Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR ở bệnh nhân tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015 - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHAN THANH LUÂN

Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR ở bệnh
nhân tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015 - 2016

Chuyên ngành : Vi sinh y học
Mã số

: 60720115

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. NGUYỄN VŨ TRUNG
2. TS. LÊ THỊ HỘI

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Thầy
Nguyễn Vũ Trung, Thầy Thuốc Ưu Tú, PGS.TS. Trưởng bộ môn Vi sinh
Trường Đại học Y Hà Nội, Phó Giám Đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung
ương là người hướng dẫn khoa học, đã luôn giúp đỡ tôi, tận tình truyền đạt
những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành luận

văn. Thầy là người luôn định hướng cho tôi trong nghiên cứu, truyền dạy cho
tôi biết bao kiến thức khoa học và cuộc sống. Sự trưởng thành của tôi trên
mỗi bước đường khoa học cũng như trong sự nghiệp đều có bàn tay và khối
óc của Thầy. Sự động viên, giúp đỡ và dìu dắt của Thầy đã cho tôi thêm nghị
lực để vượt lên chính mình, vượt lên những khó khăn trở ngại.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Hội, Trưởng phòng
Nghiên cứu và Hợp tác Phát triển (R&D), Phó Trưởng phòng Hợp tác Quốc tế
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, giáo viên đồng hướng dẫn. Người đã
luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo, động viên tôi trong quá trình học tập và thực
hiện nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Bằng tình cảm yêu mến và lời cám ơn chân thành, tôi xin gửi tới các
Thầy Cô, các anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Bệnh
Nhiệt đới Trung ương đã quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện
nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới:
-

Ban Giám hiệu và phòng Đào tạo Sau Đại học của Đại học Y Hà Nội.
Ban Giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
Khoa Kế Hoạch Tổng Hợp, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
Xin cám ơn những người bệnh đã cho phép tôi lấy bệnh phẩm làm xét

nghiệm để thực hiện đề tài. Sự đóng góp của những người bệnh đã giúp tôi


hoàn thành nghiên cứu này cũng như giúp cho những người bệnh về sau được
chăm sóc và điều trị tốt hơn.
Cuối cùng, nhưng vô cùng quan trọng tôi xin nói những lời cám ơn đầy
thương yêu với gia đình tôi, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng. Tôi luôn
khắc cốt ghi tâm tình yêu thương của Cha mẹ tôi và anh chị em trong gia

đình, những người đã động viên, thương yêu chăm sóc, khích lệ tôi. Những
người đã luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn
thành luận văn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2017

Phan Thanh Luân


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Phan Thanh Luân, Bác sĩ nội trú khóa 40, Trường Đại học Y Hà
Nội, chuyên ngành Vi sinh y học, xin cam đoan.
1. Đây là Luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của thầy PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung và TS. Lê Thị Hội.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được
công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực
và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.
Tác giả luận văn

Phan Thanh Luân


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AND
ARN
DIF
IFA
IgG
IgM

IHC
IIP
kDa
PCR
RFLP
VD

Acid Desoxyribonucleic
Acid Ribonucleic
Direct Immuno-Fluorescent Assay
Xét nghiệm Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Indirect Immunofluorescent Antibody
Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
Immunoglobulin G
Immunoglobulin M
Immuno-Histo-Chemical staining
Kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch
Indirect Immunoperoxidase Antibody Assay
Xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp
Kilo Dalton
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng trùng hợp chuỗi
Restricted Fragment Length Polymorphism Analysis
Phân tích tính đa hình chiều dài các đoạn giới hạn
Variable domain
Khu vực biến đổi

MỤC LỤC
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ.....................................................1
DANH MỤC BẢNG...................................................................................11

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1......................................................................................................3
TỔNG QUAN..................................................................................................3
1.1. Bệnh do Rickettsia.................................................................................3
1.1.1. Lịch sử.............................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh học Rickettsia..........................................................4
1.1.2.1. Hình thái.........................................................................................................4
1.1.2.2. Cấu trúc..........................................................................................................4
1.1.2.3. Khả năng đề kháng........................................................................................5
1.1.2.4. Độc tố.............................................................................................................5
1.1.2.5. Kháng nguyên và khả năng tạo miễn dịch....................................................6

1.1.3. Hệ gen của vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae.................................6
1.1.4. Dịch tễ học.......................................................................................7
1.2. Phân loại Rickettsia................................................................................7
1.2.1. Spotted Fever Group (SFG) Rickettsiae..........................................9
1.2.2. Typhus Group (TG) Rickettsiae....................................................10
1.2.3. Scrup Typhus Group (STG) Rickettsiae........................................10
1.3. Đặc điểm các nhóm bệnh do Rickettsia...............................................11
1.3.1. Sốt phát ban do Rickettsia (Spotted Fever Group)........................11
1.3.1.1. Sốt phát ban vùng núi Rocky (Rocky Spotted Fever Group)......................11
1.3.1.2. Sốt Địa Trung Hải và các vùng lân cận.......................................................12
1.3.1.3. Sốt Đông Phi và Nam Phi............................................................................12
1.3.1.4. Sốt do ve truyền ở vùng Bắc Á....................................................................12
1.3.1.5. Sốt do ve truyền ở Bắc Australia.................................................................12

1.3.2. Sốt phát ban dịch tễ (Typhus Group).............................................12

1.3.2.1. Sốt phát ban chấy rận..................................................................................12
1.3.2.2. Sốt phát ban do bọ chét chuột (Murin Typhus Fever).................................13

1.3.3. Sốt mò (Scrub Typhus Group).......................................................14
1.4. Vector truyền bệnh của vi khuẩn họ Rickettsiaceae.............................15
1.4.1. Bét, ve............................................................................................15
1.4.2. Bọ chét...........................................................................................15
1.4.3. Chấy rận........................................................................................16
1.4.4. Mò, mạt.........................................................................................16
1.5. Các kỹ thuật phát hiện nhiễm Rickettsia..............................................17
1.5.1. Kỹ thuật miễn dịch học.................................................................17
1.5.1.1. Phản ứng Weil-Felix với kháng nguyên OX-K............................................17
1.5.1.2. Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect
Fluorescent Antibody – IFA)......................................................................................18

Vào năm 1978, các nhà nghiên cứu đã phát triển phương pháp miễn dịch
huỳnh quang để phát hiện Rickettsia thay cho phương pháp Weil-Flix.
Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đoán
nhanh chóng nhiễm Rickettsia............................................................18
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khác
nhau giữa các loài Rickettsia khó phân biệt do có phản ứng liên kết
chéo kháng thể. Một phương pháp được phát triển bởi phòng thí
nghiệm tham chiếu Rickettsia của Úc đã tối ưu hoá phương pháp này,
tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả
[41]......................................................................................................18
1.5.1.3. Xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp (Indirect
Immunoperoxidase – IIP)..........................................................................................18
1.5.1.4. Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn men (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay-ELISA)............................................................................................................18

1.5.2. Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn Rickettsia...........................................19
1.5.3. Kỹ thuật sinh học phân tử..............................................................20
1.5.3.1. Kỹ thuật PCR...............................................................................................20
1.5.3.2. Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang.......................20

1.5.4. Các kỹ thuật chẩn đoán khác.........................................................21
Nhuộm soi trực tiếp và soi kính hiển vi điện tử........................................................21

1.6. Các nghiên cứu về bệnh do Rickettsia trên thế giới và trong nước. Các
hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam hiện nay.................................22
1.6.1. Các nghiên cứu trên thế giới..........................................................22
1.6.1.1. Nghiên cứu về dịch tễ..................................................................................22
1.6.1.2. Nghiên cứu về lâm sàng và kỹ thuật chẩn đoán.........................................22

1.6.2. Các nghiên cứu về bệnh do Ricketsia trong nước.........................22
1.6.3 Những hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam...............................23
CHƯƠNG 2....................................................................................................25
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................25
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................25
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................25
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu.......................................................................25
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu........................................................................25
2.2.3. Quy trình nghiên cứu.....................................................................26
2.3. Vật liệu nghiên cứu..............................................................................27
2.3.1. Vật liệu thu thập thông tin bệnh nhân...........................................27
2.3.2. Hóa chất tách chiết DNA và hóa chất phản ứng realtime PCR phát
hiện Rickettsia...............................................................................27
2.3.2.1. Hóa chất.......................................................................................................27

2.3.2.2. Vật tư tiêu hao..............................................................................................27
2.3.2.3. Trang thiết bị................................................................................................27

2.3.3. Sử dụng cặp mồi và probe.............................................................27
2.4. Quy trình thu nhận bệnh phẩm.............................................................28
2.5. Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Rickettsia.....................................29
2.5.1. Tách chiết lớp bạch cầu máu đơn nhân ngoại vi (PBMC)............29
2.5.2. Tách chiết DNA từ PBMC.............................................................29
2.6. Quy trình kỹ thuật Realtime PCR........................................................31
2.6.1 Quy trình thực hiện.........................................................................31
2.6.1.1. Chuẩn bị Mix cho phản ứng PCR................................................................31
2.6.1.2. Kỹ thuật thực hiện........................................................................................31
2.6.1.3. Đảm bảo chất lượng xét nghiệm.................................................................32
2.6.1.4. Lưu hồ sơ.....................................................................................................32

2.7. Nhận định kết quả và báo cáo...........................................................32
2.8. Địa điểm nghiên cứu............................................................................33
2.9. Xử lý và phân tích số liệu.....................................................................33
2.10. Đạo đức nghiên cứu...........................................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ...............................................................................34
3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime
PCR.....................................................................................................34
3.2. Phân loại một số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR............39
3.2.1. Độ nhạy của phản ứng Realtime-PCR trên DNA tổng số tách từ
chủng vi khuẩn Rickettsia nuôi cấy...............................................40
3.2.2. Độ đặc hiệu của phản ứng.............................................................42
3.2.3. Phân loại sốt mò bằng kỹ thuật Realtime PCR Taqman Probe.....43

Gen 47 kDa đặc hiệu cho xác định tác nhân gây bệnh sốt mò. Kỹ thuật
Realtime PCR Taqman Probe cho độ nhạy 102 copies/ml............43
Kỹ thuật đã xác định được 82 bệnh nhân nhiễm sốt mò O. tsutsugamushi
trong tổng số 254 bệnh nhân nghiên cứu chiếm tỷ lệ 32,3%........43
Dựa trên gen 47 kDa đã được thiết kế cho kỹ thuật Realtime PCR
Taqman Probe đặc hiệu cho sốt mò do vậy để xác định nhiễm sốt
mò thì nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR Taqman
Probe cho chẩn đoán nhiễm sốt mò...............................................43
Đặc điểm của bệnh nhân nhiễm sốt mò...................................................43
3.2.4. Phân loại sốt phát ban bọ chét chuột R. typhi bằng kỹ thuật
Realtime PCR Taqman Probe........................................................48
Tương tự như với sốt mò O. tsutsugamushi. Gen OmpB đặc hiệu cho
xác định tác nhân gây bệnh sốt phát ban bọ chét chuột. Kỹ thuật
Realtime PCR Taqman Probe cho độ nhạy 102 copies/ml............48
Kỹ thuật đã xác định được 10 bệnh nhân nhiễm sốt mò R. typhi trong
tổng số 254 bệnh nhân nghiên cứu chiếm tỷ lệ 3,9%....................48
Dựa trên gen OmpB đã được thiết kế cho kỹ thuật Realtime PCR
Taqman Probe đặc hiệu cho sốt phát ban bọ chét chuột. Do vậy, để
xác định nhiễm sốt phát ban bọ chét chuột thì nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật Realtime PCR Taqman Probe cho chẩn đoán nhiễm
sốt phát ban bọ chét chuột.............................................................48
Một số đặc điểm dịch tễ học lâm sàng của bệnh nhân nhiễm R. typhi.. .49
3.2.5. Phân loại sốt phát ban Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR
Taqman Probe................................................................................53


Tương tự như sốt mò và sốt phát ban bọ chét chuột. Gen 17 kDa đặc hiệu
cho xác định tác nhân gây bệnh sốt phát ban ban do Rickettsia. Sử
dụng kỹ thuật Realtime Taqman Probe trong phát hiện nhiễm sốt

phát ban do Rickettsia. Trong nghiên cứu của chúng tôi chưa có
bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do Rickettsia.................................53
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.............................................................................53
4.1. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime
PCR.....................................................................................................53
4.2. Phân loại số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR....................56
4.2.1. Đặc điểm dịch tễ học của sốt mò...................................................57
4.2.2. Đặc điểm dịch tễ học sốt phát ban do bọ chét chuột truyền..........63
KẾT LUẬN....................................................................................................67
KIẾN NGHỊ...................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................81

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi và probe của các gen 47 kDa, 17 kDa và
OmpB:............................................................................................................28
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp.....................36


Bảng 3.2: Nồng độ và độ tinh sạch DNA.....................................................40
Bảng 3.3: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng.........41
Bảng 3.4: Độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR..................................42
Bảng 3.5: Phân loại bệnh nhân nhiễm Rickettsia.......................................43
Bảng 3.6: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo nghề nghiệp.................45
Bảng 3.7: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo
nghề nghiệp....................................................................................................50


DANH MỤC HÌNH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ.....................................................1
DANH MỤC BẢNG...................................................................................11

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1......................................................................................................3
TỔNG QUAN..................................................................................................3
1.1. Bệnh do Rickettsia.................................................................................3
Hình 1.1: Hình ảnh Rickettsia.......................................................................5
Hình 1.1: Hình ảnh Rickettsia.......................................................................5
1.2. Phân loại Rickettsia................................................................................7
Hình 1.2: Mối quan hệ di truyền khác nhau giữa Rickettsia và các vi sinh
vật gần giống Rickettsia........................................................................8
Hình 1.2: Mối quan hệ di truyền khác nhau giữa Rickettsia và các vi sinh
vật gần giống Rickettsia........................................................................8
Hình 1.3: Hình minh họa TG và SFG Rickettsia trong vật chủ..................10
Hình 1.3: Hình minh họa TG và SFG Rickettsia trong vật chủ..................10
1.3. Đặc điểm các nhóm bệnh do Rickettsia...............................................11
1.4. Vector truyền bệnh của vi khuẩn họ Rickettsiaceae.............................15
1.5. Các kỹ thuật phát hiện nhiễm Rickettsia..............................................17
Vào năm 1978, các nhà nghiên cứu đã phát triển phương pháp miễn dịch
huỳnh quang để phát hiện Rickettsia thay cho phương pháp Weil-Flix.
Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đoán
nhanh chóng nhiễm Rickettsia............................................................18
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khác
nhau giữa các loài Rickettsia khó phân biệt do có phản ứng liên kết


chéo kháng thể. Một phương pháp được phát triển bởi phòng thí
nghiệm tham chiếu Rickettsia của Úc đã tối ưu hoá phương pháp này,
tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả
[41]......................................................................................................18
1.6. Các nghiên cứu về bệnh do Rickettsia trên thế giới và trong nước. Các
hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam hiện nay.................................22

CHƯƠNG 2....................................................................................................25
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................25
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................25
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................25
2.3. Vật liệu nghiên cứu..............................................................................27
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi và probe của các gen 47 kDa, 17 kDa và
OmpB:............................................................................................................28
2.4. Quy trình thu nhận bệnh phẩm.............................................................28
2.5. Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Rickettsia.....................................29
2.6. Quy trình kỹ thuật Realtime PCR........................................................31
2.8. Địa điểm nghiên cứu............................................................................33
2.9. Xử lý và phân tích số liệu.....................................................................33
2.10. Đạo đức nghiên cứu...........................................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ...............................................................................34
3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime
PCR.....................................................................................................34
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp.....................36
3.2. Phân loại một số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR............39
Bảng 3.2: Nồng độ và độ tinh sạch DNA.....................................................40
Hình 3.1: Đường chuẩn Realtime-PCR từ DNA tổng số tách chiết từ các
chủng vi khuẩn Rickettsia nuôi cấy.....................................................40


Hình 3.1: Đường chuẩn Realtime-PCR từ DNA tổng số tách chiết từ các
chủng vi khuẩn Rickettsia nuôi cấy.....................................................40
Hình 3.2: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi khuẩn nuôi cấy pha loãng............41
Hình 3.2: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi khuẩn nuôi cấy pha loãng............41
Bảng 3.3: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng.........41
Hình 3.3: Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime-PCR.......42
Hình 3.3: Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime-PCR.......42

Bảng 3.4: Độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR..................................42
Bảng 3.5: Phân loại bệnh nhân nhiễm Rickettsia.......................................43
Bảng 3.6: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo nghề nghiệp.................45
Bảng 3.7: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo
nghề nghiệp....................................................................................................50
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.............................................................................53
4.1. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime
PCR.....................................................................................................53
4.2. Phân loại số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR....................56
KẾT LUẬN....................................................................................................67
KIẾN NGHỊ...................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................81


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ nhiễm Rickettsia..............................................................34
.........................................................................................................................35
Biểu đồ 3.2. Phân bố bệnh nhân nhiễm Rickettsia theo nhóm tuổi..........35
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ bệnh nhân nghiên cứu theo giới....................................36
Biểu đồ 3.4. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo vùng địa phương........37
Biểu đồ 3.5. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo miền địa phương........37
Biểu đồ 3.6. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo tỉnh, thành...................38
Biểu đồ 3.7. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo.......................................39
các tháng trong năm......................................................................................39
Biểu đồ 3.8. Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo nhóm tuổi................44
Biểu đồ 3.9. Tỷ lệ nhiễm sốt mò theo giới...................................................45
Biểu đồ 3.10. Phân bố nhiễm sốt mò theo vùng địa phương......................46
Biểu đồ 3.11. Phân bố nhiễm sốt mò theo miền địa phương......................46
Biểu đồ 3.12. Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo tỉnh, thành.............47
Biểu đồ 3.13. Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo các tháng trong

năm.................................................................................................................48
.........................................................................................................................49
Biểu đồ 3.14. Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột
theo nhóm tuổi...............................................................................................49
Biểu đồ 3.15. Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do..........................50
bọ chét chuột theo giới..................................................................................50
Biểu đồ 3.16. Phân bố nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo.............51
vùng địa phương............................................................................................51
Biểu đồ 3.17. Phân bố nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo.............52
miền địa phương............................................................................................52


.........................................................................................................................52
Biểu đồ 3.18. Phân bố nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo tỉnh,
thành...............................................................................................................52
Biểu đồ 3.19. Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột
theo các tháng trong năm..............................................................................53


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Rickettsiosis là một trong những bệnh truyền qua côn trùng, tiết túc được
biết đến sớm nhất, do vi khuẩn ký sinh nội bào thuộc Họ Rickettsiaceae gây
nên [1]. Rickettsiae là các trực khuẩn hay cầu trực khuẩn Gram âm, kích
thước 1,0–2,0 µm × 0,3–0,5 µm. Quá trình phân loại các Rickettsiae đã trải
qua nhiều thay đổi. Đến nay, các Rickettsiae được chia làm 3 nhóm: (i) nhóm
gây bệnh sốt dịch tễ (Typhus Group) gồm các loài R. typhi, R. prowazekii và
R. canada; (ii) nhóm gây bệnh sốt phát ban (Spotted Fever Group) gồm
khoảng 20 loài khác nhau phân bố khắp thế giới; (iii) nhóm gây bệnh sốt mò

(Scrub Typhus Group) chỉ có duy nhất 1 loài Orientia tsutsugamushi [2].
Rickettsiosis là bệnh sốt cấp tính lưu hành và gây dịch ở nhiều nơi
trên thế giới. Biểu hiện lâm sàng của bệnh đa dạng, từ thể nhẹ đến nặng,
thậm chí có những thể gây nguy hiểm đến tính mạng, phụ thuộc vào từng
loài Rickettsia bị nhiễm, vào đặc điểm di truyền và tình trạng sức khỏe của
người bệnh [2]. Ở một số nơi, tỷ lệ tử vong có thể lên tới 36,8% [3].
Rickettsiosis đã được nghiên cứu ở một số nước như Nhật Bản, Đài
Loan… Đã có một số tác giả Việt Nam nghiên cứu bệnh do Rickettsia. Phạm
Thanh Thủy [4], Nguyễn Văn Sơn [5] đã nghiên cứu các vấn đề của sốt mò
thuộc một trong các nhóm bệnh gây bởi Rickettsia, nhưng chủ yếu tập trung
nghiên cứu các khía cạnh lâm sàng và điều trị.
Việc phát hiện Rickettsia trong phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như
ở Việt Nam chủ yếu dựa vào phản ứng huyết thanh học vì các Rickettsia rất
khó nuôi cấy do tính chất ký sinh nội bào bắt buộc của nó (đòi hỏi phải có phòng
an toàn sinh học cấp 3). Phản ứng huyết thanh học xác định nhiễm Rickettsia có
những điểm hạn chế nhất định. Đó là: (i) đáp ứng miễn dịch kháng thể chỉ có thể
phát hiện được ở tuần thứ hai của bệnh; (ii) không có ngưỡng giá trị của hiệu giá


2

kháng thể cho chẩn đoán; (iii) mẫu máu kép để tìm động lực kháng thể cho chẩn
đoán xác định là yêu cầu bắt buộc cho chẩn đoán song không phải lúc nào cũng
đảm bảo được; (iv) có phản ứng chéo xảy ra giữa các loài khác nhau; (v)
Rickettsiae khó nuôi cấy nên việc sản xuất kháng nguyên phục vụ cho chẩn đoán
huyết thanh học cũng gặp khó khăn [1, 2].
Hiện nay, khi các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời, mở ra một kỷ nguyên
mới cho việc chẩn đoán các căn nguyên gây bệnh nói chung và Rickettsia nói
riêng. Kỹ thuật PCR chẩn đoán đặc hiệu Rickettsia không những cho kết quả
nhanh, chính xác mà nó còn có thể xác định được Rickettsia từ bệnh phẩm là

vết loét trên bệnh nhân [6].
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là cơ sở đầu ngành tiếp nhận,
chẩn đoán và điều trị các bệnh nhân bị bệnh nhiễm trùng. Trong thời gian qua,
nhiều bệnh nhân nhập viện với các triệu chứng sốt và dấu hiệu lâm sàng
không điển hình. Kỹ thuật PCR đã được triển khai và góp phần quan trọng
trong xác định nhiễm Rickettsia. Nhằm xác định về tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở
bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương
năm 2015-2016, chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia
bằng kỹ thuật Realtime-PCR ở bệnh nhân tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
Trung ương năm 2015-2016” với 2 mục tiêu:
1.
2.

Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime-PCR.
Phân loại một số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. Bệnh do Rickettsia
1.1.1. Lịch sử
Chi Rickettsia lần đầu tiên được Howard Rickett mô tả khi ông điều tra
sự bùng nổ của bệnh Sốt phát ban rừng núi năm 1906 và 1907 [7]. Người ta
đã thấy được vai trò quan trọng của các động vật trung gian truyền bệnh
(vector). Chu kỳ sống của Rickettsia xảy ra ở cả động vật có xương sống và
động vật không xương sống. Trong đó, động vật chân đốt đóng vai trò quan
trọng không chỉ là vector truyền bệnh mà còn là vật chủ chứa đầu tiên và giúp

quá trình nhân lên của Rickettsia. Một số động vật như chuột và động vật có
túi cũng là vật chứa [8].
Hiện nay có 3 nhóm gây bệnh Rickettsioisis như loại gây sốt phát ban,
sốt dịch tễ và sốt mò [9], [10]. Hai nhóm đầu thuộc về chi Rickettsia. Trong
khi đó nhóm thứ 3 thuộc về chi Orientia. Sự phân loại Rickettsia đã có thay
đổi lớn trong thập kỷ qua, dựa vào sự ra đời của phương pháp sinh học phân
tử khi phân tích giải trình tự gen 16S rRNA [11]. Những thay đổi này đã dẫn
đến loại ra một số vi sinh vật không phải Rickettsia, mặc dù chúng được mô tả
giống Rickettsia như Coxiella burnetii và Bartonella. Hiện nay Fournier và
cộng sự đã đề xuất một hướng dẫn phân loại Rickettsia ở mức độ chi, nhóm,
loài bằng giải trình tự gen 16S rRNA (rss), 4 gen gltA (citrate synthase),
OmpA, OmpB và sca4 (genD) [12].
Chi Rickettsia hiện nay có hơn 24 loài. Tuy nhiên, có 16 loài gây bệnh
cho người. Các giả thuyết cho rằng, tất cả các loài được tìm thấy trong động
vật chân đốt có khả năng là tác nhân gây bệnh cho người [13].


4

1.1.2. Đặc điểm sinh học Rickettsia
1.1.2.1. Hình thái
Rickettsia là những cầu trực khuẩn, ngắn, không có lông, không di
động, chiều dài khoảng 0,8 – 2,0 µm, chiều rộng khoảng 0,3 – 0,5 µm, đa
hình thái, hình dạng thay đổi qua các giai đoạn phát triển: cầu khuẩn đứng riêng
rẽ hoặc thành từng đôi có khi xếp thành chuỗi ngắn hoặc từng đám trong hoặc
ngoài tế bào. Rickettsia không bắt màu Gram, khi nhuộm bằng phương pháp
Giemsa, vi khuẩn bắt màu tím hồng, bằng phương pháp Macchiavello cho màu
đỏ của fuschin trên nền xanh (trừ O. tsutsugamushi bắt màu xanh).
1.1.2.2. Cấu trúc
Rickettsia đã có một thời được xem như virus vì kích thước nhỏ bé

(0,3-0,5 μm x 0,8-2,0 μm) và phát triển nội bào. Ngày nay, Rickettsia được
khẳng định là vi khuẩn vì: Rickettsia có tất cả đặc tính cấu tạo của vi khuẩn,
đặc biệt là có vách tế bào điển hình, có tất cả các enzyme cần thiết cho sự
chuyển hóa, có chứa cả 2 loại acid nucleic: ADN và ARN và phân bào giống
vi khuẩn.
Kích thước bộ gen của họ Rickettsiaceae nhỏ hơn nhiều so với các
loài vi khuẩn khác. Nó có dạng vòng kích thước từ 1,1 đến 1,6 triệu baze
nitơ. Một số loài, khoảng 24% DNA không mang mã di truyền hoặc gen giả.
Họ Rickettsiaceae là gồm các vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc. Do vậy,
chúng ít khi tương tác với các vi khuẩn khác và ít có cơ hội trao đổi DNA.
Tuy nhiên gần đây, một số nhà nghiên cứu đã xác định R. felis là vi khuẩn kí
sinh nội bào đầu tiên mang 2 plasmid .


5

Hình 1.1: Hình ảnh Rickettsia
(Nguồn: David H. Walker Didier Raoult, Infectious Diseases)
1.1.2.3. Khả năng đề kháng
Rickettsia là những vi khuẩn rất yếu, bị tiêu diệt nhanh chóng bởi sức
nóng, độ ẩm, độ khô và các chất hóa học, bị bất hoạt ở nhiệt độ thường nhưng
tồn tại tốt ở nhiệt độ thấp (-250C đến -700C) bằng phương pháp đông lạnh. Chỉ
có Coxiella burnetii có khả năng đề kháng với khô ráo và có thể sống trong
phân của bọ chét nhiều tháng.
1.1.2.4. Độc tố
Một số Rickettsia sinh ra một loại độc tố hòa tan trong môi trường lỏng
nuôi cấy, đồng thời gây tan máu và hoại tử. Độc tố này rất yếu, gây tổn thương
ở các cơ quan nhiễm trùng giống như dạng tổn thương của ngoại độc tố. Cấu
tạo vỏ ngoài của vi khuẩn cũng có tính kháng nguyên, vỏ cũng có vai trò đặc
biệt trong gây tan huyết. Như vậy, hoạt tính gây tan huyết của Rickettsia ngoài

độc tố còn phụ thuộc vào cấu trúc gây tan huyết của vỏ và cả enzym gây tan
huyết của vi khuẩn. Độc tố gắn liền với thân của Rickettsia, nếu đun ở 600C
trong 30 phút hoặc xử lý bằng formalin 0,37%, độc tố sẽ bị hủy nhưng vẫn giữ
được tính kháng nguyên , [91].


6

1.1.2.5. Kháng nguyên và khả năng tạo miễn dịch
Rickettsia có hai loại kháng nguyên, một kháng nguyên hòa tan đặc
hiệu của nhóm và một kháng nguyên chéo.
- Kháng nguyên đặc hiệu bao gồm kháng nguyên không chịu nhiệt và
kháng nguyên chịu nhiệt.
+ Kháng nguyên không chịu nhiệt: là kháng nguyên không hòa tan, bản
chất là protein, đặc hiệu loài.
+ Kháng nguyên chịu nhiệt: là kháng nguyên hòa tan, có bản chất là
polysaccharid, đặc hiệu nhóm.
- Kháng nguyên không đặc hiệu: Bản chất là polysaccharid, kháng
nguyên này có cấu trúc gần giống với kháng nguyên của Proteus vulgaris
(chủng OX19, OX2, OXk). Vì vậy, kháng nguyên này được sử dụng trong
phản ứng Weil - Felix để chẩn đoán huyết thanh, riêng R. burnetii không có
kháng nguyên này.
Khi nhiễm Rickettsia hoặc sau khi tiêm vắc xin, cơ thể sẽ đáp ứng miễn
dịch sinh kháng thể. Các loại kháng thể xuất hiện là kháng thể ngưng kết,
kháng thể hòa tan đặc hiệu và có thể chống lại bệnh nhiễm trùng. Độc tố của
Rickettsia cũng có thể hình thành kháng thể hòa tan chống lại độc tố của nó.
Trong thực tế, người ta thấy các nhiễm khuẩn Rickettsia gây nên sốt phát ban
có khả năng tạo ra miễn dịch mạnh mẽ, lâu dài và có thể hình thành miễn dịch
chéo với các loài Rickettsia khác. Những người đã một lần mắc Rickettsiosis,
lần sau có tiếp xúc với Rickettsia cũng có thể không bị mắc bệnh , [92].

1.1.3. Hệ gen của vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae
Kích thước bộ gen của vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae nhỏ hơn nhiều
so với các loài vi khuẩn khác. Đó là dạng vòng có kích thước từ 1,1 đến 1,6
triệu baze nitơ. Trong một số loài, khoảng 24% DNA là không mang mã di
truyền hoặc gen giả [4], [29], [30], [31].


7

Rickettsiaceae là vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc, do vậy chúng ít khi
tương tác với các vi khuẩn khác và ít có cơ hội trao đổi DNA. Tuy nhiên gần
đây, một số nhà nghiên cứu đã xác định R. felis là vi khuẩn kí sinh nội bào
đầu tiên mang 2 plasmid [9], [32].
1.1.4. Dịch tễ học
Vi khuẩn họ Rickettsiaceae được tìm thấy ở tất cả các châu lục trên thế
giới [33]. O. tsutsugamushi được tìm thấy trên 13 triệu km vuông, từ ven
Châu Á-Thái Bình Dương, Tây Bắc Afghanistan qua bán đảo Kamchatka đến
vùng Đông Bắc Nga và Úc [34], [35]. Những năm gần đây, do sự phát triển
kỹ thuật chẩn đoán, ngày càng nhiều loài mới được phát hiện. Nhiều loài
thuộc nhóm gây bệnh sốt phát ban được tìm thấy ở tất cả các nơi như Châu
Âu, Châu Mỹ, Châu Á, Châu Úc và Châu Phi [2], [36], [37], [38]. Các nước
Châu Á-Thái Bình Dương, bệnh nhân nhiễm Orientia gây sốt mò chiếm tỉ lệ
cao [39] [36] [29] [40] [37]. Điều này do tác động của nhiều yếu tố như điều
kiện khí hậu, điều kiện kinh tế xã hội cũng như là thói quen sinh hoạt.
1.2. Phân loại Rickettsia
Họ Rickettsiaceae là vi khuẩn Gram (-), sống kí sinh nội bào bắt buộc ở
động vật có xương sống trong một giai đoạn của quá trình phát triển. Quá
trình phân loại các vi khuẩn họ Rickettsiaceae đã trải qua nhiều thay đổi, đến
nay họ Rickettsiaceae chia thành 2 chi là Rickettsia và Orientia. Dựa vào dữ
liệu về di truyền và tính kháng nguyên, họ Rickettsiaceae được chia làm 3

nhóm: (i) Nhóm gây bệnh sốt dịch tễ (Typhus Group-TG) gồm các loài
Rickettsia typhi, Rickettsia prowazekii; (ii) Nhóm gây bệnh sốt phát ban
(Spotted Fever Group-SFG) gồm 20 loài khác nhau phân bố khắp thế giới
trong đó có 12 loài được xác định gây bệnh Rickettsia như Rickettsia
rickettsii, Rickettsia conorii, Rickettsia africae, Rickettsia sibirica, Rickettsia
heilongjiangensis,

Rickettsia

japonica,

Rickettsia

slovaca,

Rickettsia

aeschlimanii, Rickettsia massiliae, Rickettsia honei, Rickettsia parkeri,


8

Rickettsia australis; (iii) Nhóm gây bệnh sốt mò (Scrub Typhus Group-SFG)
có 2 loài Orientia tsutsugamushi và Orientia chuto. Hai nhóm đầu thuộc chi
Rickettsia, nhóm thứ 3 thuộc chi Orientia [45], [6].

Hình 1.2: Mối quan hệ di truyền khác nhau giữa Rickettsia và các vi sinh vật
gần giống Rickettsia.
Chi Rickettsia được phân thành 2 nhóm dựa vào vị trí ký sinh nội bào,
nhiệt độ sinh trưởng tối ưu, phần trăm G+C, đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học

và đặc điểm kháng nguyên của vi khuẩn [33]. Bằng phân tích hệ gen, hai
nhóm khác gần đây cũng được đề xuất là nhóm Ancestral Group (AG) bao
gồm R. bellii và R. Canadensis và Transitional Group (TRG) bao gồm R.
akari và R. felis [9], [46].
Một điểm phân loại Rickettsia đáng chú ý khác đã được phân loại lại là
Rickettsia tsutsugamushi được phân thành chi riêng là Orientia (Orientia
tsutsugamushi), và đang trong cùng phân nhóm α-1 như các chi Rickettsia
(Hình 1.2) [7]. Coxiella burnetii (trước đây là Burnetii Rickettsia) cũng đã