Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Interleukine là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu
được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng
trong hệ thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người
phụ thuộc chủ yếu vào các interleukine, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến
các bệnh tự miễn và thiếu hụt miễn dịch.
Interleukine 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng
trưởng của các dòng tế bào B và T. Đây là những dòng tế bào có chức năng
quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của các
virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người.
Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử
dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ
hợp... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ
yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu
ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành
lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc
nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết.
Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong
lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn
khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện
nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp
một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone v.v…. mà còn để
tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế
hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn.
Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan
tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện
khác như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản,
protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên

2
việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn
gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc
từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không
phải là tác nhân gây bệnh ở người.
Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng
sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp
nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và hIL-7 nói riêng một cách
tối ưu. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương
pháp khả thi, chúng tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án:
“Nghiên cứu biểu hiện protein interleukine 7 tái tổ hợp trong hệ thống
nuôi cấy thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ưu protein
hIL-7 tái tổ hợp.
Thu nhận và tinh sạch được protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống
nuôi cấy thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực vật.
Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp
phù hợp với các hệ thống nuôi cấy thực vật.
Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực
vật: huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.
Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu
được qua hệ thống nuôi cấy thực vật.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án
4.1. Ý nghĩa lý luận
Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về biểu
hiện, sản xuất protein tái tổ hợp dùng trong y học ở thực vật thông qua

biến đổi mã di truyền và các hệ thống nuôi cấy thực vật.


3
Nội dung luận án có thể được sử dụng làm tài liệu giảng dạy,
tham khảo cho giảng viên và sinh viên các trường khối khoa học tự nhiên
nói chung và sinh học nói riêng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Luận án cung cấp quy trình biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở
các hệ thống nuôi cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, cây thuốc lá
chuyển gen trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi
cấy thu sinh khối tế bào.
Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái
tổ hợp thu được sau khi tinh sạch ở các hệ thống nuôi cấy, là tiền đề cho
các nghiên cứu sâu hơn.
5. Đóng góp mới của luận án
Luận án đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector biểu hiện protein
hIL-7 ở tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.
Đã biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế
bào BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Trong đó, protein biểu hiện
cao nhất ở cây thuốc lá chuyển gen 5 ngày tuổi với hàm lượng 36,7 ng/µg
protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao.
Đây là công trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới về
biểu hiện protein hIL-7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật.
6. Cấu trúc của luận án:
Luận án có 157 trang kể cả tài liệu tham khảo được chia thành
các chương, phần: Mở đầu (3 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (25
trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (24 trang);
Chương 3: Kết quả nghiên cứu (48 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả
nghiên cứu (8 trang); Kết luận và đề nghị (1 trang); Các công trình công

bố liên quan đến luận án (1 trang); Summary (3 trang); Tài liệu tham
khảo (26 trang); Phụ lục (7 trang). Luận án có 10 bảng; 39 hình và tham
khảo 175 tài liệu.


4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 175 tài liệu, trong đó có 8 tài
liệu tiếng Việt, 164 tài liệu tiếng Anh và 3 địa chỉ trang web về 3 vấn đề
cơ bản liên quan: (1). Vai trò của cytokine và interleukine 7 trong hệ miễn
dịch ở người; (2). Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái
tổ hợp trong y học; (3). Nghiên cứu biểu hiện hIL-7 tái tổ hợp trong hệ
thống vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ và cây thuốc lá.
Interleukine là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai
trò quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con người. Chúng có chức năng
điều hoà miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trưởng thành, di
chuyển và bám dính. Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích hoạt các phản
ứng miễn dịch của cơ thể (Chad et al., 2010). Interleukine 7 gồm một chuỗi
glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4 kDa và được ổn định
bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu nối disulfide nội
phân tử (Yoseph et al., 2016). Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb,
gồm có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13.
Hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ
hợp đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt
các cytokine khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm
trong điều trị lâm sàng như: hIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL11 và EPO (Kwon et al., 2003). Các loại cytokine có vai trò quan trọng
trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, do đó các hướng
nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng điều trị của cytokine như là
một tác nhân dược lý hoặc đích tác động đang được quan tâm nghiên
cứu. Chính vì lý do đó nên yêu cầu cấp bách đặt ra là phải hoàn thiện các

quy trình hệ thống thu nhận cytokine tái tổ hợp nói chung và interleukine
7 nói riêng, phục vụ trong y học.
Các hệ thống biểu hiện protein thường được sử dụng như: hệ
thống vi khuẩn, hệ thống biểu hiện tế bào huyền phù BY2, hệ thống biểu


5
hiện rễ tơ và hệ thống biểu hiện tạm thời ở thực vật. Trong đó, các hệ
thống biểu hiện ở thực vật thể hiện khả năng ưu việt hơn so với các hệ
thống khác do: khả năng tạo sinh khối, khả năng thu nhận protein tái tổ
hợp, ít tốn công chăm sóc v.v… Đặc biệt là các mầm bệnh, virus thực
vật không phải là đối tượng gây bệnh cho con người, nên rất phù hợp để
biểu hiện các loại protein tái tổ hợp của người phục vụ trong y học
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
Luận án sử dụng dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum L.
Cv Bright Yellow 2), cây thuốc lá N. benthamiana và N. tabacum K326
do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
Các chủng vi khuẩn E. coli DH-5α, A. tumefaciens, A.
rhizogenes, E.coli Rosetta-gami B của Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt nam cung cấp. Tế bào 2E8 do Ngân
hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp. Các vector: pK7WG2D.1, pCB301,
pRTRA 35S-TBAG-100xELP, pENTRTM221/cal nhận từ Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Hóa chất, các bộ KIT được sử dụng của các hãng Fermentas,
Invitrogen, Merck, Sigma, Promega… Các loại enzyme sử dụng của hãng
Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…Các thí nghiệm trong nghiên
cứu của luận án được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng
Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ

gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam. Luận án hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh
học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện
protein ở thực vật


6
Khai thác trình tự nucleotide và trình tự mRNA. Tiến hành thay
các codon hiếm trong gen hIL-7 bằng các codon phổ biến trong thực
vật. Thêm trình tự cmyc, histag, các vị trí nhận biết enzyme giới hạn
vào trình tự. Sử dụng BioEdit kiểm tra trình tự nucleotide và trình tự
acid amin trước và sau khi đổi mã.
2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp
Trong nội dung luận án, chúng tôi thiết kế các vector chuyển gen:
(1). pET32c(+)/IL7; (2). pENTR221/cal/IL7; (3). pK7WG2D.1/cal/IL7;
(4). pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP; (5). pCB301 35S/IL7cmyc-histag-100xELP.
2.3.3. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc
lá BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá
Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2 và rễ
tơ thuốc lá và cây thuốc lá được thực hiện gián tiếp thông qua A.
tumefaciens và A. rhizogene theo phương pháp của Topping (1998)
2.2.4. Nhóm phương pháp phân tích dòng chuyển gen
2.2.4.1. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen
Các chỉ tiêu sinh lý của các dòng tế bào chuyển gen BY2 và rễ tơ
chuyển gen được đánh giá thông qua các chỉ số khối lượng tươi và khối lượng
khô được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Quá trình đánh giá được thực hiện
theo phương pháp của Phạm Bích Ngọc năm 2009 (Ngoc et al., 2009).
2.2.4.2. Phân tích dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR, xác định
protein tái tổ hợp bằng lai miễn dịch Western blot. Phân tích biểu hiện
protein bằng điện di protein theo Laemmli (1970) và Western blot. Định
lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng ELISA theo phương pháp của Sun
và cs (2006). Protein được tinh sạch theo phương pháp IMAC và mITC
và được đánh giá hoạt tính sinh học bằng dòng tế bào 2E8.


7
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật
Sử dụng trình tự gen hIL-7 được công bố trên Ngân hàng Gen có
mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở thực vật (Codon
Usage Database) cùng với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại bỏ
và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen hIL-7 bằng các codon
phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần và trật tự các
acid amin. Sử dụng công cụ Graphical Codon Usage Analyzer kiểm tra
mức độ phù hợp của các codon trên gen hIL-7 trước và sau cải biến mã
di truyền. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA trên
gen hIL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA (Hood
et al, 2002), kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogen để giảm thiểu sự
hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp.
Kết quả chúng tôi đã thay đổi thành công mã di truyền của gen
hIL-7 với độ tương đồng nucleotide so với trình tự gen gốc là 63,6 %, độ
tương đồng acid amin là 100%. Ngoài ra, các trình tự nhận biết của
enzyme giới hạn NcoI, SacI, HindIII, các trình tự nucleotide mã hóa cho
protein c-myc và epitope his-tag được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gen
hIL-7. Trình tự nucleotide sau khi tối ưu có kích thước 536bp, được đặt
tổng hợp tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và được nhân dòng trong
vector pBSK/IL7.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng
tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7
Sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI và HindIII để cắt đồng thời
vector tách dòng pBSK/IL7 và vector pET32c(+) để tạo đầu dính sole,
sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.5.A)
Kết quả ở hình 3.5.A cho thấy ở đường chạy 1 thu được băng có
kích thước khoảng 5,9 kb tương ứng với kích thước lý thuyết của vector


8
pET32c(+); tại đường chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 2,9
kb và 0,53 kb tương ứng với kích thước của vector pBSK và gen hIL-7.
Ghép nối gen interleukin 7 vào vector pET32c(+) sẽ thu được vector tái
tổ hợp pET32c(+)/IL7 có kích thước khoảng 6,43 kb và được nhân dòng
trong E.coli DH5α. Kiểm tra sự có mặt của vector pET32c(+)/IL7 tái tổ
hợp bằng colony PCR với cặp mồi IL7_F và IL7_R và bằng phản ứng
cắt bởi enzyme giới hạn NcoI và HindIII.
Kết quả trên hình 3.5.B và 3.5.C; ở đường chạy 1 hình 3.5.B xuất
hiện một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,53 kb, còn ở đường chạy
1 hình 3.5.C xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 0,53 kb và 5,9 kb.
Các kết quả này chứng tỏ vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 đã được thiết
kế thành công. Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli rosetta
gami B để biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp.

A

C
B
Hình 3.3. Hình ảnh điện di

các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7
(A). Kết quả điện di sản phẩm cắt mở vòng pET32c(+)(đường chạy 1)
và vector pBSK/IL7 (đường chạy 2) bằng cặp enzyme NcoI và HindIII;
(B). Kết quả điện di sản phẩm colony PCR pET32c(+)/IL7 bằng cặp
mồi IL7_F và IL7_R, (-). Đối chứng âm (pET32c(+)), (+). Đối chứng


9
dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả diện di sản phẩm cắt vector
pET32c(+)/IL7 bằng enzyme cắt giới hạn NcoI và HindIII; M. Thang
DNA chuẩn 1kb.
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7
Các bước thiết kế vector pENTR221/cal/IL7 tương tự như mục
3.2.1. Sử dụng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII để tạo đầu dính cho
gen hIL-7 và vector pENTR221 để thực hiện phản ứng lai ghép, chúng
tôi đã thiết kế thành công vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7.
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7
Chúng tôi thực hiện phản ứng LR giữa plasmid tiếp nhận
pENTR221/cal/IL7 và vector đích pK7WG2D.1 để tạo vector
pK7WG2D.1/cal/IL7 tái tổ hợp bằng kỹ thuật Gateway. Kết quả chúng
tôi đã thiết kế thành công vector pK7WG2D.1/cal/IL7.
3.2.4. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Các bước thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag100xELP tương tự như mục 3.2.1. Sử dụng enzyme BamHI để tạo đầu
dính giữa gen hIL-7 và vector pRTRA, chuẩn bị cho phản ứng lai ghép
với enzyme xúc tác T4 ligase. Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag100xELP được dòng hóa trong E.coli DH5α và A.tumefaciens.
3.2.5. Thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301
được xử lý đồng thời bằng enzyme cắt giới hạn HindIII và tiến hành lai
ghép dưới sự xúc tác của enzyme T4 ligase. Kết quả chúng tôi đã thiết
kế thành công vector chuyển gen pCB301/IL7.

3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp
3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn
Tiến hành nuôi cấy tế bào E. coli rosetta-gami B chứa plasmid
tái tổ hợp trong hai môi trường LB chọn lọc có bổ sung IPTG với các
nồng độ 0,2; 0,4; 0,6 mM ở hai mức nhiệt độ 280C và 370C.


10
Kết quả phân tích protein thể hiện trên hình 3.15, tại các đường
chạy protein của các dòng E. coli rosetta-gami B mang plasmid
pET32c(+)/IL7 cảm ứng IPTG xuất hiện băng có kích thước khoảng 37
kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7 dung hợp với Thiodedoxin
(Trx.tag), trình tự mã hóa cmyc-tag và his-tag. Trong khi đó, dòng đối
chứng nuôi cấy ở 370C (đường chạy 1) và nuôi cấy ở 280C (đường chạy 5)
không biểu hiện protein này.

Hình 3.15. Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7
từ vi khuẩn E. coli Rosetta gami B nuôi ở 37oC và 28oC
1 - 4: Nuôi cấy 370C; 1: không bổ sung IPTG, 2: 0,6 mM IPTG, 3: 0,4
mM IPTG, 4: 0,2 mM IPTG; 5 - 8: Muôi cấy 280C; 5: không bổ sung
IPTG, 6: 0,6 mM IPTG, 7: 0,4 mM IPTG, 8: 0,2 mM IPTG; M: thang
protein chuẩn (Fermentas)
Chúng tôi xử lý các mẫu protein bằng DTT ở các nồng độ và
nhiệt độ khác nhau, sau đó tiến hành lai miễn dịch Western blot để xác
định chính xác protein biểu hiện có đúng là protein mong muốn. Độ nhạy
của phản ứng lai Western blot được đánh giá bằng đối chứng dương là
protein tái tổ hợp scFv có trình tự c-myc với nồng độ xác định là 50 ng/µl.
Ngoài ra, chúng tôi có thể định lượng được lượng protein hIL-7 có trong
mẫu khi so sánh mầu sắc các vạch mẫu với vạch đối chứng dương. Kết
quả thể hiện trên hình 3.16 cho thấy trên các màng lai, ở đường chạy

11
protein số 2, 3, 4, 5, 6, 7 đều xuất hiện một băng màu đậm, rõ nét có kích
thước đúng như tính toán lý thuyết, trong khi ở dòng đối chứng không có
protein này.

Hình 3.16. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot
(-). Đối chứng âm: mẫu protein không cảm ứng IPTG; 1. Mẫu protein
không xử lý DTT; 2, 3, 4, 5, 6, 7: mẫu protein xử lý DTT ở các điều kiện
khác nhau; (+). Đối chứng dương: 150 ng protein scFv; M. Thang chuẩn
protein (Fermentas).
3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2
Sử dụng các dòng BY2 chuyển gen và một dòng không chuyển
gen (đối chứng âm) sau 12 ngày nuôi cấy để tách protein tan tổng số,
điện di trên gel 12,6% SDS polyacrylamide và tiến hành phản ứng
Western blot để đánh giá chất lượng protein thông qua protein c-myc,
phát hiện sự có mặt của protein hIL-7 bằng kháng thể kháng c-Myc. Độ
nhạy của phản ứng Western blot được đánh giá bằng đối chứng dương là
protein tái tổ hợp scFV có gắn đuôi c-Myc.
Kết quả thể hiện trên hình 3.24 cho thấy, các băng protein ở các
đường chạy rõ, sắc nét chứng tỏ protein thu được khá sạch, ít bị đứt gãy.
Các dòng BY2 chuyển gen hIL-7 số 2, 3, 32 xuất hiện băng khoảng 23
kDa. Trong khi đó, dòng số 13, 39 không xuất hiện băng protein hIL-7


12
mặc dù kết quả kiểm tra bằng PCR cho kết quả dương tính; điều này có
thể do hiện tượng gen chuyển không hoạt động (Sun et al., 2006).

Hình 3.24. Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp
trong các dòng tế bào huyền phù BY2 bằng Western blot
M. Thang protein chuẩn; (+). Đối chứng dương (protein scFv 150 ng); (-).
Đối chứng âm (dòng tế bào BY2 hoang dại); 1 - 5: các dòng tế bào BY2
chuyển gen; Phản ứng lai sử dụng kháng thể anti c- myc
Từ những kết quả trên cho thấy, chúng tôi đã thiết kế và biểu hiện
thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong tế bào huyền phù BY2.
Chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA để đánh giá gián tiếp mức độ
biểu hiện của protein hIL-7 trong các dòng BY2 chuyển gen dương tính
khi kiểm tra bằng Western blot. Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp gắn
đuôi c-myc được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn của protein
scFv gắn đuôi c-myc. Kết quả thể hiện trên hình 3.25.
Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp tích luỹ trong các tế bào huyền
phù chuyển gene BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan
tổng số. Tuy nhiên, mức độ tích luỹ protein hIL-7 tái tổ hợp còn khá thấp
so với protein tổng số.


Hàm lượng hIL-7
(ng/μg protein tổng số)

13
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5

0

3

3.25

2.25

Dòng 2

Dòng 3

Dòng 32
Dòng BY2 chuyển gen

Hình 3.25. Biểu đồ so sánh hàm lượng
hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2 chuyển gen
Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp tích lũy trong các tế bào huyền
phù chuyển gen BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan
tổng số.
3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen
Chúng tôi sử dụng A.rhizogenes ATCC15834 để chuyển vector
pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mảnh lá thuốc lá để cảm ứng tạo rễ tơ chuyển
gen. Sau qua trình chọn lọc, kiểm tra trên môi trường chứa kháng sinh và
kỹ thuật PCR, đã chọn được những dòng rễ tơ sinh trưởng, phát triển tốt
mang gen chuyển để đánh giá biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp.
Sử dụng kỹ thuật Western blot để phân tích sự biểu hiện của
protein hIL-7 ở 5 dòng rễ tơ chuyển gen. Kết quả thể hiện trên hình 3.30
Kết quả kiểm tra cho thấy, các dòng rễ tơ chuyển gen mã hóa
protein hIL-7 đều xuất hiện một băng kích thước khoảng 23 kDa, tương

ứng với kích thước protein hIL-7 gắn thêm c-myc và histag theo tính toán
lý thuyết. Trong khi ở đường chạy đối chứng âm là dòng rễ tơ không
chuyển gen không xuất hiện băng protein. Điều này cho thấy gen mã hóa
protein hIL-7 đã được chuyển và biểu hiện thành công trong rễ tơ thuốc lá.


14

Hình 3.30. Kết quả biểu hiện protein hIL-7 các dòng rễ tơ bằng Western blot
M. Thang protein chuẩn; 1 - 5: dòng rễ tơ chuyển gen; (+). Đối chứng
dương (protein scFv 150 ng), (-). Đối chứng âm: dòng rễ tơ không chuyển
gen. Phản ứng lai sử dụng kháng thể kháng c-myc

Hàm lượng hIL-7
(ng/μg protein tổng số)

30
25

23.3

22

20

19.93

20

17.84

15
10
5
0

Dòng 1

Dòng 2

Dòng 3

Dòng 4

Dòng 5

Dòng rễ tơ chuyển gen

Hình 3.31. Biểu đồ so sánh hàm lượng
protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển gen
Chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA để xác định hàm lượng
protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng rễ tơ chuyển gen. Kết quả thể
hiện ở hình 3.31 cho thấy, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp thu nhận
từ các dòng rễ tơ chuyển gen dao động từ 17,84 ng/µg đến 23,3 ng/µg


15
protein tan tổng số. Trong đó, biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp cao nhất
là dòng 1, đạt 23,3 ng/µg protein tan tổng số, thấp nhất là dòng 5, đạt
17,84 ng/µg protein tan tổng số. Đặc biệt, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ

hợp biểu hiện ở dòng 2 và dòng 4 không có sự khác biệt đáng kể.
3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng
phương pháp Agro-infiltration
Chúng tôi sử dụng chủng A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang
vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP để biểu hiện tạm thời
protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phương pháp Agroinfiltration. Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá và bảo quản ở -80oC.
Để kiểm tra sự biểu hiện của protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tôi
tiến hành tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phương pháp của
Bradford (1976), sau đó sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot trên
các vị trí biểu hiện tạm thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già.

Hình 3.35. Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7
trong lá thuốc lá bằng Western blot
M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2.
Lá bánh tẻ, 3. Lá già; (-). Đối chứng âm (lá thuốc lá không chuyển gen)
Kết quả thể hiện trên hình 3.35 cho thấy ở các đường chạy 1, 2, 3
xuất hiện một băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước
protein hIL-7 tái tổ hợp có gắn thêm protein cmyc, histag và ELP; trong


16
khi ở đường chạy đối chứng âm, cây thuốc lá không chuyển gen không
xuất hiện băng này.
3.3.4.4. Phân tích định lượng và tinh sạch protein hIl-7 tái tổ hợp
Sau khi biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong thuốc
lá, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ion cố
định kim loại (niken) để tinh sạch và định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp.
Đây là phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với
his-tag. Phương pháp này dựa trên nguyên lý histidine tạo phức hợp với
các kim loại hoá trị II (niken) ở nồng độ pH trung tính. Sự tương tác của

protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH. Protein
đích sau khi liên kết với cột tinh sạch, sẽ được hoà tan thu lại bằng cách
giảm pH dung dịch hoặc tăng nồng độ của đệm ion hoặc nồng độ của
đệm EDTA hoặc imidazole.
Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein
hIL-7 tái tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE và phương pháp lai miễn dịch
Western blot. Kết quả thể hiện trên hình 3.34 cho thấy, chúng tôi chỉ thu
được một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa, đúng theo tính toán
lý thuyết.

64

Hình 3.36. Kết quả tinh sạch và định lượng
protein hIL-7 bằng phương pháp IMAC
(A). Điện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A. Dịch
chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein hIL-7 sau tinh sạch


17
(B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B. Dịch
chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein hIL-7 sau tinh sạch
(C). Định lượng protein hIL-7 bằng western blot và sử dụng phần mềm
ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200
ng/giếng, 5C. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C.
protein hIL-7 sau tinh sạch (30 µg protein tổng số/giếng).
Sau khi tinh sạch theo phương pháp IMAC, nồng độ protein tổng
số được định lượng theo phương pháp của Bradford và protein hIL-7
được định lượng bằng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả thu được
27,86 ng/µg protein tan tổng số. So sánh với một số nghiên cứu biểu hiện
protein tạm thời khác thì sự biểu hiện của protein hIL-7 trong cây thuốc

lá N. Benthamiana của chúng tôi là tương đối cao. Kết quả này cho thấy
hiệu quả của phương pháp biểu hiện tạm thời và tinh sạch protein hIL-7
từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn, dễ thực hiện. Để có
thể thu được protein hIL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn, chúng tôi
tiếp tục định lượng và tinh sạch bằng phương pháp mITC dựa trên đặc
tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích hIL-7.
Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã được biến nạp bằng
phương pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein hIL-7 tái tổ
hợp theo phương pháp mITC.
Kết quả trên hình 3.37 cho thấy, ở đường chạy 3 xuất hiện 2 băng
có kích thước khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của protein
có gắn đuôi ELP; còn ở đường chạy 2 là dịch chiết protein ra khỏi màng
lọc sau khi đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất hiện băng
protein nào, điều này chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP đã được giữ
lại trên màng lai không bị rửa trôi cùng các protein khác. Ở đường chạy
số 1 là dịch chiết sau khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh ở nồng
độ ion thấp chỉ có một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa tương
ứng với kích thước protein hIL-7 tái tổ hợp theo tính toán.


18

Hình 3.37. Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp mITC
M. Thang protein chuẩn; 1. Protein hIL-7 tinh sạch sau khi rửa màng
bằng nước lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua
màng; 3. Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch
Bảng 3.9. Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 bằng phương pháp mITC
Dịch chiết
Protein
Protein

Hiệu suất
Độ tinh
protein
tổng số (mg) tái tổ hợp (mg) thu hồi (%) sạch (%)
Dịch thô
1634,7
38,3
100
X
trước tinh sạch
Dịch hIL-7
45,8
36,7
95,82
86,3
đã tinh sạch
Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi
protein hIL-7 bằng phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt
86,3%. Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là
2,34%, kết quả này tương đương với những nghiên cứu trước đó về hàm


19
lượng protein tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số: 2% (Lamphear et al.,
2004), (Streatfield et al., 2002); 2,2% (C.H.Ha et al, 2015); 3% (Gil, 2001).

Hình 3.38. Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western blot
1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng);
2. Protein hIL-7 tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh;
3, 4, 5, 6. Đối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng.

Phương pháp gắn kết ELP vào protein đích tỏ ra có nhiều ưu điểm
như dễ dàng thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt
của ELP, đồng thời hàm lượng protein tái tổ hợp thu được thường khá cao.
Shoj và cộng sự (2009) đã thu nhận được 200 mg HA/kg lá tươi, Mortimer
và cộng sự (2012) cũng thu nhận được 675 mg HA/kg lá tươi khi sản xuất
kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp này. Trong
nghiên cứu biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, chúng tôi cũng
đã thu nhận được 36,7 ng/µg protein tan tổng số. Kết quả này cho thấy sự
biểu hiện tạm thời của protein hIL-7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá N.
benthamiana khá cao, là cơ sở để chúng tôi tiến hành sản xuất lượng lớn
protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học.


20
3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp
Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 chúng tôi sử dụng
mẫu protein hIL7 biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá bằng phương pháp
agro-infiltration ở các nồng độ hIL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5
µg/ml; 1 µg/ml; 1,5 µg/ml; 2 µg/ml; 2,5 µg/ml đối với khả năng hoạt hoá
tế bào 2E8. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.10 và hình 3.39.

Bảng 3.10. Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng protein interleukin 7
Mức độ hoạt hóa tế bào 2E8
(%)
35,7
45,3
53,3
63,8
73,6
82,5

79,3
0,35

Nồng độ protein hIL-7
0,125 µg/ml
0,25 µg/ml
0,5 µg/ml
1 µg/ml
1,5 µg/ml
2 µg/ml
2,5 µg/ml
Giá trị ED50 (g/ml)
100
80
60
40

Protein IL-7 ở
thực vật

20
0
0.125 0.25 0.5

1

1.5

2

2.5

Hình 3.39. Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein IL-7


21
Qua bảng 3.10 và hình 3.39 cho thấy, protein hIL-7 tái tổ hợp
được biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá đã thể hiện hoạt tính sinh học
trong việc hỗ trợ sinh trưởng và hoạt hoá dòng tế bào 2E8, với khả năng
hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 không bổ sung
hIL-7 vào môi trường nuôi cấy). Ở các nồng độ chất thử hIL-7 tăng dần,
% hoạt hóa tế bào của mẫu cũng tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học
của mẫu thử khá ổn định; trong đó, khả năng hoạt hóa cao nhất tại nồng
độ 2 µg/ml là 82,5%. Sau đó khả năng hoạt hóa của các mẫu không tăng
mà lại giảm đi, điều này có thể được giải thích do protein hIL-7 khi ở
liều lượng cao có thể gây ức chế cho sự sinh sản và hoạt hóa tế bào, thậm
chí gây chết cho tế bào.
Qua kết quả trên, có thể bước đầu khẳng định protein hIL-7 tái
tổ hợp có khả năng thể hiện hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở ra
khả năng sản xuất lượng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ trong y học
nhằm đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho con người.
Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Biểu hiện protein interleukin 7 trong E.coli rosetta-gami B
Trong nội dung nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng vector
pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp để biểu hiện protein hIL-7 trong vi khuẩn E.coli
Rosetta-gami B dưới sự điều khiển của promoter T7lac và nhờ hoạt tính của
T7 RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7. Chủng
rosetta-gami B mang plasmid pRARE mã hoá cho các tRNAs hiếm trong
chủng K-12 đột biến trxB/gor có khả năng tăng cường sự hình thành các cầu
nối disulfide trong tế bào chất kết hợp với vector biểu hiện pET32c có chứa

đoạn DNA mã hoá cho oligo-histidine (His-tag) hỗ trợ việc phát hiện và tinh
chế protein hIL-7 nhằm thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp có cấu trúc giống
tự nhiên để kiểm tra hoạt động của gen hIL-7 tái tổ hợp trước khi chuyển
vào các hệ thống nuôi cấy thực vật.


22
Khi được biểu hiện, protein hIL-7 sẽ dung hợp với protein
Thiodedoxin (Trx.Tag) trong pET32c(+) để tăng cường khả năng cuộn, gấp và
biểu hiện dạng tan giúp cho việc thu nhận và tinh sạch protein hIL-7 dễ dàng.
Khi có quá nhiều protein được tạo ra thì sẽ hình thành các thể vùi
trong vi khuẩn. Đây là những tinh thể đậm đặc của các protein cuộn gấp sai
không thể hoạt động chức năng. Vì lý do đó, nên chúng tôi sử dụng hệ thống
biểu hiện pET, đây là một trong hai hệ thống biểu hiện thường được sử dụng
ở E. coli để kiểm soát quá trình biểu hiện protein. Các dòng vector pET có
promoter T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site) và trình tự kết thúc
T7. Việc phiên mã từ promoter T7/lac đòi hỏi phải có T7 RNA polymerase.
Tế bào chủ E. coli có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, nhưng bị protein
lac operon, lacI ức chế kìm hãm biểu hiện gen này. Khi IPTG được bổ sung
trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, sẽ cảm ứng giải phóng lacI ra
khỏi operator của lac operon và quá trình phiên mã được bắt đầu. T7 RNA
polymerase được tạo ra và bám vào promoter T7/lac và protein tái tổ hợp
được sản xuất. Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã xác định được
hàm lượng IPTG tối ưu là 0,4mM ở điều kiện nhiệt độ 37oC cho khả năng
sản xuất protein hIL-7 tái tổ hợp tốt nhất.
Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã tiến hành thiết kế vector
biểu hiện bao gồm cả trình tự mã hóa protein hIL-7 và trình tự mã hóa cho
thiodedoxin tạo ra protein dung hợp có kích thước khoảng 37kDa và gần 80
kDa (trạng thái dimer), giúp tăng cường khả năng cuộn gấp tạo cấu trúc
không gian của protein hIL-7 và tăng khả năng tiết ra môi trường ngoại bào,

giúp cho việc thu nhận protein đơn giản hơn.
Tuy nhiên, khi biểu hiện những loại protein sinh vật nhân chuẩn,
đặc biệt là protein ở người sẽ có những hạn chế nhất định, đặc biệt là ở E.
coli thường lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở người. Vì vậy,
nhiều hệ thống khác đã được nghiên cứu để thay thế hệ thống biểu hiện ở vi
khuẩn, trong đó có các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật.


23
4.2. Biểu hiện protein interleukin 7 trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ
Sử dụng tế bào huyền phù thực vật như một mô hình sản xuất
các protein tái tổ hợp trong quy mô phòng thí nghiệm ngày càng trở nên
phổ biến. Đặc biệt, protein sản xuất từ dòng tế bào BY-2 có chứa N-liked
glycan có cấu trúc tương tự trong tế bào động vật, điều này làm tiền đề
cho việc thu nhận protein tái tổ hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh học
giống tự nhiên.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ
hợp được biểu hiện trong dòng tế bào BY-2 chỉ đạt 2,25 - 3,25 ng/g
protein tan tổng số, tương đương 0,225 - 0,335% protein tan tổng số. Hàm
lượng biểu hiện này còn thấp so với một số nghiên cứu biểu hiện protein
khác trong hệ thống BY-2 như: P.B. Ngọc (2009) biểu hiện protein
thaumatin I trong tế bào BY2 cho thấy protein thaumatin I tái tổ hợp tiết
ra khoảng 1,024 g/ml môi trường nuôi cấy; La Việt Hồng (2015), hàm
lượng protein miraculin tái tổ hợp biểu hiện trong hệ thống huyền phù
BY-2 dao động từ 1,13 - 3,10 ng/g protein tan tổng số, Đào Thị Sen
(2016), hàm lượng protein GP5 tái tổ hợp thu nhận được qua hệ thống
BY2 đạt 3,4% protein tổng số.
4.3. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 ở cây thuốc lá
Phương pháp này có lợi thế về mức độ biểu hiện protein tái tổ
hợp cao hơn rất nhiều so với phương pháp khác, cũng như thời gian sản

xuất protein nhanh hơn, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen trong tế
bào thực vật, đặc biệt không gặp phải vấn đề an toàn sinh thái như
phương pháp tạo cây chuyển gen.
Trong nghiên cứu của luận án, để tránh gặp phải hiện tượng
RNAi có thể làm giảm hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tôi đã
biểu hiện đồng thời cả protein đích interleukin 7 và protein hỗ trợ HcPro của virus khoai tây Y nhằm chống lại hiện tượng câm gen ở thực vật
bằng cách ngăn cản sự phân giải mRNA và RNA sợi đôi, từ đó giảm


24
lượng siRNA hoặc phá hỏng chức năng cắt của enzyme cắt sợi đôi Dicer
và RISC [176]. Kết quả, chúng tôi đã thu được protein hIL-7 tái tổ hợp
biểu hiện ở lá cây thuốc lá với hàm lượng khá cao.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1. Mã di truyền của gen hIL-7 được thay đổi phù hợp với hệ
thống biểu hiện ở thực vật với độ tương đồng nucleotide so với trình tự
gen hIL-7 gốc là 63,6 % và độ tương đồng acid amin là 100%.
2. Đã thiết kế thành công các cấu trúc vector chuyển gen
pET32c(+)/IL7; pENTR221/cal/IL7; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA
35S/IL7-histag-cmyc-100xELP; pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP
phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế bào
huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá để biểu hiện protein hIL-7
tái tổ hợp.
3. Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp cao nhất đạt 36,7 ng/µg
protein tan tổng số ở hệ thống biểu hiện tạm thời; thấp nhất đạt 2,25
ng/µg protein tan tổng số trong hệ thống nuôi cấy tế bào BY2.
4. Hoạt tính sinh học của protein hIL-7 thu nhận qua hệ thống
biểu hiện tạm thời đạt 82,5% ở nồng độ 2 µg/ml.
2. Đề nghị

1. Tiếp tục thử nghiệm protein hIL-7 tái tổ hợp đã tinh sạch ở
mức độ động vật thí nghiệm và trên lâm sàng nhằm đánh giá sâu hơn
hoạt tính sinh học của protein hIL-7 trước khi sản xuất trên quy mô lớn.
2. Nghiên cứu tối ưu các hệ thống biểu hiện dòng tế bào BY2, rễ
tơ thuốc lá nhằm tận dụng các ưu điểm của từng hệ thống để nâng cao
hiệu suất sản xuất protein hIL-7. Đồng thời nghiên cứu biểu hiện trên
một số loài thực vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp
protein hIL-7 tái tổ hợp.