Nồng độ sàng lọc ban đầu cho các cao là 200 µg mL-1 và cho các chất
tinh khiết là 100 µM, sau đó, thử nghiệm IC50 cho các cao và các chất có hoạt
tính. Mỗi mẫu ban đầu được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µM
(đối với các chất tinh khiết) và 200, 100, 50, 25 µg mL -1 (đối với các cao). Thí
nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng kết quả trung

bình ± độ lệch chuẩn. Chứng dương dùng cho thử nghiệm là acarbose 360 µM
(bảng 3.16). Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao
chiết được trình bày trong bảng 3.17, của các hợp chất tinh khiết phân lập từ
cây neem được trình bày trong bảng 3.18.
50

acarbose
, kết quả được trình bày dưới dạng kết quả trung

bình ± độ lệch chuẩn. Giá trị IC50 của acarbose là 360 µM.
3.3.2. Kết quả thử nghiệm trên cao chiết và trên các hợp chất tinh khiết

20


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

:

50

(Ghi chú: Pđ: phân đoạn, sđ: sơ đồ)

Bảng 3.18.

c chất phân lập từ cao etyl acetat.

IC50

21

www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

Nhận xét kết quả thử nghiệm trên các cao: khi tiến hành thử nghiệm
trên các cao eter dầu hỏa, etyl acetat và cao butanol, kết quả cho thấy cao etyl
acetat và cao butanol có hoạt tính và được xác định giá trị IC50 lần lượt là
144,95 µg mL-1 và 196,57 µg mL-1. Ngoài ra, khi tiến hành thử nghiệm trên
hai phân đoạn A4 và A5 của cao etyl acetat, chúng tôi nhận thấy hai phân đoạn
này có khả năng ức chế enzym α-glucosidase mạnh hơn cao etyl acetat nhiều
lần. Từ các kết quả thử nghiệm khả năng ức chế enzym α-glucosidase trên các
cao, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử nghiệm trên các hợp chất tinh khiết cô lập
được từ cao etyl acetat.
Nhận xét kết quả thử nghiệm trên các hợp chất tinh khiết: Khi tiến
hành thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase trên các hợp chất tinh
khiết, kết quả cho thấy đa số các hợp chất limonoid có hoạt tính ức chế enzym
α-glucosidase, ngay cả ở nồng độ thấp, với các chỉ số IC50 (IC50 <100 µM)
thấp hơn giá trị tương ứng của chất đối chứng khá nhiều (IC50 360 µM).
Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Trên thế giới, cây neem A. indica là một loài cây được nghiên cứu sớm
và cho đến nay đã có rất nhiều ứng dụng từ loài cây này. Cây neem được di
thực vào Việt Nam và được trồng phổ biến ở tỉnh Ninh Thuận từ năm 1998.
Việc nghiên cứu thấu đáo về thành phần hóa học của cây neem trồng ở Việt
Nam sẽ giúp các nhà khoa học có cái nhìn rõ hơn về loài cây này.
Qua việc nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây neem thu hái ở Ninh
Thuận, chúng tôi đã tiến hành ly trích hoạt chất limonoid từ cao etyl acetat,
thu được 20 hợp chất triterpen tinh khiết, trong đó có một hợp chất là
protolimnoid, 15 hợp chất là tetranortriterpenoid và 4 hợp chất
pentanortriterpenoid. Trong các hợp chất cô lập được có 16 hợp chất mới, các

hợp chất này được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder. Cấu trúc của các hợp
chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm như 1H-NMR, 13C-

22


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

NMR, DEPT-NMR, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, LC-MS và HR-ESIMS. Các hợp chất triterpen cô lập từ lá neem được sắp xếp theo từng nhóm:
Protolimnoid

Tetranortriterpenoid: các hợp chất tetranortriterpenoid hay còn gọi là
limonoid gồm hai nhóm chính là limonoid không mở vòng C, limonoid mở
vòng C. Trong đó, các limonoid không mở vòng C có mạch nhánh là vòng
tetrahydrofuran, vòng lacton, còn limonoid mở vòng C có mạch nhánh là
vòng γ-hydroxybutenolid, cụ thể gồm:
- Limonoid không mở vòng C

23


www.DaiHocThuDauMot.edu.vn

- Limonoid mở vòng C

Pentanortriterpenoid: các hợp chất pentanortriterpenoid có nhánh là vòng γhydroxybutenolid, tetrahydroxytetrahydrofuran và vòng lactam. Cụ thể gồm:

Việc sử dụng các phổ 1D-NMR, 2D-NMR và các phổ LC-MS, HRESI-MS để giải đoán cấu trúc các triterpen trong cây neem đã giúp chúng tôi
đúc kết một số điểm đặc trưng về phổ 1D-NMR, 2D-NMR của những hợp
chất triterpen mà chúng tôi đã trình bày trong mục 3.2.

Sự thử nghiệm khả năng ức chế enzym α-glucosidase trên các hợp chất
tinh khiết cô lập từ cao etyl acetat cho thấy có 16 hợp chất có khả năng ức chế
enzym α-glucosidase in vitro. Giá trị IC50 của chúng cũng đã được xác định.
Kết quả này có thể phần nào giải thích được vì sao lá cây neem A. indica đã
được sử dụng như một bài thuốc để kiểm soát sự quá tăng đường huyết sau
bữa ăn và sử dụng độc lập điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2 hoặc sử dụng kết
hợp trong điều trị bệnh đái tháo đường.13,77,79
4.2. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
- Tiếp tục khảo sát cao butanol của lá neem.
- Tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế việc tăng đường huyết sau bữa ăn
trên chuột của cao etyl acetat và trên các hợp chất tinh khiết đã cô lập được.
- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học trên các hợp chất tinh khiết như hoạt
tính hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt tính kháng ung thư…
24