VI SINH môi TRƯỜNG báo cáo nhóm 6

BÁO CÁO

VI SINH MÔI TRƯỜNG
PHÂN BIÊT VA GIAI THICH CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TICH

ĐỊNH TINH & ĐỊNH LƯỢNG
VI SINH VẬT
TRONG MÔT MÂU MÔI TRƯỜNG

----------NHÓM 6---------Dương Công Thàng
Nguyễn Trung Bảo
B
C
D


Vi sinh môi trường – Nhóm 6

CHỦ ĐỀ:
Phân biệt và giải thích các phương pháp
Phân tích ĐỊNH TÍNH và ĐỊNH LƯỢNG vi sinh vật
trong một mẫu môi trường (đất, nước)
A/ Phương pháp phân tích ĐỊNH TÍNH vi sinh vật
B/ Phương pháp phân tích ĐỊNH LƯỢNG vi sinh vật
1-

Phương pháp đếm trực tiếp
Là phương pháp định lượng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế
bào vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm.
Đối tượng: mật độ vsv đơn bào có kích thước lớn như nấm men, men, tảo…. có

thể được xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi.
- Ưu điểm: cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật có trong mẫu.
- Nhược điểm:
•
•
•
•
•

Không phân biệt được tế bào sống và chết trong mẫu.
Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và vật thể.
Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp do lượng dung dịch đem đếm
nhỏ.
Độ chính xác không cao, dễ nhầm lẫn.
Không thích hợp mẫu có mật độ vi sinh thấp.

Để hạn chế nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp, có 3 phương pháp đếm
trực tiếp:
•
•
•

Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi hùynh quang
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm breed
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Cách tiến hành:

2-

Phương pháp đếm khuẩn lạc
2


Vi sinh môi trường – Nhóm 6
Khác với phương pháp đếm trực tiếp, phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép
xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là
tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Do vậy
phương pháp này có tên gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc.
Mặc dù có một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là
phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống.
- Ưu điểm: là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp
trong mẫu. phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật
trong nước.có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động.
- Nhược điềm:
+ Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành
màng sinh khối
+ Số lượng khuẩn lạc trên một đĩa quá nhỏ sẻ không có giá trị thống kê
+ Nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ không đủ dài
+ Phương pháp đếm khuẩn lạc dể cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít
nhất 2 đĩa.
3-

Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc
Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong
mẫu nước khi tiến hành các thí nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương
đối thấp. phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong mẫu nước
trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khoảng lạc đếm được
sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích
hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm. Dựa trên khối lượng màu nước ban đầu và quy

ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ tế bào vi sinh vật, người ta quy ra số
lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích nước.
Như vậy phương pháp này là sự kết hợp của các phương pháp lọc vô trùng và
phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri. Màng lọc có kích thước lỗ là 0,45pm
hoặc 0,2 pm được chế tạo từ các nguyên liệu là sợi thủy tinh siêu mánh, sợi
polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trung.
Ngoài màng lọc bình thường hiện nay người ta còn sử dụng màng lọc lưới kị
nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước. các vạch chia ô bằng vật liệu
này ngăn cán sự mọc lan của các khuẩn lạc . khác với trường hợp màng lọc bình
thường , từ số các ô vuông có khoảng lạc mọc, mật độ vi sinh vật trong mẫu nước
được tính và tình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất(mpn) của lượng vi sinh vật
có trong một đơn vị thể tích mẫu theo công thức :mpn = n.ln(n/n-x)
3


Vi sinh môi trường – Nhóm 6
- Ưu điểm: xác định được mật độ vsv cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml;
100ml;…
- Nhược điểm: không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn.
4-

Phương pháp đo độ đục
Ngoài các phương pháp nêu trên, mật độ vi sinh vật c.ó thể đươc xác định một
cách gián tiếp thông qua đo độ đục. khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không
tan thì sẻ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện
trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi
sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường củng làm môi trường
trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn
nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thế xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính
giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một các gián

tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550-610nm. Trong
trường hợp này, trước tiên cần phải thiết lập được đường quan hệ tuyến tính giữa
độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác
định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác định bằng một phương pháp
trực tiếp khác, ví dụ như phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đếm trực
tiếp…
Phương pháp định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức
độ tàng trướng của hai hay nhiều chung vi sinh vật môi trường lỏng. Trong trường
hợp không cần biết giá trị tuyệt đối của mật độ tế bào thì không cần phải xây dựng
đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ.
- Ưu điểm: Phương pháp này cho kết quả nhanh thường được ứng dụng trong
theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trung tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong
phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất.
- Nhược điểm: không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật.

5-

Phương pháp MBN
Phương pháp dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vsv trong các
độ pha loãng khác nhau của mẫu. Hay có thể nói là phương pháp đánh giá số lượng
vi sinh vật có xác xuất lớn nhất hiện diện trên một đơn vị thể tích. Phương pháp
này có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong
môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp.
Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau (thông thường mỗi độ pha loãng
được nuổi cấy lập lại nhiều lần (3-10 lần)). Số lượng ống nghiệm được lặp lại càng
nhiều lần thì độ chính xác càng cao.
4

Vi sinh môi trường – Nhóm 6
Quy trình thực hiện phương pháp này như sau:
+ Cho vào các ống nghiệm có chứa các môi trường thích hợp cho sự tăng
trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích xác định dung dịch
mẫu ở nhiều nồng độ pha loãng liên tiếp.
+ Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
+ Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần
kiểm định trong từng ống nghiệm (ghi nhận số lượng số lượng ở từng độ pha
loãng).
+ Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady, suy ra mật độ vi sinh vật được
trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.
Bảng Mac Crady (hình ảnh)
Các độ pha loãng dk chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương
tính và có một số lần âm tính
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê -> giá trị ước
đoán số lượng vsv trong mẫu
- Ưu điểm : cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích
mẫu lớn.
Link bổ sung nội dung: />
5