Nghiên cứu phương pháp xác định auramin o trong thức ăn chăn nuôi bằng LC MSMS

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HÀ
MÃ SINH VIÊN: 1101139

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN
CHĂN NUÔI BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HÀ
MÃ SINH VIÊN: 1101139

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN
CHĂN NUÔI BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Trần Cao Sơn
ThS. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

i

LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm

H
N

tới những ngƣời đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong thời gian qua.

Ơ

N

hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn của mình

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Phạm Thị Thu Hà

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10
00

B

TR
ẦN

H

Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ẠO

Em cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Đặng Thị Ngọc Lan đã định
hƣớng cho em trong quá trình tìm tài liệu cũng nhƣ góp ý hoàn thành khóa
luận.
Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc
chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân
viên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện
giúp đỡ em trong suốt thời gian nghiên cứu để thực hiện đề tài.
Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn sâu nặng em xin dành cho gia đình,
bạn bè đã chăm sóc, cổ vũ, động viên em trong suốt quá trình học tập cũng
nhƣ trong cuộc sống.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức
nhƣng không tránh khỏi nhƣng thiếu sót, em kính mong nhận đƣợc những ý
kiến chỉ bảo và phê bình của quý thầy cô.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

.Q

U
Y

Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Trần
Cao Sơn, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt
quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

ii

MỤC LỤC ……………………………………………………………...……ii

H

Ơ

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT …………...……….....v

N

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………..i

U
Y

N

DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………...….vi

TP

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

ẠO

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

1.1. Tổng quan về Auramin O ........................................................................... 2

N

G

1.1.1.Khái quát chung .................................................................................... 2

H
Ư

1.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa lý ................................................................... 2

TR
ẦN

1.1.3.Độc tính ................................................................................................. 3
1.1.4.Các quy định về hàm lƣợng của Auramin O ........................................ 4

B

1.2. Tổng quan phƣơng pháp xác định Auramin O .......................................... 4

10
00

1.2.1. Các phƣơng pháp đã đƣợc thực hiện để xác định Auramin O............. 4
1.2.2. Phƣơng pháp LC-MS/MS .................................................................... 8

Ó

A

1.2.2.1. Sắc kí lỏng (HPLC)........................................................................ 9

Í-

H

1.2.2.2. Khối phổ....................................................................................... 10

-L

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13

ÁN

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 13

TO

2.2. Nguyên vật liệu – trang thiết bị................................................................ 13

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ …………………………...….vii

D

IỄ

N

Đ

ÀN

2.2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................. 13
2.2.1.1. Chất chuẩn ................................................................................... 13
2.2.1.2. Hoá chất, dung môi ...................................................................... 13
2.2.2. Trang thiết bị ...................................................................................... 14
2.2.2.1. Thiết bị ......................................................................................... 14
2.2.2.2. Dụng cụ ........................................................................................ 14

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

iii

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 14

Ơ

2.3.2 . Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ..................................................... 15

N

2.3.1. Khảo sát các điều kiện xác định chất màu AUO bằng LC-MS/MS .. 15

H

2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp .................................................................... 15

U
Y

N

2.3.4. Ứng dụng phƣơng pháp ..................................................................... 15

TP

2.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu......................................................................... 16

ẠO

2.4.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu sơ bộ………………………………………16

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

2.4.3. Phƣơng pháp chiết pha rắn………………………………………….16

N

G

2.4.4. Phƣơng pháp thẩm định ..................................................................... 18

H
Ư

2.4.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc ................................................................ 18

TR
ẦN

2.4.4.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng……………………….. 18
2.4.4.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................. 19

10
00

B

2.4.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi................................................................ 19
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................. 20

A

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 21

H

Ó

3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định AuO bằng LC-MS/MS ...................... 21

-L

Í-

3.1.1. Tối ƣu hóa các điều kiện khối phổ ..................................................... 21

ÁN

3.1.1.1. Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm ........................................ 21

TO

3.1.1.2. Tối ƣu hóa các điều kiện MS ....................................................... 22

D

IỄ
N

Đ

ÀN

3.1.2. Lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng .................................................... 23

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 15

3.1.2.1. Chọn pha tĩnh ............................................................................... 23
3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động ..................................................... 23

3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ............................................................ 25
3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu .................................................................. 25
3.2.2. Khảo sát dung môi chiết .................................................................... 26
3.2.3. Khảo sát cột chiết pha rắn SPE .......................................................... 28

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

iv

3.2.4. Khảo sát dung môi rửa giải ................................................................ 29

Ơ

3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc ...................................................................... 31

N

3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích .......................................................... 31

H

3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ................ 32

U
Y

N

3.3.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ................................................... 34

TP

3.4. Kết quả xác định AUO trong một số mẫu TACN.................................... 38

ẠO

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 41

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Kết luận ........................................................................................................... 41

N

G

Kiến nghị ......................................................................................................... 42

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10
00

B

TR
ẦN

PHỤ LỤC

H
Ư

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ...................................................................... 36

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

v

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Amoni acetat

AF

Formic acid

Acid formic

AUO

Auramine O

Auramin O (vàng ô)

Association of Official

Hiệu hội các cộng đồng

Analytical Communities

phân tích chính thức

Atmospheric pressure chemical

Chế độ ion hóa hóa học ở

ionization

áp suất khí quyển

CAV

Cell Accelerator Voltage

Thế gia tốc màng

CE

Collision Energy

ESI

Electronspray ionization

FLD

Fluoroscence detector

Ơ
H
N

U
Y

TP

.Q

B

10
00

Balance

High performance liquid

A

HPLC

ẠO

Đ

G
N

TR
ẦN

H
Ư

Năng lƣợng va chạm

Hydrophilic – lipophilic

HLB

N

Amonium acetate

APCI

Ion hóa phun điện tử
Detector huỳnh quang
Cân bằng ƣa nƣớc- ƣa béo
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

H

Ó

chromatography

Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ

Í-

LC-MS/MS

2 lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SCX

Strong Cation eXchange

Trao đổi cation mạnh

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

TO

ÁN

-L

mass spectrometry

ÀN
Đ
IỄ
N
D

Tiếng việt

AA

AOAC

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Tiếng anh

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Ký hiệu

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

vi

Thin Layer Chromatography

Sắc kí lớp mỏng

WAX

Weak Anion eXchange

Trao đổi anion yếu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10
00

B

TR
ẦN

H
Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ẠO

TP

.Q

U
Y

N

H

Ơ

TLC

N

Thức ăn chăn nuôi

TACN

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

vii

DANH MỤC BẢNG

Ơ

Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định và định lượng Auramin O trong các

N

Bảng 1.1. Giá trị giới hạn quốc tế của Auramin năm 2007.............................. 4

N

H

nền mẫu khác nhau............................................................................................ 5

.Q

LC-MS hoặc LC-MS/MS ................................................................................... 7

TP

Bảng 2.1. Số điểm IP cho các kỹ thuật phân tích ........................................... 18

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ẠO

Bảng 3.1. Các điều kiện phân tích AUO bằng ESI(+)-MS/MS....................... 21

G

Đ

Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS đối với chế độ ion dương .................. 23

H
Ư

N

Bảng 3.3. Chương trình gradient phân tích Auramin O ................................ 24
Bảng 3.4. So sánh các loại dung môi chiết đến diện tích pic của AUO ......... 27

TR
ẦN

Bảng 3.5. Khảo sát cột SPE đến độ thu hồi của AUO .................................... 28

Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải .................................................... 30

10
00

B

Bảng 3.7. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong dung môi ......... 35
Bảng 3.8. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong nền mẫu……….35

Ó

A

Bảng 3.9. Độ lặp lại và thu hồi của AUO trên nền mẫu TACN..................... 37

Í-

H

Bảng 3.10. Kết quả xác định hàm lượng AUO trong một số mẫu TACN tại Hà

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Nội ................................................................................................................... 39

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định Auramin O trong thực phẩm bằng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

viii

H

Ơ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramin O ................................................... 3

N

DANH MỤC HÌNH VẼ

N

Hình 1.2. Mô hình hệ thống LC-MS/MS ........................................................ 11

TP

Hình 3.2. Sắc kí đồ dung dịch chuẩn AUO 50 ng/mL phân tích bởi các hệ

ẠO

gradient ........................................................................................................... 25

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Hình 3.3. Quy trình xử lý mẫu khảo sát .......................................................... 26

N

G

Hình 3.4. Sắc ký đồ AUO khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau ........... 27

H
Ư

Hình 3.5. Khảo sát các loại cột SPE ............................................................... 29

TR
ẦN

Hình 3.6. Quy trình xử lý mẫu tối ưu .............................................................. 31
Hình 3.7. Sắc đồ pic AUO ở mẫu thêm chuẩn, mẫu chuẩn và mẫu trắng ...... 32

B

Hình 3.8. Sắc đồ AUO tại LOD 0,2 ng/mL ( tương đương 8 µg/kg trên mẫu)

10
00

......................................................................................................................... 33
Hình 3.9. Sắc đồ AUO tại LOQ 0,5 ng/mL ( tương đương 20 µg/kg trên mẫu)

Ó

A

......................................................................................................................... 33

Í-

H

Hình 3.10. Đường chuẩn AUO trong dung môi ............................................. 36

-L

Hình 3.11. Đường chuẩn AUO trong nềnmẫu…………………………………..36

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Hình 3.12. Sắc đồ phân tích lặp lại mẫu AUO nồng độ 25 ng/mL……………38

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U
Y

Hình 3.1. Sắc đồ các ion sản phẩm……………………………………………….22

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề nhận đƣợc sự

Ơ

N

quan tâm ngày càng lớn của xã hội và các cơ quan quản lý. Trong những năm

N

H

trở lại đây, việc sử dụng các chất cấm trong chăn nuôi gia súc, gia cầm đã gây

U
Y

nhiều bức xúc và là một vấn đề có nguy cơ tiềm tàng gây ảnh hƣởng tiêu cực

TP

các yêu cầu giám sát gắt gao hơn.

ẠO

Chất Auramin O hay còn gọi là chất vàng ô đƣợc dùng phổ biến trong

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

công nghiệp dệt may, sơn hay tạo màu trong ve quét tƣờng hoặc để nhuộm

N

G

màu vi khuẩn [25]. Ở Việt Nam, các cơ quan chức năng của Bộ NN&PTNT

H
Ư

đã phát hiện đƣợc nhiều cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi trộn chất màu này

TR
ẦN

vào trong thức ăn cho gà với mong muốn tạo màu vàng bắt mắt cho da và
chân gà để dễ bán. Khi ngƣời tiêu dùng ăn thịt gà thì sẽ hấp thụ luôn lƣợng

B

Auramin O còn tồn dƣ, dẫn tới nguy cơ bất lợi cho sức khỏe và có thể gây

10
00

ung thƣ [18]. Chính vì vậy, từ 11/2015 Bộ NN&PTNN đã ban hành thông tƣ

A

bổ sung Auramin O vào danh mục các chất cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh

H

Ó

doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam [2].

Í-

Từ yêu cầu quản lý trên, về mặt chuyên môn cần có các phƣơng pháp

-L

phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát đƣợc lƣợng Auramin

ÁN

O có trong các mẫu thực phẩm cần giám sát. Xuất phát từ nhu cầu thực tế và

TO

những đặc tính ƣu việt của kỹ thuật LC-MS/MS trong phân tích, chúng tôi đã

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

đến sức khỏe con ngƣời. Chính vì vậy, các cơ quan quản lý ngày càng đƣa ra

D

IỄ
N

Đ

ÀN

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp xác định Auramin O trong
thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS” với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định Auramin O trong thức
ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS.
2. Áp dụng phƣơng pháp trên để xác định hàm lƣợng Auramin O trong

một số mẫu thức ăn chăn nuôi trên thị trƣờng.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Auramin O

Ơ

N

1.1.1. Khái quát chung

N

H

Auramin O (dạng muối hydrochlorid) thuộc phân nhóm dẫn xuất

U
Y

ketoimin của nhóm thuốc nhuộm diphenylmethan. Auramin đƣợc tổng hợp

TP

base; CAS N. 101–61–1) với một hỗn hợp gồm ure, acid sulfamic và lƣu

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ẠO

huỳnh trong amoniac ở 175ºC. Auramin sulfat hình thành trong phản ứng có

Đ

thể sử dụng trực tiếp trong quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển sang dạng

N

G

Auramin base hay dạng muối hydrochlorid [20], [28]. Sản xuất Auramin O

H
Ư

diễn ra đầu tiên ở châu Âu nhƣng hiện nay nó chỉ đƣợc sản xuất chủ yếu ở Ấn

TR
ẦN

Độ và Trung Quốc [13].

Thuốc nhuộm Auramin O đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghiệp

10
00

B

nhuộm da, nhuộm giấy, tạo màu sơn. Ngoài ra Auramin O còn đƣợc dùng làm
chất nhuộm màu huỳnh quang trong nhuộm nhanh vi khuẩn acid có trong

A

đờm, mô nhiễm bệnh; kết hợp cùng thuốc nhuộm Rhodamin trong phép

H

Ó

nhuộm Auramin-Rhodamin để phát hiện các vi khuẩn Mycobacterium

Í-

tuberculosis [25].

-L

Auramin O đã từng đƣợc sử dụng ở một số nƣớc nhƣ một loại màu thực

ÁN

phẩm [10]. Auramin O đã đƣợc phát hiện với một tỷ lệ nhỏ ở các mẫu thực

TO

phẩm từ Ấn Độ [30], bao gồm cả đậu Hà Lan tƣơi [24]. Những năm gần đây,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

bằng cách nung nóng 4,4'- bis (dimethylaminodiphenyl) methan (Michler’s

D

IỄ
N

Đ

ÀN

Auramin O cũng đƣợc tìm thấy trong nhiều mẫu thực phẩm ở các quốc gia
nhƣ: Việt Nam và Trung Quốc [16].
1.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa lý
 Tính chất hóa lý [15],[20]
- Tinh thể ánh kim, màu từ vàng nhạt đến vàng nâu.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
3

- Điểm nóng chảy: 267ºC

Ơ

N

- Độ hòa tan: Hơi tan trong nƣớc (10 mg/ml) và ethanol (20

mg/ml); tan trong ethylen glycol, methyl ether (60 mg/ml).

N

H

 Cấu trúc:

TR
ẦN

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramin O
Công thức phân tử : C17H21N3.HCl

10
00

B

Tên đầy đủ: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine]
hydrochlorid

H

1.1.3. Độc tính

Ó

A

Tên gọi khác: Auramin O, basic yellow 2, vàng ô.

-L

Í-

Năm 1933, Muller đã báo cáo 2 ca lâm sàng ung thƣ bàng quang ở công

ÁN

nhân làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất Auramin O [31]. Những năm

TO

sau đó, các nghiên cứu thuần tập đã chỉ ra rằng có một tỷ lệ tƣơng đối cao các

ÀN

công nhân làm việc trong nhà máy sản xuất Auramin bị ung thƣ bàng quang,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

H
Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ẠO

TP

.Q

U
Y

Auramin O có chứa nhân anthraquinon, một nhân thơm có đa vòng nhƣ
công thức cấu tạo dƣới đây:

D

IỄ
N

Đ

tuyến tiền liệt hoặc dạ dày [18]. Các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên
cứu thử nghiệm tác hại của Auramin trên động vật. Kết quả cho thấy,
Auramin O làm tổn thƣơng ADN trên gan, thận, tuỷ xƣơng của chuột nhắt và
chuột cống với liều LD50 là 135 mg/kg [23], gây chết hoặc làm xuất hiện các
khối u lympho trên chuột [8]. Trên thỏ, Auramin O gây chết và làm tăng sinh
các tế bào biểu mô đƣờng tiết niệu gợi ý cho ung thƣ bàng quang [8]. Tổ chức

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
4

nghiên cứu ung thƣ thế giới IARC đã xếp Auramin O vào nhóm 2B là nhóm
các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thƣ cho ngƣời [18].

H

Ơ

N

1.1.4. Các quy định về hàm lượng của Auramin O
Ở châu Âu, việc sản xuất Auramin và Auramin hydrochlorid phải tuân

U
Y

N

theo quy định của chỉ thị 2004/37/EC áp dụng cho các hoạt động mà ngƣời

TP

[11]. Chỉ thị 2004/93/EC ngày 21 tháng 9 năm 2004 xếp Auramin và muối

ẠO

của nó vào nhóm không đƣợc có mặt trong các thành phần của mỹ phẩm [10].

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Bảng 1.1. Giá trị giới hạn quốc tế của Auramin năm 2007 [14]
Giá trị giới hạn –

Giá trị giới hạn-

gia

8 tiếng (mg/m3)

Thời gian ngắn

Ghi chú

H
Ư

N

Quốc

TR
ẦN

(mg/m3)

Australia 0,08 aerosol có thể hít

Hƣớng dẫn nồng độ

hít phải

kĩ thuật (dựa trên

10
00

Thụy Sĩ

B

phải

0,32 aerosol có thể

H

Ó

A

0,08

tính khả thi)

Í-

Ở Việt Nam, Auramin và các dẫn xuất đã bị cấm nhập khẩu, sản xuất,

-L

kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm [2]. Theo quy

ÁN

định của Bộ NN&PTNT, giới hạn phát hiện mà phƣơng pháp thử cần phải đạt

TO

để phân tích Auramin O trong thức ăn chăn nuôi là 1 mg/kg [3].

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

lao động phải tiếp xúc với chất gây ung thƣ hoặc các chất gây đột biến gen

D

IỄ
N

Đ

ÀN

1.2. Tổng quan phƣơng pháp xác định Auramin O
1.2.1. Các phương pháp đã được thực hiện để xác định Auramin O
Nghiên cứu xác định Auramin O đƣợc bắt đầu vào những năm 1970,

1980 bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và phƣơng pháp sắc
ký lớp mỏng TLC. Các nghiên cứu đƣợc tiến hành từ những năm 1990 đến

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

5

nay sử dụng phƣơng pháp HPLC và khối phổ có độ nhạy cao hơn và chọn lọc

Đánh giá
phƣơng pháp

(-)

[5]

B

TLC

10
00

- Soi màu dƣới ánh
sáng thƣờng hoặc
bằng ánh sáng cực
tím

Ó

H

Í-

ÁN

-L

- 39 loại thuốc
nhuộm
Chiết mẫu bằng
ethanol, siêu âm,
lọc.
- Auramin O

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

Đậu
tƣơng

HPLC-DAD

LOD: 0,25 µg/mL [22]

- Cột hypesil C18

R(%) : 95%

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

ẠO
Đ
G
N

Hòa tan thuốc
nhuộm, tách rửa
bằng n-butanolacid acetic-nƣớc
(4:1:5) hay nbutanol-ethanolnƣớc (9:1:1)

[29]

H
Ư

Thuốc
nhuộm
sinh
học

(-)

TR
ẦN

Chiết bằng hexan HPLC
và ethanol, lắc lỏng
lỏng với acid acetic
và nhựa trao đổi
anion lỏng, chiết
với ethyl acetact,
rửa ethyl acetat với
amoniac 5%

TP

.Q

Đối tƣợng

Mô
tôm

TLT
K

U
Y

Phƣơng pháp

Xử lý mẫu,

A

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Nền
mẫu

N

H

Ơ

Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định và định lượng Auramin O trong các
nền mẫu khác nhau

N

hơn.

- Pha động:
Kênh A: methanol
Kênh B: aceticamonium 0,5%
- Bƣớc sóng 436
nm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
6

Đối tƣợng
HPLC- DAD

LOD: 0,25 µg/g

- Bƣớc sóng 440
nm

R: 95-116%

- Pha động:

ẠO

- Chiết lỏng lỏng
HPLC – FDA
với các dung môi
- Cột ODS
hữu cơ phân cực và
- Pha động:
không phân cực
Kênh A: AA
- Làm sạch bằng

qua cột Oasis HLB 20mM (chỉnh PH
4,5 = acid acetic)
- Auramin O,
Kênh B: ACN
rhodamin B,
pararosanilin

H
Ư

[27]

LOQ: 0,125 µg/g
R: 70,2-102,8 %

H

Ó

A

10
00

B

TR
ẦN

LOD: 0,05 µg/g

Í-L

Chiết bằng ACN :
H2O (7:3)

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Sản
phầm
từ đậu

D

Đ

N

Kênh B: H3PO4
0,03%

G

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Kênh A: MeOH

HPLC- detector
UV

LOD: 0,05 mg/kg [26]
R: 88 – 93%

Basic orange II,
acid orange II và
auramin O

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

.Q

- Cột YMC
hydrosphere-C18

Thực
phẩm
đóng

hộp

[16]

N

- Auramin O và
chrysoidin II

U
Y

Cá

TLT
K

N

Đánh giá
phƣơng pháp

Ơ

Phƣơng pháp

Xử lý mẫu,

H

Nền
mẫu

Do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kỹ thuật LC-MS và LC-MS/MS đã
đƣợc ứng dụng để nghiên cứu phân tích Auramin O trong các nền mẫu thực
phẩm khác nhau. Bảng 1.3 giới thiệu một số phƣơng pháp xác định Auramin
O trong thực phẩm bằng LC-MS hoặc LC-MS/MS.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
7

Xử lý mẫu

Phƣơng pháp

Đánh giá TLT
phƣơng
K
pháp

Rhodamin

B, auramin
O
và
pararosanilin

- Chiết lỏng
lỏng với các
dung môi hữu
cơ phân cực
và
không
phân cực

LC-ESI-MS/MS

(-)

H

Ơ

Đối tƣợng

ẠO

- Pha động:

[27]

N

G

Đ

Kênh A: AA
20mM (chỉnh PH
- Làm sạch 4,5 = acid acetic)
bằng qua cột Kênh B: ACN
Oasis HLB

TR
ẦN

10
00

B

- Chiết bằng
methanol
- Làm sạch
qua cột SPE
C18

Ó

A

Chrysoidin

và Auramin
O

LOD:
1,28
µg/kg
LOQ:
4,27
µg/kg
R: 80,1 95,3%

[32]

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Thực
phẩm

UPLC-MS/MS

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q
TP

- cột ODS

H
Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Thực
phẩm
đóng
hộp

U
Y

N

Nền
mẫu

N

Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định Auramin O trong thực phẩm bằng
LC-MS hoặc LC-MS/MS

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com

LC-MS/MS

Đ

Kênh B: ACN

N

- Chiết bằng
HPLC-MS

ACN : AF 2% - Cột C18
- Qua cột SPE - Pha động :
MCX
Kênh A : ACN

TR
ẦN

H
Ư

Chyrsoidin,
Auramin O,
Astrazone
orange G

Kênh B : AF 0,1
%

LOQ: 5
µg/kg

[17]

R: 71,3 92,5%

H

Ó

A

10
00

B

Bột ớt

LOD: 2
µg/kg

-L

Í-

1.2.2. Phương pháp LC-MS/MS

ÁN

Sắc kí lỏng khối phổ là một kỹ thuật mới nhƣng đã đƣợc ứng dụng để

TO

phân tích rộng rãi do có nhiều ƣu điểm :
- Có độ nhạy cao, đặc biệt là sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) rất

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

[21]

ẠO

TP

.Q

U
Y

LOQ: 40
- Cột aligent ODS ng/g
C18
R: 79,8- Qua cột SPE - Pha động:
95,2 %
WAX
Kênh A: AA
50mM (0,1% AF)

Ơ

- Chiết bằng
MeOH : AA
50mM (1:1)

Đánh giá TLT
phƣơng
K
pháp

H

Phƣơng pháp

G

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

Chrysoidine
G, Basic
Thịt
gà và Yellow
2, Acid
các
Orange I,
sản
phẩm Acid orange
từ đậu II, Acid
Yellow 36

Xử lý mẫu

N

Đối tƣợng

Nền
mẫu

N

8

D

IỄ
N

Đ

ÀN

phù hợp để phân tích các mẫu có hàm lƣợng độc tố ở mức thấp
- Có khả năng tách các chất dựa theo m/z , do đó cùng với khả năng tách

các chất nhờ HPLC thì phƣơng pháp này có khả năng phân tích đồng thời
nhiều chất trong cùng một lần chạy
- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lƣợng
và cấu tạo của chất nên rất đặc trƣng cho từng chất

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>

www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
9

- Có khả năng phân tích đƣợc những chất không thể phân tích bằng sắc kí
khí, nhƣ các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt

Ơ

N

Về cơ bản, sắc kí lỏng khối phổ là phƣơng pháp sắc kí lỏng sử dụng bộ

N

H

phận phát hiện là detector khối phổ [1], [6].

TP

.Q

Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn
và pha động là chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn). Khi tiến hành chạy sắc kí, các

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ẠO

chất phân tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn

G

hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất

H
Ư

N

khác nhau, nên khả năng tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác

TR
ẦN

nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau
[1],[5].

B

a. Pha tĩnh trong HPLC

10
00

Trong HPLC, pha tĩnh chính là bề mặt chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách

A

hỗn hợp chất phân tích. Tùy theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp

H

Ó

sắc kí lỏng pha liên kết thƣờng chia làm 2 loại: sắc kí pha thuận (NP-HPLC)

Í-

và sắc kí pha đảo (RP-HPLC).

-L

- Sắc kí pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các

ÁN

silica trần hoặc các silica đƣợc gắn các nhóm alkyl có ít cacbon mang các

D

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

1.2.2.1. Sắc kí lỏng (HPLC)

- Sắc kí pha đảo: pha tĩnh thƣờng là các silica đã đƣợc alkyl hóa, không

phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37 [1],[5].
b. Pha động trong HPLC
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc
tách các chất phân tích trong quá trình sắc kí nhất định. Có thể chia pha động
thành hai loại:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>

www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
10

- Pha động phân cực: có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân
tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực nhƣ

Ơ

N

methanol, acetonitril. Pha động loại này đƣợc dùng trong sắc kí pha liên kết

H

pha đảo.

U
Y

N

- Pha động không phân cực: bao gồm các dung môi ít phân cực nhƣ

TP

(CS2), clorobutan, CCl4, toluen…

ẠO

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

năng rửa giải, ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung

N

G

môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi

H
Ư

thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ [1],[5].

TR
ẦN

1.2.2.2. Khối phổ

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân

10
00

B

tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số
giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách

Ó

A

thêm hay bớt điện tích của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa, … Các ion

H

tạo thành này đƣợc tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin

-L

Í-

về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [1],[7].

ÁN

Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS đƣợc trình bày ở hình 1.2.

TO

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phân

D

IỄ
N

Đ

ÀN

tích khối và bộ phận phát hiện.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

xyclopentan, n-pentan, n-hexan, n-heptan, 2-chloropropan, cacbondisulfua

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
11

H

Ơ

Detector/lƣu
giữ số liệu

Bộ phân tích
khối

N

Ion
hóa

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

a. Nguồn ion hoá

Đ

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để

N

G

chuyển thành dạng hơi và đƣợc ion hóa nguyên tử. Các kĩ thuật ion hóa

H
Ư

thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc kí lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (ESI)

tôi sử dụng kỹ thuật ESI.

TR
ẦN

và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI). Trong nghiên cứu này chúng

B

Kỹ thuật ESI chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở

10
00

dạng khí. Dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào vùng có trƣờng điện từ mạnh đƣợc

A

duy trì ở hiệu điện thế khoảng 1- 5kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển

H

Ó

thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân

Í-

tích khối phổ. Các giọt nhỏ trƣớc khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ đƣợc

-L

kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có hai chế độ bắn phá:

ÁN

bắn phá với chế độ ion dƣơng ESI(+) và ion âm ESI(-). Đối với chế độ

TO

ESI(+), ion đƣợc tạo thành thƣờng là ion [M+H]+ , còn đối với chế độ ESI(-),

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

Hình 1.2. Mô hình hệ thống LC-MS/MS

.Q

U
Y

Sắc ký
lỏng

N

Chân
không

D

IỄ
N

Đ

ÀN

ion đƣợc tạo thành thƣờng là ion [M-H]- [7].

b. Bộ phận phân tích khối
Sau khi đã đƣợc ion hóa, các ion đƣợc đƣa đến bộ phận phân tích khối
nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện
bắn phá thêm để thu đƣợc các ion con. Các kỹ thuật phân tích khối đƣợc sử

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
12

dụng phổ biến là bộ phận phân tích tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phân
tích thời gian bay. Bộ phân tích khối ba tứ cực đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ

Ơ

N

thuật LC-MS/MS và đây chính là kỹ thuật đƣợc chúng tôi sử dụng trong

H

nghiên cứu này.

U
Y

N

Tứ cực có cấu tạo gồm 4 thanh điện cực song song tạo thành một

TP

đi qua bộ lọc này. Tứ cực thứ 1 (Q1) và thứ 3 (Q3) có vai trò nhƣ là các bộ

ẠO

lọc khối. Còn tứ cực thứ 2 (Q2) có vai trò nhƣ là buồng va chạm, tại đó các

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

ion sau khi qua Q1 (ion mẹ) đƣợc bắn phá bởi năng lƣợng và khí trơ để tạo

H
Ư

N

G

thành các ion nhỏ hơn (ion con). Các ion này đƣợc lựa chọn tại Q3 [1], [7]
c. Bộ phận phát hiện:

TR
ẦN

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion đƣợc đƣa tới phần
cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho

10
00

B

phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion dƣơng tƣơng ứng từ các electron
thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển.

Ó

A

Bộ phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

H

có độ nhạy cao. Các ion sau khi qua Q3 sẽ đập vào bề mặt diod làm bật ra các

-L

Í-

electron. Các electron thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo

ÁN

ra các electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Cứ nhƣ

TO

vậy tín hiệu sẽ đƣợc khuếch đại và đƣợc ghi lại. Tín hiệu này tỷ lệ thuận với

D

IỄ
N

Đ

ÀN

lƣợng ion do đó tỷ lệ với nồng độ chất phân tích ban đầu [7].

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

khoảng trống để các ion bay qua. Những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
13

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

N

H

Ơ

Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là các mẫu thức ăn chăn nuôi (TACN)
đƣợc thu thập trên thị trƣờng Hà Nội.

N

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

TP

.Q

2.2. Nguyên vật liệu – trang thiết bị

ẠO

2.2.1. Nguyên vật liệu

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

2.2.1.1. Chất chuẩn

H
Ư

Pha dung dịch chuẩn:

TR
ẦN

Ehrenstorfer. Bảo quản ở 20 ± 4oC.

N

G

Chuẩn gốc AUO dạng rắn (độ tinh khiết 75%) của hãng Dr

- Dung dịch chuẩn AUO nồng độ 150 µg/mL : Cân 0,02g chuẩn AUO

10
00

B

dạng rắn, hòa tan và định mức bằng methanol đến 100 mL, thu đƣợc chuẩn có
nồng độ 150 µg/mL. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2-8˚C, có thể sử dụng

A

đƣợc trong 6 tháng.

H

Ó

- Dung dịch chuẩn trung gian AUO nồng độ 1 µg/mL : Hút 67 L chuẩn

Í-

AUO nồng độ 150

g/mL vào bình 10 mL và định mức đến vạch bằng

ÁN

-L

methanol. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ từ 2-8oC, có thể sử dụng đƣợc trong
3 tháng.

TO

- Dung dịch chuẩn trung gian AUO nồng độ 100 ng/mL: Hút 1 mL

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

Tổng số mẫu là 15 mẫu

D

IỄ
N

Đ

ÀN

chuẩn AUO nồng độ 1 g/mL vào bình định mức 10 mL và định mức đến

vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2-8oC, có thể sử dụng
đƣợc trong 3 tháng.
2.2.1.2. Hoá chất, dung môi
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
14

- Dung môi loại dùng cho sắc kí: acetoniril, methanol, acid formic của
Merck, Đức.

Ơ

N

- Acid acetic, amoni acetat , acetonitril của Merck, Đức.

N

H

- Nƣớc cất 2 lần.

TP

.Q

2.2.2.1. Thiết bị

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

năng cao LC 1290 và khối phổ 6460.

G

- Cột sắc ký Agilent C18 (1,8 µm x 2,1mm x 50 mm) và tiền cột tƣơng

H
Ư

N

ứng.

TR
ẦN

- Máy lắc xoáy IKA.

- Máy đồng nhất mẫu HR1843, Philips.

B

- Máy li tâm Z383K, Hermle.

10
00

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo.

Ó

H

2.2.2.2. Dụng cụ

A

- Bộ chiết pha rắn Supleco và máy hút chân không.

-L

Í-

- Micropipet có thể tích điều chỉnh đƣợc 20-200 µL, 100-1000 µL và
1000-5000 µL.

ÁN

- Bình định mức: 10 mL, 100 mL.

IỄ
N

Đ

ÀN

TO

- Ống ly tâm nhựa 50 mL.

D

ẠO

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ của Agilent gồm máy sắc ký lỏng hiệu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

2.2.2. Trang thiết bị

- Vial loại 1,8 mL.
- Pipet pasteur.
- Ống đong, phễu, giấy lọc.
- Ống SPE loại: C18, HLB, SCX.

2.3. Nội dung nghiên cứu

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial


www.twitter.com/daykemquynhon
/>
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
15

2.3.1. Khảo sát các điều kiện xác định AUO bằng LC-MS/MS
- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: tìm các điều kiện tách sắc ký bao

Ơ

N

gồm pha động, pha tĩnh

N

H

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ƣu của MS để xác

TP

.Q

2.3.2 . Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

ẠO

- Khảo sát về dung môi chiết

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox :

- Khảo sát về bƣớc làm sạch bằng SPE.

N

G

2.3.3. Thẩm định phương pháp

H
Ư

- Tính chọn lọc, đặc hiệu.

TR
ẦN

- Giới hạn phát hiện LOD.

10
00

- Khoảng tuyến tính.

B

- Giới hạn định lƣợng LOQ.
- Độ lặp lại.

Ó

A

- Độ thu hồi.

Í-

H

2.3.4. Ứng dụng phương pháp

-L

Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định hàm lƣợng AuO trong

ÁN

một số mẫu TACN trên thị trƣờng.

TO

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U
Y

định ion phân tử; lựa chọn các ion sản phẩm phù hợp.

D

IỄ
N

Đ

ÀN

2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
- Các mẫu TACN đƣợc lấy từ 3 quận trên địa bàn Hà Nội là quận Hoàng
Mai, quận Từ Liêm và quận Long Biên trong khoảng thời gian từ tháng
11/2015 – 12/2015
- Mỗi quận lấy 5 mẫu khác nhau.
- Mỗi mẫu lấy ít nhất 1 kg.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial