Nghiên cứu thành phần loài cua ghẹ sống tầng đáy ở khánh hòa và phú yên dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN SINH HỌC
-----------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI CUA GHẸ SỐNG
TẦNG ĐÁY Ở KHÁNH HÒA VÀ PHÚ YÊN DỰA TRÊN
ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

GVHD : TS. Đặng Thúy Bình
SVTH : Nguyễn Trúc Sơn
MSSV : 55131540

Khánh Hòa: 06/2017


i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp tại Trường Đại Học
Nha Trang, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ tận tình của các thầy cô, gia đình và
bạn bè. Nhân đây tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS. Đặng Thúy Bình, người đã
định hướng cũng như tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề
tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến thấy cô giáo thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và
Môi Trường – Trường Đại Học Nha Trang, những người đã truyền đạt kiến thức và kinh
nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập của những năm vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và các anh chị

trong Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử đã quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt
quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, tháng 06 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Trúc Sơn


ii

TÓM TẮT
Khánh Hòa và Phú Yên nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa chịu ảnh hưởng
của khí hậu đại dương, có đường bờ biển dài và là nơi có nhiều vũng vịnh, đầm phá và
nhiều đảo lớn nhỏ. Đồng thời, hai khu vực đa dạng hệ sinh thái như rạn san hô, rừng
ngập mặn, đầm phá, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loài sinh vật,
đặc biệt là các loài cua ghẹ sống tầng đáy. Tuy nhiên, hiện nay tình trạng khai thác thủy
hải sản một cách quá mức và thực trạng ô nhiễm môi trường cùng với biến đổi khí hậu
đã làm suy giảm đa dạng sinh học các loài sinh vật sống đáy nói chung và các loài cua
ghẹ nói riêng.
Nghiên cứu hiện tại dựa trên phương pháp phân loại về hình thái và di truyền để
phân loại một số loài cua ghẹ sống đáy phân bố ở hai khu vực Khánh Hòa và Phú Yên.
Nghiên cứu phân loại được 23 loài thuộc 16 giống và 12 họ, trong đó có 14 loài phân
loại cả hình thái và di truyền, 9 loài chỉ phân loại bằng hình thái. Trong số các họ mà
nghiên cứu ghi nhận được thì đa dạng nhất là họ Portunidae – 7 loài, tiếp đến là họ
Xanthidae – 3 loài. Họ Calappidae, Euryplacidae và Gonephacidae mỗi họ có 2 loài.
Các họ còn lại đều chỉ có 1 loài gồm Galenidae, Dorippidae, Grapsidae, Leucosiidae,
Macrophthalmidae, Carpiliidae và Gecarcinucidae.
Trình tự gen CO1 mtDNA được sử dụng kết hợp với một số trình tự trên Genbank
để xây dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp Nieghbor – Joining với giá trị

bootstrap (BT) 1000 lần. Cây phát sinh loài cho thấy sự phân tách di truyền của 7 họ cua
ghẹ được phân thành 2 nhóm chính: nhóm I (Xanthidae, Carpiliidae, Gecarcinucidae,
Portunuidae) và nhóm II (Calappidae, Macrophthalmidae và Grapsidae). Trong đó,
nhóm I phân thành 2 nhóm phụ gồm nhóm I.1 (Xanthidae, Carpiliidae, Gecarcinucidae)
và nhóm I.2 (Portunuidae). Nhóm II chia thành 2 nhóm gồm nhóm II.1 (Calappidae)
và nhóm II.2 (Macrophthalmidae và Grapsidae).


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................v
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... viii
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Tổng quan về vùng nghiên cứu .............................................................................3
1.1.1. Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Khánh Hòa ....................3
1.1.2. Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Phú Yên .........................5
1.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng các loài cua ghẹ ở trong nước và thế giới ............6
1.3. Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nghiên cứu đa dạng sinh học cua ghẹ ..........10
1.3.1. DNA ty thể và nghiên cứu di truyền .............................................................10
1.3.2. Ứng dụng kĩ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) trong nghiên cứu đa
dạng sinh học cua ghẹ .............................................................................................12
1.3.3. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh loài ở cua ghẹ .....................14
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................16
2.1. Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu ...................................................16
2.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................16
2.3. Phân loại dựa vào hình thái .................................................................................17

2.4. Nghiên cứu di truyền cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên ...................................18
2.4.1. Tách chiết DNA, khuếch đại DNA bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự........18
2.4.2. Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại ................21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................24
3.1. Phân loại về hình thái ..........................................................................................24
3.1.1. Thành phần các loài cua ghẹ thu được tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên ......24
3.1.2. Bản đồ phân bố các loài cua ghẹ trong nghiên cứu hiện tại .........................26


iv

3.1.3. Đặc điểm hình thái các loài cua ghẹ thu tại Khánh Hòa và Phú Yên ...........27
3.2. Nghiên cứu di truyền các loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên ......................49
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số ...............................................................................49
3.2.2. Khuếch đại, giải trình tự DNA các loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên.49
3.2.3. So sánh sự khác biệt trình tự giữa các loài cua ghẹ nghiên cứu ...................50
3.2.4. So sánh sự tương đồng trình tự với Genbank ...............................................52
3.2.5. Xây dựng cây phát sinh loài cua ghẹ tại Khánh Hòa và Phú Yên ................53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................58
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ tỉnh Khánh Hòa ...................................................................................4
Hình 1.2. Bản đồ tỉnh Phú Yên........................................................................................5
Hình 1.3. DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA và 13 vùng mã hóa
protein. Mũi tên màu vàng chỉ vùng gen CO1 mtDNA được sử dụng trong nghiên cứu

hiện tại ...........................................................................................................................10
Hình 2.1. Các chỉ số đo trong phân loại cua ghẹ ...........................................................17
Hình 2.2. Các chỉ tiêu đếm trong phân loại cua ghẹ .....................................................18
Hình 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR của cặp mồi LCO 1490/HCO 2198 .............20
Hình 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR của cặp mồi CF20/CR19..............................20
Hình 3.1. Bản đồ phân bố các loài cua ghẹ trong nghiên cứu hiện tại ..........................26
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái loài Charybdis natator ...................................................28
Hình 3.3. Đặc điểm hình thái loài Charybdis acutifrons...............................................29
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái loài Charybdis anisodon ................................................30
Hình 3.5. Đặc điểm hình thái loài Charybdis vadorum.................................................31
Hình 3.6 Đặc điểm hình thái loài Portunus gladiator ...................................................32
Hình 3.7. Đặc điểm hình thái loài Podophthalmus vigil ...............................................33
Hình 3.8. Đặc điểm hình thái loài Thalamita crenata ...................................................34
Hình 3.9. Đặc điểm hình thái loài Atergatis floridus ....................................................36
Hình 3.10. Đặc điểm hình thái loài Atergatis integerrimus ..........................................37
Hình 3.11. Đặc điểm hình thái loài Liagore rubromaculata .........................................38
Hình 3.12. Đặc điểm hình thái loài Calappa pustulosa ................................................39
Hình 3.13. Đặc điểm hình thái loài Calappa lophos .....................................................40
Hình 3.14. Đặc điểm hình thái loài Eucrate alcocki .....................................................41
Hình 3.15. Đặc điểm hình thái loài Eucrate crenata.....................................................42
Hình 3.16. Đặc điểm hình thái loài Carcinoplax longimanus .......................................43
Hình 3.17. Đặc điểm hình thái loài Carcinoplax purpurea...........................................44


vi

Hình 3.18. Kết quả điện di DNA tổng số của một số loài cua ghẹ ...............................49
Hình 3.19. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA của một số loài cua
ghẹ .................................................................................................................................49
Hình 3.20. Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor – Joining với độ lặp lại 1000

lần dựa trên gen CO1 mtDNA của các loài cua ghẹ thu tại tỉnh Khánh Hòa và Phú
Yên.................................................................................................................................54


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR .......................... 19
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................................... 19
Bảng 2.3. Trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cua ghẹ ........................................... 22
Bảng 3.1. Danh sách các loài cua ghẹ thu tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên .................. 24
Bảng 3.2. Chỉ tiêu hình thái các loài cua ghẹ ở tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên .............. 27
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của 7 loài cua ghẹ tại Khánh Hòa và Phú Yên thuộc 7
giống và 7 họ .................................................................................................................46
Bảng 3.4. Sự khác biệt về trình tự CO1 mtDNA của 14 loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và
Phú Yên .........................................................................................................................51
Bảng 3.5. Kết quả độ tương đồng của các trình tự CO1 mtDNA từ 14 loài cua ghẹ thu
ở tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên với dữ liệu từ Genbank.................................................52


viii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
bp

Base pairs

cm

Centimeter

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

CO1

Cytochrome c oxidase subunit 1

cvt

Cộng tác viên

BT

Bootstrap

µL

Microliter

DNA

Deoxyribonucleic acid

TĐTL

Thước đo tỷ lệ

mtDNA

Mitochondrial deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

ITS

Internal transcribed spacer

tRNA

Transfer ribonucleic acid

GB

Genbank

g

Gam

NCHT

Nghiên cứu hiện tại

PCR

Polymerase Chain Reaction

H3

Histone 3

GAPDH

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

PEPCK

Phosphoenolpyruvate carboxykinase

rbcL

Ribulose bisphosphate carboxylase large chain

matK

MaturaseK


1

MỞ ĐẦU
Đa dạng sinh học đang tồn tại hiện nay trên thế giới là kết quả của một quá trình

lịch sử tiến hóa lâu dài với nhiều bước biến đổi, phát sinh, phát triển rồi tuyệt chủng
(Đặng Ngọc Thanh và Nguyễn Huy Yết, 2009). Do các tác nhân của tự nhiên và gần
đây là sự tác động của con người làm cho đa dạng sinh học đang bị suy thoái với tốc độ
rất nhanh, các nguồn gen hoang dã cũng đang trên đà suy thoái nhanh và bị suy giảm
mạnh (Nguyễn Minh Quang và ctv, 2011; Schmidt và ctv, 2012).
Việt Nam có tổng diện tích vùng biển rộng hơn 1 triệu km2 và đường bờ biển dài
3.260 km2, trải dài trên 15 vĩ độ và nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á. Vị
trí địa lý cũng như những đặc trưng về khí hậu, lịch sử phát triển địa chất, thủy lý hóa
học của nước biển đã tạo nơi đây một môi trường sống riêng, liên quan chặt chẽ với đời
sống sinh vật cũng như tính đa dạng sinh học trong vùng biển này (Lê Đức Tố và ctv,
2009). Vì vậy Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học biển phong
phú.
Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện có khoảng trên 11 nghìn loài sinh vật sống
trong vùng biển Việt Nam, trong đó có 692 loài thực vật phù du, 657 loài động vật phù,
khoảng 2.109 loài cá với trên 100 loài cá kinh tế, 653 loài rong biển, 14 loài cỏ biển, 21
loài bò sát biển, 21 loài thú biển (Nguyễn Văn Chung và ctv, 2009). Các loài động vật
đáy đã biết khoảng 6.000 loài, trong đó động vật thân mềm – 2.500 loài, giun nhiều tơ
– 700 loài, ruột khoang – 650 loài, da gai – 350 loài, hải miên – 150 loài, giáp xác –
1500 loài với nhiều loài cua ghẹ có giá trị kinh tế (Lê Đức Tố và ctv, 2009). Ngoài ra,
với số lượng loài đã biết, các nhà khoa học trong và ngoài nước đánh giá biển Việt Nam
là một trong những trung tâm đa dạng sinh vật biển thế giới.
Khánh Hòa và Phú Yên là hai tỉnh có vị trí địa lý nằm kề nhau có khí hậu nhiệt đới
gió mùa chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương, có hệ sinh thái biển rất đa dạng, phong
phú bậc nhất Việt Nam với nhiều loài sinh vật có giá trị kinh tế. Trong đó, nhiều loài
cua, ghẹ ở khu vực Khánh Hòa và Phú Yên là một trong những nguồn lợi hải sản có
mức độ phong phú, đa dạng về thành phần loài, có giá trị về thực phẩm và kinh tế cao.
Tuy nhiên, các nghiên cứu đa dạng về giáp xác nói chung và các loài cua ghẹ còn mang
tính chất riêng lẻ, chưa thống nhất. Chủ yếu là các nghiên cứu của Võ Sĩ Tuấn và ctv
(2005); Nguyễn Văn Long và ctv (2014); Phan Thị Kim Hồng và ctv (2014); Hoàng
Đình Trung và Nguyễn Hữu Nhật (2016). Những nghiên cứu này chỉ mang tính chất

2

khảo sát và đánh giá về mặt hình thái, chưa đi sâu vào các nghiên cứu phân loại dựa trên
lĩnh vực sinh học phân tử.
Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động đến động vật,
thực vật của các quốc gia là khác nhau, sự xác định loài sử dụng phương pháp nhanh là
cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo vệ các loài đặc
hữu quý hiếm và nguy cấp. Hiện nay, phương pháp sử dụng mã vạch DNA là một trong
những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách
sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là DNA – barcoding (Hebert và ctv, 2003;
Rougerie và ctv, 2009).
Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần loài cua ghẹ sống
tầng đáy ở Khánh Hòa và Phú Yên dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền” được
thực hiện nhằm bước đầu xây dựng mối quan hệ loài, cung cấp dẫn liệu về hình thái,
phân bố và di truyền của một số loài cua ghẹ ở hai khu vực này, làm cơ sở cho các
nghiên cứu đánh giá đa dạng sinh học bằng việc xây dựng mã vạch DNA.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những thông tin khoa học liên quan đến mối quan hệ
phát sinh loài và đa dạng di truyền của các loài cua ghẹ ở Khánh Hòa và Phú Yên.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
Các loài cua ghẹ sống đáy thu được ở tỉnh Phú Yên và khu vực tỉnh Khánh Hòa dựa
trên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên. Sau đó, mẫu được phân loại bằng hình thái ngay
khi còn tươi, các nghiên cứu di truyền được thực hiện tại phòng thí nghiệm trường Đại
học Nha Trang.
Mục tiêu của đề tài:
Phân loại các loài cua ghẹ thu được tại khu vực Khánh Hòa và Phú Yên dựa trên
đặc điểm hình thái và di truyền. Xây dựng cây phát sinh loài của một số loài cua ghẹ
sống tầng đáy ở Khánh Hòa và Phú Yên.

Để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu này, đề tài tiến hành các nội dung sau:
1. Thu mẫu các loài cua ghẹ sống tầng đáy tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên.
2. Phân loại, định danh các loài cua ghẹ thu được dựa vào đặc điểm hình thái và
di truyền.
3. Khảo sát mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cua ghẹ sống tầng đáy.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vùng nghiên cứu
1.1.1. Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Khánh Hòa
 Vị trí địa lý
Khánh Hòa nằm ở vùng duyên hải Nam Trung Bộ của Việt Nam, phía Bắc giáp tỉnh
Phú Yên, phía Nam giáp tỉnh Ninh Thuận, phía Tây giáp tỉnh Đăk Lăk và phía Tây Nam
giáp tỉnh Lâm Đồng, phía đông giáp Biển Đông.
Khánh Hòa có diện tích tự nhiên là 5.197 km2, phần đất liền của tỉnh nằm kéo dài
từ tọa độ địa lý 12052’15” đến 11042’52” vĩ độ Bắc và từ 108040’33” đến 109027’55”
kinh độ Đông, có đường bờ biển dài khoảng 385 km với nhiều kênh lạch, đầm, vịnh,
cùng khoảng 200 hòn đảo lớn nhỏ ven bờ và các đảo san hô của vùng đảo Trường Sa
(Giang Nam và Nguyễn Văn Khánh, 2003). Các vũng vịnh và đầm phá phân bố liên tục
và dọc theo đường bờ biển của Khánh Hòa: Vũng Rô – Đại Lãnh, vũng Bến Gỏi – vịnh
Vân Phong, vịnh Bình Cang, đầm Nha Phu và đầm Thủy Triều - vịnh Cam Ranh.
 Khí hậu
Vị trí địa lý qui định đặc điểm tự nhiên của tỉnh vừa chịu sự chi phối của khí hậu
nhiệt đới gió mùa, vừa mang tính chất của khí hậu đại dương nên tương đối ôn hòa, nhiệt
độ trung bình hàng năm là 26,7⁰ C. Trong năm có 2 mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô.
Mùa mưa ngắn, từ khoảng giữa tháng 9 đến giữa tháng 12 dương lịch, nhất là vào tháng
10 và tháng 11, lượng mưa thường chiếm trên 50% lương mưa trong năm. Những tháng
còn lại từ tháng 1 đến tháng 8 là mùa khô, trung bình hằng năm có tới 2.600 giờ nắng

và ít chịu ảnh hưởng của bão (Giang Nam và Nguyễn Văn Khánh, 2003).


4

Hình 1.1. Bản đồ tỉnh Khánh Hòa (Nguồn: – Cập nhật
ngày 10/05/2017)
 Tài nguyên thiên nhiên
So với các tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ, tỉnh Khánh Hòa được thiên nhiên ưu đãi
với khí hậu thuận lợi, địa hình và chất đáy bờ biển khá đa dạng với nhiều đầm, vịnh và
các đảo tạo những điều kiện thuận lợi cho sự hình thành các hệ sinh thái như hệ sinh
thái rạn san hô, thảm cỏ biển, rừng ngập mặn, cửa sông, đầm vịnh.
Khánh Hòa được xếp vào các vùng ven biển có độ đa dạng sinh học cao nhất ở Việt
Nam bao gồm vịnh Nha Trang với 12 hòn đảo lớn nhỏ và mặt nước xung quanh, vịnh
Vân Phong, vịnh Cam Ranh và nhiều đảo lớn nhỏ khác. Theo điều tra ban đầu, ở khu
vực vịnh Nha Trang có 350 loài san hô, 222 loài cá rạn, 69 loài động vật giáp xác, 106
loài động vật thân mềm, 252 loài rong biển, 7 loài cỏ biển và 27 loài da gai (Võ Sĩ Tuấn
và ctv, 2005). Còn ở khu vực vịnh Vân Phong đã ghi nhận được 294 loài san hô tạo rạn,
267 loài cá, 68 loài giáp xác, 169 loài thân mềm, 37 loài da gai và 162 loài giun nhiều
tơ, trong đó cá và nhiều loài giáp xác có giá trị và nguồn lợi thủy sản cao (Nguyễn Văn
Long và ctv, 2014).
Trong những năm gần đây sức ép của sự tăng nhanh dân số, phát triển kinh tế xã
hội, quá trình khai thác như đánh bắt quá mức, đánh bắt bằng thuốc nổ và sử dụng tài
nguyên môi trường chưa hợp lý ở Khánh Hòa đã đe dọa thật sự đến các tài nguyên và
môi trường biển (Võ Sĩ Tuấn và ctv, 2005). Các hệ sinh thái vùng ven bờ đang đứng


5

trước các nguy cơ bị hủy hoại, suy thoái hoặc mất cân cân bằng sinh thái, giảm sút nguồn

lợi và tính đa dạng sinh học, cũng như giảm đi số lượng loài cua ghẹ, gây nên những
ảnh hưởng xấu cho mọi chiến lược bảo vệ, khai thác bền vững và phát triển kinh tế.
1.1.2. Vị trí địa lý, khí hậu và tài nguyên thiên nhiên của Phú Yên
 Vị trí địa lý
Phú Yên là tỉnh ven biển duyên hải Nam Trung Bộ có diện tích đất tự nhiên
5.060km2, có tọa độ địa lý từ 12039’10” đến 13045’20” vĩ độ Bắc và 108039’45” đến
109029’20” kinh độ Đông. Phía Bắc giáp tỉnh Bình Định, phía Nam giáp tỉnh Khánh
Hoà, phía Tây giáp tỉnh Đắk Lắk và Gia Lai, phía Đông giáp biển Đông và tổng diện
tích tự nhiên là 5.045 km2.
Phú Yên với chiều dài bờ biển 198 km chạy từ Cù Mông đến Vũng Rô, có nhiều
dãy núi ăn nhô ra biển hình thành các đầm, vịnh. Toàn tỉnh có nhiều đầm, vịnh như đầm
Ô Loan có diện tích 1.570 ha, đầm Cù Mông có diện tích 15.000 ha, đầm Vũng Rô, vịnh
Xuân Đài (Nguyễn Chí Bền và ctv, 2003).

Hình 1.2. Bản đồ tỉnh Phú Yên (Nguồn: – Cập nhật ngày
10/05/2017)
 Khí hậu
Phú Yên nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, đồng thời chịu ảnh hưởng của
khí hậu đại dương, độ ẩm từ 70-80%, lượng mưa đo được trong khoảng 1.200-2.600
mm, nhiệt độ trung bình hằng năm từ 23-270C.


6

Tỉnh Phú Yên chỉ có 2 mùa là mùa khô kéo dài từ tháng 1 đến tháng 8, còn mùa
mưa rất ngắn kéo dài từ tháng 9 đến tháng 12, riêng 4 tháng lượng mưa chiếm 70% 80% lượng mưa cả năm. Hệ thống sông ngòi Phú Yên hàng năm đổ ra biển khoảng 12,13
tỷ m3 nước, mang theo lượng phù sa, bùn cát gần 2,3 triệu tấn và các chất hoà tan khoảng
0,55 triệu tấn, tạo nên vùng sinh thái nước lợ giàu dinh dưỡng cho các loài thuỷ sinh vật
phát triển phong phú ở các vùng nước cửa sông, lạch ven biển (Nguyễn Chí Bền và ctv,
2003).

 Tài nguyên thiên nhiên
Phú Yên có điều kiện tự nhiên khí hậu thuận lợi, vùng biển có nguồn lợi thủy sản
vô cùng đa dạng và phong phú bao gồm: Cá, các loài giáp xác, thân mềm, rong biển,
trong đó chủ yếu là nguồn lợi cá biển và các loài tôm, cua ghẹ có giá trị về thực phẩm
và kinh tế. Phú Yên có điều kiện tự nhiên và tài nguyên vùng ven bờ, hệ thực vật, động
vật nơi đây đa dạng, phong phú bao gồm 263 loài tảo phù du, 9 loài cỏ biển, 35 loài thực
vật ngập mặn, 90 loài động vật phù du, 14 loài động vật thân mềm, 224 loài cá (Nguyễn
Minh Hạnh, 2016).
Những năm gần đây, vùng ven biển của Phú Yên đang chịu nhiều tác động từ các
hoạt động phát triển kinh tế - xã hội, vùng biển này không chỉ là “vùng trọng điểm” của
nghề khai thác bằng các ngư cụ mang tính hủy diệt, mà còn là nơi đang bị ô nhiễm do
hậu quả của nghề nuôi tôm và người dân sống xung quanh đã biến thành nơi chứa chất
thải, đồng thời chịu ảnh hưởng của thiên tai, bão lũ (Nguyễn Thị Hoài Trang, 2011;
Nguyễn Minh Hạnh, 2016). Từ đó làm suy thoái sinh cảnh và tài nguyên thủy sinh, gây
ô nhiễm môi trường, đe dọa đến sự mất đa dạng sinh học, làm suy giảm nguồn lợi thủy
sản cũng như số lượng các loài cua ghẹ.
1.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng các loài cua ghẹ ở trong nước và thế giới
 Trên thế giới
Cho đến nay đã có một số công trình được công bố về đa dạng các loài cua ghẹ
thuộc lớp giáp xác trên thế giới dựa trên hình thái và di truyền.
Carpenter và Niem (1998) bằng phương pháp chủ yếu là mô tả hình thái dựa vào
các đặc điểm bên ngoài đã xác định được 668 loài giáp xác ở Tây Thái Bình Dương,
trong đó có 16 họ cua ghẹ.


7

Guinot và ctv (2008) đưa ra danh sách các loài cua thuộc phân thứ bộ Brachyuran
trên thế giới bao gồm 6.793 loài và phân loài, 1.271 giống và phân giống, 93 họ và 38
phân họ.

Cumberlidge và ctv (2011) với nghiên cứu sự đa dạng các loài cua ở Trung Quốc
và ghi nhận được sự đa dạng nhất của hai họ: Potamidae (505 loài thuộc 95 giống) và
Gecarcinucidae (344 loài thuộc 59 giống) phân bố chủ yếu ở phía tây nam, trung nam
và phía đông.
Karasawa và ctv (2011) nghiên cứu sự phát sinh loài của phân thứ bộ Brachyura
thuộc phân bộ Pleocyemata (bộ Decapoda) bao gồm 30 loài đã tuyệt chủng và hiện hữu
dựa trên 74 đặc điểm được miêu tả bởi Guinot (1977). Nhóm tác giả ghi nhận 4 đơn vị
phân loại mới gồm Homoloida, Torynommoida, Etyoida, Dakoticancroida và 2 họ mới
(Basinotopidae và Xandarocarcinidae).
Tsang và ctv (2014) dựa trên 6 gen nhân mã hóa protein gồm AK, Enolase, GAPDH,
H3, PEPCK, NaK và 2 gen ti thể là 12S rRNA và 16S rRNA xây dựng cây phát sinh
loài của phân thứ bộ Brachyura thuộc bộ Decapoda với tổng số 142 loài thuộc 58 họ.
Devi và ctv (2015) nghiên cứu sự đa dạng các loài cua ở Cochin, Kerala phía tây
nam Ấn Độ, tổng cộng có 24 loài cua thuộc 16 giống và 8 họ đã được ghi nhận. Trong
đó, họ có số loài nhiều nhất gồm Portunidae – 9 loài, Grapsidae – 7 loài và nhiều họ
khác có số lượng loài ít như Ocypodidae, Xanthidae, Pinnotheridae, Leucosiidae,
Hymenosomatidae.
Abbas và ctv (2016) dựa trên hai phương pháp phân loại là hình thái bên ngoài và
di truyền để xác định 5 loài cua được thu thập ở thành phố Suez và vùng Abo Zenima ở
vịnh Suez phía Bắc biển Đỏ của Ai Cập. Bằng phương pháp phân loại hình thái, nhóm
tác giả đã mô tả dựa trên màu sắc, hình dạng răng hàm, mai, càng, chân bò, đồng thời
gen CO1 mtDNA đã được sử dụng cho nghiên cứu di truyền. Kết quả xác định được 5
loài cua gồm: Charybdis natator (Herbst, 1794), Charybdis hellerii (A. Milne-Edwards,
1867), Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758), Liocarcinus corrugatus (Pennant, 1777)
và Atergatis roseus (Ruppell, 1830).
 Trong nước
Cua ghẹ là một nhóm động vật giáp xác thuộc bộ mười chân có số loài và số lượng
cá thể nhiều trong các mẫu kéo lưới động vật đáy, đây là nét đặc trưng của hệ sinh vật
đáy của vùng biển nhiệt đới. Khu vực biển Việt Nam, giáp xác có khoảng 1500 loài

8

thuộc 70 họ, trong đó một số họ có số loài nhiều là Xantiidae, Gonoplacidae, Leucosidae,
Portunidae, Ocypodidae (thuộc nhóm cua), Penaeidae, Alpheidae, Paguridae,
Palaemonidae (thuộc nhóm tôm) (Đặng Ngọc Thanh và Nguyễn Huy Yết, 2009), còn
khu hệ nước ngọt có số lượng loài cua đã biết là 45 loài (Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh
Hải, 2012), bên cạnh đó mỗi vùng Bắc Trung Nam lại có những nhóm loài đặc trưng
riêng.
 Khu vực miền Bắc
Đỗ Văn Nhượng và Hoàng Ngọc Khắc (2004) cung cấp dẫn liệu về các loài cua ở
rừng ngập mặn vùng cửa sông Hồng. Nhóm tác giả xác định được 62 loài thuộc 7 họ và
27 giống. Trong số đó, họ có nhiều loài nhất gồm Ocypodidae – 27 loài, Grapsidae – 20
loài.
Đỗ Văn Tứ và ctv (2012) nghiên cứu thành phần loài động vật đáy cỡ lớn ở vườn
quốc gia Xuân Thủy tỉnh Nam Định đã thống kê được 350 loài thuộc 6 ngành (Annelida,
Arthropoda, Brachiopoda, Cnidaria, Mollusca, Sipuncula), 11 lớp, 38 bộ, 106 họ, 206
giống. Trong đó, lớp giáp xác có nhiều loài cua ghẹ có giá trị kinh tế thuộc họ Portunidae
như cua bùn (Scylla serrata), ghẹ hoa (Portunus pelagicus).
Nghiên cứu đa dạng động vật đáy cỡ lớn ở đảo Bạch Long Vĩ – Hải Phòng của Bùi
Đức Quang và ctv (2013) ghi nhận số lượng nhiều loài cua thuộc họ Xanthidae (8 loài),
điển hình nhất là cua đá (Atergatic spp.) và nhiều loài có giá trị kinh tế như Charybdis
feriata (Linnaeus, 1785), Portunus sanguinolentus (Herbst, 1783), Thalamita sima
(Edwards, 1834).
 Khu vực miền Trung
Trương Văn Đàn và ctv (2010) nghiên cứu khu hệ động vật đáy khu vực Hải Vân Sơn Trà, từ đó xác định các loài cua ghẹ tại khu vực chỉ tập trung ở một số họ như
Xanthidae – 14 giống, 17 loài; sau đó đến các họ Portunidae – 5 giống, 12 loài;
Grapsidae – 5 giống, 7 loài; Ocypodidae – 4 giống, 6 loài; các họ còn lại có số lượng
giống, loài khá ít.
Nghiên cứu của Tôn Thất Chất và Trần Thị Minh Thư (2011) xác định được 13 loài

thuộc 5 giống của họ cua bơi (Portunidae) thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế, trong đó giống
chiếm số loài lớn nhất là Charybdis và Portunus với 4 loài (chiếm 30,76%), tiếp đến là
Scylla (chiếm 23,08%) có 3 loài, Podophthamus và Thalamita 1 loài (chiếm 7,7%).


9

Nghiên cứu của Nguyễn Đắc Tạo và Hoàng Đình Trung (2011) ghi nhận được lớp
giáp xác gồm 6 họ, 10 giống và 13 loài ở khu vực đảo Cồn Cỏ tỉnh Quảng Trị, trong đó
có 11 loài cua thuộc 5 họ gồm Grapsidae, Ocypodidae, Leucossidae, Mictyridae,
Portunidae.
Tại khu vực quần đảo Hòn Mê – Thanh Hóa, Lưu Thế Anh và ctv (2011) xác định
được 37 loài giáp xác, đáng chú ý trong thành phần loài ghi nhận được 7 loài thuộc họ
ghẹ xanh (Portunidae) đây là một nhóm có giá trị kinh tế cao. Đồng thời, ghi nhận được
loài Charybdis feriatus (Linnaeus, 1758) thuộc loài động vật đáy quí hiếm.
Nguyễn Tống Cường và ctv (2015) nghiên cứu thành phần loài tôm và cua nước
ngọt ở vườn quốc gia Phong Nha – Kẻ Bàng tỉnh Quảng Bình, thành phần loài của nhóm
cua có 5 loài thuộc 4 giống và 2 họ (Parathelphusidae, Potamidae), trong đó ghi nhận
thêm 1 loài cua nước ngọt Somanniathelphusa pax cho khu vực, ngoài ra có 1 mẫu cua
thuộc giống Villopotamon có thể là loài mới cho khoa học.
Ở khu vực tỉnh Khánh Hòa, Phan Thị Kim Hồng và ctv (2014) nghiên cứu động vật
đáy vịnh Vân Phong xác định được nhiều loài cua ghẹ thuộc họ Xanthidae – 42 loài,
Pilumnidae – 12 loài, Portunidae – 8 loài, Goneplacidae – 5 loài. Thuộc khu vực tỉnh
Phú Yên, có nghiên cứu của Hoàng Đình Trung và Nguyễn Hữu Nhật (2016) điều tra
về thành phần loài động vật đáy có giá trị kinh tế tại đầm Ô Loan xác định được 6 loài,
4 giống và 2 họ thuộc lớp giáp xác. Trong đó, ghi nhận được 2 loài cua ghẹ thuộc họ
Portunidae là Scylla serrata (Forskal, 1775) và Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758).
 Khu vực biển Nam Bộ và đồng bằng sông Cửu Long
Nghiên cứu của Đỗ Văn Nhượng (2003) dẫn liệu bước đầu về cua (Brachyura) ở
rừng ngập mặn Cần Giờ xác định được 49 loài cua, họ có số loài nhiều nhất là

Ocypodidae – 25 loài, Grapsidae – 13 loài, các họ khác có số lượng loài ít hơn:
Portunidae – 5 loài, Potamidae – 2 loài, Leucosiidae – 2 loài, Majida – 1 loài và
Mictyridae – 1 loài.
Lê Văn Thọ và Phan Doãn Đăng (2011) tiến hành khảo sát động vật đáy không
xương sống cỡ lớn trên sông Vàm Cỏ Đông tỉnh Long An ghi nhận được 41 loài, 6 lớp
và 3 ngành, trong đó có hai loài cua thuộc họ Potamidae là Potamon sp. và Deacapoda
larva.
Nghiên cứu về cua nước ngọt ở các đảo lớn Việt Nam của Đỗ Văn Tứ (2015) thực
hiện trên 5 đảo gồm Cát Bà, Cù Lao Chàm, Côn Đảo, Hòn Khoai và Phú Quốc, ghi nhận


10

được 8 loài cua nước ngọt thuộc 8 giống, 2 họ (Gecarcinucidae – 3 loài và Potamidae –
5 loài).
1.3. Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nghiên cứu đa dạng sinh học cua ghẹ
1.3.1. DNA ty thể và nghiên cứu di truyền
Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể
(mitochondrial DNA-mtDNA) chiếm tỉ lệ từ 1 - 5% DNA của tế bào. DNA ty thể là một
hệ gen độc lập, thường là mạch vòng, được định vị trong ty thể. Bộ gen ty thể có cấu tạo
xoắn kép, trần, mạch vòng với 2 chức năng chủ yếu: mã hóa nhiều thành phần của ty thể
và mã hóa cho một số protein tham gia vào chuỗi chuyền điện tử, có khoảng một vài
trăm ty thể trên một tế bào (Chial và Craig, 2008).

Hình 1.3. DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA và 13 vùng mã
hóa protein. Mũi tên màu vàng chỉ vùng gen CO1 mtDNA được sử dụng trong
nghiên cứu hiện tại (Nguồn: - Cập nhật
tháng 05/2017)
Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến
hàng triệu ty thể nên số lượng DNA ty thể là rất lớn (Taylor và Turnbull, 2005). DNA

ty thể có các ưu điểm hơn DNA trong nhân như sau:
- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân (Chial và Craig, 2008).
- Số lượng bản sao lớn (Taylor và Turnbull, 2005).
- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp (Hubert và ctv, 2004).
- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài (Hubert và ctv, 2004).


11

DNA gen nhân có kích thước lớn, tần số đột biến thấp, chúng lại được di truyền từ
cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ. Trong khi đó, DNA ty thể có tốc độ tiến hóa
nhanh hơn 5 - 10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu
quả, do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong
cùng một loài. Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng
một tế bào và giữa các tế bào khác nhau.
DNA ty thể có đặc điểm không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa
là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng
mẹ. Thêm vào đó mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn và khá đồng nhất trong mỗi
tế bào, tần số đột biến cao (Chial và Craig, 2008). Các đặc điểm trên cùng với việc DNA
ty thể bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng (Chin và
ctv, 2005), nên sử dụng DNA ty thể như là một công cụ phân tử trong việc phân tích các
mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi.
Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể trong nghiên cứu di truyền cũng có một số giới
hạn. Đôi khi, trong những nghiên cứu phân loại, cây phát sinh loài dựa trên gen ti thể có
thể không phản ánh đúng hệ thống phân loại của loài bởi vì sự phân nhánh của các giống
loài có thể trước hoặc sau khi phân chia quần thể, thậm chí là loài mới. Kích thước DNA
ty thể nhỏ nên đột biến có thể dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mối quan hệ phát
sinh loài hay lịch sử tiến hóa. Hơn nữa, DNA ty thể di truyền theo dòng mẹ nên sự đa
dạng có thể lớn và không nhất thiết phản ánh đúng sự đa dạng tại các vị trí khác của gen
ở mức độ loài. Vì vậy, người ta đề nghị nên sử dụng nhiều đoạn gen để có kết quả với

độ chính xác cao (Avise, 2009; Kress và ctv, 2008; Chase và ctv, 2005).
Các chỉ thị của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa CO1, 16S rRNA,
12S rRNA, tRNA. Bên cạnh đó, trình tự của các gen mã hóa thuộc DNA ribosome (28S,
5.8S và 18S) cũng như các gen không mã hóa (khoảng chèn giữa gen ITS1 và ITS2)
cũng được sử dụng rộng rãi trong phân loại và định danh loài (Cunningham và ctv, 1996;
Berg và ctv, 2000). Trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen
cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của DNA ty thể có thể định danh được đến loài
ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật (Herbert và ctv, 2003) và thường
được sử dụng như một mã vạch DNA (DNA barcoding) để nghiên cứu sự đa dạng sinh
học của giới sinh vật (Herbert và ctv, 2003; 2004).


12

1.3.2. Ứng dụng kĩ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) trong nghiên cứu đa
dạng sinh học cua ghẹ
Khái niệm mã vạch DNA được biết đến rộng rãi từ những năm đầu thế kỷ 21, khi
các nhà khoa học Canada trình bày nghiên cứu sử dụng một đoạn gene dài 648
nucleotid từ bộ gene ty thể (vùng gen CO1 – Cytochrome Oxidase subunit 1) để định
loại 260 loài chim và đề xuất dùng nó như một "mã vạch" để lưu trữ, chuẩn hóa thông
tin các loài động vật (Hebert và ctv, 2004). Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử
dụng một vùng DNA có kích thước từ 400-800bp như là một tiêu chuẩn để nhận dạng
các loài một cách nhanh chóng, chính xác và phương pháp này được gọi là mã vạch
DNA (DNA barcoding).
Mã vạch DNA là phương pháp dựa trên việc so sánh các trình tự DNA ngắn, chuẩn
của các loài sinh vật chưa biết với ngân hàng trình tự DNA của Genbank, từ đó xác định
tên loài của mẫu nghiên cứu (Dương Văn Tăng và ctv, 2014; Trần Thị Việt Thanh và
ctv, 2015).
Sự khác biệt về trình tự DNA ty thể của đa số các loài động vật là rất rõ ràng, do đó
giải trình tự DNA ngắn được sử dụng làm mã vạch cho các loài động vật hứa hẹn sẽ

cung cấp một công cụ giám định loài chính xác, hiệu quả và định loại được với cả các
mẫu không nguyên vẹn, mẫu con non khó định loại bằng hình thái (Gill và Slikas, 1992;
Avise, 1995).
 Đặc điểm mã vạch DNA (DNA barcoding)
Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcoding là phổ biến và đặc hiệu trong các
biến dị và dễ dàng sử dụng. Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một
barcoding nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng
ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể (Kress và ctv, 2015).
Do đó, DNA barcoding lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp
được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR.
Hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:
- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ khác biệt để phân biệt giữa các loài nhưng
cũng phải không khác nhau quá lớn giữa các cá thể trong cùng loài.
- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng
DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.


13

- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng
định danh loài vào các nhóm phân loại (giống, họ,…).
- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có
độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA
- Thứ năm, đoạn DNA nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản
DNA không bị sai lệch (Taberlet và ctv, 2007).
 Ứng dụng mã vạch DNA
Hiện nay, nhiều nghiên cứu về định danh loài bằng mã vạch DNA đã thành công
trên nhiều đối tượng khác nhau như chim, cá, ốc, nhện và một số loài côn trùng thuộc
bộ cánh cứng ( />Các loài sinh vật đã được nghiên cứu thành công bằng cách sử dụng mã vạch DNA
chẳng hạn như Hebert và ctv (2004) dựa trên mã vạch DNA sử dụng gen CO1 để định

loại được 260 loài chim ở Bắc Mỹ.
Ward và ctv (2009) sử dụng vùng gen CO1 đã định loại được 5000 loài cá được thu
nhiều nơi trên thế giới, tiếp tục công trình của Ward thì đến năm 2011 Becker và ctv
đánh dấu DNA mã vạch của 7800 loài cá.
Kress và ctv (2009) dựa vào phương pháp mã vạch DNA sử dụng hệ gen lục lạp
gồm ba vùng gen rbcL, matK và trnH – PsbA xác định được 296 loài thực vật ở khu
rừng trên đảo Barro Colorado – Panama.
Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại cửa khẩu nhằm hỗ trợ xác định nguồn gốc
của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu để ngăn cản việc vận chuyển trái phép các loài
động, thực vật quý hiếm qua biên giới và còn được ứng dụng trong thực phẩm như
Vartak và ctv (2014) xác định được có 11 sản phẩm từ 11 loài cua kém
chất lượng ghi nhãn không đúng cách ở các nhà hàng Ấn Độ.
Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcoding cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên
hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã được thành lập vào tháng
5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Mục tiêu ban đầu là xây dựng một
thư viện trực tuyến trình tự mã vạch cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm
tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào. Với sự hỗ trợ của CBOL, mã vạch DNA
ngày càng phát triển và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới.


14

1.3.3. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh loài ở cua ghẹ
Cho đến nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về sự phát sinh loài cua
ghẹ đã được thực hiện. Tuy nhiên, mối quan hệ phát sinh chủng loài của chúng vẫn chưa
được giải quyết một cách triệt để.
Daniels và ctv (2002) sử dụng trình tự của ba gen ti thể 12S rRNA, 16S rRNA và
CO1 mtDNA nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của giống cua Potamonautes ở Nam
Phi. Kết quả dựa vào vị trí trên cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ chặt chẽ của 14
loài cua thuộc giống Potamonautes.

Hultgren và Stachowicz (2008) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài cua thuộc
siêu họ Majoidea được thu thập ở vùng bờ biển phía tây, đông của Hoa Kì và bờ biển
phía đông Nhật Bản. Nghiên cứu sử dụng hai gen ti thể (16S rRNA và CO1 –
cytochrome C oxidase 1) và một gen nhân (28S rRNA), kết quả đã xác định được 37
loài cua và cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các họ Epialtidae,
Pisidae, Tychidae và Mithracidae.
Viswanathan và ctv (2010) nghiên cứu mối quan hệ của 4 loài cua bùn thuộc giống
Scylla dựa trên trình tự gen CO1 được thu từ rừng ngập mặn Pichavaram bờ biển phía
Đông Nam Ấn Độ. Đồng thời, 96 trình tự từ Genbank thuộc giống Scylla được sử dụng
để xây dựng cây phát sinh loài, từ đó xác định sự khác biệt của 4 loài và mối quan hệ
tiến hóa của chúng.
Ip và ctv (2015) sử dụng các gen ty thể (gen mã hóa 12S rRNA, 16S
rRNA) kết hợp với các gen nhân mã hóa protein (NaK, Enolase và Histone 3) để xây
dựng cây phát sinh chủng loại của 32 loài cua thuộc họ Grapsidae. Kết quả các loài cua
này được chia thành hai nhánh chính: nhánh thứ nhất thuộc giống Metopograpsus và
nhánh thứ hai thuộc hai giống Grapsus và Planes với một số loài thuộc giống
Pachygrapsus nằm trong các nhánh.
Baeza (2016) nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của các loài cua thuộc họ
Porcellanidae từ khu vực phía đông nam Thái Bình Dương, dựa vào sự kết hợp các chỉ
thị phân tử 16S rRNA ty thể và một gen nhân Histone 3 (H3), xác định mối quan hệ của
11 loài cua thuộc 3 giống gồm: Petrolisthes – 6 loài, Liopetrolisthes – 2 loài và
Allopetrolisthes – 3 loài, đồng thời cho thấy sự đa dạng về tập tính sống, môi trường
sống và màu sắc của 3 giống.


15

Ở Việt Nam, Thái Thanh Bình và ctv (2009) sử dụng vùng gen ty thể CO1 nhận
dạng các loài cua xanh Scylla spp. với tổng 33 trình tự và kết quả xác định 4 loài cua
xanh có mối quan hệ gần nhau. Trên đối tượng là loài cua xanh thuộc giống Scylla,

Nguyễn Giang Sơn và ctv (2011) định loại được 2 mẫu thuộc loài S. olivacea và S.
paramamosain phân bố ở vùng biển thuộc tỉnh Cà Mau dựa trên trình tự gen 16S RNA
ribosomal, từ đó đánh giá mối quan hệ phát sinh chủng loại các loài cua thuộc giống
Scylla.
Như vậy, việc sử dụng rộng rãi các chỉ thị phân tử, đặc biệt là việc kết hợp các
chỉ thị phân tử DNA ty thể và DNA bộ gen đã góp phần làm sáng tỏ mối quan hệ của
các loài cua ghẹ nói chung và theo vùng địa lý nói riêng, góp phần cung
cấp các dữ liệu cần thiết cho việc bảo tồn loài cua ghẹ trên thế giới và Việt Nam.


16

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu
Các loài cua ghẹ thu được ở tỉnh Phú Yên và một số khu vực tỉnh Khánh Hòa, sử
dụng phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên ở hai khu vực tại các địa điểm: Vùng biển Lương
Sơn – Nha Trang, Vạn Ninh – Khánh Hòa, vùng biển Tuy Hòa – Phú Yên. Mẫu sau khi
thu được đem đi rửa sạch, chụp hình và tiến hành phân loại bước đầu về hình thái. Sau
đó, tiến hành lấy mô cơ các loài cua ghẹ thu được cố định trong cồn 96o và bảo quản ở
-200C cho các thí nghiệm sau.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu: