BƯỚC đầu NGHIÊN cứu NHÂN NHANH cây nưa (amorphophallus sp) TRONG ỐNG NGHIỆM để bảo tồn và PHỤC vụ sản XUẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH TÂY

KHOA CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM
…………………

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH
CÂY NƯA (Amorphophallus sp) TRONG ỐNG NGHIỆM ĐỂ
BẢO TỒN VÀ PHỤC VỤ SẢN XUẤT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VĂN DƯ
(VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT)
TS. LÊ XUÂN ĐẮC
(VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC)
BỘ MÔN – KHOA: CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM
NGƯỜI THỰC HIỆN: LÊ THỊ THANH HUỆ
LỚP: K2-CNSH2


HÀ NỘI - 2012

2


LỜI CAM KẾT
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và chưa
được công bố trong bất kì công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng
Tác giả

Lê Thị Thanh Huệ

3

năm 2012


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, TS. Lê Xuân Đắc,
Viện Công nghệ sinh học đã luôn tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ
Nông - Lâm - Thực phẩm trường Đại học Thành Tây đã dạy dỗ, truyền đạt
cho tôi cho tôi những kiến thức vững chắc và lòng đam mê nghiên cứu khoa
học trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi đến gia đình và bạn bè, những người đã ủng hộ, động
viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu khoa học lời biết
ơn chân thành và sâu sắc nhất.
Hà Nội, tháng 6 năm 2012

4


KÍ TỰ VIẾT TẮT
BAP
CT
CTMT
ĐC

IAA
IBA
KTST
NAA
TB

6 - Benzyl Amino Purin
Công thức
Công thức môi trường
Đối chứng
Indoly Acetic Acid
Indoly Butyric Acid
Kích thích sinh trưởng
α – Naphthalen Acetic Acid
Trung bình

5


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Kết quả tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt
Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IAA đến khả năng tạo đa chồi
Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi
Bảng 6: Kết quả tổng hợp thí nghiệm tạo đa chồi cây Nưa
Bảng 7: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ
Bảng 8: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ
Bảng 9: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ
Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu

6


Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nưa là một loại cây thường được trồng ở các quốc gia Đông Á như là một
cây lương thực và thực phẩm. Ở nước ta, Nưa mọc hoang rải rác ở khắp các
vùng rừng núi, được người dân nhiều địa phương đem về trồng cũng đã lâu
đời ở trong vườn, quanh bờ ao, dọc hàng rào và trên các đồi để làm thức ăn
cho người và gia súc, gặp nhiều ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà
Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế... Củ Nưa có nhiều
tinh bột mịn ăn ngon hơn sắn nên trước đây nhân dân ta trồng nhiều để lấy
củ làm lương thực ăn thay cơm, bẹ lá nấu canh hay muối để dành làm thức
ăn như dưa trong những tháng thiếu rau xanh cho người hoặc chế biến thức
ăn cho gia súc. Trong củ Nưa có chứa glucomannan, đây là một
polysaccharide hòa tan trong nước. Nó có khả năng làm giảm lượng đường
và cholesterol trong máu, giảm cân, thúc đẩy hoạt động đường ruột và tăng
cường chức năng miễn dịch. Glucomannan cũng được sử dụng trong công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
Cây Nưa không chỉ có giá trị về mặt thực phẩm mà còn có ý nghĩa trong
việc chống xói mòn đất. Thực trạng hiện nay, diện tích rừng nước ta đang
ngày càng bị thu hẹp, việc khai thác tài nguyên rừng bừa bãi, sự đa dạng
sinh học bị phá vỡ, nhiều nguồn gen thực vật có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng
với thực tế là ngày nay đời sống con người ngày càng nâng cao, nhiều người
không còn nghĩ đến một loài cây dân dã nhưng lại có nhiều giá trị to lớn như
cây Nưa. Hơn nữa hiện nay những nghiên cứu về cây Nưa chưa nhiều, chính
vì vậy việc quan tâm đến cây Nưa là một việc làm cần thiết để có thể nhân
giống và bảo tồn giống cây Nưa.

Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ
thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà

7


nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng
hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài
thực vật quý hiếm. (Lê Trần Bình và CS, 1997)
Với những lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu
nhân nhanh cây Nưa (Amorphophallus sp) trong ống nghiệm để bảo tồn
và phục vụ sản xuất”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xây dựng quy trình hoàn chỉnh để nhân nhanh và bảo tồn in vitro cây Nưa.
1.2.2. Yêu cầu
- Xây dựng được qui trình nhân cây Nưa trong ống nghiệm với hệ số nhân
chồi cao, chi phí sản xuất thấp, giá thành hạ...
- Cây con nuôi cấy từ ống nghiệm phát triển tốt ở giai đoạn nhà lưới và vườn
ươm.

8


Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vị trí phân loại và giá trị của cây Nưa
Cây Nưa (hay khoai Nưa) có tên khoa học là Amorphophallus sp, thuộc họ
Ráy (Araceae), lớp Một lá mầm (Monocotyledone) (Hoàng Thị Sản và
Hoàng Thị Bé, 2006). Cây thảo có củ lớn hình cầu lõm, đường kính có thể

tới 25cm; trước ra hoa, sau ra lá. Mỗi lá chia làm 3 nhánh, các nhánh lại chia
đốt, phiến lá xẻ thuỳ sâu hình lông chim, các thuỳ cuối hình quả trám thuôn,
nhọn đầu; cuống lá thon, dài 40-80cm, nhẵn, màu lục nâu, có điểm các chấm
trắng. Cụm hoa có mo lớn, phần bao mo màu lục nhạt điểm các vết lục thẫm,
ở phía mép màu hung tím, mặt trong màu đỏ thẫm. Trục hoa dài gấp đôi mo.
Quả mọng. (Hejnowicz Z và Barthlott W 2005), (Jianbin Hu và Jianwu Li,
2008)
Khoai Nưa được trồng ở Nhật bản, Trung quốc, Việt Nam và Philippin. Ở
nước ta, các dân tộc ở một số vùng đồi núi thuộc các tỉnh Quảng Ninh, Lạng
Sơn, Hà Bắc... đã có tập quán trồng khoai Nưa từ lâu đời. Nhiều vùng nông
thôn cũng có trồng để lấy củ ăn. Cây Nưa có giá trị thực phẩm rất to lớn.
Cuống lá Nưa có thể dùng để nấu canh hoặc muối dưa ăn. Củ, dọc và lá, bã
bột khoai Nưa là nguồn thức ăn rất tốt để chăn nuôi gia súc, đặc biệt chăn
nuôi lợn. Củ Nưa là phần có giá trị to lớn nhất. Củ Nưa có thể luộc ăn hoặc
gọt vỏ thổi độn với cơm, ăn mát, chắc dạ, không nóng ruột như khoai lang.
Củ khoai Nưa còn dùng để nấu chè. Tuy nhiên, Nưa chủ yếu được trồng để
lấy bột. Bột Nưa trắng mịn như bột sắn nhưng có hàm lượng tinh bột cao
hơn. Trong 100g củ khô có tinh bột là 75,16g; protein 12,5g; lipid 0,98; dẫn
xuất không protein 3,27; cellulose 3,67; tro 4,42. Tỷ lệ tinh bột nhiều gấp
đôi khoai sọ. Bột Nưa từ lâu đã được người Nam Bộ coi như một thứ thực
phẩm giải nhiệt hữu hiệu giống như bột sắn. Dân gian còn có thể dùng bột
Nưa để làm các loại bánh, làm miến và sử dụng trong công nghiệp để hồ vải.

9


Từ xưa người dân miệt duyên hải Tây Nam Bộ xem bột Nưa như một loại
thuốc dân gian. Củ Nưa có thể dùng như một dược liệu để chữa bệnh sốt rét
có báng, đờm trệ, ăn không tiêu, đầy bụng. (Đỗ Tất Lợi, 2005)
Trong củ Nưa có chứa glucomannan - một polysaccharide hòa tan trong

nước. Glucomannan là một chất phụ gia thực phẩm được sử dụng như một
chất chuyển đổi sữa hay chất làm đặc. Trong lịch sử, glucomannan đã được
sử dụng trong thực phẩm truyền thống châu Á như mì, đậu phụ, và các sản
phẩm khác. Ngoài ý nghĩa trong thực phẩm, glucomannan còn đóng vai trò
quan trọng trong một số loại dược phẩm (Tamura và CS, 2005).
Glucomannan là một chất xơ hòa tan, chính vì vậy nó được sử dụng để điều
trị táo bón. Glucomannan có thể làm giảm táo bón bằng cách giảm thời gian
vận chuyển phân (Marzio, 1989). Trong điều trị táo bón mãn tính,
glucomannan cải thiện đáng kể các triệu chứng táo bón (Passaretti, 1991).
Glucomannan cũng có tác dụng giảm colesterol, lipoprotein và chất béo
trung tính, do đó nó cũng được bổ sung vào thành phần của các loại thuốc
chữa béo phì (Walsh, 1984), (Gallaher, 2002). Chất này cũng được chứng
minh là có tác dụng hỗ trợ tích cực trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân tiểu
đường type 2 do có thể điều chỉnh nồng độ đường trong máu (Chen, 2003).
Glucomanan chiếm 70% trong chất khô của củ Nưa, vì vậy việc nghiên cứu
nhân giống cây Nưa để thu glucomannan có ý nghĩa rất to lớn.
Cây Nưa không kén đất, có thể trồng được trên nhiều loại đất từ đất xấu bạc
màu đến đất hoang đồi núi tơi xốp, nhiều mùn. Một trong những đặc điểm
sinh lý quan trọng của cây khoai Nưa là khả năng chịu bóng rất cao, dễ
quang hợp ở những nơi có ánh sáng tán xạ, độ che phủ cao do đó rất thích
hợp để trồng xen dưới các tán rừng, vườn cây ăn quả vừa tận dụng được đất
đai, vừa góp phần chống xói mòn bảo vệ đất và rừng rất tốt. Đây là một loại
cây có củ bản địa có giá trị kinh tế cần được khôi phục sản xuất để phục vụ
nhu cầu kinh tế của xã hội đồng thời góp phần bảo vệ môi trường sinh thái.

10


2.2. Tình hình nghiên cứu cây Nưa trong và ngoài nước
2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, những nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Nưa được
thực hiện ở nhiều nước, đặc biệt ở Trung Quốc phát triển rất mạnh (ChunLin Long và CS, 2005). Nhiều nước đã có những nhà máy chế biến, sản xuất
tinh bột Nưa và tách chiết glucomannan ở qui mô công nghiệp. (Suzuki và
CS, 2010)
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam chi Nưa là chi lớn nhất trong họ Ráy bao gồm 20-25 loài
(Nguyễn Văn Dư, 2005). Lần đầu tiên cây Nưa ở Việt Nam được nhà thực
vật học người Đức Engler nghiên cứu vào năm 1911 trong cuốn
Pflanzenreirich. Trong tài liệu này ông mô tả loài Nưa Bắc Bộ (A.
tonkinensis) như một loài mới ở Bắc Việt Nam. Năm 1942, Gagnepain khi
viết họ Ráy ở Đông Dương, ông đã thống kê và mô tả 4 loài Nưa ở Việt
Nam là Nưa chuông (A. campanulatus = A. paeoniifolius), Nưa Bắc Bộ (A.
tonkinensis), Nưa mekong (A. mekongensis), Nưa đứt đoạn (A. interruptus).
Mãi tới năm 1993, Phạm Hoàng Hộ viết cuốn Cây cỏ Việt Nam ông cũng
thống kê và mô tả ngắn gọn những đặc điểm về cây Nưa.
Từ trước đến nay, việc nhân giống cây Nưa chưa được chú trọng, chủ yếu
người dân tự để giống hoặc vào rừng khai khác theo hình thức tự cung tự
cấp. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về cây Nưa còn rất hạn chế. Gần đây,
nhóm nghiên cứu về Thực vật dân tộc học thuộc Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật và Trại Thực nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh
học đã và đang tiến hành thu thập các giống Nưa với mục đích bảo tồn, tiếp
theo là chọn lọc đánh giá các giống Nưa có hàm lượng glucomannan cao,
chất lượng tinh bột tốt để nhân nhanh và sản xuất cây Nưa phục vụ công
nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm. Ngày 10/3/2011, Sở Khoa học và
Công nghệ Thừa Thiên Huế đã tổ chức hội nghị tuyển chọn đề tài “Nghiên cứu
hàm lượng, chất lượng, tác dụng và xây dựng quy trình sản xuất glucomannan
11


trong củ Nưa-Amorphophallus (họ Ráy-Araceae) trồng tại tỉnh Thừa Thiên

Huế”.( />GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=20110324153307). Sáng ngày
08/02/2012, tại Hội trường Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, NCS. Nguyễn Tiến An, chuyên ngành Hóa Hữu cơ đã bảo vệ
thành công Luận án Tiến sĩ về đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, quy
trình tách chiết, biến tính hóa học và khả năng ứng dụng của glucomannan
từ củ một số loài nưa (Amorphophallus. sp – Araceae) ở Việt Nam”.
( />2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan
trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các
công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn
100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực
nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng (Nguyễn Đức Thành, 2000).
2.3.1. Môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Thành phần hóa học:
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm
một số thành phần cơ bản sau:
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
- Các vitamin
- Các amino axít
- Nguồn các - bon: một số các loại đường
- Các chất điều hoà sinh trưởng
- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai
tây, bột chuối khô...
- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

12


Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong
sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.

Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa
chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào
một số yếu tố:
- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về
thành phần môi trường.
- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo
mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế
bào, vi nhân giống…)
- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).
Độ pH môi trường
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong
nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá
trị cần thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion
và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0 - 6,0 trước khi khử trùng
được xem là tối ưu. Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi
pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trường nuôi
cấy nghèo đệm, vì thế chúng làm dao động giá trị pH, sự giao động này có
thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưởng của các tế
bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp.
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu
nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng môi
trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ
pH của môi trường về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy callus của nhiều loài
cây, pH ban đầu thường là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị
từ 6,0 - 6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính
acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl
loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5 - 6,5.
13

Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH
là bắt buộc.
Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi khử trùng.
Nhìn chung nếu độ PH cao hơn 6 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn
5 thì agar khó đông.
Các tác nhân làm rắn môi trường
Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị các
môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid). Trong
nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu
oxy. Các gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static
conditions).
Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏRhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác. Trước tiên,
gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường. Thứ hai,
chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở
tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Bình thường, từ 0,5 - 1% agar
được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi
trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trong những nghiên cứu về dinh
dưỡng, việc sử dụng agar được tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch
do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết.
Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar
với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60 oC
trong 24 giờ. Nói chung, ở 80oC agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol
và ở 40oC trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6 - 12
g/l nước.
Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử
dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25 oC). Các hợp chất khác đã được
thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và gel-rite.
Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một loại agarose được tinh sạch
14

cao gọi là Sea Plaque(k), loại này có thể được dùng để phục hồi các
protoplast đơn (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ
(perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge), bấc giấy lọc (filter
paper wick), bọt polyurethane (polyurethane foam) và xốp polyester
(polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi
trường nuôi cấy mô hoặc tế bào.
Điều thuận lợi khi làm việc với các hợp chất tạo gel nhân tạo là chúng tạo ra
các gel sạch ở các nồng độ tương đối thấp (1,25 - 2,5 g/l) và nó có thể giúp
phát hiện sự nhiễm bẩn được phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy. Các
mẫu vật sinh trưởng tốt hơn trên agar hoặc các tác nhân tạo giá thể khác phụ
thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau.
Một số loại môi trường cơ bản thường được sử dụng trong nuôi cấy mô
tế bào thực vật:
Môi trường Murashige-Skoog (MS) là một trong những loại môi trường
được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Môi trường
MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm (Murashige, 1962).
Tới nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức
gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962. Môi trường B5 được thiết
kế đầu tiên cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó
được cải tiến và trở thành môi trường thích hợp cho nuôi cấy protoplast. Môi
trường này cũng được sử dụng để tái sinh cây từ protoplast. Môi trường Chu
(N6) là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa, được
phát triển đặc biệt cho nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo, mặc dù trong các
thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi trường được phát minh bởi Nitsch (1969)
vẫn được dùng phổ biến hơn. Môi trường Nitsch ngày càng thích hợp và phổ
biến trong nuôi cấy cây đậu tương, cỏ ba lá đỏ (red clover) và các loài
legume khác. Thành phần dinh dưỡng của môi trường này đã giúp tăng sinh
trưởng của tế bào trong quá trinh phát sinh phôi và nuôi cấy protoplast.

15


Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành
công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu
gen, các kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào
trần, bao phấn, hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi
trường. Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải
lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Cho đến nay, các nhà khoa học đã tạo ra một số lượng rất lớn các môi
trường thích hợp với từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu.
2.3.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Hiện nay, từ những thành tựu của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế
bào có thể ứng dụng rất nhiều vào lĩnh vực trồng trọt, như:
- Nhân nhanh vô tính các giống cây quý: từ một mẫu nuôi cấy người ta có thể tạo ra hàng triệu cây con như nhau nếu đủ thời gian cấy chuyển. Tuy nhiên, hệ số cấy
chuyển phụ thuộc tuỳ giống, càng cấy chuyển nhiều lần càng tạo nhiều biến dị. Ví dụ, các nhà khoa học đã kết luận từ một chồi dứa đưa vào nuôi cấy trong ống
nghiệm có thể nhân ra hàng triệu cây dứa giống; từ một chồi chuối đưa vào nuôi cấy có thể nhân ra 2.000 cây chuối giống, nếu qua số này sẽ có tỷ lệ biến dị cao.

- Cải lương giống cây trồng bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristerm): để phục tráng những giống cây quý đã nhiễm virus người ta có thể nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng để nhân nhanh. Qua một số lần nuôi cấy theo kiểu này sẽ tạo ra được những cây hoàn toàn sạch bệnh từ cây đã nhiễm virus.

- Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy tế bào hạt phấn: Người
ta đã ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn để tạo những cây đơn
bội từ bao phấn hoặc hạt phấn, sau đó lưỡng bội hoá và tạo thành dòng đồng
hợp tử. Kĩ thuật này đã thành công nhiều ở những cây họ cà.
- Khắc phục lai xa bằng cách thụ phấn trong ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi: Nhờ nuôi cấy trong ống nghiệm đã khắc phục tính bất hợp giao tử trước và sau
khi thụ tinh đối với lai giữa các cây khác nhau khá xa về mặt di truyền.

- Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật mà người ta đã tạo thành cây lai từ 2 giống khác nhau

khá xa về mặt di truyền bằng cách dùng các enzim để hoà tan màng tế bào
rồi cho các tế bào trần (không còn màng) vào nuôi cấy chung trong môi
trường nhân tạo và chúng phát triển thành khối mô sẹo (callus), từ đó
chuyển khối callus này sang các môi trường phân hoá chức năng tế bào và
để nuôi cấy thành cây lai. (Nguyễn Đức Thành, 2000)
2.3.3. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây
in vitro

16


Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật
nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh
trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều
hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai chất
kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô
(Geoge, 1993).
Đặc tính của Auxin
Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành
phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô
sẹo, huyền phù tế bào và sự điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó
được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi
trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên
cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa
auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với
cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của
nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng
(sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác

động của các auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính,
rễ… Đối với nuối cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích
thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng là: IBA
(Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic
Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) (Đỗ Năng Vịnh, 2005)
Đặc tính của cytokinin
Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân
chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô và
tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP (6 Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 - amin),
17


zeatin (6 - (4 - hydroxyl - 3 metyl - trans - 2 butanylamin) purin). Hàm
lượng sử dụng các loại cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình
thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.
Ngoài 2 nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực
vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào,
qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy… GA 3 là loại được sử dụng
nhiều nhất.
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc
cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ
hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn (Vũ Văn Vụ, 2005)
2.4. Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương pháp nuôi
cấy mô và tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trong những
phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh và bảo tồn, đặc biệt là đối với
cây trồng khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống (Đỗ Năng Vịnh,
2005), (Daniel Lineberger, 1980). Dưới đây là một số thành tựu đã đạt được.
Trong nước
Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt đới

quý hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt đầu
từ các cây Thông (Taxus sps.) là loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư
hiệu quả như Taxoid và các hợp chất và một số loài thực vật có giá trị làm
thuốc (Lê Thị Xuân và CS, 1996)
Cây Màng tang (Litsea verticillata) là một loại cây thân gỗ có chứa một số
hợp chất có khả năng kháng HIV (+) – demethoxyapiercelsin và verticillatol
(Hoang VD, Zhang HJ). Tác giả Lê Xuân Đắc và cộng sự đã thành công
trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được
tìm thấy ở vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào
thực vật (Lê Xuân Đắc và CS, 2004)

18


Tác giả Nguyễn Thanh Tùng đã nhân giống in vitro thành công cây sưa
(Dalbergia tonkinensis Prain), cây thân gỗ quý hiếm và có giá trị kinh tế cao
vào năm 2008. Năm 2009 tác giả này cũng thành công với đề tài “Nghiên
cứu bảo tồn in vitro một số loài lan rừng Việt Nam quý hiếm”, nhân được
nhiều giống lan như: Thanh đạm một hoa, Thủy tiên hường, Ngọc vạn sáp,
Mỹ dung dạ lan… ( />Cây Ba kích là một cây dược liệu quý, có tác dụng bổ thận âm, bổ thận
dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp (Ning-Zhen Huang, 2007). Dịch
chiết cồn từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối
với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon (Wei, 2006). Ngày
nay nhu cầu sử dụng loài cây này làm dược liệu đang gia tăng nên nó bị khai
thác kiệt quệ. Năm 2010, các tác giả Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư đã
nghiên cứu và nhân giống thành công giống cây quý này bằng phương pháp
nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư, 2010).
Thế giới
Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái sinh một số
giống tre quý như Dendrocalamus asper (tre mạnh tông), Bambusa

multiplex (cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên (Nandi, 2002)
Các tác giả Balaraju và cộng sự (2008) đã nhân giống và tái sinh in vitro
thành công cây thuốc Vitex agnus-castus (Verbenaceae) bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ
sung 0,1 mg/l IBA. Cây thuốc Vitex agnus-castus cũng đang bị đe dọa
nghiêm trọng (Balaraju, 2008)
Năm 2008, các tác giả Nishritha, Sanjay cũng đã nhân giống in vitro thành
công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn.
Cùng năm đó, Mukherjee và RoyChowdhury cũng đã nhân giống in vitro
loài Aloe Vera sp. (Mukherjee, 2008), (Nishritha, 2008)

19


Bên cạnh đó, tác giả Park và cộng sự (2009) cũng đã tái sinh thành công loài
Rehmannia glutinosan L.Journal quý hiếm, đang bị khai thác quá mức (Park,
2009)
Ngoài ra cũng còn nhiều loài cây quý khác cũng đã được nhân giống và bảo
tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia inermis Linn (Lythraceae),
Sausurea lappa C.B.Clarke… (Arora, 1989), (Rout, 2001)
2.5. Phương pháp bảo tồn thực vật
Hai phương pháp bảo tồn cơ bản được áp dụng là: bảo tồn in situ và bảo tồn
ex situ
Bảo tồn in situ
Đây là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất, đặc biệt là với những loài cây bản
địa có phân bố tập trung và có khả năng tái sinh tự nhiên. Bảo tồn in situ
được đề xuất cho hầu hết các loại cay rừng nhiệt đới ở nước ta, bởi vì các
loài cây này thường là khó tạo thành rừng trồng đơn loài hoặc khó tái sinh
ngoài môi trường sống tự nhiên.
Bảo tồn in situ còn bao hàm cả các quần thể tái sinh nhân tạo bằng nguồn

hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ nhiều cây mẹ mà không áp dụng có định
hướng. Điều này có ý nghĩa to lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các
loài cây có phân bố rải rác, như vậy quần thụ bảo tồn được dùng làm nguồn
cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo, cho trồng rừng, làm giàu rừng
và cải thiện di truyền. Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo
vệ theo hình thức bảo tồn in situ, song có hai vấn đề được quan tâm là:
- Có quy hoạch cụ thể và xác định các vùng cần bảo vệ cho mỗi loài sao cho
cá thể vẫn lưu giữ được toàn bộ biến dị di truyền của loài.
- Kết hợp bảo tồn với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái
sinh nhân tạo, xây dựng quần tụ bảo tồn mới (in situ và ex situ), xây dựng
giống và phục vụ trồng rừng (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997)

20


Bảo tồn ex situ
Được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu nhân giống ra khỏi vùng
phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây sống (Vườn thực vật), rừng
trồng với mục đích bảo tồn (quần tụ bảo tồn ex situ, ngân hàng hạt giống,
phấn hoa hay nuôi cấy mô) (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997)
Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ:
- Thu thập các mẫu gen tiêu biểu
- Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài
- Làm tăng số lượng mẫu thu thập được (Havens, 1999)
Bảo tồn ex situ được áp dụng cho các loại cây trồng chủ yếu, các loài cây đó
biết rõ giá trị của chúng hoặc khi các quần thể tự nhiên không được bảo vệ
an toàn do tác động của sâu bệnh, lửa rừng và sự phá hoại rừng của súc vật
hoặc con người hoặc do bị tạp giao với các quần thể ngoại lai khác.
Khó khăn lớn nhất của bảo tồn ex situ là chi phí cao vì diện tích của quần thụ
bảo tồn được đề xuất là 10ha cho mỗi loài hoặc xuất xứ và được lượng biến

dị đủ lớn, nghĩa là thu hạt càng nhiều kiểu gen càng tốt (Nguyễn Hoàng
Nghĩa, 1997).

21


Phần 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu:
Cây Nưa
Vật liệu nghiên cứu:
- Nguyên liệu thực vật:
Hạt chín cây Nưa do Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp.
- Dụng cụ: Dụng cụ nghiên cứu là các trang thiết bị như: box cấy vô trùng,
panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống
giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH...(của các hãng chuyên dụng như:
Sanyo, Metler Toledo, Satorius...)
- Hóa chất: Môi trường MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối đa
lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog
(1962), đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP,
IAA, IBA...(của các hãng chuyên dụng như: Sigma, Merck, Invitrogen..)
Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 27 oC và chế độ chiếu sáng 12h/12h
với cường độ chiếu sáng 2000lux, nồng độ pH môi trường nuôi cấy 5,8.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu:
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thực vật dân tộc - Viện sinh thái
và Tài nguyên sinh vật; Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh
học.

22


Thời gian nghiên cứu:
Từ tháng 08/2011 đến tháng 06/2012
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định điều kiện khử trùng hiệu quả với hạt chín
- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo đa chồi in vitro
- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo cây in vitro hoàn chỉnh
- Xác định giá thể thích hợp cho cây in vitro nuôi trồng ngoài tự nhiên
3.4. Phương pháp nghiên cứu
- Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác
nhau và có công thức đối chứng
- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm lớn hơn hoặc bằng 30
- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần
3.4.1. Tạo mẫu vô trùng
Có 2 phương pháp vô trùng mẫu: vô trùng bằng dung dịch javen 70% và vô
trùng bằng dung dịch HgCl2.
Phương pháp vô trùng bằng dung dịch javen 70%:
1. Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng;
2. Rửa 2 lần bằng nước cất dưới vô trùng;
3. Rửa trong cồn 700C (trong 1 phút );
4. Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;
5. Khử trùng trong dung dịch javen 70%, lắc trong 10 phút;
6. Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;
7. Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;

23

Phương pháp vô trùng bằng dung dịch HgCl2
1. Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng;
2. Rửa 2 lần bằng nước cất dưới vô trùng;
3. Rửa trong cồn 700C (trong 1 phút );
4. Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;
5. Khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1%, lắc trong 10 phút;
6. Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;
7. Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;
- Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường MS. Sau
khoảng 30 ngày chồi non phát sinh in vitro, các chồi non này được sử dụng
làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2. Tạo đa chồi in vitro
Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS + 30mg/l đường
saccharose + 8g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (KTST)
với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH = 5,8.
Các chồi Nưa có kích thước 0,3 - 0,5 cm được cấy thẳng đứng trên môi
trường thạch.
Chỉ tiêu quan sát: số chồi phát sinh/mẫu.
Công thức thích hợp sẽ được chọn để áp dụng cho các lần tạo đa chồi tiếp
theo.
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi
Mục đích thí nghiệm: xác định nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi cây
Nưa.
CT môi trường

Nồng độ BAP
(mg/l)

24

ĐC
AMBA1
AMBA2
AMBA3
AMBA4
AMBA5
AMBA6
AMBA7

0
0,1
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa
chồi
Mục đích thí nghiệm: khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và NAA đến
khả năng phát sinh chồi và tăng trưởng của Nưa
CT môi trường
ĐC
AMNA1
AMNA2
AMNA3
AMNA4
AMNA5

AMNA6

Chất KTST
BAP (mg/l)
NAA (mg/l)
0
0
2
0,1
2
0,2
2
0,3
2
0,4
2
0,5
2
0,6

Trong thí nghiệm này, chất KTST BAP được bổ sung với nồng độ 2 mg/l.
Nồng độ NAA tăng dần từ 0,1 - 0,6 mg/l. Sau thí nghiệm sẽ kết luận ở mức
nồng độ nào thì mẫu cấy sẽ phát sinh nhiều chồi nhất, hiệu quả nhất.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IAA đến khả năng tạo chồi
Mục đích thí nghiệm: khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và IAA đến
khả năng tạo chồi
CT môi trường
ĐC
AMIA1

Chất KTST
BAP (mg/l)
IAA (mg/l)
0
0
2
0,1
25