Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của loài dầu nước (Dipterocarpus alatusroxb. Ex G. Don) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----o0o----

NGUYỄN MINH ĐỨC

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CỦA LOÀI
DẦU NƯỚC (DIPTEROCARPUS ALATUS ROXB. EX G.DON) Ở
RỪNG NHIỆT ĐỚI ĐÔNG NAM BỘ
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 01. 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Thị Phương Trang

Hà Nội – 2014


MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ ..........................................................................................
Mục lục ....................................................................................................................

Lời cảm ơn.............................................................................................................. i
Danh mục các từ viết tắt, ký hiệu .......................................................................... ii
Danh mục các bảng .............................................................................................. iii
Danh mục các hình ............................................................................................... iv
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
NỘI DUNG........................................................................................................... 4
Chương 1. Tổng quan tài liệu................................................................................ 4
1.1Tổng quan về họ Dầu ....................................................................................... 4
1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) ........................................................... 4
1.3 Một số khái niệm về quần thể thực vật và phân cắt nơi sống ......................... 5
1.3.1 Quần thể thực vật ................................................................................... 5
1.3.2 Nơi sống và phân cắt .............................................................................. 6
1.3.3 Quần thể nhỏ và cô lập........................................................................... 7
1.3.4 Bảo tồn và quản lý tài nguyên di truyền thực vật .................................. 7
1.4 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa
phân tử ............................................................................................................. 9
1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) ........ 13
1.6 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu
(Dipterocarpaceae) trên cơ sở vùng gen matK ............................................. 14
Chương 2. Đối tượng, địa điểm và phương pháp nghiên cứu............................. 17


2.1 Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 17
2.2 Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 18
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của 10 quần thể Dầu nước
(Dipterocapus alatus) .......................................................................................... 18
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu .... 20
2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 22
2.3.1 Khảo sát thực địa .................................................................................. 22
2.3.2 Phương pháp thu mẫu .......................................................................... 22

2.3.2 Phân tích trong phòng thí nghiệm ........................................................ 22
2.4 Phân tích số liệu ............................................................................................ 28
2.4.1 Đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước .................................... 28
2.4.2 Mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu ............................. 28
Chương 3. Kết quả và thảo luận .......................................................................... 30
3.1 Nơi sống, cấu trúc phân tầng rừng, hiện trạng quần thể Dầu nước ngoài tự
nhiên .................................................................................................................... 30
3.1.1 Nơi sống và cấu trúc phân tầng rừng ................................................... 30
3.1.2 Cấu trúc tuổi quần thể của loài Dầu nước ............................................ 45
3.1.3 Hiện trạng quần thể Dầu nước ngoài tự nhiên, một số nguyên nhân làm
suy giảm kích thước quần thể ....................................................................... 46
3.2 Đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước ............................................. 48
3.2.1 Kết quả tách chiết DNA, PCR và điện di sản phẩm ............................ 48
3.2.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể...................................... 51
3.3 Đặc điểm vùng gen matK và mối quan hệ di truyền của 11 loài Dầu ở Việt
Nam ..................................................................................................................... 58
Danh sách các trình tự đã được công bố lên Ngân hàng gen thế giới


(Genbank):........................................................................................................... 64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 65
Kết luận ............................................................................................................... 65
Kiến nghị ............................................................................................................. 66
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN VĂN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, do áp lực tăng dân số và tốc độ phát triển kinh
tế diễn ra nhanh, thảm thực vật rừng tự nhiên, nơi chứa đựng đa dạng sinh học
cao ở nước ta bị phân cắt và suy giảm mạnh. Các mảnh rừng còn sót lại hiện nay
là hậu quả của quá trình phân cắt và thường bị giới hạn về kích thước. Những
quần thể thực vật rừng thường dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích nghi khi
môi trường sống bị thay đổi, đặc biệt khi chịu áp lực của biến đổi khí hậu.
Các cây họ Dầu là những loài cây rừng chiếm ưu thế, đóng vai trò quan
trọng trong cân bằng sinh thái và kinh tế. Hiện có hơn 45 loài được biết đến từ 6
chi ở Việt Nam, chủ yếu là bản địa và đặc hữu. Do có giá trị thương mại cao và
do nhu cầu sử dụng gỗ tại các địa phương mà các cây họ Dầu đang bị khai thác
một cách mạnh mẽ. Hơn nữa, trong nhiều năm, áp lực tăng trưởng kinh tế đã dẫn
đến sự suy giảm lớn trong khu vực rừng và tăng mức độ phân mảnh tại những
khu rừng còn sót lại. Những xu hướng thay đổi này dẫn đến những ảnh hưởng
trực tiếp mang tính bất lợi đến môi trường sống và đe dọa nghiêm trọng sự tồn
tại của các cây họ Dầu. Hiện nay, 33 loài cây họ Dầu đang bị đe dọa ở mức độ
toàn cầu. Loài cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don) đã và đang
được sử dụng rộng rãi cho lĩnh vực làm đồ nội thất và xây dựng. Bên cạnh đó,
chúng còn được sử dụng như một nguồn cho tinh dầu có giá trị và được sử dụng
phổ biến trong thương mại. Loài Dầu này phân bố trong các khu rừng nhiệt đới
vùng đất thấp. Ở Việt Nam, do sự giảm của môi trường sống và khai thác quá
mức, loài cây này đã được liệt kê là bị đe dọa.
Cho đến nay, vẫn thiếu các thông tin quan trọng về đa dạng di truyền ở
cấp độ quần thể và loài, đặc biệt là những tác động có hại từ hoạt động của con
người đến loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus). Nghiên cứu này sẽ góp phần
giải quyết các vấn đề có liên quan và cung cấp thêm thông tin cho ngành kiểm
lâm để nhấn mạnh sự cần thiết của việc bảo tồn và sử dụng các loài của các cộng
đồng địa phương. Để nâng cao sự hiểu biết về sinh học bảo tồn, luận văn tiến


hành xác định các thông số di truyền học quần thể và sự phát triển của loài, cũng

như quá trình chia cắt nơi sống có liên quan đến các hoạt động của con người.
Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chung:
Đóng góp cho công tác bảo tồn và phục hồi hữu hiệu các loài quý hiếm
đang bị đe doạ ở Việt Nam. Giúp các nhà quản lý hiểu biết sâu hơn về mức độ
tiến hoá, quan hệ di truyền giữa các loài cây họ Dầu. Các yếu tố tác động của
con người làm xói mòn cấu trúc di truyền quần thể và loài. Mục tiêu này cũng sẽ
giúp cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về quá trình tuyệt chủng cũng
như mức độ tiến hoá loài không chỉ cho các loài cây họ Dầu mà còn có thể áp
dụng cho các loài cây khác có lịch sử sống tương tự và nâng cao đời sống cộng
đồng địa phương.
- Mục tiêu cụ thể:
Xác định được mức độ đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước
(Dipterocarpus alatus) có phân bố tại Việt Nam.
Xác định được các nguyên nhân làm mất tính đa dạng di truyền quần thể,
đưa ra các giải pháp phục hồi và sử dụng bền vững loài Dầu nước.
Xác định mối quan hệ di truyền của một số loài trong họ Dầu phân bố ở
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
Khảo sát, điều tra hiện trạng về phân bố, cấu trúc quần thể của loài Dầu
nước phân bố tại 4 tỉnh miền Đông Nam Bộ Việt Nam gồm: Tây Ninh, Bình
Phước, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, 1 tỉnh Nam Trung Bộ: Phú Yên và 1 tỉnh
Tây Nguyên: Đắk Lắk.
Xác định các thông số di truyền và phân tích ảnh hưởng của các biến động
môi trường sống có liên quan đến tác động của con người đến các quần thể của
loài Dầu nước ở 6 tỉnh miền Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên Việt
Nam bằng phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats).


Xác định mối quan hệ di truyền của các loài thuộc họ Dầu ở Việt Nam

trên cơ sở phân tích trình tự gen matK.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn:
Luận văn không những cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về
mức độ suy giảm đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài của loài Dầu
nước (Dipterocarpus alatus) mà còn áp dụng cho các loài Dầu khác đang bị đe
doạ và xác định được vị trí phân loại trên cơ sở phân tích trình tự vùng gen
matK cho một số loài Dầu ở Việt Nam.
Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tin
về giá trị bảo tồn và nâng cao sự hiểu biết của người dân sống gần rừng về sự
tuyệt chủng loài cần bảo vệ.
Kết quả của luận văn đóng góp cho công tác bảo tồn và quản lý hữu hiệu
nguồn gen của các loài thực vật quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng, nâng
cao hiểu biết rõ hơn về phương thức sinh sản và mức độ đa dạng di truyền trong
và giữa các quần thể Dầu, thu thập thông tin về ảnh hưởng của người dân địa
phương đến tính đa dạng di truyền của loài.


CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về họ Dầu
Họ Dầu còn được gọi là Họ Hai cánh có danh pháp khoa học
là Dipterocarpaceae gồm có 17 chi và khoảng 580-680 loài cây thân gỗ chủ yếu
phân bố ở các rừng mưa nhiệt đới vùng đất thấp với quả hai cánh. Tên gọi khoa
học của họ xuất phát từ chi điển hình là Dipterocarpus, có nguồn gốc từ tiếng
Hy Lạp (di = hai, pteron = cánh và karpos = quả, nghĩa là quả có hai cánh). Các
chi lớn nhất là Shorea (196-360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài)
và Vatica (60-65 loài). Nhiều loài chiếm ưu thế trong các cánh rừng nhiệt đới
núi thấp (dưới 500m so với mặt nước biển), thông thường có thể cây cao tới 40–
70m, đôi khi trên 80m (Dryobalanops, Hopea và Shorea). Chúng phân bố rộng
khắp vùng nhiệt đới, từ miền bắc Nam Mỹ tới Châu Phi, Seychelles, Ấn Độ,
Đông Dương và Malaysia, với sự đa dạng và phổ biến nhất ở miền tây Malaysia.

Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) [4], Việt Nam có 42 loài cây Dầu thuộc 6
chi: Anisoptera (1 loài), Dipterocarpus (12 loài), Hopea (11 loài), Parashorea
(2 loài), Shorea (8 loài) và Vatica (8 loài). Phần lớn những loài này được tìm
thấy trong rừng nhiệt đới thường xanh và rừng khộp hỗn giao ở độ cao khoảng
500m. Các cây họ Dầu đóng vai trò quan trọng về sinh thái và kinh tế trong hệ
sinh thái rừng núi thấp. Gỗ thường được sử dụng để đóng tàu, thuyền. Nhựa cây
được sử dụng cho việc sơn và làm đồ mỹ nghệ.
1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus)
Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don) phân bố trong
rừng nhiệt đới ẩm núi thấp ở Việt Nam, Lào, Campuchia và Thái Lan. Ở Việt
Nam, loài này phân bố rộng từ Nam Trung Bộ đến Đông Nam Bộ và Phú Quốc.
Dầu nước là cây gỗ lớn, chiều cao thông thường 30-35m, nhưng có khi đạt tới
40-45m, đường kính ngang ngực đạt tới 250cm. Dầu nước thường chiếm tầng
cao, ưu thế của rừng. Thân tròn đều, dáng thẳng đẹp. Gỗ màu nâu đỏ nhạt, thớ
thô, bền. Cây trước tuổi trưởng thành có tán lá hình chóp nhưng khi trưởng


thành, cây có tán lá hình lọng. Vỏ cây mỏng có màu xám trắng và nhẵn. Lá đơn
mọc cách, lá hình bầu dục hoặc trái xoan, dài 10-20cm, rộng 5-15cm; đầu hơi
nhọn; gốc lá hình nêm hay hình tròn. Phiến lá có màu xanh thẫm ở mặt trên,
màu xanh nhạt và có lớp lông mịn phủ ở mặt dưới, gân bên 11-18 đôi. Lá kèm
có lông màu vàng xám nhạt. Quả gần hình cầu, có 5 cạnh nổi rõ, đường kính 11,5cm. Quả có 5 cánh đài nhẵn; hai cánh to, cánh dài từ 10-14cm, rộng 1,5-2cm,
xếp song song, có màu đỏ tươi khi quả non và chuyển thành màu vàng khi quả
chín già; 3 cánh nhỏ có kích thước 1,2-1,4cm. Mỗi quả có 1 hạt. Mùa quả chín là
tháng 3-4 hàng năm, thường tập trung vào cuối tháng 3 và đầu tháng 4.
1.3 Một số khái niệm về quần thể thực vật và phân cắt nơi sống
1.3.1 Quần thể thực vật
Quần thể được định nghĩa là tập hợp một nhóm cá thể của một loài trong
một nơi sống cụ thể và như vậy, chúng độc lập với các quần thể khác nhau về
quan hệ sinh sản. Về mặt di truyền, quần thể liên quan ở mức độ cá thể, chúng

được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, và cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố
như kích thước quần thể, sức sinh sản, khả năng sống sót, phương thức sinh sản,
trao đổi và đột biến di truyền. Kích thước quần thể là kết quả của sự tương tác
phức tạp liên quan đến các điều kiện môi trường sống và các đặc tính quần thể
của loài. Kích thước quần thể đóng vai trò quan trọng liên quan đến phương thức
sinh sản, di truyền và tiến hoá. Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể
lai (thế hệ tiếp theo) trong quần thể và loài. Thụ phấn chéo từ cá thể của dòng
này với cá thể của dòng khác có thể sản sinh những cá thể lai đa dạng. Cấu trúc
di truyền của những cá thể này có nhiều cơ hội đóng góp vào tính đa dạng trong
quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao trong hoàn cảnh môi trường sống.
Tác động của con người đến môi trường sống thường dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc
quần thể và thiết lập những quần thể nhỏ, cô lập và cuối cùng làm suy giảm khả
năng thích nghi của quần thể với môi trường sống của chúng. Ở những thế hệ
được sản sinh bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến 3 hậu quả nghiêm trọng: sự


khác nhau về di truyền giữa các quần thể bị thu hẹp, mất tính đa dạng di truyền
và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ.
1.3.2 Nơi sống và phân cắt
Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài. Phân
cắt xảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh
quan khác nhau không giống ban đầu và không phù hợp cho sự tồn tại của loài.
Như vậy, phân cắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống. Tác nhân gây ra phân cắt bao
gồm: mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, xây
dựng khu dân cư, các công trình phát triển kinh tế và khai thác khoáng sản. Phân
cắt đe dọa đến tính thống nhất sinh thái của một vùng rộng lớn đã được hình
thành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nhân gây ra sự
tuyệt chủng (Schonewald-Cox et al., 1983) [49]. Suy giảm diện tích nơi sống sẽ
ảnh hưởng đến kích thước quần thể và sự phân mảnh nơi sống còn sót lại sẽ ảnh
hưởng đến sự phát tán loài. Hậu quả của quá trình phân cắt thường làm suy giảm

chức năng hệ sinh thái và cuối cùng mất nơi sống. Các quần thể nhỏ và bị cô lập
trong các mảnh nơi sống còn sót lại dễ bị tổn thương và ít có khả năng thích
nghi khi điều kiện môi trường sống của chúng bị thay đổi (Keller và Waller,
2002) [29]. Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đa dạng di truyền ở cả hai
mức độ quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe doạ tuyệt chủng.
Các mảnh rừng tự nhiên còn sót lại hiện nay là hậu quả của sự phân cắt và
thường bị giới hạn về kích thước và suy giảm về chất lượng. Các mảnh rừng này
có thể chứa đựng những quần thể nhỏ và bị cô lập bởi khoảng cách lớn. Đây là
bước đầu tiên của quá trình suy giảm nơi sống, dẫn đến mất chức năng của hệ
sinh thái và cuối cùng là mất nơi sống. Quần thể nhỏ và cô lập thường dễ bị tổn
thương và ít có khả năng thích nghi khi môi trường sống bị thay đổi do cấu trúc
hữu hiệu được thiết lập trong quá trình hình thành loài và quần thể bị phá vỡ.
Phân cắt nơi sống có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sinh sản của loài và
được gây ra bởi những biến đổi bất lợi của môi trường, kích thước và cấu trúc di
truyền quần thể.


1.3.3 Quần thể nhỏ và cô lập
Kích thước quần thể là kết quả của mối quan hệ phức tạp các nhân tố khác
nhau bao gồm lịch sử hình thành quần thể, điều kiện môi trường sống và đặc
điểm sinh thái của mỗi loài. Kích thước quần thể phản ánh quá trình thụ phấn,
cấu trúc di truyền và mức độ tiến hoá của loài, được ghi nhận lần đầu tiên bởi
Wright vào năm 1931 và 1938. Phần lớn các loài đang bị đe doạ đều nhỏ về số
cá thể trong mỗi quần thể và số quần thể, đều tồn tại trong những mảnh rừng
nhỏ và cô lập (Ashton, 1987) [7]. Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và
cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể (Lande,
1999) [33]. Ảnh hưởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và
cường độ quan hệ cận noãn cao. Cuối cùng là giảm khả năng thích nghi của
quần thể trong điều kiện môi trường biến đổi và khả năng nhạy cảm đối với dịch
bệnh (Hamilton, 1982) [22]. Barrett và Kohn (1991) [9] đã chỉ ra rằng với kích

thước quần thể nhỏ (<100 cá thể), tần số alen có thể khác nhau đáng kể giữa các
thế hệ với nhau. Kết quả của quá trình này sẽ làm mất alen và tính đa hình tại
mỗi lô cút liên quan đến áp lực môi trường. Byer và Meagher (1992) [12] cũng
chỉ ra rằng quần thể quá nhỏ (<50 cá thể) không có khả năng duy trì các alen
chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường.
1.3.4 Bảo tồn và quản lý tài nguyên di truyền thực vật
Công việc bảo tồn nguồn gen thực vật là duy trì tiềm năng tiến hoá và tính
chống chịu của loài trong điều kiện môi trường sống bất lợi. Do vậy, đánh giá số
lượng cá thể và các tham số đa dạng di truyền quần thể và loài được ghi nhận
như là chìa khoá dẫn đến thành công trong lĩnh vực quản lý bền vững các loài
đang bị đe doạ (Falk và Holsinger, 1991) [18]. Tiềm năng tiến hoá và khả năng
phục hồi của mỗi loài phụ thuộc vào tính đa dạng di truyền ở cả mức độ quần
thể và loài của loài đó. Tư liệu về sinh thái và di truyền quần thể sẽ cung cấp cơ
sở khoa học cho các nhà quản lý xây dựng chiến lược bảo tồn và quản lý các
loài bị đe doạ một cách bền vững và hiệu quả. Phần lớn công việc bảo tồn loài
đều hướng trực tiếp vào duy trì nơi sống, cụ thể là quan tâm đến kích thước và


tốc độ phát triển quần thể và loài. Tuy nhiên, để bảo tồn hữu hiệu bất kỳ loài nào
các nhà quản lý cần phải đưa ra chiến lược duy trì tính đa dạng di truyền ở cả hai
mức độ quần thể và loài. Kích thước quần thể đủ lớn sẽ phòng tránh tốt hơn quá
trình xói mòn di truyền và duy trì lâu bền sự sống của loài trong môi trường
sống của chúng. Suy giảm tính đa dạng di truyền thông qua các áp lực về biến
đổi bất lợi của môi trường liên quan đến cấu trúc quần thể và thụ phấn cận noãn
trong quần thể nhỏ và biệt lập là những yếu tố chính gây nên tổn thương khả
năng tồn tại lâu dài của quần thể và loài.
Hai hình thức bảo tồn loài đang bị đe doạ là bảo tồn nguyên vị và bảo tồn
chuyển vị. Đây là cơ sở khoa học phục vụ công tác bảo tồn tính đa dạng di
truyền quần thể và loài. Mối quan hệ này sẽ cung cấp thông tin về các đặc điểm
sinh thái loài và quần thể. Nó sẽ khắc phục về số lượng cá thể trong mỗi quần

thể nhỏ và củng cố các giải pháp quản lý và bảo tồn nguyên vị và chuyển vị.

Hạt

Dự trữ hạt

Một phần
Mầm

Hạt

Cả cây
Cây

Cây ở vườn

Quần thể tại chỗ

Thu thập hạt ở vườn

Hình 1.1. Sơ đồ bảo tồn chuyển vị (theo Brown và Briggs, 1991) [11]

Quá trình thiết lập hoạt động bảo tồn chuyển vị được trình bày ở Hình 1.1. Quần
thể của các loài đang bị đe dọa là đối tượng cho công tác bảo tồn nguyên vị và
cung cấp nguyên liệu như hạt và các phần khác của cây cho công tác bảo tồn
chuyển vị. Bảo tồn chuyển vị đóng vai trò duy nhất để lấp vào khoảng trống và
nâng cao tính đa dạng di truyền quần thể và cung cấp nguồn giống cho những
nơi đang bị phá hoại (Millar và Libby, 1991) [43]. Duy trì nơi sống của loài là
bảo vệ tính thống nhất vật liệu di truyền và thống nhất mối quan hệ về tiến hoá.

Mối quan hệ tương tác giữa các cá thể, quần thể và loài với nhau và với điều
kiện môi trường sống để duy trì quá trình tiến hoá của loài. Millar và Libby
(1991) [43] đã xác định đơn vị quản lý nguồn tài nguyên di truyền là đơn vị diện
tích rừng được thiết kế cho các đối tượng quản lý tài nguyên này ở mức tối
thiểu. Mục đích là điều khiển thành phần di truyền cho mỗi loài trong mỗi đơn
vị quản lý để duy trì, phục hồi tài nguyên di truyền tự nhiên. Các tác giả đã lưu ý
rằng đa dạng di truyền trong những đơn vị quản lý bị ảnh hưởng bởi những điều
kiện bên ngoài thông qua “ô nhiễm vật liệu di truyền” và áp lực chọn lọc tự
nhiên bị thay đổi do các hoạt động của con người. Tác động tiềm năng từ “ô
nhiễm” này phụ thuộc vào mức độ khác nhau của tần số alen và tính thích nghi
môi trường trong mỗi đơn vị quản lý. Rõ ràng, bảo tồn nguyên vị và bảo tồn
chuyển vị là rất cần thiết để bảo vệ và duy trì số lượng các loài, cũng như phục
hồi nơi sống của chúng.
1.4 Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử
Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa dạng
di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài quý hiếm trong tự nhiên
có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn một
cách hữu hiệu. Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm tính đa dạng di
truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến quá trình phân cắt nơi
sống (Bahulikar et al., 2004; Cascante et al., 2002; Godt et al., 1996; Keller và
Waller, 2002; Templeton et al., 1990) [8, 13, 20, 29, 54]. Các tác giả đã chỉ ra
rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng cá thể thấp
trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt. Hệ số thụ phấn cao giữa các cá
thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính đa dạng di truyền.
Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị
cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữa chúng.
Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triển
mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống ở cấp độ
phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong

nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mới như tiến


hóa phân tử, di truyền bảo tồn. Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩn thể và loài
thực vật, ngoài kỹ thuật isozyme, còn có kỹ thuật DNA với các phương pháp
như RAPD, SSR, ISSR, AFLP, RFLP, vv.
Kỹ thuật isozyme
Kỹ thuật Isozyme là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme. Phương
pháp này được Hunter và Market đưa ra từ năm 1957, được Harris hoàn thiện
vào năm 1966 và bắt đầu được sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay. Di
truyền quần thể cần thiết phải nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến
đổi di truyền trong/giữa các quần thể. Kỹ thuật isozyme được sử dụng như dấu
phân tử cho mục tiêu này. Mặc dù hiện nay đã có nhiều kỹ thuật DNA phát triển
nhưng kỹ thuật isozyme vẫn được sử dụng vì cách thức thực hiện tương đối
nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di
truyền ở cấp độ thấp. Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật
nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững
(hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường (Thanh, 2005) [5].
Kỹ thuật RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn DNA
được khuếch đại ngẫu nhiên) do Williams phát minh năm 1990 (Williams et al.,
1990) [61], Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991 (Welsh et al., 1991) [60].
Phương pháp này sử dụng cùng một số mồi ngẫu nhiên (mồi ngẫu nhiên là các
đoạn oligo nucleotide gồm khoảng 8 đến 20 Nucleotide) để thực hiện phản ứng
PCR nhằm nhân các đoạn DNA đặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các
mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được gồm
các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc. Khi bộ gen của
các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân được các đoạn
khác biệt nhau (Dung et al., 2005; Thanh, 2005) [1, 5].
Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các
đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn). Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của


các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt
được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng
cho từng phân tử DNA. Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao,
thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của
các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên
cứu, xác định nguồn gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật
(Dương, 2002; Thanh, 2005) [2, 5].
Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay. Kỹ thuật
RFLP được sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo
qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật
hoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật... Kỹ thuật RFLP
được thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn. DNA của mẫu nghiên cứu
sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng một số loại enzyme
giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí
xác định, do đó các bộ gene có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lượng và kích
thước các đoạn cắt DNA khác nhau, những bộ gene giống nhau thì sẽ cho ra số
lượng, kích thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước và số lượng các đoạn cắt
này sẽ quan sát được trên điện di đồ.
Kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), được hiểu
là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng, sử dụng những
phân đoạn DNA này làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR). Kỹ thuật này
được Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 và ngay lập tức trở thành một
công cụ hữu ích để nhận biết nhiều lô cút trong sự đa hình DNA mà không cần
biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng. Phương pháp này có thể đưa ra
nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với

nhau (Watson và Barker, 2004) [59].
Kỹ thuật SSR


Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequence Repeat) là những trình tự
nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide ngắn, đơn
giản, còn gọi là vi vệ tinh. Phương pháp truy tìm các phân đoạn DNA đơn giản
lặp lại được gọi là phương pháp vi vệ tinh (microsatellite) do Litt và Luty phát
triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử năm 1989 (Litt and Luty, 1989) [39].
Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn dài ngắn khác
nhau tùy theo từng loài. Các chuỗi lặp lại này thường từ 1–6 nucleotide. Bản
chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số
của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại.
Giá trị của SSR là do nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ
khắp genome và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Cho đến
nay kỹ thuật này đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu đa
dạng di truyền ở động vật và thực vật.
Kỹ thuật ISSR
Kỹ thuật ISSR (internal simple sequence repeat) là kỹ thuật phân tích dựa
trên việc nhân bản đoạn DNA nằm giữa 2 vùng lặp đơn giản. Với ISSR, mồi là
những đoạn lặp đơn giản. Nguyên lý của phương pháp này là khuếch đại những
đoạn trình tự nằm giữa 2 đầu lặp đơn giản. Bộ gen của sinh vật bậc cao có nhiều
đoạn DNA lặp lại, các đoạn lặp thường có kích thước ngắn (vài nucleotide), số
lần lặp lại là đặc trưng cho mỗi loài, mỗi giống. Ví dụ, ở lúa có khoảng gần 1000
lần lặp lại trật tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trật tự GATA/CTAT.
Nhiều loài cây một lá mầm như ngô, lúa… lặp lại đoạn CGG/GCC.
Phân tích ISSR sử dụng mồi bổ trợ với các vùng microsatellite nên còn
gọi là MP-PCR có thể kế thừa mở rộng từ các phân tích microsatellites khác để
tăng khả năng lặp lại và giảm tính đa hình so với RAPD. Các chỉ thị RAPD,
ISSR được dùng nhiều trong lập bản đồ, phân tích di truyền, chọn giống ở thực

vật (Tam et al., 2009) [52].
1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae)


Việc bảo tồn và quản lý của một loài đòi hỏi thông tin về đặc điểm sinh
thái và đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể của loài đó. Và để có được
những thông tin cần thiết trên, cần có sự hiểu biết rõ ràng hơn về các quá trình di
truyền và các kỹ thuật sinh học hiện đại. Vì vậy, chỉ thị (marker) DNA đã được
sử dụng để xác định mức độ khác biệt di truyền giữa các quần thể. Chỉ thị
microsatellite (lặp lại trình tự đơn giản, SSR) là hữu ích, được sử dụng để phân
tích hiệu quả sự trao đổi di truyền thông qua hạt phấn và sự phát tán hạt trong
quần thể. Vì vậy, các chỉ thị marker SSR với tính đa hình cao đã được áp dụng
trong các nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền, và mối quan hệ
sinh sản trong các quần thể (Iwata et al., 2000; Pandey và Geburek, 2009;
Takeuchi et al., 2004; Ujino et al., 1998) [26, 45, 51, 58].
Tiềm năng tiến hóa của loài phụ thuộc vào mức độ khác nhau di truyền
của nó. Hiểu biết về đa dạng di truyền sẽ cung cấp những thông tin hữu ích để
xây dựng chiến lược bảo tồn và sử dụng loài một cách bền vững. Đối với loài
thực vật, thụ phấn chéo duy trì tiềm năng lớn cho quá trình trao đổi di truyền, sẽ
duy trì mức độ cao của đa dạng di truyền trong quần thể và loài (Hamrick, 1983;
Hamrick và Godt, 1989) [23, 24]. Các thông số về mức độ đa dạng di truyền cao
cũng đã tìm thấy ở một số loài cây họ Dầu như Shorea lumutensis (Boshier,
2011; Lee et al., 2004) [10, 36], S. leprosula (Keiya et al., 2001; Lee et al.,
2000; Rimbawanto và Isoda, 2001) [28, 35, 47]. Mức độ khác nhau di truyền
giữa các quần thể trong một số loài cây họ Dầu là thấp, cũng đã được báo cáo
như Dryobalanops aromatica (Gst=0,067, Lim et al., 2002) [38], Shorea
leprosula (Gst=0,117, Lee et al., 2000) [35] và Shorea lumutensis (Gst=0,048,
Lee et al., 2004) [36]. Sự trao đổi di truyền thông qua hạt phấn nhờ côn trùng và
phát tán hạt nhờ gió và dòng nước đóng vai trò quan trọng cho các loài cây họ
Dầu (Appanah and Chan, 1981; Dayanandan et al., 1990) [6, 15].

1.6 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu
(Dipterocarpaceae) trên cơ sở vùng gen matK
Sử dụng một vùng gen chuẩn được coi là một công cụ hiệu quả xác định
loài và phân loài, cũng như xác định mối quan hệ di truyền giữa các taxon với


nhau. So với gen ty thể (cytochrome c oxidase I), hiệu quả để xác định cho
nhiều nhóm động vật, tỷ lệ khác nhau của gen này là rất thấp trong thực vật.
Hơn nữa, do cây lai và tính đa bội ở thực vật, việc xác định vùng gen chuẩn mã
là khó khăn hơn ở động vật. Do đó, Kress et al. (2005) [31] đã đề xuất vùng gen
trnH-psbA và sau đó Kress và Erickson (2007) [32] đề xuất để kết hợp hai gen
trnH-psbA và rbcL. Lahaye et al. (2008) [34] so sánh tám vùng gen bao gồm
trnH-psbA, matK, ycf5, rbcL, rpoB, ndhJ, accD và rpoC1 và xác định gen matK
như vùng gen chuẩn cho thực vật có hoa và cho thấy gen matK có thể hữu ích
trong việc xác định loài. Tuy nhiên, việc áp dụng chúng bị cản trở do các vấn đề
như mức độ khác nhau giữa các loài thấp. Nhóm nghiên cứu về thực vật (2009)
[14], dựa trên đánh giá về mức độ khác nhau giữa các loài trong bảy vùng DNA
(atpF-atpH, matK, rbcL, rpoB, rpoC1, psbK-psbL và trnH-psbA) đề nghị kết
hợp 2 locus của carboxylase ribulose-1,5-bisphosphate (rbcL) và maturase
(matK) dùng để xác định loài và phân loài. Sự kết hợp 2 locus này sẽ xác định
loài và đóng góp vào sự phát hiện loài mới.
Họ Dầu Dipterocarpaceae bao gồm 17 chi và khoảng 680 loài và được
chia thành ba phân họ; Dipterocarpoideae chứa 13 chi và khoảng 600 loài trong
rừng nhiệt đới núi thấp ở châu Á, Pakaraimoideae với một loài duy nhất ở vùng
cao nguyên Guaianan, Nam Mỹ và Monotoideae với 3 chi và 30 loài ở Châu Phi
và Nam Mỹ. Việt Nam bao gồm khoảng 42 loài và 6 chi (Nguyễn Hoàng Nghĩa,
2005) [4]. Hầu hết các loài này phân bố chủ yếu ở rừng nhiệt đới thường xanh
và rừng hỗn giao lá ở Tây Nguyên và Đông Nam Bộ. Các cây họ Dầu đóng một
vai trò quan trọng trong hệ sinh thái và kinh tế của các khu rừng núi ở độ cao
dưới 500m tại Việt Nam. Gỗ được sử dụng với mục đích xây dựng, đóng tàu

thuyền. Nhựa được sử dụng như một nguồn sơn, đánh véc ni và sơn mài. Như
một hệ quả của sự khai thác và phá rừng, môi trường sống tự nhiên của nhiều
loài cây Dầu bị suy thoái nghiêm trọng hoặc bị phá hủy. Để thiết lập các biện
pháp bảo tồn và tái trồng rừng có hiệu quả thì việc xác định chính xác loài và
mối quan hệ giữa chúng có ý nghĩa quan trọng. Trong đó, việc xác định tên loài
không phải là công việc dễ dàng tại Việt Nam. Phương pháp truyền thống để xác


định loài sử dụng các tiêu chí về hình thái như chiều cao của cây, hình dạng và
kích thước lá, các đặc điểm của hoa và quả. Tuy nhiên, phần lớn đặc điểm này
thay đổi theo độ tuổi của cây và đôi khi với môi trường sống. Do vậy, một kỹ
thuật xác định chính xác hơn dựa vào phân tích DNA để hỗ trợ cho phương pháp
phân loại truyền thống là điều vô cùng cần thiết.
Phân tích mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu
(Dipterocarpaceae) dựa trên trình tự nucleotide của một số vùng gen lục lạp đã
được nghiên cứu bởi Yuwa-amornpitak et al. (2006) [64] và Kajita et al. (1998)
[27]. Nghiên cứu này sử dụng gen lục lạp matK để xác định chín loài thuộc chi
Dipterocarpus, một loài Vatica và một loài Hopea, nhằm cung cấp thêm thông
tin để nhấn mạnh giá trị của các loài bảo tồn và tiến hóa loài Dầu ở Việt Nam.


CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus)

Hin
̀ h 2.1. Cây, lá và quả loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) ta ̣i
VQG Cát Tiên, Đồ ng Nai

Tên khác: Dầu con rái, Dầu con rái trắng, Dầu rái.
Tên khoa học: Dipterocarpus alatus Roxb. ex G.Don
Tên đồng nghĩa:

D. genopterus Turcz
D. incanus Roxb. ex Kurz
D. philipinensis Foxw.

Chi : Dầu (Dipterocarpus)
- Tổng số 268 cá thể loài Dầu nước thu tại 10 điểm nghiên cứu thuộc 6 tỉnh gồm
Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Đắk Lắk và Phú Yên.


- 10 đại diện của các loài khác thuộc họ Dầu được tìm thấy trong các khu vực
như: Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre), Dầu lông (Dipterocarpus
intricatus Dyer), Dầu mít (Dipterocarpus costatus Gaertn.), Dầu baud
(Dipterocarpus baudii Korth), Dầu trà beng (Dipterocarpus obtusifolius
Teysm), Chò nâu (Dipterocarpus retusus Bl.), Dầu đồng

(Dipterocarpus

tuberculatus Roxb.), Dầu cát (Dipterocarpus caudatus aff. condorensis Ashton),
So chai (Hopea recopei Pierre), Táu trắng (Vatica odorata (Griff) Sym. spp.
odorata).
2.2 Địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của 10 quần thể Dầu
nước (Dipterocarpus alatus)
Để phân tích đa dạng di truyền quần thể của loài Dầu nước, luận văn đã
tiến hành thu mẫu lá hoặc vỏ cây tươi của mỗi cá thể tại các quần thể nghiên cứu
với các thông tin về địa điểm thu thập (hình 2.2a), số lượng mẫu được trình bày

ở Bảng 2.1.


Hình 2.2a. Bản đồ địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền 10 quần thể Dầu nước
Bảng 2.1. Địa điểm và số mẫu thu thập cho phân tích SSR
STT

Quần thể

Ký
Số
hiệu mẫu

Địa điểm

Độ
cao

Vĩ độ
Bắc

Kinh độ
Đông

1

Mã Đà

MD

32

Vĩnh Cửu, Đồng Nai

129 m

11o12’

107o09’

2

Đảo Tiên

DT

23

Cát Tiên, Đồng Nai

120 m

11o44’

107o27’

3

Tân Phú

TP

31

Định Quán, Đồng
Nai

80 m

11o05’

107o24’

4

Núi Tượng

NT

27

Cát Tiên, Đồng Nai

130 m

11o25’

107o17’

5

Bù Gia Mập

BG

33

Bù Gia Mập, Bình
Phước

467 m

12º13’

107º10’

6

Côn Đảo

CD

29

đảo Côn Đảo

315 m

8o40’

106o39’

7

Bình Châu Phước Bửu

BC

19

Xuyên Mộc, Bà Rịa
- Vũng Tàu

100 m

10o28’

107o35’

8

Lò Gò - Xa Mát

LG

20

Tân Biên, Tây Ninh

100 m

11o21’

106o02’

9

Yok Đôn

YD

30

Đắk Lắk

230 m

12o49’

107o34’


10

Krông Trai

KT

24

Sơn Hòa, Phú Yên

158 m

13o03’

108o51’

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài họ Dầu
Để xác định vị trí phân loại loài Dầu nước, nghiên cứu đã tiến hành thu
mẫu lá hoặc vỏ cây tươi 10 loài họ dầu khác (bảng 2.2). Vị trí thu mẫu được thể
hiện ở hình 2.2b.

Hình 2.2b. Bản đồ địa điểm thu mẫu 11 loài cây họ Dầu dùng trong xác định
vị trí phân loại

Để xác định vị trí phân loại loài Dầu nước với một số loài họ Dầu khác,
nghiên cứu đã tiến hành thu thập mẫu lá hoặc vỏ cây tươi cho mỗi loài nghiên
cứu kèm theo thông tin về địa điểm thu mẫu được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh sách các loài Dầu dùng xác định vị trí phân loại
STT

Tên khoa học

Tên Việt Nam

Địa điểm thu mẫu


1

Dipterocarpus dyeri Pierre

Dầu song nàng

Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đồng Nai,

2

Dipterocarpus alatus Roxb.
ex G.Don

Dầu nước

Cát Tiên, Đồng Nai,

3

Dipterocarpus intricatus
Dyer

Dầu lông

Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đồng Nai,

4

Dipterocarpus costatus
Gaertn.

Dầu mít

Tân Biên, Tây Ninh,

5

Dipterocarpus baudii Korth

Dầu baud

Cát Tiên , Đồng Nai,

6

Dipterocarpus obtusifolius
Teysm

Dầu trà beng

Yok Đôn, Đắk Lắk,

7

Dipterocarpus retusus Bl.

Chò nâu

Hy Cường, Lâm Thao, Phú Thọ,

8

Dipterocarpus tuberculatus
Roxb.

Dầu đồng

Yok Đôn, Đắk Lắk,

9

Dipterocarpus caudatus aff.
condorensis Ashton

Dầu cát

Bình châu, Xuyên Mộc, Bà Rịa Vũng Tàu,

10

Hopea recopei Pierre

So chai

Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đông Nai,

11

Vatica odorata (Griff) Sym.
spp. odorata

Táu trắng

Cát Tiên, Đồng Nai,

2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Khảo sát thực địa
Kích thước quần thể của loài Dầu nước là rất nhỏ, do đó các thông số hình
thái cá thể trong mỗi quần thể nghiên cứu được quan sát và xác định trực tiếp tại
hiện trường, bao gồm chiều cao và đường kính ngang ngực. Khoảng cách giữa
các cá thể trong quần thể nghiên cứu cũng được xác định trực tiếp.


Nơi sống của mỗi quần thể cũng được mô tả bao gồm kiểu thảm thực vật,
cấu trúc phân tầng của thảm thực vật. Loài thực vật đặc trưng cho mỗi kiểu thảm
thực vật. Đặc điểm nơi sống và số mẫu thu thập cho phân tích đa dạng di truyền
quần thể cũng được đề cập. Để xác định chính xác tên khoa học ở mỗi nơi
nghiên cứu, mẫu tiêu bản được thu thập và được lưu giữ tại Phòng Sinh học,
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.
Ngoài ra, tại thực địa người dân địa phương cũng được phỏng vấn về
nghề nghiệp, thu nhập và nhận thức bảo tồn loài quý hiếm đang bị đe dọa tại
những khu vực nghiên cứu. Vị trí nghiên cứu được xác định trên cơ sở bản đồ
địa hình tỉ lệ 1:50.000 và định vị khu vực nghiên cứu bằng máy định vị GPS.
2.3.2. Phương pháp thu mẫu
Tổng số 268 mẫu lá hoặc vỏ cây tươi của 10 quần thể loài Dầu nước và 10
mẫu lá hoặc vỏ cây tươi của 10 loài dầu khác được thu, đánh số và bảo quản
trong silica gel ngoài thực địa. Sau đó được chuyển về phòng Phân loại thực
nghiệm và Đa dạng nguồn gen, các mẫu được bảo quản trong tủ lạnh -300C cho
đến khi mẫu được lấy ra để phân tích DNA. Mẫu tiêu bản cũng được thu thập tại
thực địa và được bảo quản trong phòng thí nghiệm
2.3.3 Phân tích trong phòng thí nghiệm

2.3.3.1 Tách chiết DNA tổng số
Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle (1987)
[16], có cải tiến theo phòng thí nghiệm bao gồm các bước sau:
Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá (hoặc vỏ cây). Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng
cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, chuyển ngay bột mịn vào ống
eppendorf 2ml.
Bước 2: Bổ sung 800 l đệm rửa (Tris-HCl 100mM, EDTA 5mM, NaH2PO4
0,5%) vào ống eppendorf chứa mẫu, vortex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm
12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần).