Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG COA reuctase in vitro và áp dụng sàng lọc một số dược liệu

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ THỊ BÍCH NGA
MÃ SINH VIÊN: 1201398

TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH
GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ HMG-COA
REUCTASE IN VITRO VÀ ÁP DỤNG
SÀNG LỌC MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ THỊ BÍCH NGA
MÃ SINH VIÊN: 1201398

TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH
GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ HMG-COA
REUCTASE IN VITRO VÀ ÁP DỤNG
SÀNG LỌC MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Thùy Dương

Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới TS. Nguyễn Thùy Dương, DS. Phạm Đức Vịnh – Bộ môn Dược Lực –
Trường Đại học Dược Hà Nội, người cô, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn,
giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên cũng
như các bạn đã và đang cùng em nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược lực – Trường
Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất, nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ, động
viên để em có thể hoàn thành khóa luận này.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo trong Ban giám hiệu, Phòng đào
tạo và các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những
kiến thức quý báu trong suốt năm năm em học tập tại trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người luôn theo sát chăm
lo, động viên khích lệ em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài vừa qua.
Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Hồ Thị Bích Nga


MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Mối quan hệ giữa rối loạn lipid máu, tăng cholesterol và enzym HMG-CoA
reductase ..................................................................................................................3
1.1.1. Định nghĩa rối loạn lipid máu ...................................................................3
1.1.2. Tăng cholesterol và vai trò của enzym HMG-CoA reductase ..................3
1.1.3. Thuốc ức chế HMG-CoA reductase ..........................................................4
1.2. Enzym HMG-CoA reductase ...........................................................................6
1.2.1. Nguồn gốc, phân bố ..................................................................................7
1.2.2. Cấu trúc, cơ chế hoạt động ........................................................................7
1.2.3. Động học enzym .....................................................................................10
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác bởi enzym ........................11
1.3. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro ..13
1.3.1. Phương pháp quang phổ ..........................................................................13
1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ..................................13
1.3.3. Kỹ thuật đồng vị phóng xạ (RI) ..............................................................14
1.3.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .........................................................14
1.4. Các nghiên cứu tìm kiếm dược liệu theo hướng điều trị rối loạn lipid máu và
ức chế HMG-CoA reductase .................................................................................15
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới ...................................................................15
1.4.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ..................................................................16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
...................................................................................................................................17
2.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................17


2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ..............................................................................17
2.1.2. Chuẩn bị các mẫu dược liệu ....................................................................19
2.2. Phương tiện nghiên cứu .................................................................................19
2.2.1. Hóa chất ..................................................................................................19
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................20

2.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................20
2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................21
2.4.1. Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym HMG-CoA
reductase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng .......................................................21
2.4.2. Áp dụng sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro trên đĩa
Costar 96 giếng của một số dược liệu. ..............................................................26
2.5. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................29
3.1. Kết quả ...........................................................................................................29
3.1.1. Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase
in vitro trên đĩa Costar 96 giếng........................................................................29
3.1.2. Áp dụng sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro trên đĩa
Costar 96 giếng của một số dược liệu. ..............................................................36
3.2. Bàn luận .........................................................................................................38
3.2.1. Về triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase
in vitro trên đĩa Costar 96 giếng........................................................................38
3.2.2. Về sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro trên đĩa Costar
96 giếng của một số dược liệu ..........................................................................42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CoA-SH, CoA

Coenzym A

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DTT

Dithiothreitol

EDTA

Acid ethylen diamin tetraacetic

HDL-C

Lipoprotein tỷ trọng cao

HMG-CoA

3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A

HMG-CoA reductase

3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A reductase

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

IC50

Nồng độ ức chế 50%

LDL-C

Lipoprotein tỷ trọng thấp

LS-CM/CM

Sắc kí lỏng khối phổ

MVA

Acid mevalonic

MVAL

Mevalonolacton

NADPH

Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat

OD

Mật độ quang

RLLPM

Rối loạn lipid máu

TG

Triglycerid

TLTK

Tài liệu tham khảo

VLDL-C

Lipoprotein tỷ trọng rất thấp


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Hiệu quả làm giảm LDL-C tương đối giữa các mức liều các statin. ..........5
Bảng 2.1. Danh sách các dược liệu dùng trong nghiên cứu. .....................................18
Bảng 3.1. Tốc độ tiêu thụ NADPH trong thời gian khảo sát ở các nồng độ enzym khác
nhau. ..........................................................................................................................30
Bảng 3.2. Tốc độ tiêu thụ NADPH trong thời gian khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau.
...................................................................................................................................32
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của atorvastatin lên hoạt tính HMG-CoA reductase ở các nồng
độ khác nhau. ............................................................................................................34
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của 10 dược liệu ở nồng độ 100 µg/ml đến
hoạt tính HMG-CoA reductase. ................................................................................36


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp cholesterol..........................................................................4
Hình 1.2. Cấu trúc HMG-CoA reductase người và vị trí gắn của HMG-CoA, NADP
trong các tetramer (A: Mặt trước, B: Mặt sau). ..........................................................8

Hình 1.3. Cấu trúc monomer của HMG-CoA reductase người. .................................9
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của HMG-CoA reductase.............................................10
Hình 1.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym HMG-CoA reductase. ......12
Hình 2.1. Quy trình thí ngiệm khảo sát động học enzym. ........................................22
Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng được
xúc tác bởi enzym HMG-CoA reductase. .................................................................23
Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất HMG-CoA
đến phản ứng của enzym HMG-CoA reductase. ......................................................24
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase của
atorvastatin. ...............................................................................................................25
Hình 2.5. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase của
các mẫu thử dược liệu. ..............................................................................................27
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ quang theo thời gian với các dung dịch
enzym có nồng độ khác nhau. ...................................................................................29
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ quang theo thời gian ở các nhiệt độ
khác nhau...................................................................................................................31
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc theo thời gian của tốc độ tiêu thụ NADPH ở
các nồng độ HMG-CoA khác nhau. ..........................................................................33
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự ức chế HMG-CoA reductase của artovastatin ở các nồng
độ khác nhau. ............................................................................................................35
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự ức chế HMG-CoA reductase của các mẫu thử dược liệu
ở nồng độ 100 µg/ml. ................................................................................................37


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cholesterol là thành phần quan trọng của tất cả màng tế bào nhân chuẩn. Trong
máu, cholesterol được vận chuyển dưới dạng kết hợp với protein hay còn gọi là các
lipoprotein. Duy trì sự cân bằng nồng độ cholesterol có vai trò rất quan trọng đối với
sự phát triển cơ thể khỏe mạnh. Mất cân bằng nồng độ cholesterol có thể gây ra nhiều
bệnh lý. Trong đó, cholesterol máu tăng là một trong những yếu tố nguy cơ phát triển

các bệnh lý mạch vành (CAD) đồng thời làm tăng sự phát triển của các gốc tự do,
đóng vai trò trong sự phát sinh bệnh lý khác ngoài bệnh mạch vành như ung thư, viêm
[17], [22]. Hiện nay các bệnh lý tim mạch chiếm 1/3 tổng số ca tử vong trên toàn thế
giới, các chuyên gia dự báo đến năm 2020, các bệnh lý tim mạch là nguyên nhân hàng
đầu gây tử vong và tàn tật trên toàn thế giới [34], [46].
Các thuốc hóa dược trong điều trị rối loạn lipid máu đang được sử dụng tương
đối rộng rãi bao gồm các statin, nhựa gắn acid mật (resin), fibrat, acid nicotinic …
Trong đó, các statin là nhóm thuốc đầu tay được sử dụng cho bệnh nhân tăng
cholesterol máu với khả năng dung nạp khá tốt. Đích tác dụng của các statin là enzym
HMG-CoA reductase, một enzym đóng vai trò then chốt trong quá trình tổng hợp
cholesterol. Điều này gợi ý quá trình phát triển các thuốc mới có thể lựa chọn hướng
nghiên cứu ức chế hoạt động của enzym này. Để bổ sung, hỗ trợ cho các hóa dược,
nguồn nguyên liệu sinh học ngày càng được quan tâm nghiên cứu trong điều trị bệnh
rối loạn lipid máu. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu để tìm kiếm các dược liệu
có tác dụng ức chế HMG-CoA reductase trong điều trị bệnh lý liên quan đến tăng
cholesterol [33], [53]. Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu sinh học rất phong phú, cùng
với kinh nghiệm lâu đời trong sử dụng thuốc YHCT để điều trị các bệnh lý liên quan,
có thể cung cấp một nguồn có giá trị cho sàng lọc các dược liệu có tác dụng ức chế
enzym HMG-CoA reductase. Tuy nhiên, hiện chưa có công bố liên quan đến các
phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase trong nước.
Xuất phát từ những thực tế như vậy, với mong muốn xây dựng một phương
pháp sàng lọc, xác định nhanh dược liệu có tiềm năng trong điều trị rối loạn lipid máu

1


thông qua ức chế enzym HMG-CoA reductase, chúng tôi thực hiện đề tài “Triển khai
phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro và áp dụng
sàng lọc một số dược liệu” với hai mục tiêu:
1. Triển khai được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym HMG-CoA

reductase in vitro trên đĩa 96 giếng.
2. Áp dụng phương pháp đã triển khai để sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA
reductase của một số dược liệu có tiềm năng trong điều trị tăng cholesterol máu.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Mối quan hệ giữa rối loạn lipid máu, tăng cholesterol và enzym HMG-CoA
reductase
Lipid trong cơ thể gồm các thành phần chính: phospholipid (PL), triglycerid
(TG), cholesterol tự do (FC), cholesterol ester (CE) và acid béo tự do [6], [12].
1.1.1. Định nghĩa rối loạn lipid máu
Rối loạn lipid máu (RLLPM) là tình trạng bệnh lý khi có một hoặc nhiều thông
số lipid bị rối loạn (tăng triglycerid, tăng cholesterol huyết tương, cholesterol tỷ trọng
thấp (LDL-C), hoặc giảm cholesterol tỷ trọng cao (HDL-C), …) [2], [14]:
- Tăng cholesterol toàn phần (TC): khi nồng độ cholesterol ≥ 6,2 mmol/L
(Bình thường < 5,2 mmol/L).
- Tăng triglycerid (TG): khi nồng độ triglycerid ≥ 4,5 mmol/L (Bình thường
< 2,26 mmol/L).
- Giảm HDL-C: khi nồng độ HDL – C máu ≤ 0,9 mmol/L (Bình thường > 0,9
mmol/L).
- Tăng LDL-C: khi nồng độ LDL-C ≥ 3,4 mmol/L (Bình thường < 3,4
mmol/L).
- RLLPM hỗn hợp: TC > 6,2 mmol/L và TG khoảng 2,26- 4,5 mmol/L.
1.1.2. Tăng cholesterol và vai trò của enzym HMG-CoA reductase
Lipid trong huyết tương bao gồm nhiều thành phần khác nhau, trong đó
cholesterol và triglycerid là hai thành phần chính [47]. Tăng cholesterol máu được
định nghĩa là mức cholesterol toàn phần trong huyết thanh ≥ 6,2 mmol/L hoặc đang
sử dụng thuốc hạ lipid [14], [43]. Cholesterol được tổng hợp chủ yếu ở gan và ruột.

Quá trình tổng hợp cholesterol có thể chia thành 4 giai đoạn [4], trong đó giai đoạn
tạo mevalonat được xem là giai đoạn then chốt [40] (Hình 1.1).
Mevalonat (MVA) được tạo thành từ 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A
(HMG-CoA) dưới xúc tác HMG-CoA reductase [88]. Trong tế bào, nồng độ MVA
được kiểm soát chặt chẽ thông qua hoạt tính của HMG-CoA reductase, enzym xúc
tác giảm bốn electron của HMG-CoA để chuyển thành MVA và CoA-SH.
3


Acetyl CoA

HMG-CoA
Giai đoạn 1

HMG-CoA reductase
Mevalonat

Giai đoạn 2
Isopren
Giai đoạn 3
Squalen
Giai đoạn 4
Cholesterol
Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp cholesterol.
1.1.3. Thuốc ức chế HMG-CoA reductase
Tăng cholesterol toàn phần, LDL-C hoặc giảm HDL-C dẫn đến nguy cơ mắc
bệnh lý mạch vành, bệnh mạch não và mạch máu (CHD). Trong đó, xơ vữa động
mạch dẫn đến các biểu hiện thiếu máu cục bộ là một trong những hậu quả nghiêm
trọng nhất của rối loạn lipid máu [47].
Các loại thuốc hiện có để làm giảm cholesterol, đặc biệt là LDL-C bao gồm:

các statin, ezetimib, chất gắn acid mật, chất ức chế PCSK9, lomitapid và mipomersen
[26]. Trong đó, liệu pháp điều chỉnh lipid được biết đến nhiều nhất là sử dụng các
statin – chất ức chế HMG-CoA reductase [38], [71]. Các nghiên cứu cho thấy statin
làm giảm sự tiến triển của bệnh xơ vữa động mạch, giảm nhồi máu và tỷ lệ gặp các
biến cố tim mạch [19]. Hiện nay có 7 chất ức chế HMG-CoA reductase (các statin)
được phê duyệt ở Hoa Kì để làm giảm cholesterol, đây là những thuốc đầu tay trong
điều trị rối loạn lipid và có thể làm giảm LDL-C đến 60%. Ba statin có nguồn gốc từ
nấm (lovastatin, simvastatin và pravastatin) và bốn statin được tổng hợp (atorvastatin,
rosuvastatin, fluvastatin và pitavastatin) [26]. Lovastatin là chất ức chế HMG-CoA
reductase đầu tiên, được phê duyệt vào năm 1987 để điều trị chứng tăng cholesterol
máu [16].
4


• Cơ chế tác dụng
Tất cả các statin đều có cấu trúc tương tự phần HMG của HMG-CoA, sự khác
nhau ở chỗ các statin có cấu trúc cồng kềnh và kị nước hơn [38]. Khi statin gắn với
HMG-CoA reductase, các chất này sẽ ngăn chặn sự tiếp cận của cơ chất HMG-CoA
với trung tâm hoạt động của enzym, ngăn cản sự tổng hợp mevalonat [26], [72]. Căn
cứ vào phần cấu trúc tương tự HMG-CoA, các statin là các chất ức chế cạnh tranh
với HMG-CoA reductase [38]. Bên cạnh đó, chúng làm thay đổi cấu hình của enzym
làm cho enzym không giữ được chức năng bình thường [77]. Sự giảm tổng hợp
cholesterol ở tế bào gan làm gia tăng các thụ thể LDL-C dẫn đến việc tăng cường đưa
LDL-C trong tuần hoàn về gan làm giảm LDL và các tiền thân của nó (IDL, VLDL)
trong tuần hoàn [73].
• Sử dụng trong điều trị tăng cholesterol
Hiệu quả chủ yếu của các statin là giảm LDL-C trong máu. Các statin khác
nhau có thể làm giảm LDL-C mức độ khác nhau trong đó rosuvastatin liều 40 mg
có thể làm giảm LDL-C tối đa 60% (Bảng 1.1.) [26]
Bảng 1.1. Hiệu quả làm giảm LDL-C tương đối giữa các mức liều các statin.

%

Sim

Ator

Flu

Rosu

Pita

(Zocor)

(Lipitor)

(Lescol)

(Crestor)

(Livalo)

27

10 mg

-

20 mg

20 mg

40 mg

-

-

34

20 mg

10 mg

40 mg

40 mg

80 mg

-

1 mg

41

40 mg

20 mg

80 mg

80 mg

-

-

2 mg

48

80 mg

40 mg

-

-

-

10 mg

4 mg

54

-

80 mg

-

-

-

20 mg

-

60

-

-

-

-

-

40 mg

-

Giảm
LDL

Lo

Pra

(Mevacor) (Pravachol)

Chú thích:
Sim: Simvastatin;

Ator: Atorvastatin;

Lo: Lovastatin;

Flu: Fluvastatin;

Rosu: Rosuvastatin; Pita: Pitavastatin.

5

Pra: Pravastatin;


Mức độ giảm LDL-C càng lớn khi bệnh nhân có mức LDL-C ban đầu càng
cao. Ngoài nồng độ LDL-C, các statin cũng làm giảm các cholesterol không phải
HDL-C bao gồm triglycerid, VLDL-C huyết tương [18], [45]. Khả năng làm giảm
triglycerid tương quan với sự giảm LDL-C [78].
• Tác dụng không mong muốn
Sử dụng các statin có thể gặp một số tác dụng không mong muốn: đau đầu,
mất ngủ, chóng mặt, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, táo bón, phát ban, … Tác dụng phụ

nghiêm trọng của các statin bao gồm các tác dụng phụ trên gan và cơ vân [35].
- Trên gan: tổn thương gan nghiêm trọng trên lâm sàng từ statin rất hiếm,
nhưng việc sử dụng statin có thể liên quan đến tổn thương gan và đôi khi có độc tính
trên gan [21].
- Viêm cơ và đau cơ dai dẳng: statin làm tăng các triệu chứng đau cơ, mỏi, yếu
cơ, suy nhược cơ. Một phân tích meta các thử nghiệm mù đôi, có đối chứng placebo
đã cho thấy sự gia tăng tỷ lệ gặp viêm cơ trên bệnh nhân dùng statin so với giả dược
[58]. Viêm cơ được xác định khi creatinin kinase (CK) tăng > 10 lần giới hạn bình
thường trên [58].
- Tiêu cơ vân: tổn thương cơ nghiêm trọng có dẫn đến tăng CK rõ rệt
(rhabdomyolysis). Tiêu cơ vân có thể dẫn đến myoglobin niệu, suy thận và tử vong –
một biến chứng nghiêm trọng của statin khi dùng đơn độc hoặc phối hợp với các
fibrat hay các thuốc có tương tác khác [31], [41], [49].
1.2. Enzym HMG-CoA reductase
HMG-CoA reductase là một enzym oxy hóa xúc tác chuyển đổi HMG-CoA
thành MVA thông việc giảm bốn electron:
HMG-CoA reductase

HMG-CoA + 2NADPH + 2H+

2NADP+ + CoA-SH + Mevalonat

HMG-CoA reductase là enzym xúc tác cho giai đoạn sớm (cùng với gần 20
enzym khác) trong quá trình tổng hợp cholesterol. HMG-CoA reductase là đích tác
dụng của các statin, nhóm thuốc quan trọng làm giảm cholesterol trong máu và điều
trị các bệnh tim mạch [32], [75].

6

1.2.1. Nguồn gốc, phân bố
Enzym HMG-CoA reductase được tìm thấy trong sinh vật nhân chuẩn và sinh
vật nhân sơ. Có hai loại enzym HMG-CoA reductase, các enzym loại I tìm thấy ở
sinh vật nhân chuẩn và một số loài vi khuẩn cổ và các enzym loại II tìm thấy ở vi
khuẩn thực (Eubacteria) và một số loài vi khuẩn cổ khác. Trong sinh vật nhân chuẩn,
HMG-CoA reductase được cố định trong màng của lưới nội chất (glycoprotein xuyên
màng của lưới nội chất) [32].
1.2.2. Cấu trúc, cơ chế hoạt động
• Cấu trúc
HMG-CoA reductase là một chuỗi polypeptid đơn chứa 888 amino acid với
hai đầu -NH2 tận và -COOH tận. Đầu -NH2 tận gắn với sterol của màng lưới nội
chất. Đầu -COOH tận tan trong nước, nằm trong thành phần của tế bào chất cần thiết
cho hoạt động xúc tác của enzym [39].
Cấu trúc phần xúc tác của HMG-CoA reductase được xác định là phần amino
acid 426 đến 888. Ba cấu trúc tinh thể được xác định thông qua việc gắn các cơ chất
khác nhau với phân tử protein. Dạng A chứa HMG và CoA, dạng B chứa HMG-CoA,
dạng C chứa HMG, CoA và NADP+. Mỗi dạng cấu trúc tinh thể chứa 4 đơn vị
monomer trong đơn vị bất đối xứng gọi là các tetramer tương tự nhau nhưng không
hoàn toàn giống nhau. Cả 12 cấu trúc đều chứa phần amino acid 477–863 giống nhau,
trong khi đầu N tận (amino acid 439-476) và đầu C tận (amino acid 863-872) chỉ xuất
hiện ở một số monomer [40].
Phần xúc tác dạng tetramer của HMG-CoA reductase ở người cấu trúc gần
như đối xứng D2 (đối xứng hai mặt), kích thước 110 × 80 × 70 Å. Trong cấu trúc
tetramer, các monomer được sắp xếp thành 2 dimer (được gọi là ‘1’ và ‘2’), mỗi bộ
có 2 vị trí hoạt động. Vị trí hoạt động được hình thành từ các phần acid amin của 2
monomer (gọi là ‘α’ và ‘β’) [40] (Hình 1.2).
Cấu trúc của monomer của HMG-CoA reductase ở người có 3 miền: miền N,
miền L, và miền S (Hình 1.3). Miền N nhỏ nhất có cấu trúc xoắn ∝ (acid amin 460527). Miền L lớn nhất có cấu trúc như một lăng kính, tạo nên kết cấu trung tâm (acid

7

amin 528-590 và 694-892). Miền S được chèn vào miền L giữa Lβ3 và Lα2 kết nối
bởi một sợi β-liên tục và vòng xoắn từ acid amin 682-694 (vòng cis-loop vì có chứa
một cis- peptid giữa các phần acid amin C688 và T689, rất cần thiết cho sự hình thành
vị trí liên kết HMG). Trong phân tử protein đầy đủ, miền N sẽ nối phần xúc tác của
enzym HMG-CoA reductase với màng tế bào, miền L tạo kết cấu trung tâm còn miền
S tạo vị trí gắn kết cho NADP (H) [40].

Hình 1.2. Cấu trúc HMG-CoA reductase người và vị trí gắn của HMG-CoA, NADP
trong các tetramer (A: Mặt trước, B: Mặt sau).
8


Hình 1.3. Cấu trúc monomer của HMG-CoA reductase người.
• Cơ chế hoạt động
Enzym HMG-CoA reductase xúc tác giảm bốn electron của HMG-CoA để
chuyển thành MVA và ngược lại [39]. Phản ứng như sau [32]:
HMG-CoA reductase

(S)-HMG-CoA + 2NADPH + 2H+

(R)-mevalonat + 2 NADP+ + CoA-SH.

Phản ứng trải qua 3 giai đoạn trong đó có hai giai đoạn khử tạo mevaldyl-CoA
và mevaldehyd được xem là giai đoạn trung gian (giai đoạn 1 và 2).
- Giai đoạn 1: HMG-CoA + NADPH + H+ → [Mevaldyl-CoA] + NADP+.
- Giai đoạn 2: [Mevaldyl-CoA] → [Mevaldehyd] + CoA-SH.
- Giai đoạn 3: [Mevaldehyd] + NADPH + H+ → Mevalonat + NADP+.
Cơ chế cụ thể của HMG-CoA reductase được mô tả như hình 1.4 [32]. HMGCoA và NADH liên kết với vị trí hoạt động và vùng mũ (flap domain) được sắp xếp

theo trình tự. Liên kết thioester của HMG-CoA bị biến đổi, anion O- được ổn định
nhờ proton từ Glu83 và liên kết hydro của Lys267. Các hemithioacetal vẫn tồn tại
trong khi các vùng mũ mở và cơ chất NADP+ dạng oxy hóa tách ra. Khi một phân tử
khác của cơ chất NADH dạng khử gắn với vị trí hoạt động của enzym thì vùng mũ
đóng lại. Tiếp theo, Glu83 hỗ trợ xúc tác phân hủy hemithioaxetal tạo mevaldehyd
9


và anion CoA-SH, sau đó được proton hóa bởi cation His381. CoA-SH được cố định
bởi Ser85 và His381. Mevaldehyd bị biến đổi, anion O- tiếp tục được ổn định nhờ
proton từ Glu83 và liên kết hydro của Lys267, vùng đệm bị đảo lộn trật tự, giải phóng
sản phẩm mevalonat.

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của HMG-CoA reductase.
1.2.3. Động học enzym
Hai cơ chất phản ứng để tạo thành hai sản phẩm phản ứng được gọi là phản
ứng bi-bi. Phương trình cho phản ứng bi-bi [9]:
E + AX + B ↔ E + A + BX.
Trong đó: E là enzym, AX và B là cơ chất, A và BX là sản phẩm.
Có ba cơ chế phản ứng bi – bi [9]:
- Các phản ứng bi - bi thứ tự ngẫu nhiên: cơ chất có thể gắn với enzym trước,
sản phẩm có thể tách ra trước, phản ứng xảy ra qua một phức hệ trung gian E-AX-B.

10


- Các phản ứng bi – bi có thứ tự bắt buộc: trong phản ứng này, một cơ chất là
AX phải được gắn với enzym trước khi cơ chất còn lại B gắn vào, phản ứng qua một
phức hệ trung gian E-AX-B.
Các phản ứng kép hay phản ứng bi bi ping – pong: Cơ chế phản ứng có liên

quan đến sự liên kết AX với enzym và sự chuyển nhóm X đến vị trí trên enzym. Sản
phẩm A sau đó được giải phóng, cơ chất thứ 2 là B được gắn vào E-X tạo phức hợp
E-B-X trước khi giải phóng sản phẩm cuối cùng.Vận tốc phản ứng đối với phản ứng
bi bi ping-pong trong trường hợp cố định cơ chất B:
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝐴𝑋 ]

𝑉=

𝐴𝑋 + [𝐴𝑋](1 +
𝐾𝑚

𝐵
𝐾𝑚
)
𝐵

𝐵
Trong đó 𝐾𝑚𝐴𝑋 , 𝐾𝑚
là hằng số Michaelis-Menten cho từng cơ chất AX và B.

Trong các công bố trước đó, thông số Km được xác định nằm trong khoảng
0,007-0,079 mM cho các đồng phân khác nhau của cơ chất HMG-CoA trong điều
kiện thí nghiệm khác nhau. Tuy nhiên một nghiên cứu của Langdon Ronald B. và
Counsell Raymond E. (1976) đã cho thấy hằng số Km đối với đồng phân D-HMGCoA là 1,01± 0,12 µM, thấp hơn 3,5 đến 40 lần so với các công bố trước đó [52].
Trong nhiều nghiên cứu công bố gần đây, hằng số Km đối với cơ chất HMGCoA khoảng 10-5 M [29], [30], [39].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác bởi enzym
• Nồng độ cơ chất
Tốc độ phản ứng enzym phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất tăng,
tốc độ phản ứng xúc tác của enzym tăng, nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức
cao thì tốc độ phản ứng đạt đến cực đại và không tăng nữa. Thời điểm này, enzym

bão hòa cơ chất [4].
• Nồng độ enzym
Tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzym tỷ lệ thuận với hàm lượng enzym, nhưng
khi tăng cao nồng độ enzym thì tốc độ cũng không tăng nữa do các sản phẩm được
tạo ra nhiều sẽ tác động vào vị trí dị lập thể của enzym làm cho phản ứng đạt trạng
thái bão hòa [4].
11


• Nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ của phản ứng enzym lên đến tốc độ cực đại
cho đến khi enzym bị biến tính. Mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10oC tốc độ phản ứng tăng
lên 2 lần. Khi nhiệt độ tăng tới 60-70oC thì phần lớn enzym mất hẳn hoạt tính, nhiệt
độ đó được gọi là nhiệt độ tới hạn [4]. Một số nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu
của HMG-CoA reductase là 37oC [54], [67] (hình 1.6). Ở nhiệt độ -20oC, HMG-CoA
reductase ổn định hoạt tính trong 2 tháng [16].

Hình 1.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym HMG-CoA reductase.
• pH
Enzym rất nhạy cảm với pH môi trường, vì vậy pH có tác động rất lớn đến tốc
độ phản ứng enzym. Mỗi enzym có một pH hoạt động tối ưu nhất. Một sự thay đổi
nhỏ so với pH tối ưu cũng dẫn đến giảm hoạt tính enzym do thay đổi sự ion hóa của
các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzym [4].
• Ion kim loại
Những ion kim loại như Ag+, Hg+, Pb++ có độc tính cao với hầu hết các enzym,
có thể ảnh hưởng đến hoạt động của HMG-CoA reductase. Tác động của ion kim loại
rất phức tạp vì nó tác dụng đến trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [4].

12

• Tác dụng của các chất hoạt hóa
Các chất hoạt hóa có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzym. Các chất
hoạt hóa có bản chất rất khác nhau. Glutathion có tác dụng hoạt hóa một số enzym
oxy hóa khử có nhóm hoạt động -SH [4].
• Tác dụng của các chất ức chế
Chất ức chế là các chất làm giảm tốc độ của phản ứng enzym. Chất ức chế có
thể gây ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế phức hợp enzym cơ
chất [4]. Các statin là chất ức chế hoạt động enzym HMG-CoA reductase theo cơ chế
ức chế cạnh tranh do ngăn cản sự tiếp xúc của cơ chất với enzym, làm giảm tốc độ
phản ứng [26], [72].
1.3. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro
1.3.1. Phương pháp quang phổ
• Nguyên tắc của phương pháp
HMG-CoA reductase

HMG-CoA +2NADPH+ 2H+

2NADP+ + CoA-SH + Mavelonat

Hoạt độ enzym được xác định dựa trên đo tốc độ tiêu thụ NADPH bằng
phương pháp đo quang ở bước sóng 340 nm ở 37oC. Một đơn vị hoạt độ enzym được
định nghĩa là lượng NADPH tiêu thụ bởi 1 mg enzym mỗi phút ở nhiệt độ 37oC.
• Tiến hành
Phương pháp này được nhiều nhóm nghiên cứu áp dụng với những thay đổi
phù hợp với từng điều kiện thực nghiệm [37], [48], [54], [68] … Dung dịch đệm
thường dùng có chứa KCl, EDTA và dithiothreitol (DTT), pH trong khoảng 6,8-7,4,
nhiệt độ 37oC. Phương pháp đo được tiến hành bằng hỗn hợp thử gồm có đệm, cơ
chất HMG-CoA, NADPH và enzym HMG-CoA reductase. Lượng NADPH tiêu thụ
được xác định mỗi 15-20 giây trong 10-15 phút.

1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)
• Nguyên tắc của phương pháp
HMG-CoA reductase xúc tác cho phản ứng chuyển HMG-CoA thành CoA và
mevalonat bằng cách tách bốn electron. Trong cơ thể mevalonat tồn tại cân bằng với

13


trạng thái mevalonolacton (dạng lacton của nó). Hoạt độ enzym được xác định thông
qua lượng mevalonolacton (MVAL) tạo thành.
• Tiến hành
Nhiều phản ứng giám sát (MRM) ở độ phân giải đơn vị được sử dụng để giám
sát quá trình chuyển đổi các hình thức proton của MVAL tại m/z 147,0 → 59,1 và
MVAL-D7 tại m/z 154,0 → 59,1 ở chế độ ion âm. Các quá trình chuyển đổi của m/z
147,0/59,1 và m/z 154,0/59,1 được sử dụng để phát hiện và định lượng
mevalonolacton (MVAL) và MVAL-D7 [81].
1.3.3. Kỹ thuật đồng vị phóng xạ (RI)
Nguyên tắc của phương pháp là đo nồng độ đồng vị phóng xạ trong [14C] acid
mevalonic (MVA) hoặc 5 [32P] phospho-mevalonat được sản xuất từ HMG-CoA [63].
HMG-CoA reductase
(S)-HMG-CoA + 2NADPH + 2H+

(R)-mevalonat + 2NADP+ + CoASH

Chất phóng xạ đặc hiệu gắn với mevalonat được xác định bằng ống đếm tần
số nhấp nháy và GLC (sắc kí lỏng-khí) [63].
1.3.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng tạo mevalonat từ HMG-CoA
và NADPH dưới sự xúc tác của HMG-CoA reductase [61].
Sắc kí lỏng hiệu năng cao theo dõi định lượng cả 2 cơ chất (HMG-CoA và

NADPH) và sản phẩm (CoA, mevalonat, và NADP+).
Hỗn hợp phản ứng gồm HMG-CoA reductase (0,4 μM), NADPH (2,68 mM),
và HMG-CoA (1,55 μM) được ủ ở 37oC, ước lượng thời gian thu hồi và tách bằng
HPLC. Cả chất phân tách và hỗn hợp ủ được tiêm và tách trên cột C18 pha đảo. Hoạt
tính xúc tác enzym được thực hiện ở 37oC trong natri phosphat 100 mM chứa EDTA
1 mM, DMSO 2% và MgSO4 1 mM, pH 6,8. HMG-CoA, NADPH, và NADP+ được
theo dõi trực tiếp trong khi mevalonat được xác định bằng cách theo dõi sự tạo thành
CoA.

14


1.4. Các nghiên cứu tìm kiếm dược liệu theo hướng điều trị rối loạn lipid máu
và ức chế HMG-CoA reductase
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về sự tồn tại của các hoạt chất làm giảm
cholesterol và các chất ức chế HMG-CoA reductase đã được chứng minh trong các
loài thực vật khác nhau. Tỏi (Allium sativum) làm giảm đáng kể cholesterol toàn phần
và LDL-C trong huyết thanh, đồng thời tăng mức HDL-C ở chuột ăn dầu oliu [23],
Morus alba, Melissa officinalis, Artemisia capillaries giảm TG, cholesterol huyết
tương, hạn chế sự tích tụ lipid trong gan, đông thời gia tăng nồng độ mRNA của các
enzym PPARα – chịu trách nhiệm cho quá trình beta oxy hóa chất béo [53], Vitis
vinifera [51], Kiwifruit [48], Ananas comosus [85], Quercus infectoria, Rosa
damascena và Myrtus communis [33] ức chế HMG-CoA reductase, giảm tổng hợp
cholesterol. Một số nghiên cứu về các vị thuốc ở Trung quốc: Đan sâm (Radix salvia
miltiorrhizae) tiêm tĩnh mạch liều 80mg/ngày trong 14 ngày [44], Trạch tả (Rhizoma
alismatis) uống 10g/ngày trong 2 tuần [86], Nhân sâm (Radix Ginseng) nghiên cứu
trên chuột nhắc uống 2mg/kg/ngày trong 90 ngày [50], Hà thủ ô (Radix Polygoni
Multiflori) nghiên cứu trên chuột cống liều 24mg/kg/ngày trong 4 tuần [24],
Gynostemma pentaphyllum [60] có tác dụng làm giảm cholesterol toàn phần, LDLC, TG, tăng HDL-C. Bên cạnh các vị thuốc, nhiều bài thuốc có tác dụng hạ lipid được

nghiên cứu tại Trung Quốc. Bài thuốc "Đan sâm cát căn” giảm cholesterol tự do
và este hóa trong các bạch cầu đơn nhân, giảm nhẹ nồng độ TC và LDL-C ở những
bệnh nhân mắc bệnh động mạch vành [27], "Linh quế truật cam thang", “Quế tinh
phương”, “Giáng chỉ linh phương”, “Thư tâm hoạt huyết phương”, “Trạch tả thang”
cho thấy hiệu quả giảm TC, TG [7] …
Như vậy, điểm qua một số nghiên cứu (thực nghiệm và lâm sàng) về thuốc
YHCT điều trị hội chứng RLLPM trên thế giới đã cho thấy có rất nhiều vị thuốc và
bài thuốc YHCT có tác dụng trong điều chỉnh RLLPM, thể hiện tác dụng rất khả quan
trong điều trị bệnh này. Do đó các thuốc từ dược liệu cần tiếp tục được nghiên cứu
và phát triển để có thể ứng dụng nhiều hơn nữa trong tương lai.

15


1.4.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam
Tài nguyên dược liệu ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng, nền y học cổ
truyền phát triển lâu đời, nhiều loài đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian nhằm
mục đích chữa bệnh [76]. Trong nước đã có một số nghiên cứu tìm kiếm cây thuốc
có tác dụng điều trị rối loạn lipid được công bố. Linh chi Việt Nam (Ganoderma
Luadum) có tác dụng hạ TC, TG, LDL-C và làm tăng HDL-C trên chuột cống trắng
[1]. Bài thuốc “Nhị trần thang” có tác dụng làm giảm 13% TC, 37% TG, 19% LDLC và làm tăng 20% HDL-C [5]. Bài thuốc “Bán hạ bạch truật thiên ma thang” làm
giảm 16% TC, 31,5% TG, 20,2% LDL-C và làm tăng 19,8% HDL-C [13] … Tuy
nhiên, hiện nay chưa có công bố nào liên quan đến đánh giá tác dụng ức chế enzym
HMG-CoA reductase.
Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu tiến hành triển khai phương pháp nhằm
tìm kiếm các dược liệu có tác dụng điều trị rối loạn lipid máu thông qua ức chế HMGCoA reductase. Cốt khí củ, me rừng, phèn đen, đan sâm, dứa dại, trạch tả, bạch truật,
sói rừng, ý dĩ, địa liền là những cây thuốc đã được phát hiện khả năng làm giảm
cholesterol, điều chỉnh rối loạn lipid máu [15], [42], [55], [56], [57], [65], [74], [82],
[84]. Do vậy, chúng tôi lựa chọn các dược liệu này áp dụng vào phương pháp đánh
giá tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase.

16


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Đề tài áp dụng triển khai phương pháp với 10 mẫu dược liệu do khoa Phân
tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu cung cấp từ 2 nguồn:
- Nguồn dự án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dược liệu [3].
- Từ kho lưu trữ của khoa Phân tích – Tiêu chuẩn Viện Dược liệu.
Việc định danh tên khoa học của mẫu dược liệu do cử nhân Ngô Văn Trại,
Viện Dược liệu xác định.
Tiêu chí lựa chọn dược liệu đưa vào nghiên cứu: các dược liệu đã được ghi
nhận hoặc có một loài cùng chi đó đã được ghi nhận có tác dụng điều chỉnh rối loạn
lipid, hạ cholesterol, giảm LDL-C máu.
- Cơ sở dữ liệu để rà soát thông tin và lựa chọn:
+ Tài liệu chuyên khảo (Thực vật – Dược liệu – Dược cổ truyền):
Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi [8], Y học cổ truyền của Hoàng
Trọng Quang [11], Những bài thuốc thần dược của Trung Quốc của Điền Phong Ô
và Trương Thanh Vân [10].
+ Các nghiên cứu về tác dụng hạ cholesterol, LDL-C, điều trị rối loạn
lipid máu của các mẫu dược liệu đó đã được công bố.
Thông tin về các dược liệu nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.

17