Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và bước đầu đánh giá đặc tính sinh học của Interleukin11 người tái tổ hợp

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ QUÝ

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN,TINH CHẾ VÀ BƯỚC
ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ QUÝ

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. TRƯƠNG NAM HẢI
Viện Công nghệ sinh học

2. TS. LÊ THỊ THU HỒNG
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội – 2017


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................. ii
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................v
DANH MỤC HÌNH............................................................................... vi
MỞ ĐẦU ...............................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU..................................3
1.1. Interleukin-11 và vai trò đối với hệ tạo máu ..........................................3
1.1.1. Hệ tạo máu và con đường tạo tiểu cầu ở cơ thể người .................................. 3
1.1.2. Đặc tính phân tử, cấu trúc và cơ chế hoạt động của Interleukin-11 .............. 6
1.1.3. Những nghiên cứu về vai trò của IL-11 trên mô hình thực nghiệm .............. 9
1.2. Tình hình nghiên cứu biểu hiện interleukin-11 tái tổ hợp ......................12
1.3. Hệ biểu hiện protein tái tổ hợp ..........................................................19
1.3.1. Sơ lược về hệ biểu hiện protein tái tổ hợp, ưu và nhược điểm .................... 19
1.3.2. Một số chủng biểu hiện thông thường của E. coli ....................................... 23
1.3.3. Vector biểu hiện của chủng E. coli .............................................................. 25
1.3.4. Một số giải pháp cải thiện mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp .................. 27
1.3.5. Tinh sạch protein và những khó khăn thường gặp ...................................... 29
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................35
2.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................35
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 35
2.1.2. Hóa chất và vật tư dùng cho nghiên cứu ..................................................... 36
2.1.3. Thiết bị ......................................................................................................... 40

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................40


2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử và vi sinh ............................................. 40
2.2.2. Các phương pháp hóa sinh và miễn dịch ..................................................... 44
2.2.3. Phương pháp đánh giá tác dụng tăng sinh dòng tế bào của IL-11............... 49
2.2.4. Phương pháp đánh giá tính an toàn của IL-11 tái tổ hợp ............................ 50
2.2.5. Phân tích, xử lý số liệu ................................................................................ 53
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................56
3.1. Biểu hiện Interleukin-11 trong tế bào E. coli .......................................56
3.1.1. Biểu hiện Interleukin-11 dạng đơn trong vector pET22b(+) ....................... 56
3.1.2. Biểu hiện Interleukin-11 dạng dung hợp trong vector pE-SUMO3 ............ 64
3.1.3. Lựa chọn điều kiện biểu hiện protein SUMO-IL11..................................... 67
3.2. Tinh chế và tạo sản phẩm Interleukin-11 ............................................73
3.2.1. Tinh chế protein SUMO-IL11 bằng sắc ký ái lực ....................................... 73
3.2.2. Cắt protein SUMO-IL11 bằng enzyme ....................................................... 79
3.2.3. Tạo công thức cho protein IL-11 ................................................................. 80
3.2.4. Loại chất gây sốt ở sản phẩm IL-11 ............................................................ 82
3.2.5. Đông khô sản phẩm IL-11 ........................................................................... 85
3.3. Bƣớc đầu đánh giá đặc tính sinh học của protein IL-11 tái tổ hợp ..........87
3.3.1. Đánh giá độ tinh sạch của protein IL-11 ..................................................... 87
3.3.2. Đọc trình tự axit amin đầu N của protein IL-11 .......................................... 88
3.3.3. Đánh giá tác dụng tăng sinh dòng tế bào TF-1 ............................................ 89
3.3.4. Đánh giá tính an toàn chung trên chuột ....................................................... 90
3.3.5. Đánh giá độc tính cấp trên chuột nhắt trắng ................................................ 91
3.3.6. Đánh giá độc tính bán trường diễn trên chuột cống .................................... 92
3.3.7. Đánh giá chất gây sốt trên thỏ ..................................................................... 99
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................. 100
4.1. Biểu hiện Interleukin-11 ngƣời tái tổ hợp ........................................ 100
4.2. Tinh chế protein IL-11 tái tổ hợp ................................................... 104

4.3. Tạo sản phẩm IL-11 có khả năng sử dụng bằng đƣờng tiêm ............... 108
4.4. Bƣớc đầu đánh giá đặc tính sinh học của sản phẩm IL-11 .................. 111
4.4.1. Độ tinh sạch và trình tự axit amin đầu N của IL-11 .................................. 111
4.4.2. Tác dụng tăng sinh dòng tế bào của IL-11 ................................................ 113
4.4.3. Tính an toàn của IL-11 tái tổ hợp trên mô hình động vật .......................... 116
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 123
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .......... 125
SUMMARY ...................................................................................... 126
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 131
PHỤ LỤC ..............................................................................................1


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải và TS. Lê
Thị Thu Hồng, là những thầy cô đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt
nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này.
Luận án được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật di truyền; Phòng Thí nghiệm
Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam và được hỗ trợ bởi Đề tài độc lập cấp Nhà nước
“Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao
dùng trong y học (điều trị)” (2012-2016), mã số ĐT-PTNTĐ.2012-G/04 do GS.
TS. Trương Nam Hải làm chủ nhiệm.
Để hoàn thành luận án nghiên cứu này, tôi cũng đã nhận được nhiều sự
giúp đỡ quý báu và nhiệt tình của các cơ quan và cá nhân, tôi xin bày tỏ lòng
cảm ơn sâu sắc đến:
- Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Bộ phận đào tạo Viện Công
nghệ sinh học, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Bộ Khoa

học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện về thời gian, hỗ trợ kinh phí và
trang thiết bị để giúp tôi hoàn thành luận án này.
- TS. Đỗ Thị Huyền cùng tập thể cán bộ Phòng Kỹ thuật di truyền thuộc
Viện Công nghệ sinh học đã luôn hỗ trợ, động viên, giúp đỡ và tạo những
điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án của mình.
- Bộ Môn Sinh lý Bệnh – Miễn dịch, trường Đại học Y Hà Nội và Viện KIểm
định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế là đơn vị thực hiện nội dung
đánh giá tính an toàn của sản phẩm IL-11 tạo ra.
Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc tôi xin dành cho gia đình và bạn bè, những
người đã luôn động viên về tinh thần trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án.

Nguyễn Thị Quý

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng
cộng tác với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng
Tác giả

năm 2017

Nguyễn Thị Quý

ii


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ALT

Alanine aminotransferase

Alanine aminotransferase

AST

Aspartate
aminotransferase

Aspartate aminotransferase

BHK

Baby hamster kidney

Tế bào thận chuột non

BSA

Bovine Serum Albumin

Albumin huyết thanh của bò

CFU-GM

Colony-forming unitgranulocyte, monocyte

Cụm bạch cầu hạt – bạch cầu mono

CFU-Me

Colony-forming unitmegakaryocyte

Cụm mẫu tiểu cầu

CFU-Mix

Colony forming unit-mix

Cụm hỗn hợp

CHO

Chinese hamster ovary

Tế bào tử cung chuột bạch

COS

CV-1 cells in Origin,
Tế bào thận khỉ xanh châu Phi
carrying the SV40 genetic
material

dH2O

De-ionized water

Nước khử ion

ECM

Extracellular matrix

Chất nhày ngoại bào

EMEA

European Medicines
Agency

Cơ quan quản lý thuốc châu Âu

EPO

Erythropoietin

Yếu tố tạo hồng cầu erythropoietin

FBS

Fetal Bovine Serum

Huyết thanh bào thai bò

FDA

Food and Drug
Administration

Cục Quản lý Thuốc và Thực phẩm
(Mỹ)

G-CFS

Granulocyte colony
stimulating factor

Yếu tốc kích thích cụm bạch cầu
hạt

Gm-CSF

Granulocyte macrophage
colony-stimulating factor

Yếu tố kích thích cụm bạch cầu hạt
và đại thực bào

GST

Glutathione S-transferase

Glutathione S-transferase

HEK-239

Human embryonic kidney
cells 293

Tế bào thận phôi người
iii


IL-3

Interleukin-3

Interleukin-3

IL-5

Interleukin-5

Interleukin-5

IL-6

Interleukin-6

Interleukin-6

IL-11

Interleukin-11

Interleukin-11

IPTG

Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside

Chất cảm ứng IPTG

Jaks

Janus kinase

Chất truyền tín hiệu Janus kinase

LB

Luria-Bertani

Môi trường LB

LBamp

Luria-Bertani with
ampicillin

Môi trường LB bổ sung ampicillin
tới nồng độ cuối cùng 100 g/ml

M-CSF

Macrophage colonystimulating factor

Yếu tố kích thích tạo cụm đại thực
bào

SCF

Stem cell factor

Yếu tố tế bào gốc

STATs

Signal transducer and
activators of transcription

Chất truyền tín hiệu và chất hoạt

hóa phiên mã

SUMO

Small Ubiquitin-like
Modifier

Protein cải biến có kích thước phân
tử nhỏ giống ubiquitin

Ub

Ubiquitin

Protein điều hòa ubiquitin

TNF

Tumor necrosis factor

Yếu tố hoại tử khối u

TPO

Thrombopoietin

Yếu tố kích thích mẫu tiểu cầu

iv

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Trình tự và kích thước của một số đuôi dung hợp…………………

16

Bảng 2.1. Các loại enzyme, kháng thể và hóa chất dùng trong nghiên cứu..…

36

Bảng 2.2. Môi trường và dung dịch dùng cho nghiên cứu …..……………….

37

Bảng 2.3. Liều tiêm protein IL-11 cho chuột nhắt trắng …...………………...

51

Bảng 2.4. Liều tiêm protein IL-11 cho thỏ thí nghiệm …...………………...

53

Bảng 3.1. Hàm lượng endotoxin trong mẫu protein IL-11 tinh chế ………….

82

Bảng 3.2. Hiệu suất loại endotoxin ở sản phẩm IL-11 bằng màng Ultracel 30
kDa…………………………………………………………………

84

Bảng 3.3. So sánh nồng độ protein IL-11 trước và sau khi đông khô..............

86

Bảng 3.4. Trọng lượng của chuột thí nghiệm trong 7 ngày theo dõi ................

91

Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt trắng ……………

91

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của IL-11 đến thể trọng của chuột cống……………….

92

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của IL-11 đến chức năng tạo máu của chuột..................

93

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của IL-11 đến hoạt độ aspartate aminotransferase và

94

alanine aminotransferase trong máu chuột .......................................
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của IL-11 đến chức năng gan của chuột.........................

95

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của IL-11đến nồng độ creatinin trong máu chuột..........

97

v


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Ảnh hưởng của các yếu tố tăng trưởng đến quá trình biệt hóa tế
bào máu…………………………………………………………….

4

Hình 1.2. Sơ đồ minh họa phức hợp cytokine và thụ thể truyền tín hiệu vào
trong tế bào ..……………………………………………………….

5

Hình 1.3. Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-11 người…………………...

7

Hình 1.4. Sơ đồ mô tả nguồn gốc chủ yếu tiết ra IL-11 từ một số loại tế bào,
tạo thành phức hợp truyền tín hiệu gồm 6 tiểu đơn vị với tỷ lệ
2:2:2 (gồm IL-11, IL-11R và GP130)………………….

8

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát các bước thực hiện của đề tài nghiên cứu………...

54

Hình 3.1. Phân tích gen pelB_il-11 và gen il-11opt ở vector tách dòng
pUC57 bằng enzyme giới hạn .........................................................

58

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch của gen pelB_il-11, gen il-11opt và
vector pET22b(+) giới hạn bởi enzyme NdeI và NotI trên gel
agarose 0,8%………………………..................................................

60

Hình 3.3. Phân tích các gen il-11 trong vector biểu hiện pET22b(+) bằng
enzyme giới hạn ……………...…………………………………….

61

Hình 3.4. Phân tích sự biểu hiện protein IL-11 từ chủng E. coli BL21 mang
vector pET22_pelB_il-11 bằng SDS-PAGE (A) và Western blot
(B)…………………………………………………………………..

62

Hình 3.5. Phân tích sự biểu hiện của protein IL-11 trong các chủng E. coli
Rosetta 2, BL21 và JM109 mang vector pET_il-11opt bằng SDSPAGE (A) và Western blot (B)…………………………………….

63

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen il-11opt từ vector pUC57_il11opt bằng kỹ thuật PCR .................................................................

64

Hình 3.7. Phân tích gen il-11 ở vector pSUMO_il-11opt bằng enzyme giới
vi


hạn ....................................................................................................

65

Hình 3.8. Phân tích sự biểu hiện của protein SUMO-IL11 ở 3 chủng E. coli
mang vector pSUMO_il-11opt bằng SDS-PAGE (A), Western blot
(B) và dịch phá tế bào (C).................................................................

66

Hình 3.9. Phân tích sự biểu hiện của protein SUMO-IL11 từ chủng E. coli
Rosetta 2 tái tổ hợp trong 9 môi trường trên gel SDS-PAGE ..........

68

Hình 3.10. Phân tích sự biểu hiện của protein SUMO-IL11 từ chủng E. coli
Rosetta 2 tái tổ hợp được cảm ứng với các nồng độ IPTG khác
nhau ..................................................................................................

69

Hình 3.11. Phân tích sự biểu hiện của protein SUMO-IL11 từ chủng E. coli
Rosetta 2 ở các nhiệt độ khác nhau ..................................................

70

Hình 3.12. Phân tích sự biểu hiện của protein SUMO-IL11 từ chủng E. coli
Rosetta 2 ở môi trường có pH khác nhau ........................................

71

Hình 3.13. Phân tích sự biểu hiện protein SUMO-IL11 từ chủng E. coli Rosetta 2
tại các thời điểm mật độ tế bào cảm ứng khác nhau ........................

72

Hình 3.14. Phân tích sự biểu hiện của protein SUMO-IL11 ở chủng E. coli
Rosetta 2 theo thời gian nuôi cấy cảm ứng ......................................

73

Hình 3.15. Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra mức độ tinh sạch của protein
SUMO-IL11 bằng đệm PBS 20 mM chứa 150 mM NaCl ...............

74

Hình 3.16. Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra mức độ tinh sạch của protein
SUMO-IL11 bằng đệm rửa I và II gấp 5 lần thể tích cột .................
Hình 3.17. Sắc ký đồ quá trình tinh sạch SUMO-IL11 ở cột 50 ml Ni-NTA

76
77

Hình 3.18. Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra mức độ tinh sạch của protein
SUMO-IL11 từ cột sắc ký ái lực 50 ml Ni-NTA..............................

78

Hình 3.19. Ảnh điện di protein IL-11 thu được từ hỗn hợp cắt thể dung hợp
SUMO-IL11 bằng enzyme ...............................................................

80

Hình 3.20. Điện di SDS-PAGE kiểm tra protein IL-11 trong một số công thức
đệm ...................................................................................................

81
vii


Hình 3.21. Kết quả kiểm của phản ứng LAL đối với protein IL-11 sau khi loại
chất gây sốt bằng màng Ultracel 30 kDa ..........................................

83

Hình 3.22. Hình ảnh đông khô và hoàn nguyên của sản phẩm IL-11.................

85

Hình 3.23. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự ổn định của protein IL-11 đông

khô ....................................................................................................

86

Hình 3.24. Phân tích độ tinh sạch của protein IL-11 trên gel SDS-PAGE (A)
kết hợp với phần mềm QuatityOne (B).............................................

87

Hình 3.25. Điện di SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của protein IL-11 bằng
sắc ký lọc gel ....................................................................................

88

Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn sự tăng sinh của tế bào TF-1 đối với nồng độ
protein IL-11 tái tổ hợp đo ở bước sóng 550 nm và 615 nm ............

90

Hình 3.27. Ảnh xét nghiệm hình thái vi thể gan của chuột sau 30 ngày tiêm
IL-11 tái tổ hợp ................................................................................

96

Hình 3.28. Ảnh xét nghiệm hình thái vi thể thận của chuột sau 30 ngày tiêm
IL-11 tái tổ hợp .................................................................................

98

Hình 3.29. Kết quả đánh giá chất gây sốt bằng cách đo thân nhiệt của thỏ

trước và sau khi tiêm sản phẩm IL-11...............................................

99

viii


1

MỞ ĐẦU
Bê ̣nh máu hay còn go ̣ i là bê ̣nh của hê ̣ ta ̣o máu khiế n máu có tình tra ̣ng bấ t
thường. Bê ̣nh máu có thể do nguyên phát (chức năng ta ̣o máu b ị khiế m khuyế t bẩ m
sinh hoă ̣c thay đổ i ác tính trong thành phầ n tuỷ xương ) hoặc do thứ phát (thiế u dinh
dưỡng, rố i loa ̣n trao đổ i chấ t , các yếu tố vật lý , hoá học, ô nhiễm…). Các rối loạn
thường gă ̣p trong bê ̣nh máu là thiế u máu , xuấ t huyế t , bê ̣nh máu trắ ng , ung thư tuỷ
xương, ung thư ha ̣ch và số lươ ̣ng các loa ̣i tế bào máu tăng lên hoă ̣ c giảm đi ... Các
bê ̣nh liên quan đế n hê ̣ t ạo máu là b ệnh phức tạp, khó chữa, có tỷ lệ tử vong cao, là
một thách thức lớn cho ngành y học.
Sự tạo thành tế bào máu là một quá trình tăng sinh và biệt hoá của tế bào gốc
tạo máu ở tuỷ xương theo cơ chế điều hoà phức tạp nhưng rất chặt chẽ, nhịp nhàng
với sự tham gia của các yếu tố như tế bào gốc tạo máu, vi môi trường tạo máu và
các yếu tố kích thích tạo máu bao gồm các cytokine. Những nghiên cứu gần đây cho
thấy yếu tố vi môi trường là các yếu tố tác động gần, có vai trò trung gian tạo thuận
lợi cho sự sinh máu. Sự có mặt các cytokine sẽ kích thích tế bào gốc tăng sinh và
hướng biệt hoá theo định hướng cụ thể từng dòng. Trong bốn nhóm của cytokine là
interferon, interleukin, yếu tố hoại tử khối u, yếu tố tăng trưởng, interleukin đóng
vai trò trung gian trong việc liên kết với thụ thể đặc hiệu để điều khiển các hoạt
động của tế bào như sự tăng sinh, biệt hóa, phân chia và chết. Mỗi loại interleukin
có vai trò khác nhau trong hệ miễn dịch, trong đó interleukin-11 (IL-11) kích thích
sự biệt hóa của các tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền mẫu tiểu cầu, đồng thời kích

thích chúng trưởng thành để sản xuất tiểu cầu. Do đó, IL-11 được coi là một yếu tố
tăng trưởng tạo máu và được làm dược phẩm điều trị các bệnh liên quan đến hệ tạo
máu. Năm 1997, loại interleukin đầu tiên được Cục Quản lý Thuốc và Thực phẩm
Hoa Kỳ (FDA) cấp phép điều trị bệnh thiếu hụt tiểu cầu và giảm bớt nhu cầu truyền
tiểu cầu cho các bệnh nhân ung thư sau hoá trị liệu chính là IL-11 người tái tổ hợp
dưới tên thương mại là Neumega (Kaye, 1998). Việc sản xuất protein có thể được
cải thiện nếu như phương pháp biểu hiện protein ở trạng thái tan được phát triển đặc


2

biệt là ở những hệ biểu hiện đơn giản như vi khuẩn. Tuy nhiên, IL-11 là một protein
khó được biểu hiện dạng đơn phân tử ở tế bào Escherchia coli. Những công bố trên
thế giới về loại cytokine này còn hạn chế và sản phẩm tạo ra chưa được đánh giá
đặc tính sinh học một cách hệ thống. Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu trên đối tượng
này không phổ biến và mới được triển khai tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công
nghệ sinh học.
Xuất phát từ mong muốn tạo ra IL-11 người tái tổ hợp giống với sản phẩm
Neumega để có thể chủ động về mặt công nghệ sản xuất loại cytokine có giá trị sử
dụng trong y dược, đề tài luận án với tên “Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và bước
đầu đánh giá đặc tính sinh học của Interleukin-11 người tái tổ hợp” được thực
hiện với những mục tiêu sau:
-

Biểu hiện được protein IL-11 người tái tổ hợp ở tế bào Escherichia coli.

-

Tinh chế protein IL-11 tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu làm dược phẩm tiêm.

-

Bước đầu đánh giá đặc tính sinh học của IL-11 tái tổ hợp tạo ra.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Interleukin-11 và vai trò đối với hệ tạo máu
1.1.1. Hệ tạo máu và con đường tạo tiểu cầu ở cơ thể người
Máu là một loại dịch trong cơ thể lưu thông trong hệ tuần hoàn, gồm 2 thành
phần chính là tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) và huyết tương. Các loại tế
bào máu trưởng thành thực hiện những chức năng chuyên môn cao như hồng cầu
vận chuyển O2 và CO2; bạch cầu chống lại tác nhân lây nhiễm bằng việc tạo ra
kháng thể, đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và thực bào; tiểu cầu tham gia
chức năng đông máu, khi số lượng tiểu cầu trong máu giảm sẽ xuất hiện tình trạng
chảy máu (xuất huyết). Tất cả những loại tế bào máu đều có một nguồn gốc chung
là tế bào gốc tạo máu. Cơ chế điều khiển quá trình biệt hóa đó liên quan đến một
nhóm glycoprotein đặc hiệu có tên là các yếu tố tăng trưởng tạo máu hay còn gọi là
cytokine. Chúng có bản chất là protein tan trong nước với cách thức hoạt động theo
kiểu tự tiết (autocrine), cận tiết (paracrine) và nội tiết (endocrine).
Tùy vào nguồn gốc tổng hợp, chức năng và đích tác động, cytokine được chia
làm các nhóm như yếu tố kích thích tạo cụm tế bào, interferon, yếu tố hoại tử khối
u, lymphokine, monokine, chemokine (điều hòa các phân tử hóa hướng động) và
interleukin. Cytokine có rất nhiều vai trò, nhất là với hệ miễn dịch của cơ thể như
tăng sinh - phát triển - biệt hóa - apotosis và hóa hướng động (chemotaxis). Một
cách cụ thể hơn, chúng điều hòa quá trình tạo máu, miễn dịch, viêm, sự phát sinh
ung thư, sự hình thành và phát triển của tế bào thần kinh (Ishihara and Hirano,
2002; Zhang and Lodish, 2008). Đối với quá trình tạo máu, cytokine đóng vai trò

điều hòa sự tồn tại, tăng sinh và biệt hóa của các tế bào gốc tạo máu thành tế bào
tiền thân và cuối cùng là tế bào máu trưởng thành (Hình 1.1).


4

Tiểu cầu

Cụm mẫu tiểu cầu
Mẫu tiểu cầu

Bạch cầu ái kiềm
Cụm mẫu bạch cầu ái kiềm
Bạch cầu ái toan

Tế bào gốc
định hướng
dòng tủy

Cụm mẫu bạch cầu ái toan
Bạch cầu trung tính

Bạch cầu mono

Cụm bạch cầu
hạt-bạch cầu
mono

Hồng cầu lưới

Cụm nguyên hồng cầu
Hình 1.1: Ảnh hƣởng của các yếu tố tăng trƣởng đến quá trình biệt hóa tế bào
máu
(Nguồn: www.lookfordiagnosis.com)
Cytokine truyền tín hiệu đến tế bào nhờ phức hợp các tiểu đơn vị thụ thể gồm
có thụ thể gắn cytokine và thụ thể truyền tín hiệu. Chất điều hòa quan trọng của con
đường truyền tín hiệu là chất truyền tín hiệu Janus kinase (Jaks) và chất hoạt hóa
phiên mã STATs (Signal transducer and activators of transcription) (Ishihara and
Hirano, 2002). Đầu tiên, cytokine bám vào thụ thể (chuỗi ) sau đó liên kết với thụ
thể thứ hai (chuỗi ) để hình thành phức hợp hai tiểu đơn vị thụ thể ( và ) rồi
hoạt hóa Jaks. Sau khi được hoạt hóa, Jaks sẽ gắn phospho vào các vùng của thụ thể
để tạo ra các vị trí có khả năng gắn với phân tử STATs. STATs gắn vào chuỗi  rồi
được phosphoryl hóa và tách khỏi thụ thể, hình thành dimer di chuyển đến nhân tế


5

bào, từ đó điều hòa quá trình phiên mã của gen đích (Hình 1.2) (Ishihara and
Hirano, 2002). Bằng cơ chế hoạt động như trên , cytokine điều hòa các chức năng
của tế bào như trạng thái không hoạt động, tự đổi mới, sự biệt hóa, sự phân chia và
di chuyển của tế bào (Zhang and Lodish, 2008).





Cytokine


Dimer hóa

thụ thể

JAK

SH2
STAT

Hoạt hóa JAK kinase và
gắn phospho vào thụ thể
Gắn phospho vào
STAT bởi JAK kinase

Dimer hóa
STAT

DNA
Phiên mã gen đặc hiệu
Hình 1.2: Sơ đồ minh họa phức hợp cytokine và thụ thể truyền tín hiệu vào
trong tế bào
Cytokine bám vào thụ thể đặc hiệu dẫn đến dimer hóa các tiểu đơn vị thụ thể và
hoạt hóa JAK kinase, gắn phospho vào thụ thể. Các tín hiệu tạo ra từ cytokine và
thụ thể được truyền tới nhân tế bào bằng các phản ứng của chất truyền tín hiệu.
(Nguồn: />Mẫu tiểu cầu là những tế bào được biệt hóa chuyên biệt từ tế bào gốc tạo
máu ở tủy xương để sản xuất tiểu cầu. Tế bào gốc sẽ lần lượt được biệt hóa thành


6

cụm mẫu tiểu cầu (CFU-Me), nguyên mẫu tiểu cầu, tiền mẫu tiểu cầu và mẫu tiểu
cầu (Pang et al., 2005). Sau đó, mẫu tiểu cầu trưởng thành và bắt đầu quá trình sản

xuất tiểu cầu (Italiano et al., 1999). Cytokine tác động chủ yếu đến quá trình tạo
mẫu tiểu cầu là thrombopoietin (TPO) và một số cytokine khác như IL-11, GmCSF, IL-3, IL-6, chemokine (SDF-1, FGF-4) (Avecilla et al., 2004) và
erythropoietin (Deutsch and Tomer, 2006). Quá trình tạo mẫu tiểu cầu có ý nghĩa
quan trọng về mặt lâm sàng đối với những người bị thiếu hụt tiểu cầu đặc biệt là
những trường hợp ung thư sau khi xạ trị và diệt tủy để cấy ghép tế bào gốc tạo
máu vì hai phác đồ điều trị đều làm giảm tế bào mẫu tiểu cầu ở tủy xương. Những
bệnh nhân đó cần nhanh chóng được phục hồi tiểu cầu ngoại vi và sự tăng sinh
của mẫu tiểu cầu là giải pháp hiệu quả nhất để đáp ứng lượng tiểu cầu đã bị thiếu
hụt. Truyền tiểu cầu chỉ là phương thức điều trị tạm thời nhằm cầm máu hoặc đề
phòng biến chứng xuất huyết nặng. Ngoài ra, tiểu cầu truyền vào chỉ sống được
khoảng 3 – 4 ngày nên cần đợt truyền tiếp theo. Trong một số trường hợp, ở những
người truyền nhiều lần, cơ thể có khả năng sinh ra kháng thể phá hủy tiểu cầu
truyền vào. Hiện nay trên thế giới, có một loại thuốc được biết đến là thuốc sinh tiểu
cầu (thrombopoietic agents), có bản chất là IL-11 tái tổ hợp với tên gọi là Neumega.
Loại thuốc này giúp tăng trưởng và trưởng thành mẫu tiểu cầu, làm tăng số lượng
tiểu cầu của bệnh nhân. Thuốc sinh tiểu cầu mang lại chiến lược điều trị mới đầy
hứa hẹn đối với bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu do miễn dịch hoặc do giảm sinh tiểu
cầu ở tủy xương.
1.1.2. Đặc tính phân tử, cấu trúc và cơ chế hoạt động của Interleukin-11
Ở người, gen mã hóa IL-11 có kích thước 7 kb, định vị trên vai dài của
nhiễm sắc thể số 19 tại vị trí 19q13.3-19q13.4, chứa 5 vùng exon và 4 vùng intron
(McKinley et al., 1992). Mặc dù thuộc họ IL-6 nhưng gen il-11 và gen il-6 có sự
tương đồng rất thấp với nhau. Một số vùng nucleotit ở đầu 5’ của gen il-11 giống
đến 70% các gen mã hóa cho IL-2, IL-3, IL-9 và Gm-CSF. Gen il-11 đã được
đăng ký trên Genbank với mã số là NM_000641 gồm 3 phiên bản của 3 nhóm tác
giả ký hiệu là NM_000641.1 (2281 bp), NM_000641.2 (2354 bp) và NM_000641.3


7

(2381 bp). Cả ba đều giống nhau về trình tự nucleotit mã hóa cho peptit tín hiệu
(63 Nu tương ứng với 21 axit amin) và protein IL-11 trưởng thành (534 Nu tương
ứng với 178 axit amin). Dạng tiền protein IL-11 gồm 199 axit amin, sau khi dịch
mã, đoạn peptit tín hiệu 21 axit amin bị cắt đi trở thành protein IL-11 trưởng thành
dài 178 axit amin. Trong đó, một số axit amin quan trọng giữ vị trí cốt yếu gắn với
thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào là Met59, Lys42 và Lys99 (Morris et al., 1996).
Cấu trúc không gian của IL-11 đã được mô phỏng gồm có 4 chuỗi A, B, C, D với
cấu trúc xoắn  (Hình 1.3).

vùng III

vùng I

vùng II

Hình 1.3: Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-11 ngƣời
Các cấu trúc xoắn  được ký hiệu lần lượt từ A đến D. Đường đứt quãng biểu thị
cho các vùng không có vị trí quyết định. Các gốc axit amin được cho là có vị trí
quan trọng đến tương tác của IL-11 với thụ thể IL-11R (vùng I - màu xanh) và tiểu
đơn vị gp130 (gồm vùng II - màu vàng và vùng III - màu đen).
(Nguồn: Putoczki et al., 2014)


8

Protein IL-11 có cấu tạo khác với những cytokine còn lại như không có
cysteine nên không hình thành cầu disulfide, không có asparagin trong phân tử để
hình thành cấu trúc glycosyl hóa (vị trí gắn carbonhydrate đầu N và đầu O). Do đó
có thể lựa chọn hệ vi khuẩn để biểu hiện IL-11 người tái tổ hợp vì ở hệ này không
có quá trình cải biến sau dịch mã. Ngoài ra, IL-11 là một phân tử giàu proline

(12%), leucine (23%) và các axit amin tích điện dương khác (14%) nên điểm đẳng
điện của nó cao hơn hẳn (pI = 11,6) so với cytokine còn lại (Czupryn et al., 1995).
Điểm đẳng điện cao có thể gây trở ngại cho việc biểu hiện protein ở tế bào chủ.
Tới nay, tất cả các bằng chứng đều cho thấy IL-11 là một phân tử đơn phân có
khối lượng ~19 kDa.
Xƣơng và mô liên kết

Tế bào nền

Tế bào ung thƣ

Tế bào sụn

Tế bào bạch cầu

Nguyên bào sợi ung thư

Tế bào màng hoạt dịch khớp

Tế bào lympho

Tế bào biểu mô

Tế bào tạo xương

Đại thực bào

Hình 1.4: Sơ đồ mô tả nguồn gốc tiết ra chủ yếu của IL-11 từ một số loại tế
bào, sau đó tạo thành phức hợp truyền tín hiệu gồm 6 tiểu đơn vị theo tỷ lệ
2:2:2 (gồm IL-11, IL-11R và GP130)

(Nguồn: Johnstone et al., 2015)


9

Phân tử IL-11 hoạt động theo cơ chế tương tác với tế bào đặc hiệu thông qua
thụ thể IL-11Rα và truyền tín hiệu vào tế bào đó bằng tiểu đơn vị gp130 (Taga,
1997). Đầu tiên, phân tử IL-11 bám vào thụ thể IL-11R hình thành phức hợp IL11/IL-11R. Tiếp theo, phức hợp này liên kết chặt với gp130 để tạo thành phức
hợp 3 tiểu đơn vị. Sau đó, từng đôi phức hợp 3 tiểu đơn vị lại liên kết với nhau
hình thành phức hợp 6 tiểu đơn vị bao gồm 2 phân tử IL-11, hai phân tử IL-11R
và hai phân tử gp130, từ đó truyền các đáp ứng sinh học vào trong tế bào đích
(Barton et al., 2000; Johnstone et al., 2015) (Hình 1.4).
Các đáp ứng sinh học được truyền vào tế bào là kích thích tế bào gốc tạo
máu tăng sinh và biệt hóa thành mẫu tiểu cầu (Du and Williams, 1997; Yonemura
et al., 1992), tăng sinh bạch cầu (Hangoc et al., 1993), kháng viêm (Bussel et al.,
2001; Ghalib et al., 2003; Moreland et al., 2001; Sands et al., 2002).
1.1.3. Những nghiên cứu về vai trò của IL-11 trên mô hình thực nghiệm
Interleukin-11 là một cytokine tham gia vào chức năng tạo máu, đã được
nghiên cứu ở mức độ in vitro và in vivo (Du and Williams, 1994; Schwertschlag et
al., 1999). Ở in vitro, tác dụng tạo máu của IL-11 đã được chứng minh bằng sự tăng
sinh số lượng cụm nguyên bào tủy, tế bào tiền mẫu tiểu cầu và mẫu tiểu cầu trưởng
thành của chuột (Musashi et al., 1991; Tsuji et al., 1992; Weich et al., 1997). Khi
hiệp lực với IL-3, IL-11 còn có tác dụng thúc đẩy sự tạo thành cụm mẫu tiểu cầu
của người và chuột (Teramura et al., 1992). Những nghiên cứu trên đã cho thấy IL11 tái tổ hợp tác động lên tế bào gốc ở cả giai đoạn sớm và muộn của quá trình biệt
hóa cũng như kích thích tế bào mẫu tiểu cầu trưởng thành, từ đó thúc đẩy quá trình
sản xuất tiểu cầu (Du and Williams, 1997).
Ở mức độ in vivo, IL-11 tái tổ hợp đã được nghiên cứu thử nghiệm trên mô
hình động vật bình thường và động vật gây bệnh. Trên mô hình động vật bình
thường như loài gặm nhấm và khỉ cynomolgus, IL-11 có khả năng kích thích tạo tế
bào mẫu tiểu cầu. Một cách cụ thể hơn, ở chuột bạch, IL-11 đã kích thích tiền tế bào

mẫu tiểu cầu tăng sinh, qua đó làm tăng số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi. Đối
với chuột cống, việc thử nghiệm IL-11 cũng cho kết quả tương tự, số lượng tiểu cầu


10

và kích thước của tế bào mẫu tiểu cầu trong tủy xương tăng lên. Ở khỉ, IL-11 cũng
làm tăng số lượng tiểu cầu trong máu bằng cách thúc đẩy kích thước và tốc độ thành
thục của tế bào mẫu tiểu cầu ở tủy xương (Yonemura et al., 1992). Với cả chuột và
khỉ, IL-11 không có tác dụng làm thay đổi số lượng hồng cầu, bạch cầu ngoại vi và
thể tích hồng cầu (Neben et al., 1993; Yonemura et al., 1992).
Trong khi đó, các nghiên cứu thử nghiệm IL-11 trên mô hình động vật gây
bệnh đã cho thấy IL-11 làm tăng đáng kể số lượng bạch cầu ngoại vi ở chuột ghép
tủy và chuột chiếu xạ (Du et al., 1993). Số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi cũng
tăng lên theo liều của protein IL-11 tái tổ hợp. Lô chuột ghép tủy được tiêm IL-11
có thời gian giảm bạch cầu trung tính ngắn hơn (ít nhất 7 ngày) so với lô chuột dùng
tá dược. Nhóm chuột ghép tủy sử dụng phối hợp cả IL-11 và SCF đều có sự tăng
lên về số lượng bạch cầu, tiểu cầu tổng số và thể tích hồng cầu trong máu (Du et al.,
1993). Kết quả nghiên cứu của Du và Williams cũng chỉ ra rằng IL-11 tái tổ hợp
làm cho tủy xương, tế bào lách, tế bào mẫu tiểu cầu, cụm bạch cầu hạt - bạch cầu
mono (CFU-GM), cụm hỗn hợp (CFU-Mix), cụm tế bào tiền mẫu tiểu cầu (CFUMe) ở chuột ghép tủy tăng lên. Nguyên nhân làm cho mức độ sống sót của chuột
tăng lên là do khả năng phục hồi một cách nhanh chóng của cấu trúc niêm mạc biểu
mô ruột (Du and Williams, 1994). Trong một nghiên cứu khác, chuột chiếu xạ sau
khi ghép tủy và gây nhiễm retrovirus biểu hiện IL-11 cDNA thì số lượng tế bào
định hướng dòng tủy (myeloid progenitor) ở lá lách tăng lên 20 lần (Hawley et al.,
1993). Sử dụng IL-11 ở lô chuột kết hợp cả hóa trị (5-FU at 150 mg/kg) và xạ trị đã
làm giảm đáng kể tình trạng của bệnh và số lượng chuột chết (Du et al., 1994). Ở
mô hình thử nghiệm chuột chiếu xạ dưới liều gây chết (500 cGy) và tiêm
carboplatin (1,2 mg/con) thì chuột có hiện tượng thiếu máu và tiểu cầu trầm trọng,
không có khả năng phục hồi tiểu cầu. Tuy nhiên, ở lô chuột sau 20 ngày sử dụng IL11, các dòng tế bào máu ở tủy xương và lá lách đã bắt đầu xuất hiện. Số lượng các

tiền tế bào mẫu tiểu cầu, hồng cầu, bạch cầu hạt và đại thực bào ở tủy xương và lá
lách tăng lên ở ngày thứ 15 và 30 sau khi diệt tủy. Với mô hình thử nghiệm này, IL11 đã cho thấy nó có tác dụng giảm nhẹ tình trạng thiếu hụt tiểu cầu và thể tích


11

hồng cầu, đồng thời rút ngắn thời gian thiếu máu và tiểu cầu (Leonard et al., 1994).
Ngoài ra, một kết quả nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng chuột bị ức chế miễn dịch
bằng cyclophosphamide sau khi điều trị với IL-11 đã phục hồi được cả bạch cầu
trung tính và tiểu cầu, tương tự như kết quả thử nghiệm IL-11 trên tế bào chuột in
vitro (Hangoc et al., 1993).
Bên cạnh những nghiên cứu về tác dụng của IL-11 trên mô hình động vật, IL11 tái tổ hợp còn được đánh giá có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư ở người. Các kết
quả thử nghiệm pha I của IL-11 trên người đã được thực hiện từ năm 1993 (Gordon
et al., 1996; Orazi et al., 1993). Cụ thể, ở phụ nữ ung thư vú giai đoạn muộn được
hóa trị với liều hóa chất cao (cyclophosphamide và doxorubicin) và tiêm IL-11 dưới
da (≥ 25 µg/kg/ngày) trước và sau mỗi 4 đợt hóa trị, số lượng tiểu cầu trung bình ở
bệnh nhân đã tăng lên. Ngoài ra, số lượng tế bào mẫu tiểu cầu ở tủy xương cũng
tăng lên đáng kể. Các kết quả nghiên cứu sau này cũng chỉ ra rằng IL-11 có hiệu
quả khi điều trị riêng hoặc phối hợp với G-CSF ở những người bị bệnh máu trắng
và các bệnh ung thư liên quan đến tế bào máu (Bhatia et al., 2007; Zhang, 2004).
Ngoài chức năng chính là kích thích tế bào gốc tạo máu tăng sinh và biệt hóa
thành mẫu tiểu cầu, IL-11 cũng được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng
kháng viêm trong điều trị bệnh viêm đường ruột (Sands et al., 2002), viêm khớp
dạng thấp (Hermann et al., 1998; Moreland et al., 2001), bệnh viêm gan mạn tính
(Ghalib et al., 2003) và bệnh sốt phát ban kèm với suy giảm tiểu cầu kéo dài (Bussel
et al., 2001). Ngoài ra, IL-11 tái tổ hợp còn có hoạt tính ngăn chặn quá trình tổng
hợp mỡ ở dòng tế bào nền H-1A và dòng tế bào tiền tạo mỡ 3T3-11 của chuột
(Fuhrer and Yang; 1996 Kawashima et al., 1991). Do có khả năng ức chế chứng
phát phì với nguyên tế bào mỡ nên IL-11 người tái tổ hợp còn có tên gọi khác là
yếu tố ức chế chứng phát phì (AGIF).

Sau khi nghiên cứu về IL-11, năm 1997 loại interleukin người tái tổ hợp đầu
tiên đã được FDA cấp phép sử dụng để điều trị bệnh thiếu hụt tiểu cầu và giảm bớt
nhu cầu truyền tiểu cầu cho những bệnh nhân ung thư sau hóa trị liệu chính là
Interleukin-11 tái tổ hợp dưới tên thương mại là Neumega (Kaye, 1998).


12

Những năm gần đây, IL-11 cũng được nghiên cứu có ảnh hưởng đáng kể đến
độ dày của vỏ não và mật độ xương ở các xương dài, thúc đẩy quá trình tạo
xương, cải thiện khả năng chịu đựng chất oxi hóa ở tế bào biểu mô (Garbers and
Scheller, 2013; Putoczki and Ernst, 2010). Các nghiên cứu mới trên IL-11 vẫn đang
thực hiện để tìm hiểu vai trò của IL-11 trong việc điều hòa ung thư. Theo đó, IL-11
vừa có hoạt tính sinh ung thư vừa có hoạt tính kháng ung thư. Tác dụng sinh ung
thư được cho là do cytokine này khởi động tín hiệu STAT3 mạnh hơn STAT1. Sự
cân bằng giữa STAT1 và STAT3 trong cơ thể đóng vai trò quyết định đến các đáp
ứng sinh ung thư và kháng ung thư và IL-11 là một trong những chất quan trọng
nhất ảnh hướng đến sự cân bằng đó (Yuzhalin and Kutikhin, 2014).
Ngoài ra, IL-11 còn được biểu hiện ở phần lớn các tế bào ung thư biểu mô ruột
đã chẩn đoán là khối u ác tính. Việc xâm lấn khối u và di căn cần có sự phân cắt của
enzyme màng và chất nhày ngoại bào (extracelular matrix, ECM). Các enzyme
Matrix metalloproteinase chủ yếu liên quan đến sự phát tán tế bào ung thư bằng
cách phân hủy ECM và tạo ra môi trường hỗ trợ khởi động và duy trì tăng trưởng
của khối u. Ảnh hưởng của IL-11 đến sự biểu hiện của protein Matrix
metalloproteinase 13 (MMP-13) đã được Yang và cộng sự tìm hiểu vào năm 2014.
Đây là enzyme có mặt ở hầu hết các loại u ác tính xâm lấn và có phổ hoạt tính rộng
lên các mô lân cận. Nhóm tác giả trên đã chỉ ra rằng IL-11 kích thích MMP-13 biểu
hiện tùy vào thời gian tác động và nồng độ của IL-11 ở những tế bào ung thư biểu
mô ruột bằng tín hiệu PI3K-AKT và JAK-STAT3. Do đó hai còn đường này có thể
được xem xét để điều trị bệnh ung thư biểu mô ruột di căn (Yang et al., 2014).

1.2. Tình hình nghiên cứu biểu hiện interleukin-11 tái tổ hợp
Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp, các gen mã hóa cho
yếu tố tăng trưởng tạo máu đã được nhân dòng và biểu hiện thành sản phẩm protein
tái tổ hợp. Chúng có thể được sử dụng một cách rộng rãi trong việc hỗ trợ điều trị
một số bệnh ví dụ như tăng cường khả năng phục hồi tế bào máu sau khi cấy ghép
tủy xương, tăng cường khả năng nuôi cấy tế bào gốc in vitro cho mục đích cấy
ghép, nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể, hỗ trợ điều trị một số bệnh về máu