Đánh giá mức độ tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong một số nguồn nước thải nhà máy dược phẩm trên địa bàn hà nội

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ NHÀN
Mã sinh viên: 1201427

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ TỒN DƯ
KHÁNG SINH NHÓM QUINOLON
TRONG MỘT SỐ NGUỒN
NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM
TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ NHÀN
Mã sinh viên: 1201427

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ TỒN DƯ
KHÁNG SINH NHÓM QUINOLON
TRONG MỘT SỐ NGUỒN
NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM
TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. DS. Lê Xuân Kỳ
Nơi thực hiện:

1. Bộ môn Vật lý – Hóa lý
2. Viêṇ Công nghê ̣ Dươ ̣c phẩ m Quố c gia

HÀ NỘI 2017


LỜI CẢM ƠN
Sau mô ̣t thời gian thực hiê ̣n, khóa luâ ̣n “Đánh giá mức đô ̣ tồ n dư kháng
sinh nhóm Quinolon trong mô ̣t số nguồ n nước thải nhà máy dươ ̣c phẩ m
trên điạ bàn Hà Nô ̣i” đã đươ ̣c hoàn thành. Bên ca ̣nh sự cố gắ ng của bản thân,
em đã nhâ ̣n đươ ̣c sự giúp đỡ rấ t nhiề u từ phía nhà trường, bô ̣ môn, gia đình và
ba ̣n bè.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cám ơn chân thành
đến DS. Lê Xuân Kỳ, người thầ y đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ
em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
cùng các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Vật lý – Hóa lý và
Viê ̣n Công nghê ̣ Dươ ̣c phẩ m Quố c gia đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, cùng toàn
thể các thầy cô các bộ môn Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và
giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên,
quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Phạm Thị Nhàn


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về tình hình sản xuất kháng sinh tại Việt Nam ............... 3
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ....................................................... 4
1.2.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon ................................................. 4
1.2.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu............................................. 6
1.3. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu ............................ 6
1.3.1. Sắc ký lỏng khối phổ............................................................................ 6
1.3.2. Phương pháp chiết pha rắn................................................................. 12
1.4. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng quinolon trong nước thải ... 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 16
2.2. Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 16
2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn ...................................................... 16
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ ............................................................................... 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 17
2.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thực ................................ 17
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu ..................................................................... 18
2.3.3. Phương pháp phân tích bằ ng LC-MS/MS ......................................... 18
2.3.4. Đánh giá sự phù hơ ̣p của phương pháp phân tích đã lựa cho ̣n .......... 20
2.3.5. Ứng dụng phân tích mẫu thực............................................................ 21
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 22


3.1. Đánh giá sư ̣ phù hơ ̣p của phương pháp phân tích đã xây dư ̣ng ....... 22
3.1.1. Chuẩ n bi ̣daỹ dung dich

̣ chuẩ n ........................................................... 22
3.1.2. Độ phù hợp của hệ thống ................................................................... 22
3.1.3. Tỷ lê ̣ cường đô ̣ ion ............................................................................. 23
3.1.4. Xây dựng đường chuẩ n để đinh
̣ lươ ̣ng .............................................. 24
3.2. Phân tích mẫu thực ................................................................................ 26
3.2.1. Lấy mẫu.............................................................................................. 26
3.2.2. Kế t quả đinh
̣ lươ ̣ng nồ ng đô ̣ kháng sinh trong nước thải .................. 28
3.2.3. Nhâ ̣n xét kế t quả thu đươ ̣c ................................................................. 32
3.4. Bàn luâ ̣n .................................................................................................. 36
3.4.1. Về thời điể m và vi tri
̣ ́ lấ y mẫu ........................................................... 36
3.4.2. Về phương pháp xử lý mẫu................................................................ 36
3.4.3. Về phương pháp phân tích ................................................................. 37
3.4.4. Về kế t quả đinh
̣ lươ ̣ng nồ ng đô ̣ kháng sinh trong nước thải ............. 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

API

Ion hóa áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization)

APCI

Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Chemical Ionization)

APPI

Ion hóa bằ ng photon ta ̣i áp suấ t khí quyể n (Atmospheric
Pressure Photoionization)

CIP

Ciprofloxacin

CTCT

Công thức cấu tạo

CTPT

Công thức phân tử

ESI

Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton)

EtOH

Ethanol

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

IS

Chuẩn nội (Internal Standard)

KLPT

Khối lượng phân tử

LEV

Levofloxacin

LC-MS

Sắc kí lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass
spectrometry)

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem
mass spectrometry)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MeOH

Methanol

NOR

Norfloxacin

OFLO

Ofloxacin


PA

Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

S

Diện tích píc

SĐK

Số đăng ký

SPE

Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

TB

Trung bình

tR

Thời gian lưu


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Số SĐK kháng sinh từ 01/2010 đế n 12/2015 ở Viê ̣t Nam.................3
Bảng 1.2. Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm quinolon .........5
Bảng 2.1. Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu ..... 16
Bảng 2.2. Chương trình gradient ..................................................................... 19
Bảng 2.3. Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên cứu ... 19
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ phù hợp hệ thống ........................................... 23
Bảng 3.2. Tỷ lệ cường độ ion định tính/ ion định lượng - (RSD) ................... 24
Bảng 3.3. Kết quả xậy dựng đường chuẩn các kháng sinh nghiên cứu .......... 25
Bảng 3.4. Nồ ng đô ̣ kháng sinh trong các mẫu nước thải (ng/l) ...................... 28

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ hê ̣ thố ng LC-MS/MS ............................................................7
Hình 1.2. Sơ đồ ta ̣o ion dương bằ ng nguồ n ESI.............................................9
Hình 3.1. Sắc ký đồ các kháng sinh trong mẫu D.010317.S1 ......................31
Hình 3.2. Sắc ký đồ các kháng sinh trong mẫu A.040117.S3 ......................31
Hình 3.3. So sánh nồng độ kháng sinh tại ba vị trí của cơ sở A ..................32
Hình 3.4. So sánh nồ ng đô ̣ kháng sinh tại hai vị trí của cơ sở B..................33
Hình 3.5. So sánh nồ ng đô ̣ kháng sinh tại bốn vị trí của cơ sở C ................34
Hình 3.6. So sánh nồng đô ̣ kháng sinh tại hai vị trí của cơ sở D .................35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, thuốc kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong y học, thú y và
nuôi trồng thủy sản với mục đích phòng hoặc điều trị các bệnh nhiễm trùng.
Thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng nhưng sự tồn dư của
kháng sinh trong môi trường nước nói chung có thể gây ra nhiều hậu quả, điển
hình là tình trạng kháng thuốc kháng sinh. Thực trạng kháng kháng sinh đã
mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển như Việt
Nam, cu ̣ thể là sự gia tăng các bệnh nhiễm khuẩn và chi phí cho việc thay thế
các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền [7]. Bên cạnh nguyên nhân
do việc sử dụng thuốc không hợp lý, thì sự tồn tại dư lượng kháng sinh trong
thực phẩm và môi trường tự nhiên cũng là yếu tố quan trọng thúc đẩy tình trạng
xuất hiện vi khuẩn đề kháng kháng sinh. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy sự tồn
tại của kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên
phổ biến [12], [23], [24].
Nguyên nhân của sự tồn dư kháng sinh trong môi trường tự nhiên là do
quá triǹ h đào thải các loại thuốc mà người và động vật sử dụng, do ngành nông
nghiệp, ngư nghiêp̣ và từ các nhà máy sản xuất dược phẩm. Trước đây việc thải
các kháng sinh từ các nhà máy sản xuất ít được chú ý nhưng gần đây các nghiên

cứu đã cho thấy rằng ở một số nước châu Á nồng độ các kháng sinh thải ra đã
lên đến vài mg/l [16], [19].
Theo quy định của Cục Quản lý Dược hiện nay, các công ty sản xuất
kháng sinh phải đạt tiêu chuẩn GMP với hệ thống xử lý nước thải. Tuy nhiên
việc kiểm soát nồng độ kháng sinh tồn dư trong nước thải ở các cơ sở này vẫn
chưa được quan tâm đúng mức. Ngày 28/12/2011, Bộ Tài Nguyên và Môi
Trường ban hành thông tư số 47/2011/TT-BTNMT quy định quy chuẩn quốc
gia về môi trường, tuy nhiên, dư lượng kháng sinh trong nước thải công nghiêp̣
1


dươ ̣c chưa được quy định cụ thể. Kháng sinh nhóm quinolon hiện đang được
nhiều nhà máy, xí nghiệp dược sản xuất với các dạng bào chế khác nhau: viên
nén, viên nang, thuố c tiêm…
Đã có một vài nghiên cứu ở Việt Nam xác định dư lượng kháng sinh
trong nước thải sinh hoạt, bệnh viện, nuôi trồng thủy sản và nước thải công
nghiê ̣p dươ ̣c. Các nghiên cứu này tập trung phân tích, đánh giá hàm lượng của
một kháng sinh cụ thể hoặc hỗn hợp nhiều kháng sinh. Tuy nhiên, đề tài xác
định dư lượng kháng sinh nhóm quinolon trong nước thải từ các cơ sở sản xuất
dược phẩm ở nước ta mới chỉ dừng la ̣i ở bước xây dựng phương pháp và áp
du ̣ng trên số lươ ̣ng mẫu ít để đánh giá tiń h khả thi của phương pháp.
Xuất phát từ thực trạng trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh
giá mức độ tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong một số nguồn nước thải
nhà máy dược phẩm trên địa bàn Hà Nội” với các mục tiêu:
1. Đánh giá sự phù hợp của phương pháp phân tích bằ ng LC-MS/MS đã
được xây dựng để xác đi ̣nh các kháng sinh quinolon (ofloxacin, ciprofloxacin,
norfloxacin) trong nước thải công nghiê ̣p dược.
2. Xác định và sơ bộ đánh giá dư lượng các kháng sinh ofloxacin,
ciprofloxacin và norfloxacin có trong nước thải một số nhà máy dược phẩm ở
Hà Nội bằng LC-MS/MS.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tình hình sản xuất kháng sinh tại Việt Nam
Ngành dược phẩm ở Việt Nam đang phát triển với khoảng 200 nhà sản
xuất kháng sinh. Năm 2015, sản xuất thuốc, hóa dược, dược liệu tăng 3,6 % so
với năm 2014 [26]. Trong thời hạn 5 năm, từ năm 2010 đến năm 2015, đa số
các nhóm thuố c kháng sinh sản xuấ t trong nước đã đăng ký là β-lactam
(amoxicilin, cefuroxim...), quinolon (ciprofloxacin, ofloxacin...), và macrolid
(neomycin, clarithromycin, azithromycin...) (Bảng 1.1) [25].
Bảng 1.1. Số SĐK kháng sinh từ 01/2010 đến 12/2015 ở Việt Nam
Số

Tên kháng

Số

Tên kháng

Số

SĐK

sinh

SĐK

sinh

SĐK

Amoxicilin

291

Erythromycin

75

Penicilin

35

Cefuroxim

198

Cefoperazon

71

Lincomycin

34

Cephalexin

184

Neomycin

71

Roxithromycin

34

Spiramycin

167

Cefotaxim

68

Cefepim

29

Cefixim

147

Ofloxacin

66

Cefazolin

27

Metronidazol

148

Ceftazidim

61

Gentamycin

25

Cefaclor

129

Levofloxacin

60

Doxycyclin

21

Cefadroxil

113

Ampicilin

57

Cloramphenicol

20

Ciprofloxacin

99

Azithromycin

52

Moxifloxacin

19

Clarithromycin

95

Ceftriaxon

48

Amikacin

13

Trimethoprim

94

Tetracyclin

40

Rifampicin

11

Sulfamethoxazol

90

Clindamycin

39

Vankomycin

9

Cedinir

77

Tobramycin

35

Norfloxacin

8

Tên kháng sinh

(Nguồn: Cục Quản lý Dược Việt Nam 12/2015)

3


1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.2.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon
❖ Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng:
Công thức cấu tạo chung:

Phân loại và phổ tác dụng: Có nhiều cách phân loại quinolon như dựa
trên phổ tác dụng và công dụng, dựa vào phân tử có hoặc không có fluor. Ngày
nay, các quinolon được phân loại chi tiết thành 4 thế hệ (Bảng 1.2) [9].
❖ Cơ chế tác dụng
Theo một hoặc hai cơ chế sau và đều cho tác dụng diệt khuẩn:
- Ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN, giúp cho sự sao chép và
phiên mã, vì vậy ức chế sự sao chép và nhân lên của ADN của vi khuẩn [4],
[9].
- Tạo phức với kim loại hóa trị 2 và 3 như canxi, nhôm… mà đây là những

thành phần không thể thiếu của nhiều enzym và protein sinh học. Do đó nhiều
enzym và protein quan trọng của vi khuẩn bị bất hoạt [9].
❖ Cơ chế đề kháng
Vi khuẩn kháng lại quinolon theo 3 cơ chế chính:
- Thứ nhất, vi khuẩn thay đổi cấu trúc màng làm giảm tính thấm của quinolon
qua màng tế bào vi khuẩn, giảm mức độ thâm nhập của thuốc vào trong tế bào.
- Thứ hai, vi khuẩn hoạt hóa bơm ngược, đẩy ngược thuốc ra khỏi tế bào.
- Thứ ba, vi khuẩn đột biến cả hai enzym bị ức chế bởi quinolon là ADN gyrase
và topoisomerase IV [9].

4


Bảng 1.2. Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm quinolon
Quinolon

Phổ tác dụng

Công dụng

Thế hệ I
Acid nalidixic
Acid pipemidic
Acid oxolinic
Cinoxacin

Nhạy cảm với các vi khuẩn Gram (-), Nhiễm khuẩn tiết
đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu chưa biến
niệu Enterobacter. Không tác dụng chứng.
trên P.aeruginosa.

Thời gian bán thải ngắn, bài tiết qua
nước tiểu.

Thế hệ II
Ciprofloxacin
Ofloxacin
Norfloxacin
Lomefloxacin

Phổ rộng với Gram (-), cả
P.aeruginosa.
Tác dụng trên một số Gram (+), bao
gồm cả Staphylococcus pneumoniae,
trừ Streptococcus pneumonia.
Thời gian bán thải dài hơn.

Nhiễm khuẩn tiết
niệu, nhiễm khuẩn
bể thận, sinh dục,
tiền liệt tuyến, da
và mô mềm.

Phổ rộng với Gram (-), một số cả trên
P.aeruginosa; Phổ mở rộng trên
Gram (+), cả S. pneumoniae và các vi
khuẩn đã kháng penicillin.
Một số có thời gian bán thải dài hơn.

Đợt cấp của viêm
phế quản mạn tính,

viêm phổi mắc
phải ở cộng đồng,
nhiễm khuẩn mô
mềm, xương.

Thế hệ III
Levofloxacin
Moxifloxacin
Gemifloxacin
Gatifloxacin

Thế hệ IV
Alatrovafloxacin Như thế hệ III. Phổ mở rộng với các
Grepafloxacin
vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn không
Trovafloxacin
điển hình.
Một số có thời gian bán thải dài hơn.

5

Như thế hệ I, II,
III (trừ nhiễm
khuẩn niệu phức
tạp), nhiễm khuẩn
đường hô hấp, ổ
bụng, vùng chậu.


1.2.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu

Hiện nay, các kháng sinh quinolon thế hệ I ít sản xuất, kháng sinh thế hệ
IV ít hoặc hầu như chưa sản xuất ở Việt Nam. Các kháng sinh thế hệ II và III
được sản xuất khá phổ biến. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số
kháng sinh quinolon nhóm II và III sau:
Ciprofloxacin hydroclorid
- CTPT: C17H18FN3O3.HCl.
- CTCT:

.HCl

- KLPT: 367,8.
- Độ tan: Tan trong nước; khó tan trong MeOH, EtOH [6].
Norfloxacin
- CTPT: C16H18FN3O3.
- CTCT:
- KLPT: 319,3.
- Độ tan: Rất khó tan trong nước, khó tan trong ACN và EtOH 96 % [4].
Ofloxacin
- CTPT: C18H20FN3O4.
- CTCT:
- KLPT: 361,38.
- Độ tan: Ít tan trong nước hoặc EtOH [6].
1.3. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu
1.3.1. Sắc ký lỏng khối phổ
1.3.1.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
❖ Khái niệm:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển
của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân

6


bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1].
❖ Nguyên tắc:
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng
một dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ
di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân
bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác
nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân
tích định tính và định lượng.
1.3.1.2. Sắc ký lỏng khối phổ

❖ Khái niệm:
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân
tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
performance liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối
(m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS).
Nguồ n
ion hóa

Tứ cực
thứ nhất

Buồng
va chạm

Tứ cực
thứ hai

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

❖ Nguyên tắc:
Sau khi đươ ̣c tách trong hê ̣ thố ng sắ c ký lỏng, mẫu cầ n phân tích sẽ đi
qua mô ̣t ố ng dẫn đế n đầ u dò MS. Ta ̣i đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồ ng
ion hóa áp suất khí quyển (API - Atmospheric Pressure Ionization) với kiể u ion
hóa phun điện tử (ESI - Electrospray Ionizaton), ion hoá hoá học ở áp suất khí
quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization - APCI), hoă ̣c ion hóa bằ ng
photon ta ̣i áp suấ t khí quyể n (Atmospheric Pressure Photoionization - APPI).
7


Ion sinh ra được tập trung, gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân
tích khối ta ̣o ra tín hiêụ đă ̣c trưng ta ̣i bô ̣ phâ ̣n phát hiêṇ ion. Từ đó, xác định các
chất.

❖ Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)
- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị
khối phổ. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột
sắc ký.
- Bộ phận chuyển (interface) từ hệ thống sắc ký lỏng (LC) vào khối phổ (MS):
Bộ phận chuyển có nhiệm vụ chuyển các thành phần phân tích từ cột LC vào
nguồn MS. Bộ phận chuyển thực sự cần thiết vì các thiết bị LC và MS về cơ
bản không tương thích. Pha động trong hệ thống LC là chất lỏng có áp suất cao,
máy phân tích của MS thường hoạt động dưới chân không (khoảng 6-10 torr).
Vì vậy, không thể trực tiếp bơm từ cột LC vào nguồn MS. Nhìn chung, bộ phần
chuyển là một phần cơ học đơn giản của hệ thống LC-MS/MS chuyển lượng
chất phân tích cực đại, loại bỏ một phần của pha động được sử dụng trong LC
và bảo vệ bản chất hóa học của các chất phân tích. Theo yêu cầu, bộ phận
chuyển không nên can thiệp vào hiệu quả ion hóa và điều kiện chân không của

hệ thống MS. Ngày nay, bộ phận chuyển được áp dụng rộng rãi dựa trên các
phương pháp ion hoá áp suất khí quyển (API) như ion hoá bằng phun điện tử
(ESI), ion hoá hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) và ion hoá bằng photon ở
áp suất khí quyển (APPI).
- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân
tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các
mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao. Ion
phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tính
được tỷ số khố i lươ ̣ng ion/điê ̣n tích (m/z).
Có ba kiểu hình thành ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton
8


– ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI), Ion hóa bằ ng photon ta ̣i áp suấ t khí quyể n (Atmospheric
Pressure Photonization – APPI).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng máy phân tích với bộ phận ion
hóa bằng kỹ thuật ESI để ion hoá các phân tử trung hoà thành các ion phân tử,
các mảnh ion hoặc các gốc mang điện tích. Đây là kỹ thuật ion hóa được ứng
dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử
lớn, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein hoặc các polyme
công nghiệp như polyethylen glycol.
Với kỹ thuật ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện
thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ
mang điện tích tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm
bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Đến một giới hạn, các hạt sương bị phân
chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá
trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Sau đó, các
ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi
vào bộ phân tích khối.

Hình 1.2. Sơ đồ tạo ion dương bằ ng nguồ n ESI
- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion
sẽ được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ
9


trường để đi đến bộ phận phát hiện.
Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion
(Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube).
Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện
đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với
tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào
tứ cực.
Hiện nay, bộ phân tích khối tứ cực chập ba được sử dụng phổ biến trong
kỹ thuật LC-MS/MS và đây cũng là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong
nghiên cứu này. Cấu tạo gồm ba tứ cực được ghép nối với nhau. Trong đó, tứ
cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định
từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực thứ 2 (Q2) với áp suất
cao, các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar,
He. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3 có nhiệm vụ tách
các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận phát hiện.
- Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch
đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron
(electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier).
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến
nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinod làm bật ra các electron.
Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinod tiếp theo và sẽ tạo ra
electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron.

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các
ion ban đầu đập vào một dinod tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân
electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng
ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động
10


như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân
quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.
- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system):
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và
phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử
lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được. Mô ̣t số kỹ thuâ ̣t ghi phổ trong
đầ u dò khố i phổ bao gồm:
+ Quét toàn phổ (SCAN):
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion
để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích.
Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn.
Đố i với đầ u dò khố i phổ ba tứ cực, chế đô ̣ Full scan MS thường đươ ̣c lựa cho ̣n
để khảo sát ion me ̣, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành
thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất.
+ Selected Ion Monitoring (SIM):
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc
trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được
lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các
thư viện có sẵn. Đố i với đầ u dò khố i phổ ba tứ cực, chế đô ̣ SIM thường đươ ̣c
lựa cho ̣n để khảo sát năng lươ ̣ng phân mảnh khi đã biế t ion me ̣.
+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring).
Đố i với khố i phổ ba tứ cực, 2 kỹ thuâ ̣t ghi phổ có đô ̣ nha ̣y cao thường

đươ ̣c sử du ̣ng là SRM và MRM.
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cầ n quan tâm và đưa vào đầu dò để
phát hiện.
11


MRM: trên thực tế , do yêu cầ u về mă ̣t kỹ thuâ ̣t đố i với phân tích vi lươ ̣ng
nên các ion con cầ n quan tâm thường từ 2 ion trở lên, do vâ ̣y kỹ thuâ ̣t ghi phổ
MRM thông du ̣ng hơn SRM. Đầ u tiên, cô lâ ̣p ion cầ n cho ̣n (ion me ̣) ở tứ cực
thứ nhấ t, phân mảnh ion cô lâ ̣p đó ta ̣i tứ cực thứ 2 (thực chấ t là buồ ng va cha ̣m)
thu đươ ̣c các ion con, cô lâ ̣p 2 (hoă ̣c nhiề u) ion con cầ n quan tâm ở tứ cực thứ
3 và đưa vào đầ u dò để phát hiên.
̣

❖ Ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ:
Do sắc ký lỏng khối phổ có độ chọn lọc và độ nhạy cao, nên nó thường
được sử dụng để xác định hoạt chất, chấ t cấ m lượng siêu vết trong các mẫu có
thành phần phức tạp. Một số ứng dụng được sử dụng phổ biến như:
- Định tính, định lượng thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh học.
- Định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản,
chất cấm trong mỹ phẩm, thực phẩm, môi trường.
- Ngoài ra, còn nhiều ứng dụng khác đang được nghiên cứu sử dụng…
1.3.2. Phương pháp chiết pha rắn
Các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp,
hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân
tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần
phải tách, làm giàu các thành phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều
phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng - lỏng,
sắc ký cột, chiết Soxhlet, chiết pha rắn (Solid Phase Extraction– SPE)...

nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:
- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc.
- Cô đặc mẫu.
- Lượng mẫu không cần nhiều.
- Lượng dung môi tiêu thụ ít.
- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu.
12


- Đơn giản, nhanh.
Dựa trên các mối liên hệ giữa đặc tính chất phân tích, nồng độ, nền mẫu
mà chúng tôi chọn phương pháp SPE để xử lý mẫu.
Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp chiết dựa vào sự phân tán của chất
phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được chiết từ pha lỏng vào
pha rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào các ống nhỏ. Pha
lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ lại trên
ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác phù hợp.
Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể tích dịch ban
đầu. Vì thế qua SPE, ngoài tác dụng làm sạch có thể thực hiện thêm bước làm
giàu mẫu. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tương tự như trong sắc ký lỏng,
có thể là dẫn chất polysiloxan, polyme tạo pha liên kết, ngoài ra còn có cả pha
không liên kết. Tùy theo đặc tính của pha rắn mà có thể chia thành các loại cột
có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha đảo hay trao đổi ion.
Có 2 cơ chế tách chất phân tích khỏi mẫu nhờ chiết pha rắn:
+ Các chất tạp, nhiễu được rửa giải khỏi cột, chỉ có chất phân tích được lưu
giữ lại sao cho lượng tạp chất trong chất phân tích được giảm thiểu tối đa, chất
phân tích sau đó được rửa giải bằng một dung môi rửa giải mạnh, bay hơi tới
cắn hoặc trực tiếp đem đi phân tích.
+ Tạp chất, chất nhiễu được giữ lại trên cột, chất phân tích đi ra theo pha lỏng
được thu hồi.

Quy trình chiết pha rắn gồm 4 giai đoạn:
+ Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để hoạt hóa các
nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung
môi.
+ Nạp mẫu: Trước khi nạp mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ để đưa
mẫu vào môi trường phù hợp sao cho giai đoạn này phải lưu giữ được toàn bộ
13


chất phân tích trên cột. Chất phân tích cùng một số chất khác được giữ lại trên
cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh cạnh tranh và ảnh
hưởng đến quá trình tương tác của chất phân tích với pha tĩnh.
+ Rửa tạp chất: Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất khác có liên
kết với pha tĩnh. Phải chọn được dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa tan và
kéo được các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích.
+ Rửa giải: Chất phân tích lưu giữ trên cột được hòa tan và kéo ra khỏi cột
bằng một dung môi phù hợp. Cần phải tối ưu loại dung môi rửa giải, thể tích
dung môi rửa giải, pH dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải…để có thể rửa giải
được tối đa chất phân tích nhưng rửa giải tối thiểu các tạp chất còn trên cột [8],
[14].
1.4. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng quinolon trong nước thải
Các kháng sinh quinolon có phổ tác dụng rộng, hoạt lực mạnh, được sử
dụng trong nhiều trường hợp, nên đây là những kháng sinh được quan tâm
nghiên cứu nhiều với nền mẫu phong phú như: trong chế phẩm, dịch sinh học,
các nguồn nước tự nhiên đến nước thải sinh hoạt, bệnh viện, công ty dược.
Phương pháp định tính, định lượng cũng đa dạng từ phương pháp vi sinh, quang
học, HPLC detector huỳnh quang với độ nhạy và tính chọn lọc cao, nhưng lại
khó có thể phân tích các nhóm kháng sinh có trong nước thải với nồ ng đô ̣ thấp
(ppb). Các nghiên cứu sử dụng trên hê ̣ thống LC–MS/MS trên nền mẫu nước
thải cũng được thế giới nghiên cứu, nhưng chưa được áp dụng với nước thải

công nghiệp dược ở Việt Nam.
Một số nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon như
sau:
- Dương Hồng Anh và cộng sự (2007) đã phân tích lượng vết một số kháng
sinh họ Floquinolon trong nước thải bệnh viện dựa trên hai giai đoạn chiết tách
và làm giàu bằng phương pháp SPE sử dụng cột chiết cation hỗn hợp, định
14


tính, định lượng bằng HPLC với detector huỳnh quang. Quy trình có hiệu suất
thu hồi cao (trung bình 84 – 101 %), giới hạn định lượng 0,5 – 1 μg/l [2].
- Nguyễn Thị Hạnh (2015) đã xây dựng phương pháp xác định dư lượng
một số kháng sinh quinolon trong nước thải công nghiệp dược bằng LCMS/MS. Phương pháp có độ thu hồi cao (77,75 – 114,93 %), giới hạn phát hiện,
giới hạn định lượng đến nồng độ ppb (từ 0,66 ng/ml - 0,5 ng/ml) [5].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp đã xây dựng của
Nguyễn Thị Hạnh để ứng dụng phân tích dư lượng các kháng sinh nghiên cứu
trong nước thải của các nhà máy sản xuất dược phẩm.
- Jay E.Renew và Ching Hua Huang (2004) đã định lượng đồng thời các
kháng sinh fluoroquinolon trong nước thải bằng phương pháp LC-MS sử dụng
cột C18, tốc độ 0,25 ml/phút, chương trình gradient: pha động A (1 mM
CH3COONH4; 0,007 % acid acetic băng; 10 % ACN), pha động B (100 %
ACN). Phương pháp có độ thu hồi trên 90 % với 1 µg/l với các chất phân tích,
giới hạn phát hiện trong khoảng 20 – 50 ng/l [13].
- Vishal Diwan và cộng sự (2010) đã xây dựng và đánh giá dư lượng của 7
kháng sinh, trong đó có ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin
trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ. Nghiên cứu đã sử dụng kỹ
thuật chiết pha rắn và phương pháp LC-MS/MS với LOD của phương pháp từ
0,01 đến 2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh [22].
- N. Dorival – Garcia và cộng sự (2013) đã xây dựng phương pháp phát hiện
13 kháng sinh quinolon trong nước thải sử dụng chiết pha rắn và hệ thống

HPLC- MS/MS sử dụng cột UPLC. Giới hạn phát hiện của phương pháp trong
khoảng 0,02 – 0,04 ng/ml, giới hạn định lượng trong khoảng 0,07 – 0,15 ng/ml,
thu hồi từ 98,5 % – 103,9 % tùy thuộc vào mỗi kháng sinh [20].

15


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chất nghiên cứu: ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin.
Mẫu trắ ng: nước thải của các cơ sở sản xuấ t đã kiể m tra bằ ng sắ c ký lỏng
khố i phổ , không phát hiê ̣n thấ y các kháng sinh nghiên cứu (dưới giới ha ̣n phát
hiên).
̣
Mẫu thử: nước thải của các công ty sản xuất dược phẩm.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn
Bảng 2.1. Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Tên chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Acetonitril

Merck (Đức)

HPLC

Hóa

Methanol

Merck (Đức)

HPLC

chất,

Acid hydrocloric

Trung Quốc

PA

thuốc

Acid formic

Merck (Đức)

HPLC

thử

Natri edetat

Merck (Đức)

PA

Nước cất
Ofloxacin

Chất
chuẩn

Norfloxacin

Hàm lượng

36,36 %

Tinh khiết
Viện KNTW
SKS: 310887.02
Viện KNTW
SKS: 0208148

Ciprofloxacin

Viện KNTW

hydroclorid

SKS: 0315029.03

Trimethoprim

CIL - Mỹ

13C3

SKS: SDED-02

16

Chuẩ n VKN

99,99 %

Chuẩ n VKN

99,14 %

Chuẩ n VKN

93,27 %

TCCS

50 µg/ml