Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và hàm lượng Prolin của hạt đậu tương nảy mầm trong dung dịch đường Saccarôzơ

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được sự chỉ bảo, hướng
dẫn tận tình của thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Mã, cùng các thầy cô giáo
trong khoa Sinh – KTNN, sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong
suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy giáo
PGS.TS Nguyễn Văn Mã, Khoa Sinh – KTNN, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên
cứu Khoa học và Chuyển giao công nghệ, Thư viện trường ĐHSP Hà Nội 2
đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em có thể hoàn thành tốt
khóa luận này.
Trong quá trình thực hiện, do còn nhiều hạn chế, đề tài nghiên cứu
của em không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được sự chỉ bảo,
đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn sinh viên để đề tài của em
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 28 tháng 4 năm 2010.
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết
quả nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực
và không trùng lặp với các tác giả khác.
Hà Nội, Ngày 28 tháng 4 năm 2010.
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh

1

MỤC LỤC
Mở đầu........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài..............................................................................1
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu...................................................4
2.1. Mục đích nghiên cứu..............................................................4
2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu............................................................. 4
3. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài.............................................. 4
Nội dung......................................................................................................... 5
Chương 1. Cơ sở lí luận của vấn đề nghiên cứu.......................................... 5
1.1. Vai trò của nước đối với thực vật................................................. 5
1.2. Vai trò của nước đối với sự nảy mầm của đậu tương....................6
1.3. Prolin và vai trò của prolin đối với thực vật..................................8
1.3.1. Bản chất hoá học của prolin......................................................8
1.3.2. Vai trò của prolin....................................................................... 9
1.4. Tình hình nghiên cứu về cây đậu tương, prolin và sự ảnh
hưởng của áp suất thẩm thấu đối với thực vật................................................. 10
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.................................... 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................... 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................... 14
2.2.1. Phương pháp xác định các áp suất thẩm thấu............................14
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm................................................... 15
2.2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu..........................16
2.2.3.1. Xác định tỉ lệ nảy mầm...........................................................16
2.2.3.2. Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm............................16
2.2.3.3. Phân tích hàm lượng prolin của mầm.....................................17
2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê kết quả thực nghiệm......................18
Chương 3. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và
hàm lượng prolin của mầm đậu tương........................................................19
3.1. Tỉ lệ nảy mầm của đậu tương........................................................19
3.2. Sự sinh trưởng của thân và rễ mầm............................................... 22

3.3. Khối lượng tươi và khối lượng khô của mầm............................... 28
3.4. Hàm lượng prolin của mầm..........................................................33
Kết luận.......................................................................................................... 36
Tài liệu tham khảo......................................................................................... 37


MỞ ĐẦU
Đậu tương, đỗ tương hay đậu nành
1. Lí do chọn
đề tài

(Glycinemax) là một loại cây thuộc họ Đậu
(Fabaceae) bộ Đậu (Fabales) là một cây
trồng rất có giá trị. Hàm lượng các chất
dinh dưỡng có ở đậu tương khá cao. Trong
hạt, hàm lượng protein có thể chiếm tới 40%
khối lượng khô của hạt, thành phần của nó
chứa rất nhiều axit amin khác nhau, trong đó
có một số axit amin không thay thế rất cần
thiết đối với cơ thể: lơxin, izolơxin, valin,
metionin, triptophan,… Đây là nguồn protein
thực vật có giá trị cao cung cấp cho con
người và động vật. Trong hạt đậu tương còn
chứa nhiều nguyên tố khoáng: Fe, Ca, P,
Mg, S và thành phần chất xơ tốt cho tiêu
hóa. Vitamin trong đậu tương cũng có nhiều
loại khác nhau, trong đó đáng kể nhất là
các vitamin nhóm B: B1, B2, B6 ngoài ra
còn có vitamin E, axit pholic. So với các loại
đậu khác thì đậu tương có chứa các axit béo

thiết yếu cao hơn. Tổng số chất béo chiếm
khoảng 18%, thành phần cacbonhiđrat chiếm
31%. Ngoài ra, đậu tương còn chứa một số
thành phần rất có lợi cho sức khỏe con
người như phytosterols, lecithin, isoflavons
và phytoestrogen…[19].


Sản

phẩm

từ cây đậu tương
được sử dụng rất
đa dạng như dùng
trực tiếp hạt thô
hoặc

chế

biến

thành đậu phụ, ép
thành

dầu

đậu

nành,

làm

nước

tương,

sữa

đậu

nành, bánh kẹo,…
[17] đáp ứng nhu
cầu về đạm trong
khẩu phần ăn hàng
ngày

của

con

người

cũng

như

của gia súc. Theo
các

nghiên

cứu

của các nhà khoa
học Mĩ và Hàn
Quốc cho thấy: ăn
nhiều sản phẩm từ
đậu tương có thể
giúp

ngăn

ngừa

được nhiều bệnh
ung thư nhất là
ung

thư

do

hoocmon gây ra:

ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt hay ung
thư đường ruột,


một số bệnh liên quan đến gan, mật, kiểm soát thể trạng, phòng ngừa bệnh

tiểu đường, béo phì và loãng xương [4].
Cũng như các cây họ Đậu khác, bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao, cây
đậu tương còn có tác dụng rất tốt trong việc cải tạo đất, tạo năng suất cho các
cây trồng khác. Điều này có được là do hoạt động cố định nitơ của loài vi
khuẩn Rhizobium sống cộng sinh trong các nốt sần của rễ cây. Chúng cung
cấp đạm cho đất làm cho đất trở nên tơi xốp, màu mỡ hơn và đồng thời lượng
protein trong hạt và các bộ phận khác của cây đậu tương cũng cao hơn những
cây trồng khác.
Mặt khác, cây đậu tương còn có thời gian sinh trưởng ngắn, lại thích
ứng với nhiều phương thức canh tác như: luân canh, xen canh…nên có thể
nâng cao được hệ số sử dụng đất trồng và tăng hiệu quả kinh tế trên một đơn
vị diện tích canh tác [3].
Về nguồn gốc, đậu tương được coi là một trong những cây trồng cổ nhất
của nhân loại, xuất phát từ một loại đậu tương dại thân mảnh dạng cây leo, tên
khoa học là G.sofa Sied & Zuc (T. Hymovitz 1970) ở vùng Mãn Châu (Trung
Quốc). Sau đó diện tích gieo trồng đậu tương được mở rộng trên phạm vi toàn
thế giới. Hiện nay đậu tương được trồng trên 200 quốc gia, chủ yếu tập trung
ở một số nước: Hoa Kỳ, Trung Quốc và Ấn Độ [1].
Ở Việt Nam, ngay từ thời vua Hùng ông cha ta đã biết trồng và sử
dụng nhiều loại đậu trong đó có đậu tương. Hiện nay, đậu tương được coi là
một cây trồng nông nghiệp quan trọng, chỉ đứng sau lúa và ngô. Tuy nhiên,
diện tích gieo trồng cũng như năng suất đậu tương của nước ta còn rất hạn
chế. Diện tích gieo trồng chỉ dao động trong khoảng vài trăm nghìn ha, năng
suất trung bình chỉ bằng khoảng 57% năng suất đậu tương bình quân trên toàn
thế giới. Nước ta nằm trong khu vực khí hậu có tiềm năng sản xuất đậu tương
cho năng suất cao nhất trên toàn cầu [2]. Tuy nhiên, địa hình nước ta khá


phức tạp, 3/4 là đồi núi, diện tích đất canh tác chỉ chiếm 21% tổng diện tích,
trong đó diện tích đất màu mỡ không nhiều, diện tích đất bị nhiễm mặn khá

lớn (ước tính có khoảng 54 triệu ha đất đai ở Đông Nam Á và Việt Nam bị
nhiễm mặn). Ở những vùng đất này, áp lực thẩm thấu rất lớn, làm cho cây
trồng khó hút được nước, nên thường không sinh trưởng và phát triển bình
thường được. Do đó, việc lựa chọn được những giống cây trồng có khả năng
chống chịu tốt và cho năng suất cao trên những vùng đất này gặp rất nhiều
khó khăn.
Vì vậy, nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng nói chung và
đậu tương nói riêng là một việc làm có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất
nông nghiệp ở Việt Nam. Điều đó không chỉ góp phần làm tăng năng suất cây
trồng mà còn có thể mở rộng được diện tích đất canh tác nông nghiệp ở nước
ta.
Khả năng chống chịu của cây trồng trong điều kiện khắc nghiệt đã và
đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trên
cơ sở tính mẫn cảm của các loại cây trồng khác nhau với điều kiện ngoại
cảnh, trong từng giai đoạn nhất định, các nhà khoa học đã xác định được khả
năng chống chịu ở một số cây trồng khác nhau: khả năng chịu nóng, chịu
lạnh, chịu hạn, chịu mặn. Trong đó, khả năng chống chịu ở giai đoạn nảy
mầm được đặc biệt quan tâm, bởi đây là giai đoạn đầu tiên, giai đoạn tạo tiền
đề cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể cây non mới.
Trên đối tượng cây đậu tương, đã có một số nhà khoa học nghiên cứu
như: Sheila A.Blackman, Miquel Ribas – Carbo, Finnegan…[29], [33] tìm
hiểu ảnh hưởng của sự thiếu nước đến quá trình quang hợp, hô hấp, sinh
trưởng. Ở Việt Nam, cũng có một số tác giả đã nghiên cứu về đậu tương như:
Nguyễn Huy Hoàng, Trần Đình Long, Nguyễn Văn Mã, Trần Thị Phương


Liên…[7],[8], [9], [10], [11], [12], [13], [14] với các vấn đề đánh giá khả
năng chịu hạn, quang hợp, chất lượng hạt, chọn tạo giống.
Tuy nhiên, số lượng các công trình nghiên cứu về sự ảnh hưởng của áp
suất thẩm thấu đến cây đậu tương chưa nhiều. Và sự nghiên cứu mới chỉ dừng

lại ở việc đánh giá sự ảnh hưởng của một áp suất thẩm thấu nhất định. Cho
đến nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào đánh giá một cách tổng thể
mức độ ảnh hưởng của các áp suất thẩm thấu nhau đến sự sinh trưởng của cây
đậu tương. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và hàm lượng
prolin của hạt đậu tương nảy mầm trong dung dịch đường saccarôzơ”.
2. Mục đích và nhiệm vụ
nghiên cứu 2.1.Mục đích
nghiên cứu
Đánh giá được mức độ ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khả
năng sinh trưởng và prolin trong mầm đậu tương.
22. Nhiệm vụ nghiên cứu
Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng (tỉ lệ nảy mầm, chiều dài thân, rễ
mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô) và prolin của mầm đậu tương được
gieo trong dung dịch đường có các áp suất thẩm thấu khác nhau.
3. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài
- Bổ sung thêm nguồn tư liệu về nghiên cứu các chỉ tiêu sinh trưởng và hàm
lượng prolin trong giai đoạn nảy mầm của đậu tương.
- Bước đầu đánh giá được mức độ ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự
sinh trưởng và hàm lượng prolin của đậu tương trong giai đoạn nảy mầm.
- Bổ sung thêm nguồn tư liệu nghiên cứu, tạo cơ sở tiền đề để các nhà chọn tạo
giống có thể lựa chọn được giống cây trồng thích hợp nhằm nâng


cao năng suất cây trồng nông nghiệp, mở rộng diện tích gieo trồng đậu tương
trên các vùng đất nhiễm mặn.

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Vai trò của nước đối với thực vật

Nước là một chất không thể thiếu trong cấu trúc của tế bào thực vật.
Hàm lượng nước của đa số thực vật đạt từ 70 – 80%. Ở các loài rau, nước có
thể chiếm 90% khối lượng tươi của cây. Còn ở một số cơ quan như hạt, bào tử
thì chứa ít nước như vậy chúng duy trì được khả năng nảy mầm lâu hơn.
Sự kết hợp của các phân tử nước và các yếu tố cấu trúc của tế bào
quyết định độ bền vững, rắn chắc của mô, duy trì hình dạng cấu trúc của tế
bào và toàn bộ cơ thể, tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt động sống của cây.
Nước trực tiếp tham gia vào các hoạt động sinh lí, sinh hóa của thực vật, là
môi trường cho các phản ứng hóa học diễn ra trong tế bào và cơ thể, là dung
môi của nhiều chất, hầu hết các phản ứng hóa sinh trong tế bào thực vật đều
xảy ra trong môi trường nước. Trong quá trình trao đổi chất và năng lượng,
nước tham gia như một nguyên liệu. Trong quá trình quang hợp, nước cung
+

+

cấp H để NADP thành NADPH thông qua phản ứng quang phân li nước.
Nước tham gia vào nhiều phản ứng sinh hóa của quá trình hô hấp hiếu khí, sự
thủy phân các hợp chất cao phân tử nhất thiết cần sự có mặt của nước. Chính
vì vậy, chỉ cần giảm một lượng nước nhỏ trong tế bào cũng có thể gây nên
những thay đổi đáng kể các hoạt động trao đổi chất. Từ đó, ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng và phát triển của cây.


Bên cạnh đó, nước còn có vai trò hiđrat. Nó được hấp phụ trên bề
mặt các hạt keo (protein, axit nucleic) và trên bề mặt màng sinh học (màng
sinh chất, màng không bào, màng các bào quan) tạo thành lớp nước mỏng bảo
vệ cho các cấu trúc sống của tế bào. Nước còn có vai trò quan trọng trong
việc điều hòa và ổn định nhiệt độ của lá giúp quá trình sinh lí, sinh hóa của cơ
thể diễn ra bình thường trong điều kiện nhiệt độ cao. Do nước có tỷ nhiệt cao

0

và có thể bay hơi trong bất kỳ nhiệt độ nào kể cả nhiệt độ dưới 0 C. Khi thiếu
nước cây thường thay đổi về hình thái, mô mất sức căng, cây bị héo, tế bào
giảm hàm lượng nước tự do, màng sinh chất chuyển từ sol sang gel, tính thấm
của tế bào rễ thay đổi, hoạt động của enzim thủy phân giảm mạnh, sự tổng
hợp ADN bị giảm sút, thậm chí bị phân giải. Nhiều khi các phản ứng xảy ra
trong điều kiện thiếu ôxi do lỗ khí đóng dẫn tới việc hình thành nhiều sản
phẩm độc như: axit lactic, etanol, axetalđehit, amoniac,… và tế bào giảm khả
năng tích lũy ATP.
Ngoài ra, nước còn góp phần tích cực trong việc đảm bảo mối liên hệ
khăng khít giữa cơ thể với môi trường. Sự thiếu nước trong cây làm cho lỗ khí
đóng, làm giảm lượng CO2 xâm nhập vào lá khiến cho hoạt động quang hợp
giảm sút, hơn nữa sự thiếu nước còn giảm sự vận chuyển các sản phẩm quang
hợp từ lá đến cơ quan, bộ phận khác của cây, giảm việc gắn Cacbon vào các
hợp chất. Quá trình tổng hợp protein bị giảm còn do tăng cường phân giải axit
nucleic khi bị thiếu nước.
Đặc biệt, nếu bị thiếu nước đột ngột lại càng nguy hiểm hơn do
chúng làm rối loạn quá trình trao đổi chất, gây hậu quả hết sức nghiêm trọng,
có thể làm chết cây, ngay cả khi chưa bị héo hoàn toàn.
Nhu cầu nước của thực vật thay đổi tùy theo loài, tuỳ vào các giai
đoạn sinh trưởng của cây. Và sự sinh trưởng phát triển của cây chỉ diễn ra
bình thường khi được cung cấp đủ nước.


1.2. Vai trò của nước đối với sự nảy mầm của đậu tương
Đậu tương cũng là một cây trồng có nhu cầu nước cao, trong cả quá
trình sinh trưởng cây cần một lượng nước mưa vào khoảng 350 – 600 mm. Hệ
số phân tán khoảng 600 – 1000 g nước/1 g chất khô. Trong quá trình sinh
trưởng nhu cầu nước của cây tăng dần. Hàng loạt các chỉ tiêu sinh trưởng và

năng suất như: chiều cao cây, số đốt, kích thước thân, số hoa, tỉ lệ đậu quả, số
hạt và trọng lượng hạt…đều có tương quan với độ ẩm đất, đặc biệt là tỉ lệ nảy
mầm.
Nảy mầm là giai đoạn quan trọng trong chu trình sinh trưởng và phát
triển của thực vật nói chung và đậu tương nói riêng. Quá trình nảy mầm diễn
ra mạnh mẽ tạo cơ sở thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển sau này của
cây. Quá trình nảy mầm diễn ra với nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt
với tốc độ cao để chuẩn bị cho sự hình thành cây mới. Đậu tương là cây 2 lá
mầm nên sự nảy mầm của hạt đậu tương cũng gồm các pha cơ bản sau:
Pha trương hạt
Pha hình thành và hoạt hóa enzim
Pha tích lũy chất dinh dưỡng
Pha động viên chất dinh dưỡng và xác định chất hữu cơ đặc trưng
cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm.
Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nước nhờ cơ chế hút trương của
hạt làm hạt trương lên, hạt chuyển từ trạng thái ngủ nghỉ sang trạng thái sinh
trưởng mạnh. Trong hạt, bắt đầu tăng tính thủy hóa của keo nguyên sinh chất,
giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo dẫn đến những biến đổi sâu sắc và đột
ngột trong quá trình trao đổi chất của hạt liên quan đến sự nảy mầm. Đặc
trưng nhất là sự tăng mạnh mẽ hoạt tính enzim thủy phân phân giải
polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành chất đơn giản, dẫn đến
thay đổi hoạt động thẩm thấu. Các sản phẩm thủy phân này dùng làm nguyên

11


liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng áp suất
thẩm thấu trong hạt giúp cho quá trình hút nước vào hạt nhanh chóng.
Tiếp theo, là sự sinh trưởng của phôi. Khi hạt nảy mầm phôi bắt đầu
sinh trưởng. Đầu tiên, rễ mầm nhô ra để cố định cây hút nước và các chất hòa

tan. Trụ dưới lá mầm duỗi ra trước khi cành bắt đầu sinh trưởng. Sau đó các
lá mầm được đẩy lên mặt đất nhờ trụ dưới lá mầm.
Giai đoạn nảy mầm của hạt đặc biệt mẫn cảm đối với sự thiếu nước.
Hạt khô có hàm lượng nước khoảng 10 – 14% và chỉ bắt đầu nảy mầm khi hút
được một lượng nước bằng 50 – 70% khối lượng của hạt [24]. Trong giai
đoạn này sự sinh trưởng phát triển của mầm dựa trên nguồn dinh dưỡng dự
trữ của hạt và phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ và độ ẩm của môi trường. Nếu hạt
không được cung cấp đủ lượng nước cần thiết thì các enzim thuỷ phân không
được hoạt hóa, các quá trình sinh lí, sinh hóa cần thiết cho sự nảy mầm không
được diễn ra bình thường. Do đó ảnh hưởng rất lớn tới khả năng nảy mầm của
hạt. Và một trong những nguyên nhân dẫn tới sự thiếu nước này là do áp suất
thẩm thấu của môi trường quá cao làm hạt không hút đủ lượng nước cần thiết
cho sự nảy mầm.
1.3. Prolin và vai trò của prolin đối với thực vật
1.3.1. Bản chất hóa học của prolin
Prolin hay α – piroliodin có công thức cấu tạo:
COOH
H2N

C

H2C

CH2
CH2

H


Trong phân tử prolin chứa piroliodin được tạo thành do sự kết hợp

của nhóm amin bậc 1 với mạch bên, do đó prolin là một axit amin chứa nhóm
amin bậc 2. Vì vậy, prolin còn được gọi là iminoaxit [32].
Prolin là một amino axit ưa nước, được tổng hợp từ glutamic bởi
enzim chìa khóa là delta 1– pyrroline – 5–carboxylate synthetase (P5CS) [27].
1.3.2. Vai trò của prolin
Prolin là một trong những chất thuộc nhóm có khối lượng phân tử
nhỏ và được xem là chất có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao, bên cạnh đó
còn có nhóm hợp chất amon bậc 4 và nhóm hợp chất sulfonium 3 –
dimethylsulfonio propionate (DMSP) [32] cũng là nhóm có khả năng tạo áp
suất thẩm thấu cao và chúng đều là dẫn xuất của các tiền chất axit amin.
Các chất này có cùng một tính chất là không tích điện ở pH trung
tính và có khả năng tan tốt trong nước mà lại không gây ra sự biến đổi pH.
Hơn nữa, khi ở nồng độ cao chúng rất ít hoặc không ảnh hưởng tới sự tương
tác giữa các đại phân tử hoà tan [32]. Các chất này được xem là đóng vai trò
then chốt trong sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu ở tế bào chất của tế bào thực
vật. Và prolin cũng có thể có chức năng như protein thẩm thấu, ưa nước và
giống như một chất thu nhận hyđroxyl.
Khi nghiên cứu chức năng sinh học của prolin, biểu hiện hình thái và
chống chịu áp lực thẩm thấu, Nanjo và cộng sự đã phát hiện: những cây bị đột
biến về hình dạng (có sự bất bình thường về biểu bì, tế bào mô mềm và hệ
mạch) có hàm lượng P5CS thấp, rất mẫn cảm với áp lực thẩm thấu. Nhưng
những sự biến đổi kiểu hình đó có thể ức chế được bằng cách tăng cường hàm
lượng prolin ngoại bào [31].
Theo Wyn Jones (1977) những chất được coi là tác nhân cạnh tranh
thẩm thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, được xem như đóng vai trò chủ


đạo trong việc thích ứng thẩm thấu tế bào chất của thực vật, nhằm phản ứng
lại áp lực thẩm thấu. Khi bị tác động bởi áp suất thẩm thấu thì sự tích luỹ
prolin có thể tăng từ 10 - 100 lần [26].

Kết quả nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy sự tích luỹ prolin là một
phản ứng thông thường của thực vật sống ở nơi có nồng độ muối cao (Stewart
và Lee 1974; Treichel 1975; Briens và Larther 1982) và trong mô lá, mô phân
sinh chồi của thực vật chịu áp lực nước (Barnet và Taylor 1996; Boggess
1976), trong vùng đỉnh của thực vật sống ở nơi có thế năng nước thấp (Voet
berg và Sharp 1991) [32].
Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng prolin và axit abxisic của những
đối tượng mẫn cảm và chống chịu điều kiện áp suất thẩm thấu của Zheng YiZhi và Li Tian cũng khẳng định rằng: phản ứng với áp lực nước và nồng độ
muối, cây đậu tương tích luỹ hàm lượng prolin cao, đó được xem như phản
ứng thích nghi với điều kiện khô hạn [35].
Theo những cách thức khác nhau, những nghiên cứu ứng dụng công
nghệ gen với tính chống chịu các điều kiện bất lợi về nước, đang tập trung
vào nhóm gen thuộc chu trình tổng hợp prolin. Các gen này mã hoá cho
enzim P5CS và P5CR (enzim tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) đã được
Kishor chuyển thành công vào thuốc lá và nhận kết quả tốt, lượng prolin tăng
từ 8 - 10 lần so với cây đối chứng [27].
1.4. Tình hình nghiên cứu về cây đậu tương, prolin và sự ảnh hưởng của
áp suất thẩm thấu đối với thực vật
Đậu tương là một cây trồng nông nghiệp phổ biến, có giá trị cao cả
về mặt dinh dưỡng và kinh tế, nên đã được các nhà khoa học quan tâm,
nghiên cứu từ rất sớm. Các công trình nghiên cứu đầu tiên, trên thế giới về
cây đậu tương, được biết đến vào khoảng giữa thế kỉ XVII, trong đó hướng
nghiên cứu chủ yếu tập trung vào một số vấn đề như: sự sinh trưởng, đặc tính


nông sinh học…Trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của khoa học
công nghệ, cùng với sự ra đời của các trang thiết bị hiện đại, các nhà khoa học
có điều kiện đi sâu tìm hiểu các cơ chế sinh lí liên quan đến khả năng chống
chịu của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng, đặc biệt là khả năng
chịu hạn được quan tâm nghiên cứu khá nhiều như: ảnh hưởng của sự thiếu

nước đến sự phát triển của hạt [34], quá trình quang hợp [31], quá trình hô
hấp… Một số cơ chế hóa sinh và sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu
như: xác định vị trí của gen liên quan đến việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu
(Maitra N, Cushman J, C 1994…), gen tổng hợp một số chất hình thành và
tích lũy nhiều khi gặp hạn hán: prolin, nhóm amin bậc 4, một số đường…
[15], [21].
Sheila A. Blackman và cộng sự năm 1992 [33] đã nghiên cứu protein
sốc nhiệt (HSP – heat shock protein) trong phôi hạt đậu tương đang chín ở
điều kiện bình thường và dưới áp suất thẩm thấu cao. Kết quả nghiên cứu
khẳng định HSP tăng lên trong quá trình hình thành hạt và giảm khi hạt nảy
mầm. HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm oligosaccarit chưa được tổng
hợp đủ lượng để thực hiện chức năng.
Nhiều nghiên cứu khẳng định có mối liên quan giữa sự tích lũy axit
abxisic (ABA) với sự tăng hàm lượng các chất điều chỉnh thẩm thấu khi gặp
hạn, các chất này thường là protein hoặc axit amin được điều khiển tổng hợp
bởi các gen RAB (responsive to abscisic acid). Bên cạnh đó, cũng có một số
chất có khả năng điều chỉnh thẩm thấu không liên quan đến sự tích lũy ABA,
sự tăng hàm lượng của chúng độc lập với sự tích lũy ABA.
Ở Việt Nam, vào khoảng những năm 60, 70 của thế kỉ trước đậu tương
mới bắt đầu được quan tâm nghiên cứu, nội dung nghiên cứu chủ yếu tập
trung vào: giống, thời vụ và phân bón. Thí nghiệm tại Trại Sông Lô năm 1953
do Bùi Huy Đáp chỉ đạo được xem là thí nghiệm chính quy đầu tiên về cây


đậu tương ở Việt Nam. Về sau, có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả
như: Nguyễn Danh Đông, Trần Đình Long, Trần Thượng Tuấn, Trần Thị Lệ
Nguyên, Nguyễn Đăng Khoa, chủ yếu nghiên cứu về quá trình sinh trưởng
của rễ, thân, hoa, quả của đậu tương [1].
Trong những năm gần đây, số lượng các công trình nghiên cứu về cây
đậu tương tăng lên nhiều. Trong đó, hướng nghiên cứu tập trung chủ yếu vào

tính chống chịu của cây, đặc biệt là tính chịu hạn: nghiên cứu đặc tính di
truyền và khả năng chịu hạn ở con lai đậu tương F1 (Nguyễn Huy Hoàng) [7].
So sánh động thái hình thành nốt sần ở một số giống, dòng đậu tương chịu
hạn [9]. Nghiên cứu thành phần điện di protein của một số giống đậu tương có
khả năng chịu hạn khác nhau (Trần Thị Phương Liên) [11], khả năng chịu hạn
của một số giống đậu tương năng suất cao trên đất bạc màu (Nguyễn Văn Mã)
[12], một số chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa của cây đậu tương trong điều kiện gây
hạn (Nguyễn Văn Mã, Phan Hồng Quân) [14]… Kết quả nghiên cứu đã được
ứng dụng trong sản xuất và chọn tạo được nhiều giống đậu tương mới có năng
suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu, canh tác của Việt
Nam.
Tại Trung tâm Nghiên cứu và Thực nghiệm đậu đỗ, Viện Khoa học Kĩ
thuật Nông nghiệp Việt Nam, nhiều giống đậu tương nhập nội và giống địa
phương đã được đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng bằng một số phương
pháp: cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường saccarôzơ, phương pháp dùng
nhiệt độ cao… [7], [8], [9]. Kết quả là, từ trên 1000 mẫu giống nhập nội đã
phân lập được 68 mẫu giống chịu hạn tổng hợp, 14 giống vừa chịu nóng, vừa
chịu hạn tốt…
Về sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu, đã có một số công trình nghiên
cứu trên các đối tượng động vật như: lưỡng cư, bò sát… Trên thực vật, các
nhà khoa học cũng đã đánh giá được sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối


với khả năng hút nước, sự sinh trưởng của bộ rễ, thân và lá. Trong nuôi cấy
mô: ảnh hưởng của manitol đến tích lũy prolin và glucose liên quan đến khả
năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus cà chua [5]. Trên đối tượng
đậu tương cũng đã có một số tác giả nghiên cứu về sự ảnh hưởng của áp suất
thẩm thấu, nhưng sự nghiên cứu mới chỉ dừng lại việc đánh giá sự ảnh hưởng
của một áp suất thẩm thấu nhất định (7 hoặc 9 atm), còn việc đánh giá một
cách tổng thể mức độ ảnh hưởng của một loạt các áp suất thẩm thấu khác

nhau từ thấp đến cao thì hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào được
công bố.
Về hàm lượng prolin, trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên
cứu về prolin, tập trung chủ yếu vào một số vấn đề như: sự biến đổi hàm
lượng prolin ở điều kiện gây hạn, bản chất hóa sinh của prolin, việc tìm hiểu
cơ chế của quá trình tổng hợp prolin cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến quá
trình này [26], [27], [31], [32], [35]…
Ở nước ta, việc nghiên cứu các chỉ tiêu sinh hóa thông qua việc đánh giá
hàm lượng prolin chưa phổ biến trên nhiều đối tượng thực vật. Mới chỉ có
một số công trình nghiên cứu về sự biến đổi hàm lượng prolin trên một số đối
tượng như: cà chua [5], đậu xanh [6], lúa [15]. Đến nay, số lượng các công
trình nghiên cứu về sự biến đổi hàm lượng prolin trên đối tượng cây đậu
tương chưa nhiều.


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đối tượng là 2 giống đậu tương
DT96 và AK02 do Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
- DT96: Giống được tạo ra từ tổ hợp lai giữa 2 giống đậu tương DT84 và
DT90, giống được công nhận chính thức năm 2004 [16]. Thời gian sinh
trưởng là: 90 - 95 ngày. Thân có màu nâu nhạt, lá màu xanh nhạt, hoa tím vỏ
quả xám. Hạt màu vàng, rốn hạt màu trắng. Năng suất: 1,8 - 3,2 tấn/ha. Khối
lượng 1000 hạt: 190 - 220 g. Giống chịu được nóng, lạnh và chịu hạn tốt.
Gieo trồng được 3 vụ trong năm. Vùng đất gieo trồng thích hợp: tất cả các
loại đất và vùng sinh thái có trồng đậu tương, thích nghi tốt với vùng núi cao
[18].
- AK02: Giống được tạo ra bằng phương pháp chọn lọc cá thể từ giống đậu
tương vàng Mường Khương. Được công nhận giống chính thức năm 1987
[20]. Thời gian sinh trưởng là: 75 - 85 ngày. Hạt dạng bầu dục, hơi tròn, màu

vàng nhạt. Năng suất trung bình: 1,5-1,6 tấn/ha. Khối lượng 1000 hạt là: 100
– 120 g. Chịu hạn kém. Trồng được 3 vụ trong năm. Vùng đất gieo trồng
thích hợp: Đồng bằng, trung du và miền núi phía bắc.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định các áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu (P) được xác định theo phương pháp của
Schardakov & Grodzinsk (1981) và tính giá trị bằng phương trình Van– Hoff:
P = i.C.R.T
Trong đó:
P: Áp suất thẩm thấu (atm)
C: Nồng độ mol/l của dung dịch (M)
R: Hằng số khí (R=0,0821)


T: Nhiệt độ tuyệt đối (K)
i:Hệ số điều chỉnh sự phân ly
(Đối với dung dịch saccarozơ i= 1)
Sau đó, chúng tôi tiến hành thử khả năng nảy mầm của đậu tương ở các
áp suất thẩm thấu khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy đậu tương chỉ có
khả năng nảy mầm trong môi trường có các áp suất thẩm thấu từ 1 – 11 atm,
khi áp suất thẩm thấu ≥ 12 atm thì đậu tương không còn khả năng nảy mầm
nữa. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu sự sinh
trưởng và prolin của đậu tương nảy mầm trong dung dịch đường với 12 áp
suất thẩm thấu khác nhau từ 1 đến 12 atm.
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành làm các thí nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên
cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ Trường ĐHSP Hà Nội 2.
Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm
gieo hạt trong dung dịch đường theo phương pháp xác định khả năng chịu hạn
của Volcova [34]. Hạt đậu tương được gieo trên các khay nhựa, đánh số thứ

tự, có lót giấy thấm và chia thành 2 lô: lô thí nghiệm được tưới bằng dung
dịch đường saccarôzơ đã được pha tương ứng với các áp suất thẩm thấu từ 1
đến 12 atm, lô đối chứng được tưới bằng nước cất. Khi bắt đầu gieo, mỗi
khay được tưới một lượng nước hoặc dung dịch đường vừa đủ, làm ướt đều
giấy thấm và tương đương nhau ở tất cả các mẫu. Sau đó, mỗi ngày bổ sung
thêm ở mỗi mẫu 50 ml nước hoặc dung dịch đường.
Vì hạt nảy mầm trong dung dịch đường rất dễ bị nhiễm khuẩn nên hạt
giống và các dụng cụ đều được khử trùng trước khi gieo.
Hạt giống: chọn hạt giống đều, khỏe, có phôi sáng và không sâu mọt.
Khay nhựa, bình, tay…được rửa sạch, sau đó khử trùng bằng cồn.


Các dụng cụ thí nghiệm khác: Cốc thủy tinh, ống nghiệm, panh, kẹp,
…rửa sạch, sấy ở 106º trong 10 phút.
Dung dịch đường sau khi pha được hấp khử trùng ở 110ºC trong 15
phút, sau đó bổ sung thêm thuốc kháng sinh nistatin để chống nấm (1 viên/1lit
dung dịch)
Các mẫu thí nghiệm được đặt trong buồng cấy vô trùng.
2.2.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.2.3.1. Xác định tỉ lệ nảy mầm
Đếm số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi xuất hiện hạt nảy mầm đầu
tiên cho đến khi không còn có thêm hạt nảy mầm mới. Hạt được coi là đã nảy
mầm khi có chiều dài rễ mầm đạt từ 2 mm trở lên [32]. Tỉ lệ nảy mầm được
tính theo công thức:
T=

a
b

.100

Trong đó:
T: tỉ lệ nảy mầm
a: số hạt nảy mầm
b: tổng số hạt đem gieo
2.2.3.2. Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm
- Chiều dài thân, rễ mầm (mm): sử dụng thước có chia đơn vị đến mm để
đo chiều dài của thân mầm, rễ mầm vào các ngày 3, 5, 7 sau khi hạt nảy
mầm.
- Khối lượng tươi của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, sau
đó cân khối lượng của mầm vào ngày đầu tiên, ngày thứ 7 sau khi hạt nảy
mầm.
- Khối lượng khô của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, đem
0

sấy khô ở 105 C cho đến khi khối lượng không đổi (3h). Sau đó, cân


khối lượng khô, thời gian cân vào ngày đầu tiên và ngày thứ 7 sau khi hạt nảy
mầm.
2.2.3.3. Phân tích hàm lượng prolin
Hàm lượng prolin của mầm được xác định theo phương pháp của
Bates và cộng sự (1973) [22] đã được Đinh Thị Phòng cải tiến (2001) [15]
Cân 0,5 g mầm/1 mẫu, nghiền kĩ, thêm 10ml dung dịch axit
sulfosalicylic 3% li tâm 4000 vòng trong 30 phút, lọc lấy dịch trong. Lấy 2 ml
dịch chiết cho vào bình (hoặc ống nghiệm) thêm 2 ml axit axetic và 2 ml
dung dịch ninhyđrin (dung dịch này gồm 30 ml dung dịch axit axetic + 1,25 g
0

nyhiđrin), đậy kín. Đem ủ trong nước nóng 100 C trong 1h. Sau đó ủ đá 5

phút. Tiếp theo, bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần
dịch mầu hồng ở bên trên, đo mật độ quang học ở bước sóng 520 nm trên
máy quang phổ UV - Spectrophotometer.
Tất cả các α - axit amin của protein đều phản ứng màu với ninhyđrin
tạo hợp chất màu xanh tím, riêng imino axit như prolin tạo thành màu vàng
với cơ chế phản ứng phức tạp. Tính chất này có cực đại hấp thụ ở bước sóng
λ= 520 nm.
Hàm lượng axit amin prolin được tính theo công thức sau: (công thức
suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin)
2

Y= 0,0179X + 0,095

(R = 1)

Trong đó :
Y: Hàm lượng prolin (mg/l)
X: Giá trị mật độ quang học đo được ở bước sóng 520nm
2

R : Hệ số tương quan
Sau đó hàm lượng prolin được đổi ra đơn vị mg/g theo công thức:
A=

Y.V
P.1000
21


Trong đó:

A: hàm lượng prolin (mg/g)
P: khối lượng mẫu (g)
V: thể tích dịch prolin chiết được.
2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê các kết quả thực nghiệm
Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và xử lí bằng phần

mềm

Microsoft Office Exel theo các tham số:
n


X

n

X

;

i 1

=

2

 =

i1

 X  X 

;

= 

2

n 1

n

 .100
C v=

2

;

X
2

m d = m1  m2

2

;

m=
td=



;

n

d
md

;

m% =

m.100
X

d = X1 - X 2

Trong đó:
X : Giá trị trung bình số học

n: Số lần nhắc lại
C v : Hệ số biến động
m% : Độ chính xác của thí nghiệm
 : Độ lệch chuẩn

m d : Sai số của hiệu các trung bình số học
t d : Tiêu chuẩn độ tin của hiệu
Tiêu chuẩn độ tin của hiệu được so với bảng tiêu chuẩn Student với số

bậc tự do : n 1 + n 2 - 2
Trong đó :
n 1 : Số lần nhắc lại ở công thức thí nghiệm
n 2 : Số lần nhắc lại ở công thức đối chứng


CHƯƠNG 3: ẢNH HUỞNG CỦA ÁP SUẤT THẨM THẤU
TỚI SỰ SINH TRƯỞNG VÀ HÀM LƯỢNG PROLIN
CỦA MẦM ĐẬU TƯƠNG
3.1. Tỉ lệ nảy mầm
Nảy mầm là quá trình sinh lí quan trọng trong chu kì sinh trưởng và
phát triển của thực vật nói chung, đậu tương nói riêng, đảm bảo duy trì sự
sống, tạo cơ sở ban đầu cho sự phát triển của một cơ thể mới. Trong giai đoạn
này thực vật rất mẫn cảm với sự thiếu nước. Quá trình nảy mầm được bắt đầu
bằng sự hút nước, trương nước của hạt và chỉ tiếp tục khi lượng nước mà hạt
hút được đạt khoảng 50% - 70% khối lượng khô của hạt [24]. Khi hạt được
gieo trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao, nghĩa là áp lực giữ nước của
môi trường lớn hơn khả năng hút nước của tế bào, hạt khó hút được lượng
nước cần thiết thậm chí khi khi áp suất thẩm thấu quá cao còn có thể làm cho
nước từ trong tế bào đi ra ngoài, kìm hãm sự nảy mầm của hạt. Theo nghiên
cứu của Fernando và cộng sự trên đối tượng thực vật Chenopodium quinoa
willd cho thấy: tỉ lệ nảy mầm chỉ đạt khoảng 14% sau gieo hạt khi cho chúng
nảy mầm trong dung dịch NaCl [23].
Khi theo dõi tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương được gieo trong dung dịch
dường saccarôzơ ở các áp suất thẩm thấu khác nhau, chúng tôi thu được kết
quả trong bảng 1
Từ kết quả bảng 1 cho thấy: tỉ lệ nảy mầm tăng dần từ ngày 1 đến ngày
3 sau đó dừng lại, các ngày tiếp theo tỉ lệ nảy mầm không tăng thêm nữa, các
hạt chưa nảy mầm có dấu hiệu bị hỏng.
Trong ngày đầu tiên, đậu tương chỉ nảy mầm được ở những áp suất

thẩm thấu thấp (1 – 3 atm). Ngày 2, đậu tương nảy mầm được ở những áp
suất thẩm thấu cao hơn (từ 1 - 8 atm ở AK02 và 1 – 9 atm ở DT96). Ngày 3,


hạt nảy mầm được tới 11 atm, còn khi áp suất thẩm thấu lớn hơn hoặc bằng
12 atm thì đậu tương không nảy mầm.
Trong cùng một ngày, áp suất thẩm thấu tăng thì tỉ lệ nảy mầm có xu
hướng giảm. Từ ngày thứ 2 trở đi tỉ lệ nảy mầm ổn định khi gieo ở áp suất
thẩm thấu thấp, chẳng hạn: 1 – 3 atm ở ngày 2; 1 – 6 atm ở ngày 3, 4. Sau đó,
tỉ lệ nảy mầm giảm một cách rõ rệt.
Ở điều kiện áp suất thẩm thấu cao, DT96 có tỉ lệ nảy mầm tốt hơn
AK02 (từ 7 – 11 atm). Trong ngày thứ 2, chỉ có DT96 nảy mầm ở áp suất
thẩm thấu bằng 9 atm, còn AK02 thì chưa nảy mầm ở áp suất này.
Bảng 1:Tỉ lệ nảy mầm của đậu tương
Đơn vị: %
AK02

DT96

Ptt

ngày 1

ngày 2

ngày 3

ngày 4

ngày 1

ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

nước cất

64,37

98,38

98,45

98,65

52,33

98,36

98,33

98,58

1 atm

36,14

97,58

98,33

98,33

28,72

97,72

98,35

98,38

2 atm

22,33

98,35

98,38

98,42

20,33

98,00

98,16

98,32

3 atm

20,33

97,64

98,32

98,35

16,00

97,63

98,37

98,00

4 atm

0,00

62,26

98,56

98,33

0,00

58,33

98,00

98,45

5 atm

0,00

55,36

97,83

98,00

0,00

52,00

98,33

98,47

6 atm

0,00

48,51

98,14

98,32

0,00

44,33

97,63

98,12

7 atm

0,00

32,25

65,16

67,16

0,00

38,00

72,33

73,00

8 atm

0,00

24,33

50,18

50,33

0,00

32,33

68,00

68,12

9 atm

0,00

0,00

35,33

36,48

0,00

20,00

65,33

65,45

10 atm

0,00

0,00

30,14

31,18

0,00

0,00

42,00

42,33

11 atm

0,00

0,00

11,33

12,00

0,00

0,00

22,33

22,36

12 atm

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

Hình 1.1: Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ nảy mầm của AK02

Hình 1.2: Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ nảy mầm của DT96