Xây dựng phương pháp xác định s allyl cystein trong tỏi và chế phẩm tỏi bằng sắc ký lỏng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ THÙY LINH
1201318

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
S-ALLYL CYSTEIN TRONG TỎI VÀ
CHẾ PHẨM TỎI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ THÙY LINH
1201318

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
S-ALLYL CYSTEIN TRONG TỎI VÀ
CHẾ PHẨM TỎI BẰNG SẮC KÍ LỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ
Người hướng dẫn:
ThS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được cảm ơn ThS. Đặng Thị Ngọc Lan – Giảng
viên Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội, người
đã chỉ bảo, giúp đỡ và động viên em rất nhiều trong suốt quá trình thực
hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới
ThS. Vũ Ngân Bình và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa phân
tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất và
giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Ban giám hiệu,
phòng Đào tạo cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã
trang bị cho em những kiến thức và kỹ năng trong thời gian em theo học
dưới mái trường.
Cuối cùng, lời cảm ơn thân thương nhất em muốn gửi đến gia đình, bạn
bè, những người đã luôn động viên và âm thầm giúp đỡ em trong suốt thời
gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Đặng Thị Thùy Linh


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng, biểu
Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về tỏi................................................................................................... 2
1.1.1. Tổng quan về tỏi tươi ..................................................................................... 2
1.1.2. Tổng quan về tỏi đen ...................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về SAC ............................................................................................... 5
1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất ......................................................................... 5
1.2.2. Tác dụng dược lý............................................................................................ 5
1.2.3. Các phương pháp xác định ............................................................................. 6
1.3. Tổng quan về sắc ký lỏng..................................................................................... 9
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng............................................................................ 9
1.3.2. Nguyên tắc của sắc ký tạo cặp ion ............................................................... 10
1.3.3. Nguyên tắc của phương pháp tạo dẫn xuất .................................................. 10
1.3.4. Ứng dụng ...................................................................................................... 12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 12
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ................................................................................. 12
2.1.1. Đối tượng ..................................................................................................... 12
2.1.2. Nguyên liệu .................................................................................................. 12
2.1.3. Thiết bị ......................................................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 13
2.3.1. Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký ..................................................................... 13
2.3.2. Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký ......................................................... 13
2.4. Thẩm định phương pháp định lượng .................................................................. 13
2.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 16
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 17
3.1. Chuẩn bị các dung dịch ...................................................................................... 17
3.2. Khảo sát .............................................................................................................. 17

3.2.1. Khảo sát quy trình định lượng trực tiếp ....................................................... 17
3.2.2. Khảo sát quy trình định lượng bằng tạo cặp ion .......................................... 19
3.2.3. Khảo sát quy trình định lượng bằng tạo dẫn xuất ........................................ 21
3.3. Thẩm định phương pháp định lượng .................................................................. 29
3.3.1. Độ chọn lọc .................................................................................................. 29
3.3.2. Độ phù hợp của hệ thống ............................................................................. 31
3.3.3. Đường chuẩn .............................................................................................. 32
3.3.4. Độ lặp lại của phương pháp ...................................................................... 33
3.3.5. Độ đúng của phương pháp ........................................................................ 34
3.3.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ ........................ 35
3.3.7. Hiệu suất chiết .............................................................................................. 35
3.4. Xác định hàm lượng SAC trong mẫu tỏi đen, tỏi tươi, cao tỏi .......................... 36
3.5. Bàn luận ............................................................................................................. 37
3.5.1. Lựa chọn phương pháp................................................................................. 37
3.5.2. Điều kiện xử lý mẫu ..................................................................................... 38
3.5.3. Xây dựng phương pháp định lượng ............................................................. 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

ACN

Acetonitril

DAD

Diod Array Detector

Tiếng Việt

Detector mảng diod

DĐVN

Dược điển Việt Nam

FLD

Detector huỳnh quang

HPLC
MeOH
MS

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

Methanol
Mass Spectrometry

NXB

Khối phổ
Nhà xuất bản

RSD

Relative Standard Deviation

SAC

S-allyl-L-cystein

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

S/N

Signal/Noise

Tín hiệu/Nhiễu đường nền

Ultraviolet Visible

Phổ tử ngoại – Khả kiến

UV-VIS

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng
1.1

Nội dung
Các nghiên cứu định lượng SAC trong tỏi đen và chế

Trang
7

phẩm tỏi
3.1

Diện tích pic của dẫn xuất SAC tại các pH khác nhau

28

3.2

Thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử

30

3.3

Độ phù hợp hệ thống

32

3.4

Bảng biều thị giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu

33

3.5

Giá trị hàm lượng của SAC trong mẫu tỏi đen

34

3.6

Kết quả biểu thị % tìm lại của khối lượng chuẩn thêm

35

vào
3.7

Kết quả hiệu suất chiết

36

3.8

Kết quả xác định hàm lượng của SAC trong mẫu tỏi và

37

chế phẩm tỏi


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Nội dung

Trang

1.1

Sơ đồ chuyển Alliin thành Allicin

2

1.2

Sơ đồ chuyển GSAC thành SAC nhờ enzym γ-GTP

4

1.3

Công thức cấu tạo S- allyl cystein

5

3.1

SKĐ của mẫu chuẩn ở điều kiện sắc ký 1

18

3.2

SKĐ của mẫu thử ở điều kiện sắc ký 1

18

3.3

SKĐ của mẫu chuẩn ở điều kiện sắc ký quy trình 3

20

3.4

SKĐ của mẫu tỏi đen ở điều kiện sắc ký quy trình 3

20

3.5

SKĐ của mẫu tỏi trắng với pha động là đệm phosphat

22

3.6

SKĐ của mẫu tỏi đen với pha động là đệm phosphat

22

3.7

SKĐ của mẫu tỏi đen với pha động là đệm acetat

22

3.8

SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 1

23

3.9

SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 2

24

3.10

SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 3

24

3.11

SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 4

25

3.12

Phổ UV của sản phẩm dẫn xuất hoá của SAC

26

3.13

SKĐ của mẫu thử khi chiết bằng nước

26

3.14

SKĐ của mẫu thử khi chiết bằng hệ dung môi

26

nước:methanol
3.15

Khảo sát đệm borat pH=8.5

27

3.16

Khảo sát đệm borat pH=9.0

28

3.17

Khảo sát đệm borat pH=9.2

28

3.18

SKĐ của mẫu trắng

30


3.19

SKĐ của chuẩn SAC

30

3.20

SKĐ của mẫu tỏi trắng

30

3.21

SKĐ của mẫu tỏi đen M5

31

3.22

Mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

33

SAC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỏi là cây trồng phổ biến ở nước ta. Trong những năm gần đây, tỏi và
các chế phẩm tỏi (điển hình là tỏi đen) thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên
cứu do có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của ung thư. Sau quá
trình lên men tỏi tạo thành tỏi đen, khả năng chống oxy hóa của tỏi tăng lên
đáng kể [6], [13]. Hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen
cũng tăng tên, trong đó đáng chú ý là S-allyl-L-cystein (SAC). Đây là chất có
hoạt tính chống oxy hóa, ức chế sự phát triển ung thư, hạ đường huyết và hạ
cholesterol [16].
Hiện nay tỏi đen được sử dụng khá phổ biến nhưng chưa có tiêu chuẩn
cụ thể đối với chất lượng của tỏi đen. Ở Việt Nam các nghiên cứu về SAC trong
tỏi đen vẫn còn khá ít. Năm 2012, Học viện quân y đã nghiên cứu định lượng
SAC trong tỏi đen bằng HPLC [3]. Tuy nhiên, nghiên cứu này còn nhiều hạn

chế do ảnh hưởng khá nhiều của nền mẫu. Do đó cần xây dựng một phương
pháp tách tốt hơn để định lượng SAC trong tỏi đen. Bên cạnh đó, ở Việt Nam
hiện nay chưa có nghiên cứu về hàm lượng SAC trong tỏi tươi và các chế phẩm
tỏi khác như cao tỏi. Vì vậy, tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp xác
định S-allyl cysteine trong tỏi và chế phẩm tỏi bằng sắc ký lỏng” để góp phần
phục vụ công tác kiểm nghiệm và cung cấp thêm các lựa chọn cho các nhà phân
tích với hai mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng SAC trong tỏi và chế
phẩm tỏi bằng sắc kí lỏng.
2. Ứng dụng phương pháp trên để định lượng SAC trong tỏi và một số chế
phẩm tỏi trên thị trường.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về tỏi
1.1.1. Tổng quan về tỏi tươi
a. Đặc điểm thực vật và phân bố:
Tỏi, còn được gọi là đại toán, có tên khoa học là Allium sativum L., họ
Hành (Aliaceae). Tỏi là cây thảo, thân hành, hình trụ ép vào nhau quanh một
trục lõi, phía dưới mang nhiều rễ phụ. Lá phẳng và hẹp, hình dài, mỏng, bẹ to
và dài có rãnh dọc, đầu nhọn hoắt, gân song song, hai mặt nhẵn. Cụm hoa mọc
ở ngọn, bao bọc bởi những lá mo có mũi nhọn rất dài, hoa màu trắng hay hồng
có cuống hình sợi dài, bao hoa gồm 6 phiến hình mũi mác, xếp thành hai hàng,
thuôn, nhị 6 chỉ nhị có cựa dài, dính vào các mảnh bao hoa, bầu gần hình cầu.
Quả nang [5]. Bộ phận dùng là củ tỏi. Tại Việt Nam có nhiều vùng đất trồng
tỏi nổi tiếng như: Lý Sơn, Phan Rang...
b. Thành phần hóa học:
Tỏi tươi chứa khoảng 62,8% nước, 6,3% protein, 0,1% chất béo, 29%

hydratcacbon, Ca 0,00003%, P 0,000031, Fe 0,0013%, vitamin C 0,013%.
Thành phần chủ yếu trong tỏi là allicin (C6H10OS2) một hợp chất chứa
lưu huỳnh có tính kháng khuẩn, đặc biệt là đối với chủng Staphllococcus,
thương hàn, phó thương hàn, tả, trực khuẩn bạch hầu, vi khuẩn thối. Allicin
được taọ thành từ alliin nhờ enzym alliinase theo phản ứng sau [2].

alliinase
Alliin

Allicin
Hình 1.1. Sơ đồ chuyển Alliin thành Allicin

2


Allicin rất dễ kết hợp với cystein, một acid amin chứa gốc SH tạo thành
C6H11O2S2. Gốc SH có vai trò quan trọng trong sự sinh sản của vi khuần. Nhờ
đó allicin ức chế sự sinh sản của vi khuẩn [2].
Trong tỏi chứa hợp chất polysaccharid có Se-GPS ức chế sự phá hoại
màng hồng cầu và có khả năng vận chuyển gốc tự do có oxy hoạt động [5].
Ngoài ra trong tỏi còn có một số hợp chất saponin steroid có hoạt tính chống
nấm và một số pectin như arabinose, manose, glucose [5].
c. Công dụng
Tỏi được sử dụng như một gia vị phổ biến trong bữa ăn hằng ngày. Ngoài
ra tỏi còn được biết đến trong vai trò một vị thuốc Đông y vị cay, tính ôn, quy
kinh can và vị với tác dụng thanh nhiệt giải độc, sát trùng, chữa băng đới, nhọt,
hạch ở phổi, tiêu đờm, đầy chướng, đại tiểu tiện khó... [2]
Tỏi có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm, ức chế sự phát triển của tụ
cầu vàng, trực khuẩn lao, E. Coli, trực khuẩn mủ xanh, Candida… [2]. Tỏi làm
giảm cholesterol và lipid huyết tương, sự chuyển hóa mỡ do ức chế enzym

HMG-CoA reductase [5]. Tỏi cũng có tác dụng chống tăng huyết áp và tác dụng
hạ đường huyết khi dùng cao nước, cồn tỏi hoặc bột tỏi [26]. Tỏi có tác dụng
chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do, ức chế sự oxy hóa LDL [5]. Tỏi còn được
dùng chữa các bệnh hô hấp như viêm phổi, hen suyễn hay hen mãn tính do ức
chế giải phóng histamin khỏi tế bào ưa kiềm và tế bào mast [17].
1.1.2. Tổng quan về tỏi đen
Mặc dù có rất nhiều tác dụng, tỏi có mùi hôi rất khó chịu do có chứa
allicin và các thành phần gây mùi khác. Vì vậy, các nhà khoa học Nhật Bản,
Hàn Quốc đã nghiên cứu lên men tỏi tươi tạo ra tỏi đen để khắc phục nhược
điểm này. Tỏi đen là sản phẩm lên men từ tỏi tươi ở nhiệt độ 70-80oC và độ ẩm
thích hợp trong 1-3 tháng [20]. Sản phẩm thu được có màu đen vị ngọt, không

3


còn mùi vị hăng cay của tỏi tươi do enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóa
alliin thành allicin bị ức chế bởi độ ẩm của quá trình chế biến tỏi đen [8].
Trong quá trình lên men sẽ xảy ra phản ứng chuyển hoá các hợp chất
chứa lưu huỳnh như methionin, cystein, methanethiol thành những hợp chất
mới chứa lưu huỳnh tan được trong nước như S-allyl-L-cystein, alliin, isoalliin,
cycloalliin, các dẫn chất của cystein, dẫn chất tetrahydro-β-carboline [28]. Quy
trình lên men tự nhiên cũng làm cho hàm lượng carbohydrat tăng từ 28,7%
(trong tỏi) lên tới 47,9% (trong tỏi đen), nhờ đó tỏi đen có vị ngọt của trái cây
vì trong thành phần tỏi có chứa đường, acid amin và sau quá trình lên men sẽ
tạo ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen. Do đó tỏi sau khi lên men tự nhiên
sẽ chuyển thành màu đen, vị ngọt, không còn mùi cay, hăng của tỏi thông
thường.
Đặc biệt sau khi lên men hàm lượng SAC trong tỏi đen tăng lên đáng kể,
có thể cao hơn gấp 5-6 lần trong tỏi tươi [10]. Hàm lượng SAC thay đổi rất
nhiều phụ thuộc vào điều kiện lên men như nhiệt độ hay thời gian lên men.

Sang Eun Bae và các cộng sự đã chỉ ra rằng khi lên men ở 40oC hàm lượng
SAC trong tỏi đen sẽ cao nhất vì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym
γ-GTP (γ-glutamyl transpeptidase) xúc tác cho phản ứng thủy phân chuyển
GSAC (glutamyl-S- allylcysteine) thành SAC [11]. Sơ đồ của phản ứng này
được thể hiện ở hình 1.2.

γ-GTP
GSAC

SAC

Hình 1.2. Sơ đồ chuyển GSAC thành SAC nhờ enzym γ-GTP

4


Như vậy sau quá trình lên men, hàm lượng SAC trong tỏi tăng lên do sự
chuyển hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh như methionin, cystein, methanethiol
và phản ứng thủy phân chuyển GSAC thành SAC. Hàm lượng SAC tăng lên
trong tỏi đen làm dịch chiết tỏi đen có một số tác dụng vượt trội so với tỏi tươi
như: tác dụng chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, ức chế tế bào ung thư [28].
1.2. Tổng quan về SAC
1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất
SAC có danh pháp IUPAC: (R)-3-(Allylthio)-2-aminopropanoic acid và
có các tên gọi khác nhau như S-allylcystein, L-deoxyalliin. Liên kết -C-S- là
phần hoạt động mạnh nhất của phân tử SAC, mang đến hoạt tính sinh học của
phân tử này. Công thức cấu tạo của SAC được thể hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3. Công thức cấu tạo S- allyl cystein
SAC có công thức hóa học: C6H11NO2S, khối lượng phân tử: 161,222.

Điểm nóng chảy: 223,3 – 223,7oC, điểm sôi: 300oC
SAC tan tốt trong nước: 137 mg/ml, pKa1=2,53; pKa2= 9,14.
SAC không có hệ liên kết đôi liên hợp nên khả năng hấp thụ tử ngoại –
khả kiến (UV-VIS) rất kém.
1.2.2. Tác dụng dược lý
a. Tác dụng chống oxy hóa
SAC có hoạt tính chống oxy hóa cao nhờ khả năng loại bỏ gốc tự do, tiền
chất oxy hóa, kích thích hoạt động của enzym chống oxy hóa và ức chế enzym
oxy hóa [15].

5


b. Tác dụng trong điều trị ung thư
SAC được chứng minh có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tuyến tiền liệt,
ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư CWR22 [14], ức chế sự phát triển và
di căn của ung thư gan [21]. Ngoài ra, SAC còn được biết đến với các tác dụng
ức chế sự phát triển của ung thư phổi tế bào không nhỏ [30].
c. Tác dụng với đường huyết
Tác dụng bảo vệ của SAC trên tuyến tụy được thí nghiệm trên mô hình
chuột bị gây tiểu đường bằng streptozotocin (STZ). Mức đường huyết được
kiểm soát sau khi sử dụng SAC. Hiệu quả của SAC được so sánh với glyclazide,
một thuốc hạ đường huyết. Những phát hiện này gợi ý rằng SAC có tác dụng
điều trị trong tiểu đường [24]. Đối với những người mắc bệnh tiểu đường thì
SAC giúp tăng sản xuất insulin giúp vận chuyển glucose đi đến các tế bào, làm
hạ đường huyết [25].
d. Tác dụng với các bệnh lý thần kinh
SAC làm giảm đáng kể tình trạng thiếu máu não và chảy máu não, chống
lại quá trình oxy hóa và ngăn chặn các tổn hại đến tế bào thần kinh, giúp làm
giảm tổn thương não sau khi bị tắc động mạch não [9]. SAC có tác dụng hạn

chế một số bệnh lý liên quan đến thoái hóa synap thần kinh và các bệnh viêm
khớp có liên quan đến Alzheimer [23].
e. Nâng cao miễn dịch
Dịch chiết tỏi đen làm tăng cường hệ thống miễn dịch trên chuột [31].
f. Tác dụng khác
SAC có tác dụng bảo vệ tim, giảm kích thước nhồi máu, tỉ lệ tử vong
trong điều trị nhồi máu cơ tim [27]. SAC giúp cải thiện cholesterol máu thông
qua cơ chế làm gián đoạn chuyển hóa cholesterol [29].
1.2.3. Các phương pháp xác định

6


Một số phương pháp phân tích SAC trong tỏi và tỏi đen được liệt kê
trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Các nghiên cứu định lượng SAC trong tỏi đen và chế phẩm
tỏi
Tên tác giả
Chử Văn Mến
và cộng sự
(2012) [3]
Arnaul T. và
cộng sự
(2005) [8]

Sanghee Lee
và cộng sự
(2014) [18]

Mẫu

Chuẩn
bị mẫu

Pha động

C18 (150 x
4,6 mm; 5
μm)

H3PO4 0,1%
trong nước và
ACN

LOQ 28,2
ng/ml,
LOD 8,46
ng/ml

C18 (150×3
mm; 3µm)

NaH2PO4, acid
heptanesulfonic,
pH= 2,1 và
ACN

LOD
29,67
µg/ml

Tỏi đen

Nước ép
tỏi tươi
đun
nóng

90 phút
40oC

Nước
70oC

Sanghee Lee
và cộng sự
(2014) [18]

Tỏi đen

Tỏi đen

UV

Nước.
Tạo dẫn
xuất với
dansyl
clorid

C18 (250x
4,6 mm; 5
µm)

CH3COONa và
MeOH

C18 AccQTag
(150x3,9
mm)

AccQ-Tag
(CH3COONa
140 mM,
triethylamin 17
mM, EDTA 1
mM, pH 5,05),
ACN, nước

C18 (50x2,1
mm; 1,8
μm)

Acid formic
0,1% trong
amoni acetat 20
mM (pH 3,5) và
acid formic
0,1% trong
ACN.

Nước.
Sang Eun Bae
et al. và cộng
sự (2012)
[10]

Detector

Nước
Tỏi đen

Tạo dẫn
xuất với
AccQFlour
trong
ACN

MeOH

LOD,
LOQ

Pha tĩnh

7

LOD 0,23
µg/g,
LOQ 0,71

µg/g

LOD 6,28
µg/ml,
FLD

MS

LOQ
19,02
µg/ml

LOD 0,02
µg/ml


SAC trong nước ép tỏi, tỏi đen được chiết bằng dung môi nước hoặc
methanol ở nhiệt độ thường hoặc 40oC, 70oC. Phương pháp được sử dụng phổ
biến để phân tích SAC trong tỏi đen là HPLC kết nối với các detector khác
nhau. Trong đó có 3 detector chính là hấp thụ UV-VIS, huỳnh quang (FLD) và
khối phổ (MS).
a. Phương pháp HPLC với detector UV
SAC trong tỏi đen có thể được phân tích trực tiếp không qua tạo dẫn
xuất; tạo cặp ion hoặc dẫn xuất hoá với dansyl clorid trước khi phân tích bằng
HPLC.
- Chử Văn Mến và các cộng sự đã ứng dụng và phát triển phương pháp
sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UV để xác định trực tiếp hàm lượng SAC
trong tỏi đen Lý Sơn [3]. Các tác giả sử dụng điều kiện phân tích sắc ký khá
đơn giản: Cột optimapak C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm dung dịch
H3PO4 0,1% trong nước và ACN, bước sóng phát hiện ở 210 nm. Tuy nhiên

trên sắc ký đồ, pic của SAC chưa được tách hoàn toàn khỏi nền mẫu thử.
- Tác giả Arnault và cộng sự [8] đã phát triển phương pháp xác định SAC
trong tỏi đen, sử dụng kỹ thuật tạo cặp ion. Tác giả sử dung cột Hypurity Elite
C18 (150 × 3 mm; 3µm), pha động bao gồm 20 mM NaH2PO4 và 10 mM acid
heptanesulfonic trong nước, pH= 2,1 (điều chỉnh bằng acid orthophosphoric
850 mL/L) và ACN. Bước sóng phát hiện là 208 nm. Giới hạn phát hiện của
phương pháp là 29,67 µg/mL, còn tương đối cao.
- Tác giả Sanghee Lee và cộng sự [18] đã phát triển phương pháp HPLC
bằng cách tạo dẫn xuất của SAC với dansyl clorid (Dns-Cl). Tác giả lấy 0,1 mL
dịch ép tỏi trộn với 0,25 mL thuốc thử dansyl clorid (Dns-Cl) 10 mM trong
ACN và 0,65 mL đệm borat 20 mM (pH 9,2) ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
Sản phẩm sau đó được lọc và chạy HPLC.

8


Tác giả sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm); pha động gồm natri
acetat 50 mM (điều chỉnh pH về 5 bằng acid formic) và methanol (MeOH); thể
tích tiêm 10 µl; bước sóng phát hiện 250 nm. LOD là 0,23 µg/g, LOQ là 0,71
µg/g. Tuy nhiên thời gian phân tích dài (72 phút).
b. Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang
-

Năm 2012, Sang Eun Bae và các cộng sự [10] đã phát triển và thẩm định

phương pháp xác định SAC trong tỏi đen bằng cách tạo dẫn xuất với AccQFlour (1-[(quinolin-6-ylcarbamoyl)oxy]pyrrolidin-2,5-dion).
Mẫu được phản ứng với thuốc thử AccQ-Flour (khoảng 10 mM AccQ-Flour
trong ACN). Tác giả sử dụng cột C18 AccQ-Tag (150 x 3,9 mm; 4µm), nhiệt
độ cột 37oC. Bước sóng kích thích là 250 nm và bước sóng phát xạ là 395 nm.
Pha động gồm AccQ-Tag (140 mM CH3COONa, 17 mM triethylamine, 1 mM

EDTA, pH 5,05), ACN và nước.
Phương pháp này có LOD là 6,28 µg/mL và LOD là 19,02 µg/mL. Trong
phân tích SAC, sử dụng phương pháp HPLC-FLD có LOD, LOQ thấp hơn xấp
xỉ bốn lần so với phương pháp định lượng trực tiếp bằng HPLC-UV.
c. Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS
-

Tác giả Sanghee Lee và cộng sự [18] đã phát triển phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ (LC-MS/MS) để xác định
SAC từ tỏi. Tác giả sử dụng cột C18 Zorbax Eclipse XDB (50 mm x 2,1 mm;
1,8 μm). Pha động bao gồm dung dịch acid formic 0,1% trong amoni acetat 20
mM (pH 3,5) và 0,1% formic acid trong ACN. Giới hạn phát hiện của phương
pháp là 0,02 µg/mL.
1.3. Tổng quan về sắc kí lỏng
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng

9


Sắc kí lỏng là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất
trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng. Sắc kí
lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào
pha tĩnh sử dụng [1]. Tùy vào ái lực với pha động và pha tĩnh mà chất phân tích
sẽ được rửa giải ra khỏi cột với tốc độ khác nhau.
1.3.2. Nguyên tắc của sắc ký tạo cặp ion
Các chất phân cực khi phân tích bằng sắc ký pha đảo thông thường sẽ ít
bị lưu giữ và bị rửa giải ra sớm. Một trong những phương pháp hay dùng để
tăng thời gian lưu giữ các chất này là tạo cặp ion. Cặp ion gồm các ion có điện
tích trái dấu được giữ gần nhau không phải bằng các liên kết hóa học mà bởi

lực tĩnh điện. Các amin hữu cơ, muối amoni có độ dài mạch khác nhau là các
tác nhân tạo cặp ion hay được sử dụng cho chất phân tích dạng anion. Các
sulfonat thơm hoặc sufonat mạch hydrocarbon dài là các tác nhân tạo cặp ion
hay được sử dụng cho các chất phân tích dạng cation. Mạch alkyl của chất tạo
cặp ion càng dài và nồng độ càng cao thì lực lưu giữ chất phân tích càng lớn.
Ngoài ra còn có các chất tạo cặp ion dễ bay hơi như trifluoroacetic acid và
heptaflourobutyric acid… Cặp ion tạo thành có ái lực với pha tĩnh lớn hơn chất
phân tích ban đầu, do đó sẽ tăng lưu giữ trong sắc ký pha đảo [12].
1.3.3. Nguyên tắc của phương pháp tạo dẫn xuất
Phương pháp tạo dẫn xuất là phương pháp thực hiện phản ứng hóa học
gắn nhóm chức vào chất phân tích, làm biến đổi tính chất lý hóa của chất phân
tích, thuận tiện cho quá trình xử lý mẫu, tách và phát hiện chất. Một phản ứng
tạo dẫn xuất hay gặp là gắn các nhóm mang màu có khả năng hấp thụ UV tốt
từ một tác nhân dẫn xuất hóa vào chất phân tích. Phương pháp này được áp
dụng trong trường hợp chất phân tích không hấp thụ UV-VIS hoặc độ hấp thụ
rất thấp, khó phát hiện bằng detector UV-VIS. Dẫn xuất của chất phân tích tạo
thành có khả năng hấp thụ UV-VIS tốt hơn, do đó có thể phát hiện bằng detector
10


UV-VIS. Ngoài ra, một số phản ứng dẫn xuất hóa sinh ra sản phẩm có khả năng
phát huỳnh quang và có thể phát hiện bằng detector huỳnh quang. Dẫn xuất hóa
cũng làm tăng khả năng tách do sản phẩm dẫn xuất hóa thường được lưu giữ
lâu hơn trên cột, đặc biệt với các phân tử nhỏ và rất phân cực. Như vậy phương
pháp tạo dẫn xuất được sử dụng để gắn nhóm chức giúp phát hiện chất phân
tích bằng detector, tăng độ chọn lọc, độ nhạy, cải thiện khả năng tách, thay đổi
độ tan, hiệu suất chiết… Dẫn xuất hóa có thể được thực hiện trước cột hoặc sau
cột.
Một số chất hay được dẫn xuất hóa khi phân tích bằng sắc ký lỏng là các
amin mạch thẳng, acid amin, hợp chất có nhóm carbonyl và hydroxyl… Trong

đó tác nhân được sử dụng phổ biến cho phân tích acid amin là FMOC-Cl (9Fluorenylmethoxycarbonyl chloride), dansyl clorid, OPA…[23]. Khi tạo dẫn
xuất với dansyl clorid có nhiều ưu điểm so với FMOC và OPA về độ sạch của
đường nền và khả năng tách [19].
Cơ chế phản ứng với amino acid của dansyl clorid:
Dan-C1+ H2O
Dan-C1+ amino acid

Dan-OH +HCl (1)
Dan-amino acid + HC1 (2)

Phản ứng (1) là phản ứng thủy phân của Dan-Cl, xảy ra nhanh ở pH lớn
hơn 10 [16]. Phản ứng 2 xảy ra khi nhóm amin tồn tại ở dạng –NH2. Như vậy
cần lựa chọn pH để phản ứng (2) xảy ra và phản ứng (1) ít xảy ra. Thông thường
pH cần khống chế dưới 9,5 [16].
1.3.4. Ứng dụng
a. Định tính
- So sánh thời gian lưu của chất cần phân tích và thời gian lưu của chất chuẩn
khi chạy trong cùng điều kiện sắc ký.
- Chồng phổ UV-VIS của chất thử với chất chuẩn: hệ số match > 0,995

11


- Kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức
hoặc số khối [1]
b. Định lượng
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic.

12

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 . Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Đối tượng
❖

Đối tượng nghiên cứu: SAC

❖

Đối tượng phân tích: tỏi tươi, tỏi đen (một nhánh và nhiều nhánh), cao tỏi
đen

2.1.2. Nguyên liệu
❖ Chất chuẩn: SAC (Sigma Aldrich, số lô: LC43355, hàm lượng: 98%)
❖ Hóa chất, dung môi:
- Dansyl clorid (Số lô: A0380771, hàm lượng 98%)
- Acetonitril, methanol loại dùng cho HPLC (Merck, Đức)
- Triethylamin, natri tetraborat, acid borat, amoni acetat, acid acetic băng, kali
dihydro phosphat, acid phosphoric (Merck, Đức).
2.1.3. Thiết bị
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies Series 1200với detector
DAD, phần mềm Agilent Chemstation (Agilent, Mỹ).
- Cột sắc kí: Gemini C18 (150 x 4,6 mm; 3 μm) (Phenomenex)
Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) (Agilent)
Apollo C18 5u (150 x 4,6 mm; 5 μm) (Alltech)
Zobax SB-C18, (150 x 4,6 mm; 5 μm)
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)
- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan)

- Cân phân tích Satorius TE214S có độ chính xác ± 0,1 mg (Đức)
- Cân kỹ thuật Satorius TE412 (Đức)
- Máy đo pH Mettler Toledo EF20/EL20 (Thụy Sĩ)
- Màng lọc Cellulose acetat 0,45 µm (Satorius Stedim Biotech, Đức)

13


2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát điều kiện sắc ký
- Khảo sát quy trình xử lý mẫu
- Thẩm định phương pháp định lượng
+ Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp
+ Độ phù hợp của hệ thống
+ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
+ Độ đúng, độ lặp lại của phương pháp
+ Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký
❖ Dung dịch chuẩn
Pha dung dịch chuẩn SAC gốc 2000 ppm: cân chính xác khoảng 10 mg SAC
chuẩn vào bình định mức 5 ml, thêm nước đến vạch, bọc tối, bảo quản ở -80oC.
❖ Dung dịch thử
Các mẫu tỏi được đồng nhất hóa, chiết siêu âm bằng dung môi nước hoặc
hỗn hợp dung môi nước và methanol.
2.3.2. Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký
a. Khảo sát quy trình chiết mẫu: khảo sát dung môi chiết, số lần chiết
b. Khảo sát các điều kiện sắc ký để xác định SAC
- Quy trình định lượng trực tiếp bằng sắc ký lỏng: khảo sát pha tĩnh, pha động,
bước sóng phát hiện

- Quy trình định lượng bằng tạo cặp ion: khảo sát tác nhân tạo cặp ion, pha tĩnh,
pha động, bước sóng phát hiện
- Quy định lượng SAC bằng phương pháp tạo dẫn xuất: khảo sát điều kiện dẫn
xuất hoá, pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện.
14


2.4. Thẩm định phương pháp định lượng
Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ chọn lọc, khoảng tuyến tính
và đường chuẩn, độ phù hợp của hệ thống, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp,
giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ.
❖ Độ chọn lọc
- Độ chọn lọc là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất
như tiền chất, chất chuyển hóa, các chất tương tự…
- Cách xác định: Phân tích mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng trong cùng điều kiện
sắc ký. Mẫu trắng phải không được cho tín hiệu phân tích. Thời gian lưu của
mẫu chuẩn và mẫu thử phải tương đương nhau.
❖ Độ phù hợp của hệ thống:
- Độ phù hợp của hệ thống được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên
cùng một mẫu chuẩn.
- Cách xác định: Pha một mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc ký 6
lần với điều kiện đã lựa chọn. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic yêu
cầu là RSD ≤ 2%.
❖ Độ tuyến tính:
- Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa
đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định.
Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+ b và hệ số tương quan r.
- Cách xác định: Phân tích ít nhất 5 mẫu chuẩn, xây dựng phương trình hồi quy
tuyến tính giữa diện tíc pic và nồng độ SAC trong mẫu chuẩn. Từ các thông số
thu được tính toán hệ số tương quan r, yêu cầu r ≥ 0,99.

❖ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

15


- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ
thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu
trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được.
- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu
thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ
chính xác mong muốn.
- Cách xác định: Dựa trên tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu (S/N)
Pha loãng mẫu chuẩn đến nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của
chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N).
Trong đó

S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích.
N: Nhiễu đường nền.

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu
đường nền, thông thường lấy S/N = 3.
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần
nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10.
❖ Độ lặp lại
- Độ lặp lại: là mức độ gần nhau giữa các kết quả riêng lẻ của các phép đo theo
đúng quy trình thử nghiệm được lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn
S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%).
- Cách xác định: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi
tiêm vào hệ thống sắ ký và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD
≤ 7,3% ở mức nồng độ 10 μg/g [7].

❖ Độ đúng (độ thu hồi)
- Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị
trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận
là đúng.

16